(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (51) Int. Cl.: C07K 14/025 ( ) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/US 05/ (30) Elsõbbségi adatok: P US (72) Feltalálók: BRYAN, Janine, T., Rahway, NJ (US); BROWNLOW, Michelle, K., Rahway, NJ (US); SCHULTZ, Loren, D., Rahway, NJ (US); JANSEN, Kathrin, U., Rahway, NJ (US) (73) Jogosult: Merck Sharp & Dohme Corp., Rahway, NJ (US) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (54) HPV 52 L1 optimalizált expresszáltatása élesztõben HU T2 A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 9 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T2 2 A találmány területe A találmány tárgya általánosságban a humán papillomavírus- (HPV) fertõzés megelõzése és/vagy terápiája. Közelebbrõl a találmány tárgyát a HPV52 L1 fehérjét kódoló szintetikus polinukleotidok képezik, és a polinukleotidokat tartalmazó rekombináns vektorok és gazdák. A találmány tárgyát képezik HPV52 vírusszerû részecskék (VLP) is, ahol a VLP¹k rekombináns HPV 52 L1 vagy L1+L2 élesztõsejtekben történõ expresszáltatásával vannak elõállítva, és azok alkalmazása vakcinákban és gyógyászati készítményekben HPV megelõzésére és kezelésére. A találmány háttere A humán papillomavírusnak (HPV) több mint 80 típusa van, amelyek közül sokat kapcsolatba hoztak biológiai fenotípusok széles körével, a jóindulatú proliferatív szemölcsöktõl a rosszindulatú karcinómákig [összefoglalásért lásd McMurray és munkatársai, Int. J. Exp. Pathol. 82(1): oldal (2001)]. A HPV6 és HPV11 a jóindulatú szemölcsökkel és/vagy a genitális vagy respiratorikus nyálkahártya nem rosszindulatú condyloma acuminata-ival kapcsolatos leggyakoribb típusok. A HPV 16 és HPV 18 nagy kockázatú típusok, amelyek leggyakrabban a méhnyak, hüvely, vagina, szeméremtest és a végbél in situ és invazív karcinómáival kapcsolatosak. A méhnyakkarcinómák több mint 90%¹a kapcsolatos HPV16, HPV18 vagy a kevésbé onkogén HPV31, 33, 45, 52 és 58 típusokkal való fertõzéssel [Schiffman és munkatársai, J. Natl. Cancer Inst. 85(12): oldal (1993)]. Az a megfigyelés, hogy a HPV-DNS detektálható a méhnyakkarcinómák %-ában, erõs epidemiológiai bizonyíték arra, hogy a HPV¹k méhnyakkarcinómát okoznak [lásd Bosch és munkatársai, J. Clin. Pathol. 55: old. (2002)]. A papillomavírusok kicsi (50 60 nm), buroktalan, ikozahedrális DNS-vírusok, amelyek maximum nyolc korai és két késõi gént kódolnak. A virális genom nyílt leolvasási fázisait (ORF) E1 E7-nek és L1¹nek és L2¹nek nevezik, ahol az E jelentése korai és L jelentése késõi. Az L1 és L2 kódolja a vírus kapszidfehérjéit, míg az E gének olyan funkciókkal kapcsolatosak, mint például a virális replikáció és celluláris transzformáció. Az L1 fehérje a fõ kapszidfehérje és molekulatömege kda. Az L2 fehérje a minor kapszidfehérje. Immunológiai adatok arra utalnak, hogy a legtöbb L2 fehérje az L1 fehérjén belül található virális kapszidban. Az L1 és L2 fehérjék egyaránt erõsen konzerváltak a különbözõ papillomavírusok között. Az L1 fehérje vagy az L1 és L2 fehérjék kombinációjának expresszáltatása élesztõben, rovarsejtekben, emlõssejtekben vagy bakteriális sejtekben vírusszerû részecskék (VLP) automatikus összeállítódásához vezet [összefoglalásért lásd Schiller és Roden, Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses ; szerk.: Lacey, kiad.: Leeds, UK: Leeds Medical Information, oldal (1996)]. A VLP¹k morfológiailag hasonlítanak a valódi virionokhoz, és képesek semlegesítõ ellenanyagok magas titerének kiváltására, amikor állatoknak vagy embereknek beadják. Mivel a VLP¹k nem tartalmazzák a potenciálisan onkogén virális genomot, biztonságos alternatívát biztosítanak az élõ vírus alkalmazásával szemben a HPV-vakcinafejlesztésben [összefoglalásért lásd Schiller és Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: oldal (2000)]. Ezen okból az L1 és L2 géneket immunológiai célpontokként azonosították HPV-fertõzés és betegség elleni profilaktikus és terápiás vakcinák kifejlesztésére. A HPV-vakcinafejlesztést és forgalmazást gátolta a kapszidfehérjék magas expressziós szintje elérésének a nehézsége sikeresen transzformált gazdaorganizmusokban, limitálva a tisztított fehérje termelését. Tehát a HPV L1 fehérjéket, mint például HPV 52 L1 fehérjét kódoló vad típusú nukleotidszekvenciák azonosításának ellenére nagyon kívánatos lenne HPV L1 fehérje könnyen megújítható forrásainak kifejlesztése, amely a tervezett gazdasejtben történõ expresszáltatásra optimalizált HPV 52 L1¹et kódoló nukleotidszekvenciákat alkalmaz. Emellett hasznos lenne olyan HPV 52 L1 VLP¹k nagy mennyiségû elõállítása, amelyek rendelkeznek a natív fehérjék immunitást okozó tulajdonságaival vakcinafejlesztésben történõ alkalmazásra. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát készítmények és eljárások képezik a HPV 52 L1 gének által expresszált fehérjetermékek elleni immunitás kiváltására és fokozására. Közelebbrõl a találmány tárgyát HP V52 L1 fehérjét kódoló polinukleotidok képezik, ahol a polinukleotidok kodonoptimalizálva lettek élesztõsejtben történõ magas szintû expresszióra. A találmány alternatív megvalósítási módjaiban a polinukleotid nukleotidszekvenciája meg van változtatva, hogy elimináljuk az élesztõ által felismert transzkripciós terminációs szignálokat. A találmány tárgyát képezik továbbá HPV 52 vírusszerû részecskék (VLP) is, ahol a VLP¹k rekombináns HPV 52 L1 vagy L1+L2 élesztõsejtekben történõ expresszáltatásával vannak elõállítva, és azok alkalmazása immunogén készítményekben és vakcinákban HPV-betegség vagy HPV-vel kapcsolatos rák megelõzésére és/vagy kezelésére. A találmány tárgyát a HPV 52 L1 fehérjét kódoló szintetikus DNS-molekulák képezik. A szintetikus molekulák kodonjai úgy vannak megtervezve, hogy az élesztõsejt által preferált kodonokat alkalmazzuk. A találmány egy alternatív megvalósítási módjában a szintetikus molekula nukleotidszekvenciája meg van változtatva, hogy elimináljuk az élesztõ által felismert transzkripciós terminációs szignálokat. A szintetikus molekulák HP V52 L1 fehérje forrásaként alkalmazhatók, amelyek maguktól összeállítódhatnak VLP-kké. A VLP-ket VLP-alapú vakcinában alkalmazhatjuk. A találmány egy szemléltetõ megvalósítási módja olyan szintetikus nukleinsavmolekulát tartalmaz, amely a 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV 52 L1 fehérjét kódolja, amely nukleinsavmolekula nukleotidok olyan szekvenciáját tartalmazza, amely kodonoptimalizálva van élesztõsejtben történõ expresszáltatásra. 2

3 1 HU T2 2 A találmány tárgyát képezik rekombináns vektorok és rekombináns gazdasejtek is, prokarióták és eukarióták egyaránt, amelyek a leírásban feltárt nukleinsavmolekulákat tartalmazzák. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a gazdasejt élesztõsejt. A találmány tárgyát képezi eljárás is HPV 52 L1 fehérje expresszáltatására rekombináns gazdasejtben, amely magában foglalja a következõket: (a) HPV 52 L1 fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmazó vektor bejuttatása élesztõgazdasejtbe; és (b) az élesztõgazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik az HPV 52 L1 fehérje expresszálódását. A találmány tárgyát képezi eljárás is HPV 52 L1 fehérje expresszáltatására rekombináns gazdasejtben, amely magában foglalja a következõket: (a) HPV 52 L1 fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmazó vektor bejuttatása élesztõgazdasejtbe, ahol a nukleinsavmolekula kodonoptimalizálva van az élesztõgazdasejtben történõ optimális expresszáltatásra; és (b) az élesztõgazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik az HPV 52 L1 fehérje expresszálódását. Elõnyös megvalósítási módok szerint a nukleinsavmolekula nukleotidok 1. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvenciáját (amelyet a leírásban 52 L1 R szekvenciának nevezünk) tartalmazza. A találmány tárgyát képezik HPV 52 vírusszerû részecskék (VLP) is, amelyek élesztõsejtekben vannak elõállítva, eljárások HPV 52 VLP¹k elõállítására és eljárások HPV 52 VLP¹k alkalmazására. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint az élesztõ a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe. A találmány egy másik aspektusa HPV 52 VLP, ahol a VLP HPV 52 L1 vagy HPV 52 L1+L2 élesztõsejtben történõ rekombináns expresszáltatásával van elõállítva. A találmány még másik aspektusa HPV 52 VLP, amely kodonoptimalizált HPV 52 L1 gén által termelt HPV 52 L1 fehérjét tartalmaz. A találmány ezen aspektusának egy szemléltetõ megvalósítási módja szerint a kodonoptimalizált HPV 52 L1 gén nukleotidok 1. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvenciáját tartalmazza. A találmány tárgyát képezi eljárás is immunválasz indukálására állatban, amely magában foglalja HPV 52 vírusszerû részecskék beadását az állatnak. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a HPV 52 VLP¹k kodonoptimalizált génrõl vannak termeltetve. A találmány még másik aspektusa eljárás HPV-vel kapcsolatos méhnyakrák megelõzése vagy kezelése, amely magában foglalja HPV 52 VLP-ket tartalmazó vakcina emlõsnek történõ beadását. A találmány ezen aspektusának egy elõnyös megvalósítási módja szerint a HPV 52 VLP¹k élesztõben vannak termeltetve A találmány tárgyát képezik HPV 52 vírusszerû részecskéket (VLP) tartalmazó vakcina is, ahol a HPV 52 VLP¹k élesztõben vannak elõállítva. A találmány ezen aspektusának egy alternatív megvalósítási módja szerint a vakcina továbbá tartalmazza legalább egy további HPV-típus VLP¹it is. A legalább egy további HPV-típus bármilyen jelentõséggel bíró HPV-típus lehet, beleértve a szakterületen ismert bármilyen HPV típust vagy késõbbiekben azonosítottakat is. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a HPV-típus olyan típus, amely klinikai fenotípussal kapcsolatos, mint például szemölcsökkel vagy méhnyakrákkal. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a legalább egy további HPV-típus a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: HPV6, HPV¹11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 és HPV68. A találmány tárgyát képezik HPV 52 vírusszerû részecskéket tartalmazó készítmények is, ahol a HPV 52 VLP¹k élesztõben vannak elõállítva. Továbbá a találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények is, amelyek HPV 52 VLP-ket és legalább egy további HPV-típus VLP¹it tartalmazzák. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a legalább egy további HPV-típus a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 és HPV68. A leírásban és a csatolt igénypontokban a határozatlan és határozott névelõ egyes számú formái magától értetõdõen magukban foglalják a többes számú referenciákat, amennyiben a tartalom nyilvánvalóan másként nem követeli meg. A leírásban és a mellékelt igénypontokban a következõ definíciókat és rövidítéseket alkalmazzuk: A promoter kifejezés alatt felismerési helyet értünk a DNS-szálon, amelyhez az RNS-polimeráz kötõdik. A promoter iniciációs komplexet alkot az RNS-polimerázzal, hogy iniciálja és irányítsa a transzkripciós aktivitást. A komplex módosítható aktiváló szekvenciák által, amelyeket enhanszereknek vagy upstream aktiváló szekvenciáknak nevezünk, vagy gátló szekvenciákkal, amelyeket szilenszereknek nevezünk. A vektor kifejezés alatt olyan eszközt értünk, amely által DNS-fragmenseket lehet bejuttatni gazdaszervezetbe vagy gazdaszövetbe. Különféle típusú vektorok vannak, beleértve plazmidok, vírusok (beleértve adenovirus), bakteriofágok és kozmidok. A kazetta kifejezés alatt olyan nukleotid- vagy génszekvenciát értünk, amely vektorról expresszálandó, például a HPV 52 L1 fehérjét kódoló nukleotid- vagy génszekvencia. Általában a kazetta olyan vektorba inszertált génszekvenciát tartalmaz, amely bizonyos megvalósítási módokban a nukleotid- vagy génszekvencia expresszáltatására szolgáló szabályozószekvenciákat biztosít. Más megvalósítási módokban a nukleotid- vagy génszekvencia biztosítja az expresszálódásához szükséges a szabályozószekvenciákat. További megvalósítási módokban a vektor biztosít néhány szabályozószekvenciát és a nukleotid- vagy génszekvencia biztosít 3

4 1 HU T2 2 más szabályozószekvenciákat. Például a vektor biztosíthatja a nukleotid- vagy génszekvencia transzkripciójához a promotert és a nukleotid- vagy génszekvencia biztosítja a transzkripció terminációs szekvenciát. A vektor által biztosított szabályozószekvenciák nem korlátozó példái közé tartoznak enhanszerek, transzkripciós terminációs szekvenciák, splice akceptor és donor szekvenciák, intronok, riboszómakötõ szekvenciák és poli(a) addíciós szekvenciák. Az 52 L1 vad típusú szekvencia és 52 L1 wt szekvencia megnevezések az itt 3. azonosító számú szekvenciaként feltárt HPV 52 L1 szekvenciára vonatkoznak. Habár a HPV 52 L1 vad típusú szekvenciát korábban ismertették, nem szokatlan kisebb szekvenciavariációk megléte klinikai izolátumokból nyert DNS¹ek között. Tehát izoláltunk egy reprezentatív HPV 52 L1 vad típusú szekvenciát olyan klinikai mintákból, amelyekrõl korábban kimutatták, hogy tartalmaznak HPV 52 DNS¹t (lásd az 1. példát). A HPV 52 L1 vad típusú szekvenciát alkalmaztuk referenciaszekvenciaként a leírásban feltárt kodonoptimalizált HPV 52 L1 szekvenciák összehasonlítására (lásd az 1. ábrát). A HPV 52 L1 R és 52 L1 R megnevezések szemléltetõ szintetikus HPV 52 L1 nukleotidszekvenciára vonatkoznak (1. azonosító számú szekvencia), amit a leírásban tárunk fel, ahol a szekvencia újra fel lett építve oly módon, hogy olyan kodonokat tartalmaz, amelyek preferáltak élesztõsejtek általi magas szintû expresszióra. A hatásos mennyiség kifejezés elegendõ vakcinakészítmény bejuttatását jelenti ahhoz, hogy a polipeptid megfelelõ szintjét hozza létre, oly módon, hogy immunválasz legyen az eredmény. A szakember számára nyilvánvaló, hogy ez a szint különbözõ lehet. Konzervatív aminosavszubsztitúció alatt egy aminosav-oldalláncnak egy másik, kémiailag hasonló aminosav-oldallánccal való helyettesítését értjük. Ilyen konzervatív szubsztitúciók példái: egy hidrofób oldallánc (izoleucin, leucin, valin vagy metionin) szubsztitúciója egy másikkal; egy poláros oldallánc szubsztitúciója egy másik azonos töltésû poláros oldallánccal (például arginin lizin helyett; glutaminsav aszparaginsav helyett). Az emlõs kifejezés alatt bármilyen állatot értünk, beleértve az embert is. VLP vagy VLP¹k alatt vírusszerû részecskét vagy vírusszerû részecskéket értünk. A szintetikus kifejezés azt jelenti, hogy az HPV 52 L1 gén oly módon lett létrehozva, hogy nukleotidok olyan szekvenciáját tartalmazza, amelyek nem azonosak a természetben elõforduló vad típusú HPV 52 L1 génben (52 L1 wt, 3. azonosító számú szekvencia) jelen lévõ nukleotidok szekvenciájával. Amint fent mondtuk, a leírás szerint olyan szintetikus molekulákat biztosítunk, amelyek élesztõsejtekben történõ expresszáltatásnál preferált kodonokat tartalmazó nukleotidok szekvenciáját tartalmazzák. A találmány szerinti szintetikus molekulák ugyanazt az aminosavszekvenciát kódolják, mint vad típusú HPV 52 L1 gén (2. azonosító számú szekvencia) Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra olyan szekvencia egymás alá rendezést mutat be, ahol a nukleotidok meg lettek változtatva a találmány szerinti szintetikus HPV 52 L1 génben (1. azonosító számú szekvencia, jele 52 L1 R ) (lásd a 2. példát). A referenciaszekvencia az 52 L1 vad típusú szekvencia (3. azonosító számú szekvencia, jele 52 L1 wt ; lásd az 1. példát) A megváltoztatott nukleotidokat a megfelelõ helyükön jelezzük. A nukleotidszámot zárójelben adjuk meg. Az újjáépített 52 L1 szekvenciában azonos nukleotidokat pontokkal jelöljük. A 2. ábra az újjáépített szintetikus HPV 52 L1 kétszálú nukleinsavat (1. és 7. azonosító számú szekvencia) és egykódos aminosavszekvenciát (2. azonosító számú szekvencia) mutatja be. A nukleotidok számát a bal oldalon adjuk meg. A 3. ábra a HPV 52 L1 wt és HPV 52 L1 R transzkriptumok Northern-blotját mutatja be (lásd a 4. példát). A blotot az 52 L1 wt és az 52 L1 R szekvenciák ellen létrehozott DNSpróbák keverékével próbáztuk. A jobb oldali nyíl a teljes hosszúságú 52 L1 transzkriptum megjósolt pozícióját jelöli. Semmilyen hosszúságú transzkriptumot sem detektáltunk az 52 L1 wt RNS 5 és 10 g sávjaiban. Teljes hosszúságú transzkriptumok látszódnak az 52 L1 R esetében, az 5 és 10 g sávokban egyaránt. A 4. ábra a HPV 52 L1 wt (52 wt) és 52 L1 R (52R) fehérjék Western-blotját mutatja be. A HPV 16 L1 alkalmaztuk referenciaként (16). 10, 5 és 2,5 mikrogramm totál élesztõ-fehérjekivonatot denaturáltunk és vittünk fel 10% SDS-PAGE gélre. A fehérjéket Westernmódon vittük át. Detektáltuk a HPV 52 L1 fehérjét a kapott bloton élesztõre abszorbeált anti-trpe-hpv 31 L1 kecske poliklonális antiszérummal, amely keresztreagál a HPV 52 L1¹el és HPV 16 L1¹el. A molekulatömeg-markereket kda-ban jelöljük a bal oldalon. A nyilak a ~55 kda HPV 52 L1 fehérje pozícióját jelölik. Az 5. ábra találmány szerinti HPV 52 L1 R fehérjemolekulákból álló HPV 52 VLP¹k reprezentatív mintáját mutatja be, transzmissziós elektronmikroszkópiával vizualizálva (lásd a 7. példát). A gömb alakú részecskék átmérõje ebben a nyers mintában 40 és 60 nm között változott, és némely részecske kapszomerek rendezett hálózatát mutatta. A vonal megközelítõleg 0,1 m¹t jelent. A találmány részletes leírása A méhnyakkarcinómák többsége humán papillomavírus (HPV) specifikus onkogén típusaival való fertõzéssel kapcsolatos. A találmány tárgyát készítmények 4

5 1 HU T és eljárások képezik onkogén HPV-típusok által expresszált fehérjetermékek elleni immunitás kiváltására és fokozására. Közelebbrõl a találmány tárgyát HPV 52 L1 fehérjét kódoló polinukleotidok képezik, ahol a polinukleotidok kodonoptimalizálva vannak élesztõben történõ magas szintû expresszióra. A találmány tárgyát képezik HPV52 vírusszerû részecskék (VLP) is, amelyek élesztõsejtben vannak elõállítva, és a találmány feltárja a polinukleotidok és VLP¹k alkalmazását immunogén készítményekben és vakcinákban HPV-vel kapcsolatos rák megelõzésére és/vagy kezelésére. A vad típusú HPV52 L1 nukleotidszekvenciájáról beszámoltak (Genbank hozzáférési száma: NC ). A találmány tárgyát a HPV 52 L1 fehérjét kódoló szintetikus DNS-molekulák képezik. A találmány egyik aspektusában a szintetikus molekula kodonok olyan szekvenciáját tartalmazza, ahol legalább a kodonok némelyike meg lett változtatva, hogy az élesztõsejt által magas szintû expresszióra preferált kodonokat alkalmazzuk. A találmány egy alternatív aspektusában a szintetikus molekula nukleotidszekvenciája meg van változtatva, hogy elimináljuk az élesztõ által felismert transzkripciós terminációs szignálokat. A szintetikus molekulák kódolószekvenciaként alkalmazhatók HPV52 L1 fehérje expressziójához, amelyek maguktól összeállítódhatnak VLP¹ké. A VLP¹k alkalmazhatók VLP-alapú vakcinában hatékony immunprofilaxis biztosítására papillomavírus-fertõzés ellen semlegesítõ ellenanyag és sejtközvetített immunitás révén. Ilyen VLP-alapú vakcinák hasznosak lehetnek már meglévõ HPV-fertõzések kezelésére is. A HPV VLP¹k expressziója élesztõsejtekben azzal az elõnnyel jár, hogy költséghatékony és könnyen adaptálható nagyléptékû tenyésztéshez fermentorokban. Ezenfelül az élesztõgenom könnyen megváltoztatható a megnövekedett tenyésztési és expressziós potenciálú rekombináns, transzformált élesztõ szelekciójának biztosítására. Azonban sok HPV L1 fehérje beleértve a HPV 52 L1¹et is olyan szinten expresszálódik élesztõsejtekben, ami alacsonyabb, mint ami kívánatos a kereskedelmi célú léptéknöveléshez (lásd a 2. példát). Ennek megfelelõen a találmány tárgyát olyan HPV 52 L1 génszekvenciák képezik, amelyek optimalizálva vannak élesztõsejtes környezetben történõ magas szintû expresszióra. A négy lehetséges nukleotidbázis triplett kodonja több mint 60 féle variáns alakban létezhet. Mivel ezek a kodonok csak 20 különbözõ aminosav számára biztosítják az üzenetet (valamint a transzkripciós iniciációhoz és terminációhoz), bizonyos aminosavakat több mint egy kodon kódolhat, amely jelenséget kodonredundanciaként ismerünk. Nem teljesen értett okokból az alternatív kodonok nem egységesen vannak jelen az különbözõ típusú sejtek endogén DNS-ében. Sõt, úgy tûnik, hogy variábilis természetes hierarchia vagy preferencia van bizonyos kodonok esetében bizonyos sejttípusokban. Például a leucin aminosavat hat DNS-kodon bármelyike határozza meg, a CTA, CTC, CTG, CTT, TTA és TTG. A mikroorganizmusok genomkodon használatának kiterjedt elemzése feltárta, hogy az E. coli endogén DNS¹e leggyakrabban a CTG leucint meghatározó kodont tartalmazza, míg az élesztõ és nyálkagombák DNS¹e leggyakrabban a TTA leucint meghatározó kodont tartalmazza. Ezen hierarchia láttán általában úgy vélik, hogy egy leucinban gazdag polipeptid E. coli-beli magas szintû expressziójának nagy valószínûségû elérése bizonyos mértékben függeni fog a kodonhasználat gyakoriságától. Például valószínû, hogy egy TTA kodonokban gazdag gén gyengén fog expresszálódni E. coli-ban, míg egy CTG-ben gazdag gén magas szinten fog expresszálódni ebben a gazdában. Hasonlóképpen, ez leucinban gazdag polipeptid élesztõgazdasejtben történõ expresszálódáshoz az elõnyös kodon a TTA lenne. A kodonpreferencia jelenség jelentõsége a rekombináns DNS-módszerekre kifejezett, és a jelenség megmagyarázhatja exogén gének magas szintû expressziója elérésének számos korábbi sikertelenségét sikeresen transzformált gazdaszervezetekben egy kevésbé preferált kodon lehet ismételten jelen a beinszertált génben, és a gazdasejt expressziós gépezete nem mûködhet megfelelõ hatékonyan. Ez a jelenség arra utal, hogy az elképzelt gazdasejtek preferált kodonjaival megtervezett szintetikus gének az idegen genetikai anyag optimális formáját biztosíthatják a rekombináns fehérjeexpresszió megvalósításához. Ily módon a találmány egyik aspektusa olyan HPV 52 L1 gén, amely kodonoptimalziálva van élesztõsejtekben történõ magas szintû expresszióhoz. A találmány egy megvalósítási módja szerint azt találtuk, hogy az ugyanazon fehérjeszekvenciát kódoló alternatív kodonok alkalmazása megszüntetheti a HPV 52 L1 fehérjék élesztõsejtek általi expressziójának akadályait. A találmány szerint HPV 52 L1 génszegmenseket alakítottunk át azonos transzlált szekvenciájú szekvenciákká, de alternatív kodonhasználattal, amint Sharp és Cowe ismertetik [ Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae, Yeast 7: oldal (1991)], amely hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. A módszer általánosságban olyan kodonok azonosítását foglalja magában a vad típusú szekvenciában, amelyek rendszerint nem kapcsolatosak magas szinten expresszálódó élesztõgénekkel, és azok helyettesítését az élesztõben való magas szintû expresszióhoz optimális kodonokkal. Az új génszekvenciákat azután megvizsgáljuk az ezen kodonhelyettesítésekkel keletkezett nemkívánatos szekvenciák jelenlétére (például ATTTA szekvenciák, intron splice felismerési helyek véletlen kialakulása, nemkívánatos restrikciós enzim helyek, magas GC¹tartalom, élesztõ által felismert transzkripciós terminációs szignálok jelenléte stb.). A nemkívánatos szekvenciákat elimináljuk a meglévõ kodonoknak ugyanazon aminosavat kódoló eltérõ kodonokkal történõ helyettesítésével. A szintetikus génszegmenst azután teszteljük a javított expresszióra. A fent ismertetett eljárást alkalmaztuk HPV 52 L1 szintetikus génszegmensek létrehozására, ami az élesztõsejtes környezetben való magas szintû expresszióra optimalizált kodonokat tartalmazó gént 5

6 1 HU T2 2 eredményez. Bár a fenti eljárás a módszerünk összefoglalását adja HPV-vakcinákban alkalmazható kodonoptimalizált gének tervezésére, a szakember számára nyilvánvaló, hogy hasonló vakcinahatékonyságot vagy gének megnövekedett expresszióját elérhetjük az eljárás kisebb variációival vagy a szekvencia kisebb variációival. Ennek megfelelõen a találmány tárgya olyan szintetikus polinukleotid, amely HPV 52 L1 fehérjét vagy biológiailag aktív fragmensét vagy mutáns formáját kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, és a polinukleotidszekvencia élesztõgazdasejtben való expresszióra optimalizált kodonokat tartalmaz. A HPV 52 L1 fehérje mutáns formáinak nem korlátozó példái közé tartoznak: konzervatív aminosavszubsztitúciók, aminosavterminális csonkolások, karboxiterminális csonkolások, deléciók vagy addíciók. Bármely ilyen biológiailag aktív fragmens és/vagy mutáns olyan fehérjét vagy fehérjefragmenst kódol, amely legalább lényegében imitálja a 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV 52 L1 fehérje immunológiai tulajdonságait. A találmány szerinti szintetikus polinukleotidok olyan mrns-molekulákat kódolnak, amelyek funkcionális HPV 52 L1 fehérjét expresszálnak, oly módon, hogy az hasznos terápiás vagy profilaktikus HPV-vakcina fejlesztésében. A találmány egyik aspektusa olyan kodonoptimalizált nukleinsavmolekula, amely a 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV 52 L1 fehérjét kódolja, amely nukleinsavmolekula olyan nukleotidok szekvenciáját tartalmazza, amelyek kodonoptimalizálva vannak élesztõsejtben történõ expresszáltatásra. A találmány ezen aspektusának egy elõnyös megvalósítási módja szerint a nukleinsavmolekula nukleotidok 1. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvenciáját tartalmazza. A találmány tárgyát képezik rekombináns vektorok és rekombináns gazdasejtek is, prokarióták és eukarióták egyaránt, amelyek a leírásban feltárt nukleinsavmolekulákat tartalmazzák. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a gazdasejt élesztõgazdasejt. A leírásban ismertetett eljárásokkal létrehozott szintetikus HPV 52 DNS¹t, funkcionális ekvivalenseit vagy fragmenseit rekombináns úton expresszáltathatjuk molekuláris klónozással olyan expressziós vektorba, amely alkalmas promotert és más megfelelõ transzkripciós szabályozóelemeket tartalmaz. Az expressziós vektort átvihetjük prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekbe a rekombináns HPV 52 L1 fehérje termeltetésére. Ilyen manipulációkra szolgáló módszereket részletesen ismertetnek a szakterületen (Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel és munkatársai, kiad.: Green Pub. Associates és Wiley-Interscience, New York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose és munkatársai, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990), amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik) Ily módon a találmány tárgyát képezi eljárás HPV 52 L1 fehérje expresszáltatására rekombináns gazdasejtben, amely magában foglalja a következõket: (a) HPV 52 L1 fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmazó vektor bejuttatása élesztõgazdasejtbe; és (b) az élesztõgazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik az HPV 52 L1 fehérje expresszálódását. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás HPV 52 L1 fehérje expresszáltatására rekombináns gazdasejtben, amely magában foglalja a következõket: (a) HPV 52 L1 fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmazó vektor bejuttatása élesztõgazdasejtbe; ahol a nukleinsavmolekula kodonoptimalizálva van az élesztõgazdasejtben történõ optimális expresszáltatásra; és (b) az élesztõgazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik az HPV 52 L1 fehérje expresszálódását. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás HPV 52 L1 fehérje expresszáltatására rekombináns gazdasejtben, amely magában foglalja a következõket: (a) 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleinsavat tartalmazó vektor bejuttatása élesztõgazdasejtbe; és (b) az élesztõgazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik az HPV 52 L1 fehérje expresszálódását. A találmány szerinti szintetikus géneket olyan expressziós kazettává állíthatjuk össze, amely a HPV 52 L1 fehérje gazdasejtben való hatékony expressziójának biztosítására megtervezett szekvenciákat tartalmaz. A kazetta elõnyösen tartalmazza a szintetikus gént, mûködõképesen kapcsoltan a kapcsolódó transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciákkal, mint például promoterrel és terminációs szekvenciákkal. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a promoter a S. cerevisiae GAL1 promoter, habár a szakember számára nyilvánvaló, hogy számos más ismert élesztõpromoter bármelyikét, mint például a GAL10, GAL7, ADH1, TDH3 vagy PGK promotereket, vagy más eukarióta promotereket alkalmazhatunk. Egy elõnyös transzkripciós terminátor az S. cerevisiae ADH1 terminátor, habár más ismert transzkripciós terminátorok is alkalmazhatók. A GAL1-promoter-ADH1-terminátor kombináció különösen elõnyös. A találmány egy másik aspektusa HPV 52 vírusszerû részecske (VLP), amely a HPV 52 L1 vagy HPV 52 L1+L2 élesztõsejtben történõ rekombináns expresszáltatásával van elõállítva, eljárások HPV 52 VLP¹k elõállítására és eljárások HPV 52 VLP¹k alkalmazására. A VLP¹k maguktól összeállítódhatnak, amikor az L1 a humán vagy állati papillomavírusok fõ kapszidfehérjéje expresszálódik élesztõsejtekben, rovarsejtekben, emlõssejtekben vagy baktériumokban [összefoglalásért lásd Schiller és Roden, Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses ; szerk.: Lacey, kiad.: Leeds, UK: Leeds Medical Information, old. (1996)]. Morfológiailag megkülönböztethetetlen HPV VLP-ket állíthatunk elõ az L1 és L2 kapszidfehérjék kombinációjának expresszáltatásával is. A VLP¹k L1 72 pentamerjébõl állnak T=7 ikoza- 6

7 1 HU T2 2 hedrális szerkezetben [Baker és munkatársai, Biophys. J. 60(6): oldal (1991)]. A VLP¹k morfológiailag hasonlítanak a valódi virionokhoz, és képesek semlegesítõ ellenanyagok magas titerének kiváltására, amikor állatnak beadják. Nyulak [Breitburd és munkatársai, J. Virol. 69(6): oldal (1995)] és kutyák [Suzich és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(25): oldal (1995)] immunizálása VLP-kkel megmutatta, hogy mindkettõ esetben semlegesítõ ellenanyagok indukálódnak, és védenek a kísérletes papillomavírus-fertõzéssel szemben. Emellett felnõtt nõk HPV 16 VLP-kel történõ immunizálásáról kimutatták, hogy védenek a HPV 16 fertõzés és HPV 16 méhnyak intraepithelialis neoplázia ellen [Koutsky és munkatársai N. Engl. J. Med. 347: oldal (2002)]. Mivel a VLP¹k nem tartalmazzák a potenciálisan onkogén virális genomot és képesek saját maguktól összeállítódni, amikor egyetlen génrõl expresszálódnak, biztonságos alternatívát képviselnek az élõ vírus alkalmazásával szemben a HPV-vakcina-fejlesztésben [összefoglalásért lásd Schiller és Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: oldal (2000)]. Ily módon a találmány tárgyát olyan vírusszerû részecskék képezik, amelyek HPV 52 rekombináns L1 fehérjéjébõl vagy rekombináns L1+L2 fehérjéibõl állnak, ahol a rekombináns fehérje élesztõsejtben van expresszáltatva. Amint fent elmondtuk, a találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a HPV 52 VLP¹k élesztõben vannak elõállítva. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az élesztõ a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe. A találmány egy másik aspektusa HPV 52 VLP, amely kodonoptimalizált HPV 52 L1 gén által termelt HPV 52 L1 fehérjét tartalmaz. A találmány ezen aspektusának egy elõnyös megvalósítási módja szerint a kodonoptimalizált HPV 52 L1 gén nukleotidok 1. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvenciáját tartalmazza. A találmány egy még másik aspektusa eljárás HPV 52 VLPák elõállítására, amely magában foglalja a következõket: (a) élesztõ transzformálása HPV 52 L1 fehérjét vagy HPV 52 L1+L2 fehérjéket kódoló rekombináns DNS-molekulával; (b) a transzformált élesztõ tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik a rekombináns DNS-molekula expresszióját a rekombináns HPV 52 fehérje termeléséhez; és (c) a rekombináns HPV 52 fehérje izolálása HPV52 VLP¹k elõállításához. A találmány ezen aspektusának egy elõnyös megvalósítási módja szerint az élesztõ kodonoptimalizált HPV 52 L1 génnel van transzformálva HPV 52 VLP¹k elõállítására. Egy különösen elõnyös megvalósítási mód szerint a kodonoptimalizált HPV 52 L1 gén nukleotidok 1. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvenciáját tartalmazza A találmány tárgyát képezi eljárás is immunválasz indukálására állatban, amely magában foglalja HPV 52 vírusszerû részecskék beadását az állatnak. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a HPV 52 VLP¹k HPV 52 L1¹et vagy HPV 52 L1+L2¹t kódoló kodonoptimalizált gén rekombináns expresszáltatásával vannak elõállítva. A találmány még másik aspektusa eljárás HPV-vel kapcsolatos méhnyakrák megelõzése vagy kezelése, amely magában foglalja HPV 52 VLP-ket tartalmazó vakcina emlõsnek történõ beadását. A találmány ezen aspektusának egy elõnyös megvalósítási módja szerint a HPV 52 VLP¹k élesztõben vannak termeltetve. A találmány tárgyát képezi HPV 52 vírusszerû részecskéket (VLP) tartalmazó vakcina is. A találmány ezen aspektusának egy alternatív megvalósítási módja szerint a vakcina továbbá tartalmazza legalább egy további HPV-típus VLP¹it is. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a legalább egy további HPV-típus a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 és HPV 68. A találmány ezen aspektusának egy elõnyös megvalósítási módja szerint a vakcina HPV 16 VLP-ket is tartalmaz. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint a vakcina HPV 16 VLP-ket és HPV 18 VLP-ket is tartalmaz. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint a vakcina HPV 6 VLP-ket és HPV 11 VLPket, HPV 16 VLP-ket és HPV 18 VLP-ket is tartalmaz. A találmány tárgyát képezi HPV 52 vírusszerû részecskéket tartalmazó gyógyászati készítmény is. Továbbá a találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények is, amelyek HPV 52 VLP-ket és legalább egy további HPV-típus VLP¹it tartalmazzák. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a legalább egy további HPVtípus a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 és HPV 68. A találmány szerinti vakcinakészítményeket egyedül alkalmazhatjuk megfelelõ dózisokban, amelyek lehetõvé teszik a HPV 52 fertõzés optimális gátlását minimális potenciális toxicitás mellett. Ezenfelül más szerek együttes vagy egymást követõ beadása is kívánatos lehet. A vakcinát kapó alanyba bejuttatandó vírusszerû részecskék mennyisége az expresszáltatott géntermék immunogenitásától függ. Általában körülbelül g, és elõnyösen körülbelül g immunológiailag vagy profilaktikusan hatásos dózisnyi VLP¹t adunk be közvetlenül az izomszövetbe. A találmány tárgykörébe tartozik szubkután injekció, intradermális bejuttatás, bõrön keresztül történõ hatás, és a beadás más módjai, mint például intraperitoneális, intravénás vagy inhalációs bejuttatás is. A találmány tárgykörébe tartozik, hogy megerõsítõ vakcinálást is alkalmazhatunk. A parenterális beadás, mint például intravénás, 7

8 1 HU T2 2 intramuszkuláris, szubkután vagy más beadási módok adjuvánssal, mint például alumínium vagy Merck alumíniumadjuváns, együtt vagy egymás után a találmány szerinti vakcina parenterális beadásával szintén elõnyös. Az összes, leírásban említett publikáció hivatkozás útján a kitanítás részét képezi azon módszerek és anyagok ismertetése és feltárása céljából, amelyek alkalmazhatók a jelen találmánnyal kapcsolatban. A leírásban semmi sem értelmezhetõ annak elismeréseként, hogy a találmány nem elõzi meg ezen feltárásokat korábbi feltalálás révén. A találmány elõnyös megvalósítási módjainak a mellékelt ábrákra való hivatkozással történõ ismertetése után nyilvánvaló, hogy a találmány nem korlátozódik azokra a pontos megvalósítási módokra, és a szakember különféle változtatásokat és módosításokat hajthat végre anélkül, hogy eltérne a mellékelt igénypontokban meghatározott oltalmi körtõl és annak szellemiségétõl. A következõ példák illusztrálják, de nem korlátozzák a találmányt példa Reprezentatív HPV 52 L1 szekvencia meghatározása A HPV 52 L1 szekvenciát korábban már leírták (Genbank hozzáférési száma: NC ). Nem szokatlan azonban, hogy kisebb szekvenciavariációkat találnak a klinikai izolátumokból nyert DNS¹ek között. A reprezentatív HPV 52 L1 vad típusú szekvencia meghatározásához DNS¹t izoláltunk három különbözõ klinikai mintából, amelyekrõl korábban kimutatták, hogy tartalmaznak HPV 52 DNS¹t. A HPV 52 L1 szekvenciákat amplifikáltuk polimeráz-láncreakcióban (PCR) a Taq DNS-polimeráz és a következõ láncindítók alkalmazásával: 5 L1 5 ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT¹3 (4. azonosító számú szekvencia) és 3 52 Bgl II 5 ¹GA- GATCTCAATTACACAAAGTG¹3 (5. azonosító számú szekvencia). Az amplifikált termékeket agarózgélen elektroforetizáltuk és láthatóvá tettük etídium-bromidfestéssel. Az 1500 bp L1 csíkokat kivágtuk és a DNS¹t megtisztítottuk Geneclean Spin Kit (Q¹Bio Gene, Carlsbad, CA) reagenskészlet alkalmazásával. A DNS¹t azután beligáltuk a pcr2.1 TA klónozóvektorba (Invitrogen). TOP10F E. coli-sejteket transzformáltunk a ligációs eleggyel, és szélesztettük ampicillinnel és IPTG-vel és X¹gal-lal kiegészített LB agarra a kolóniák kék/fehér szelektáláshoz. A csészéket megfordítottuk és 16 órán keresztül inkubáltuk 37 C¹on. Kolónia-PCR¹t hajtottunk végre öt fehér kolónián, amelyek a három PCR-rel amplifikált klinikai izolátumból származtak. 5 L1 és 3 52 Bgl II láncindítókat kétlépéses PCR-ben, amelyben az elsõ lépés 10 ciklust tartalmazott 96 C¹on 15 másodpercen keresztül (denaturálás), 55 C¹on 30 másodpercen keresztül (anneálás) és 68 C¹on 2 percen keresztül (lánchosszabbítás), és a második lépés 35 ciklust tartalmazott lényegében hasonló programon, kivéve hogy az anneálási lépést 50 C¹on végeztük 30 másodpercen keresztül. A PCRtermékeket agarózgélen elektroforetizáltuk és láthatóvá tettük etídium-bromid-festéssel. Az egyes klinikai izolátumokból származó számos kolónia tartalmazott 1500 bp méretû csíkokat. A kolóniákat kitenyésztettük kanamicint tartalmazó LB tápközegen, rázatás mellett 37 C¹on 16 órán keresztül. Miniprepeket készítettünk a plazmid-dns extrahálására, amelyeket megemésztettünk restrikciós endonukleázokkal az L1 génnek a plazmidon való jelenlétének a demonstrálására. A kapott restrikciós fragmenseket agarózgél-elektroforézissel és a etídium-bromid-festéssel tettük láthatóvá. A három klinikai izolátumból származó klónozott L1 inszerteket tartalmazó plazmidokon DNS-szekvenálást végeztünk. A DNS- és transzlált aminosavszekvenciákat összehasonlítottuk egymással és a Genbank HPV 52 L1 szekvenciákkal. A három klinikai izolátum szekvenciaelemzése megmutatta, hogy egyik sem volt azonos a Genbank-szekvenciával (hozzáférési száma: NC ). A pcr2.1 HPV 52L1 #2C klónt választottuk ki reprezentatív HPV 52 L1 szekvenciának, és a leírásban 52 L1 vad típusú szekvenciaként hivatkozunk rá (3. azonosító számú szekvencia, lásd az 1. ábrát). Az 52 L1 vad típusú (wt) szekvenciaként kiválasztott szekvencia egy pontmutációt tartalmazott, amikor összehasonlítottuk a Genbank-szekvenciával, amely egy csendes mutáció volt az nukleotidnál (adenin guanin). A HPV 52 L1 wt szekvencia aminosavszekvenciája azonos volt az 52 L1 Genbank-szekvenciával. A HPV 52 L1 vad típusú szekvenciát amplifikáltuk az 5 L1 Bgl II láncindító [5 GAGATCTCACAAAA- CAAAATGTCCGTGTGGC 3 (6. azonosító számú szekvencia)] és a fent ismertetett 3 52 Bgl II láncindító alkalmazásával, hogy egy Bgl II hosszabbítást adjunk hozzá. A PCR¹t Taq-polimeráz alkalmazásával végeztük. A PCR-terméket agarózgélen elektroforetizáltuk és láthatóvá tettük etídium-bromid-festéssel. A ~1500 bp méretû csíkot kivágtuk, és a DNS¹t megtisztítottuk a Geneclean Spin kit (Q¹Bio Gene, Carlsbad, CA) reagenskészlet alkalmazásával. A PCR-terméket az után beligáltuk a pcr2.1 vektorba és TOP10F sejteket transzformáltunk a ligációs eleggyel. A fehér kolóniákat kitenyésztettük kanamicint tartalmazó LB tápközegen, rázatás mellett 37 C¹on 16 órán keresztül. Miniprepeket készítettünk a plazmid/dns extraháláshoz. A HPV 52 L1 gént Bgl II restrikciós endonukleázos emésztéssel szabadítottuk fel a vektorszekvenciákból. A megemésztett DNS¹t agarózgélen elektroforetizáltuk és láthatóvá tettük etídium-bromid-festéssel. Az L1 csíkot megtisztítottuk a Geneclean reagenskészlet alkalmazásával és beligáltuk defoszforilált, BamHI-emésztett pgal110 vektorba. TOP10F E. coli-sejteket transzformáltunk a ligációs eleggyel. A HPV 52 L1 inszert helyes irányítottságának szkrínelésére a kolóniákból származó plazmid-dns¹t PCR¹el amplifikáltuk. DNSszekvenálást végeztünk az inszertek szekvenciájának és irányítottságának igazolására. A kiválasztott klónt pgal110-hpv 52L1 #5¹nek neveztük el. A kiválasztott klónból Maxiprep DNS¹t preparáltunk. Saccharomyces cerevisiae-sejteket tettünk kompetenssé Glusulase ¹zal végzett szferoplasztizálással, és transzfor- 8

9 1 HU T2 2 máltunk a pgal110-hpv 52L1 #5¹tel. Az élesztõ transzformációs elegyet Leu( ) szorbitol topagarban szélesztettük Leu( ) szorbitolcsészékre, és felfordítva inkubáltuk 3 5 napon keresztül 30 C¹on. Kolóniákat szedtünk fel és kentünk szét izoláláshoz Leu( ) szorbitolcsészékre. Az izolált kolóniákat azt követõen felnövesztettük 5 ml 5 X Leu Ade szorbitol, 1,6% glükózés 4% galaktóztartalmú tápközegben forgatott csöves tenyészetekben 30 C¹on, hogy indukáljuk a HPV 52 L1 transzkripcióját és a fehérjeexpressziót példa Élesztõkodon-optimalizáció Az élesztõben preferált kodonokat már leírták [Sharp, Paul M és Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae., Yeast 7: oldal (1991)]. A HPV 52 L1 wt fehérje expressziója detektálható volt; azonban a transzkripció szintje nagyon alacsony volt és nem volt detektálható Northern-blottal. Azt feltételeztük, hogy az érés elõtti transzkripciós termináció lehet felelõs a HPV 52 L1 gén alacsony expressziós szintjéért. A gén transzkripciójának növelésére és annak biztosítására, hogy teljes hosszúságú transzkriptumok keletkezzenek, az HPV 52 L1 gént újra felépítettük élesztõben preferált kodonok alkalmazásával. A szekvenciát megvizsgáltuk az élesztõ által felismert élesztõ terminációs szignálok jelenlétére, és ezeket a szekvenciákat elimináltuk alternatív kodonokkal történõ szubsztitúcióval, miközben megõriztük ugyanazt az aminosavszekvenciát. Az újra felépített HPV 52 L1 szekvencia amely élesztõre kodonoptimalizált szekvenciákat tartalmaz 379 nukleotidváltozást tartalmaz a vad típusú HPV 52 L1 wt szekvenciához hasonlítva. A kapott szekvenciát a leírásban 52 L1 R (R= rebuild, lásd az 1. ábrát) nevezzük. Az 52 L1 wt (3. azonosító számú szekvencia) és az 52 L1 R (1. azonosító számú szekvencia) szekvenciák közötti változásokat az 1. ábrán mutatjuk be. Az 58 L1 R aminosavszekvenciája nem változott meg (2. azonosító számú szekvencia, lásd a 2. ábrát). Az újjáépített szekvencia megnövekedett HPV 52 L1 fehérjeexpressziót biztosít, amely szignifikáns elõrelépés a vad típushoz képest vakcinafejlesztésben történõ alkalmazásra. Az optimalizált gén elõállításához alkalmazott stratégia az volt, hogy hosszú átfedõ szensz és antiszensz oligomereket terveztünk, amelyek lefedik a gént, szubsztituálva a nukleotidokat az élesztõben preferált kodonszekvenciákkal, miközben megtartottuk az eredeti aminosavszekvenciát. Ezeket az oligomereket alkalmaztuk a templát-dns helyett Pfu DNS-polimerázzal végzett PCR-reakcióban. További amplifikációs láncindítókat terveztünk és alkalmaztunk az újrafelépített szekvenciák templátoligomerekrõl történõ amplifikálására. Az amplifikáció optimális körülményei szekcióspecifikusak voltak; azonban a legtöbb alkalmazott program az alábbira hasonlított: 94 C 5 percen keresztül (denaturáció), majd 25 ciklus: 95 C 30 másodpercen keresztül (denaturáció), C 30 másodpercen keresztül (anneálás), és 72 C 1,5 percen keresztül (lánchosszabbítás), majd 7 perc végsõ lánchosszabbítás 72 C¹on és 4 C¹on tartva. A PCR-termékeket agarózgélelektroforézissel vizsgáltuk meg. A megfelelõ méretû csíkokat kivágtuk és a DNS¹t megtisztítottuk a géldarabból. Az amplifikált fragmenseket azután templátként alkalmaztuk az 1512 nukleotid hosszúságú újrafelépített HPV 52 L1 gén összeállításához. Az újjáépítést követõen az 1512 nt méretû csíkot megtisztítottuk a gélbõl, és beligáltuk pcr4 Blunt vektorba (Invitrogen, Carlsbad, CA). A ligálást követõen kompetens E. coli TOP10 sejteket transzformáltunk a ligációs eleggyel. Kolóniákat tenyésztettünk 4 ml, ampicillint tartalmazó LB tápközegben, és plazmid-dns¹t extraháltunk a kolóniákból miniprep módszerekkel. A plazmid-dns¹t megszekvenáltuk, hogy igazoljuk az újrafelépített HPV 52 L1 kívánt változásainak jelenlétét. BamHl hosszabbítások mindkét véghez való hozzáadására az 52 L1 R ( rebuild ) szekvenciát újraamplifikáltuk a pcr4blunt¹52 L1 R¹bõl. Az amplifikált fragmenst klónoztuk mint fent, és a kapott plazmidot megszekvenáltuk. A plazmidot pcr4 Blunt¹52 L1 R (Bam) megemésztettük BamHI-lel és a kapott DNSfragmens-inszertet elektroforetizáltuk agarózgélen. A ~1530 bp méretû HPV 52 L1R (Bam) fragmenst gélen megtisztítottuk, és beligáltuk BamHI-emésztett pgal110¹be. TOP10F E. coli (Invitrogen) sejteket transzformáltunk a ligációs eleggyel. A kapott kolóniákat PCR-rel szkríneltük a HPV 52 L1 R inszert helyes irányítottságban való jelenlétére. A szekvenciát és az irányítottságot DNS-szekvenálással igazoltuk. Maxiprep plazmid-dns¹t preparáltunk. S. cerevisiae-sejteket tettünk kompetenssé szferoplasztizálással, és transzformáltunk. Az élesztõtranszformációt Leu- szorbitol topagarban szélesztettük Leuszorbitolcsészékre, és felfordítva 7 napon keresztül inkubáltuk. Kolóniákat szedtünk fel és kentünk szét klonális izoláláshoz Leu- szorbitolcsészékre. Az izolált kolóniákat azt követõen felnövesztettük 5 ml 5 X Leu- Ade- szorbitol, 1,6% glükóz- és 4% galaktóztartalmú tápközegben forgatott csöves tenyészetekben 30 C¹on, hogy indukáljuk az L1 transzkripcióját és a fehérjeexpressziót. 48 óra elteltével az OD 600 =10-nek megfelelõ térfogatú tenyészetet lecentrifugáltunk, a felülúszót eltávolítottuk és a csapadékot lefagyasztottuk 70 C¹on. 3. példa RNS-preparálás A HPV 52 L1 expresszálására galaktózindukálással indukált transzformált élesztõ sejtcsapadékát felolvasztottuk jégen, felszuszpendáltuk 0,8 ml Trizol reagensben (Life Technologies, Gibco BRL) és szobahõmérsékleten inkubáltuk 5 percen keresztül. Egyötöd térfogatnyi kloroformot adtunk a csõbe. Azután erõteljesen felráztuk 15 másodpercen keresztül, hogy összekeverjük, és szobahõmérsékleten inkubáltuk 3 percen keresztül. 5 perc 13 k rpm centrifugálás után a felsõ fázist összegyûjtöttük, és átvittük egy új csõbe. 0,4 ml izopropanolt adtunk a csõbe. A keveréket szobahõmérsékle- 9

10 1 HU T2 2 ten inkubáltuk 10 percen keresztül. Az RNS kicsapására centrifugálást végeztünk 13 k rpm¹en 10 percen keresztül. A felülúszót dekantáltuk, az RNS-csapadékot megmostuk 75% EtOH-val, és a centrifugálást megismételtük. A felülúszót dekantáltuk és az RNS-csapadékot hagytuk levegõn megszáradni 15 percen keresztül, majd felszuszpendáltuk RNáz-mentes vízben. Spektrofotometriásan meghatároztuk az RNS koncentrációját a mintában azt feltételezve, hogy az l¹es A 260 -érték=40 g/ml RNS, amikor az A 260 / 280 arány 1,7 2,0. 4. példa Northern-blot elemzés 1,1%¹os formaldehides agarózgélt öntöttünk g RNS¹t kombináltunk denaturálópufferrel (végkoncentrációk: 6% formaldehid, 50% formamid és 0,1 MOPS) és felhevítettük 65 C¹ra 10 percen keresztül. Egytized térfogatnyi gélfelviteli puffert adtunk hozzá, és a mintát felvittük a gélre. Az elektroforézist 75 V¹on hajtottuk végre 1 MOPS pufferben ~3 órán keresztül. A gélt megmostuk 60 percen keresztül 10 SSC pufferben. Az RNS¹t kapillárishatás révén átvittük Hybond¹N+ nejlonmembránra (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 16 órán keresztül 10 SSC-ben. Azután az RNS¹t rögzítettük a nejlonmembránra Stratagene UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) készülék autokeresztkötési funkciójának alkalmazásával történõ keresztkötéssel. A rögzítés után a nejlonmembránt hagytuk megszáradni. A Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit I reagenskészletet (F. Hoffmann¹La Roche Ltd., Basel, Switzerland) alkalmaztuk az 52 L1 wt és 52 L1 R DNS-szekvenciák DIG-gel történõ jelölésére, amely próbaként alkalmazható 52 L1 wt és 52 L1 R RNS detektálására a Northern-bloton. A prehibridizációt, hibridizációt és az anti-dig alkalikus-foszfatázzal konjugált ellenanyaggal végzett immunfestést a gyártó javaslatait követve hajtottuk végre. Röviden, a blotot prehibridizáltuk 37 C¹on 30 percen keresztül gyengéd rázatás mellett. A próbát denaturáltuk 95 C¹ra 5 percen keresztül történõ hevítéssel és csillapítottuk jégen. A próbát hozzáadtuk a hibridizációs oldathoz és felvittük a membránra 4 órán keresztül 44,6 C¹on gyengéd rázatás mellett. Azután eltávolítottuk a hibridizációs oldatot, és a blotot kétszer megmostuk 5 percen keresztül 0,1% SDS¹t tartalmazó 2 SSC-ben szobahõmérsékleten, majd tovább mostuk 65 C¹on 0,5 SSC-vel és 0,1% SDS-sel. Azután a blotot blokkoltuk 30 percen keresztül, és anti-dig alkalikus-foszfatázzal konjugált ellenanyagot vittünk fel rá 1:5000 hígításban 30 percen keresztül. A blotot megmostuk és meghatároztuk a próbához kötõdött RNS jelenlétét az alkalikus foszfatázzal konjugált anti-dig kötött ellenanyag NBT/BCIP szubsztrátos detektálásával. Az 52 L1 wt¹t expresszáló élesztõ kezdeti elemzése arra utalt, hogy a HPV 52 L1 expresszálódott; azonban a szint alacsony volt. A HPV 52 L1 wt expresszálására indukált tenyészetekbõl származó élesztõextraktumokból származó RNS Northern-blot elemzése nem mutatott ki semennyi detektálható HPV 52 L1 RNS¹t. Mivel detektáltunk valamennyi megfelelõ méretû fehérjét, nyilvánvaló volt, hogy keletkezett valamennyi teljes hosszúságú transzkriptum. Az 52 L1 szekvenciát újrafelépítettük élesztõben preferált kodonszekvenciákkal, és úgy hoztuk létre, hogy elkerüljük a lehetséges korai transzkripciós terminációs helyeket a robusztus transzkripció biztosítására. Az 52 L1 R transzkriptum Northern-blot elemzése azt tárta fel, hogy teljes hosszúságú transzkriptumok jöttek létre és azok detektálhatók Northern-blot elemzéssel (3. ábra). 5. példa HPV 52 L1 fehérje-expresszió A galaktózzal indukált OD 600 =10 ekvivalens tenyészetek fagyasztott élesztõsejt-csapadékát felolvasztottuk jégen, és felszuszpendáltuk 300 l PC¹pufferben (100 mm Na 2 HPO 4 és 0,5 M NaCl, ph=7,0) 2 mm PMSF¹el. Savval megmosott 0,5 mm¹es üveggyöngyöket adtunk hozzá, ~0,5 g/csõ koncentrációban. A csöveket három 5 perces ciklusban felvortexeltük 4 C¹on 1 perces szünetekkel. 7,5 l 20% TritonX100¹at adtunk hozzá és a vortexelést megismételtük 5 percig 4 C¹on. A csöveket jégre helyeztük 15 percre, majd lecentrifugáltuk 10 percen keresztül 4 C¹on. A felülúszót átvittük steril mikrocentrifugacsövekbe, amelyeket felcímkéztünk teljes élesztõfehérje-extraktumként, dátumoztuk, és 70 C¹on tároltuk. 6. példa Western-blot-elemzés Az egyes HPV 52 L1 konstrukciókból származó 20 élesztõizolátumból való teljes fehérjeextraktumot Western-blottal elemeztük, hogy igazoljuk a HPV 52 L1 fehérje expresszióját galaktózindukálás után. 10, 5 és 2,5 mikrogramm totál élesztõfehérje-kivonatot denaturáltunk és vittünk fel 10% SDS-PAGE gélre SDS-PAGE mintafelvivõ pufferrel és felmelegítettük 95 C¹ra 10 percen keresztül. A HPV 16 L1 fehérjét amely megközelítõleg 55 kda méretû alkalmaztuk pozitív kontrollként, a HPV L1¹mentes teljes élesztõextraktum, mint negatív kontroll mellett (adatokat nem közlünk). A fehérjéket felvittük 10% SDS-PAGE gélre, és elektroforetizáltuk Tris-glicin pufferben. A fehérjék elválasztása után a fehérjéket Western-módon átvittük a gélbõl nitrocellulózra, és a kapott blotot blokkoltuk 1 hígítópufferben (Kirkegaard and Perry Laboratories) 1 órán keresztül szobahõmérsékleten rázatás mellett. A blotot háromszor megmostuk és azután inkubáltuk élesztõre abszorbeált kecske anti-trpe-hpv 31 L1 szérummal amely keresztreagál HPV 16 és HPV 52 L1 fehérjékkel szobahõmérsékleten 16 órán keresztül. Azután a blotot háromszor megmostuk, és inkubáltuk anti-kecske-hrp konjugált ellenanyag 1:2500 hígításával 1 órán keresztül. A blotot ismét megmostuk háromszor, és a NBT/BCIP detekciós szubsztrátot (Kirkegaard and Perry Laboratories) vittünk fel rá. Az immunreaktív fehérjéket lila csíkokként detektáltuk a blot¹on. Minden esetben a HPV 52 L1 fehérje különálló immunreaktív csíkként volt detektálható a nitrocellulózon 10

11 1 HU T2 2 megközelítõleg 55 kda méretben (4. ábra). A HPV 52 L1 R csík (2,5 g sáv) intenzitása láthatóan szignifikánsan erõsebb volt, mint a HPV 52 L1 wt csíké (10 g). Nyilvánvaló volt, hogy az újrafelépítés után a kodonoptimalizált HPV 52 L1 R expressziós szintje több mint 4¹szeresre növekedett, ami a Western-blot közvetlen összehasonlításának a detekciós limitje példa Transzmissziós elektronmikroszkópia Annak demonstrálására, hogy az 52 L1 fehérje valójában magától összeállítódott pentamer¹l1 kapszomereket alakítva ki, amelyek pedig maguktól összeállítódnak vírusszerû részecskékké, részlegesen megtisztított HPV 52 L1 R fehérjeextraktumot elemeztünk transzmissziós elektronmikroszkópiával (TEM). Élesztõsejteket tenyésztettünk kisléptékû fermentációs körülmények között és lecentrifugáltuk. A csapadékokat tisztítási kezeléseknek vetettük alá. A csapadékot és a feltisztított élesztõextraktumokat immunblottal elemeztük, hogy demonstráljuk a HPV 52 L1 fehérje expresszióját és a megmaradását a tisztítási eljárás folyamán. A feltisztított élesztõextraktumokat azután lecentrifugáltuk 45%¹os szukrózpárnán, és a kapott csapadékot pufferben felszuszpendáltuk a HPV 52 L1 VLP¹k TEM-mel végzett vizsgálathoz. A termelt HPV 52 L1 R VLP¹k egy reprezentatív mintáját az 5. ábrán mutatjuk be. A gömb alakú részecskék átmérõje ebben a nyers mintában 40 és 60 nm között változott, és némely részecske kapszomerek rendezett hálózatát mutatta. A szekvencialistában található szabad szövegek fordítása 1. azonosító számú szekvenciához: <223> HPV52L1R 4 6. azonosító számú szekvenciákhoz: <223> PCR láncindító 7. azonosító számú szekvenciához: <223> 52L1R antiszensz Szekvencialista <110> Merck & Co., Inc. <120> OPTIMIZED EXPRESSION OF HPV 52 L1 IN YEAST <130> PCT <150> 60/ <151> <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1512 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV52L1R <400> 1 atgtccgtct ggagaccatc cgaagctact gtctacttgc caccagttcc agtctctaag 60 gttgtctcta ccgacgaata cgtctccaga acctccatct actactacgc tggttcctct 120 agattgttga ctgtcggtca cccatacttc tctatcaaga acacctcctc cggtaacggt 180 aagaaggtct tggttccaaa ggtctctggt ttgcaataca gagtcttcag aatcaagttg 240 ccagacccaa acaagttcgg tttcccagac actagtttct acaacccaga aactcaaaga 300 ttggtctggg cttgtactgg tttggaaatc ggtagaggtc aaccattggg tgtcggtatc 360 tctggtcacc cattgttgaa caagttcgac gacactgaaa cctctaacaa gtacgctggt 420 aagccaggta tcgataacag agaatgtttg tctatggact acaagcaaac tcaattgtgt 480 atcttgggtt gtaagccacc aatcggtgaa cactggggta agggtactcc atgtaacaac 540 aactctggta acccaggtga ctgtccacca ttgcaattga tcaactccgt catccaagac 600 ggtgacatgg tcgacactgg tttcggttgt atggacttca acaccttgca agcttctaag 660 tccgacgtcc caatcgacat ctgttcctct gtctgtaagt acccagacta cttgcaaatg 720 gcttctgaac catacggtga ctccttgttc ttcttcttga gaagagaaca aatgttcgtc 780 agacacttct tcaacagagc tggtaccttg ggtgacccag ttccaggtga cttgtacatc

12 HU T2 caaggttcca actctggtaa cactgctact gtccaatcct ctgctttctt cccaactcca 900 tctggttcca tggtcacctc cgaatcccaa ttgttcaaca agccatactg gttgcaaaga 960 gctcaaggtc acaacaacgg tatctgttgg ggtaaccaat tgttcgtcac cgtcgtcgac 1020 actactagat ctactaacat gaccttgtgt gctgaagtca agaaggaatc cacctacaag 1080 aacgaaaact tcaaggaata cttgagacac ggtgaagaat tcgacttgca attcatcttc 1140 caattgtgta agatcacctt gaccgctgac gtcatgactt acatccacaa gatggacgct 1200 actatcttgg aagactggca attcggtttg actccaccac catccgcttc cttggaagac 1260 acttacagat tcgtcacttc cactgctatc acctgtcaaa agaacactcc accaaagggt 1320 aaggaagacc cattgaagga ctacatgttc tgggaagtcg acttgaagga aaagttctct 1380 gctgacttgg accaattccc attgggtaga aagttcttgt tgcaagctgg tttgcaagct 1440 agaccaaagt tgaagagacc agctagctct gctccaagaa cttccaccaa gaagaagaag 1500 gtcaagagat aa 1512 <210> 2 <211> 503 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 52 <400> 2 Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala The Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Gly Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glo Tyr Val Ser Arg Thr Ser Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys Asn Thr Ser Ser Gly Asn Gly Lys Lys Val Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile Lys Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Phe Asp Asp Thr Glu Thr Ser Asn Lys Tyr Ala Gly Lys Pro Gly Ile Asp Asn Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Pro Cys Asn Asn Asn Ser Gly Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Gln Leu Ile Asn Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe

13 HU T2 Gly Cys Met Asp Phe Asn Thr Leu Gln Ala Ser Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Ser Ser Val Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Thr Leu Gly Asp Pro Val Pro Gly Asp Leu Tyr Ile Gln Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Val Gln Ser Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Glu Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Ala Glu Val Lys Lys Glu Ser Thr Tyr Lys Asn Glu Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Lys Met Asp Ala Thr Ile Leu Glu Asp Trp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Thr Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asn Thr Pro Pro Lys Gly Lys Glu Asp Pro Leu Lys Asp Tyr Met Phe Trp Glu Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Gln Ala Arg Pro Lys Leu Lys Arg Pro Ala Ser Ser Ala Pro Arg Thr Ser Thr Lys Lys Lys Lys Val Lys Arg 500 <210> 3 <211>

14 HU T2 <212> DNA <213> Human Papillomavirus Type 52 <400> 3 atgtccgtgt ggcggcctag tgaggccact gtgtacctgc ctcctgtacc tgtctctaag 60 gttgtaagca ctgatgagta tgtgtctcgc acaagcatct attattatgc aggcagttct 120 cgattactaa cagtaggaca tccctatttt tctattaaaa acaccagtag tggtaatggt 180 aaaaaagttt tagttcccaa ggtgtctggc ctgcaataca gggtatttag aattaaattg 240 ccggacccta ataaatttgg ttttccagat acatcttttt ataacccaga aacccaaagg 300 ttggtgtggg cctgtacagg cttggaaatt ggtaggggac agcctttagg tgtgggtatt 360 agtgggcatc ctttattaaa caagtttgat gatactgaaa ccagtaacaa atatgctggt 420 aaacctggta tagataatag ggaatgttta tctatggatt ataagcagac tcagttatgc 480 attttaggat gcaaacctcc tataggtgaa cattggggta agggaacccc ttgtaataat 540 aattcaggaa atcctgggga ttgtcctccc ctacagctca ttaacagtgt aatacaggat 600 ggggacatgg tagatacagg atttggttgc atggatttta ataccttgca agctagtaaa 660 agtgatgtgc ccattgatat atgtagcagt gtatgtaagt atccagatta tttgcaaatg 720 gctagcgagc catatggtga cagtttgttc ttttttctta gacgtgagca aatgtttgtt 780 agacactttt ttaatagggc cggtacctta ggtgaccctg tgccaggtga tttatatata 840 caagggtcta actctggcaa tactgccact gtacaaagca gtgctttttt tcctactcct 900 agtggttcta tggtaacctc agaatcccaa ttatttaata aaccgtactg gttacaacgt 960 gcgcagggcc acaataatgg catatgttgg ggcaatcagt tgtttgtcac agttgtggat 1020 accactcgta gcactaacat gactttatgt gctgaggtta aaaaggaaag cacatataaa 1080 aatgaaaatt ttaaggaata ccttcgtcat ggcgaggaat ttgatttaca atttattttt 1140 caattgtgca aaattacatt aacagctgat gttatgacat acattcataa gatggatgcc 1200 actattttag aggactggca atttggcctt accccaccac cgtctgcatc tttggaggac 1260 acatacagat ttgtcacttc tactgctata acttgtcaaa aaaacacgcc acctaaagga 1320 aaggaagatc ctttaaagga ctatatgttt tgggaggtgg atttaaaaga aaagttttct 1380 gcagatttag atcagtttcc tttaggtagg aagtttttgt tacaggcagg gctacaggct 1440 aggcccaaac taaaacgccc tgcatcatcg gccccacgta cctccacaaa gaagaaaaag 1500 gttaaaaggt aa 1512 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 4 21 atgtccgtgt ggcggcctag t <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 5 22 gagatctcaa ttacacaaag tg <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence 14

15 1 HU T2 2 <220> <223> PCR Primer <400> 6 gagatctcac aaaacaaaat gtccgtgtgg c 31 <210> 7 <211> 1512 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 52L1R antisense <400> 7 tacaggcaga cctctggtag gcttcgatga cagatgaacg gtggtcaagg tcagagattc 60 caacagagat ggctgcttat gcagaggtct tggaggtaga tgatgatgcg accaaggaga 120 tctaacaact gacagccagt gggtatgaag agatagttct tgtggaggag gccattgcca 180 ttcttccaga accaaggttt ccagagacca aacgttatgt ctcagaagtc ttagttcaac 240 ggtctgggtt tgttcaagcc aaagggtctg tgatcaaaga tgttgggtct ttgagtttct 300 aaccagaccc gaacatgacc aaacctttag ccatctccag ttggtaaccc acagccatag 360 agaccagtgg gtaacaactt gttcaagctg ctgtgacttt ggagattgtt catgcgacca 420 ttcggtccat agctattgtc tcttacaaac agatacctga tgttcgtttg agttaacaca 480 tagaacccaa cattcggtgg ttagccactt gtgaccccat tcccatgagg tacattgttg 540 ttgagaccat tgggtccact gacaggtggt aacgttaact agttgaggca gtaggttctg 600 ccactgtacc agctgtgacc aaagccaaca tacctgaagt tgtggaacgt tcgaagattc 660 aggctgcagg gttagctgta gacaaggaga cagacattca tgggtctgat gaacgtttac 720 cgaagacttg gtatgccact gaggaacaag aagaagaact cttctcttgt ttacaagcag 780 tctgtgaaga agttgtctcg accatggaac ccactgggtc aaggtccact gaacatgtag 840 gttccaaggt tgagaccatt gtgacgatga caggttagga gacgaaagaa gggttgaggt 900 agaccaaggt accagtggag gcttagggtt aacaagttgt tcggtatgac caacgtttct 960 cgagttccag tgttgttgcc atagacaacc ccattggtta acaagcagtg gcagcagctg 1020 tgatgatcta gatgattgta ctggaacaca cgacttcagt tcttccttag gtggatgttc 1080 ttgcttttga agttccttat gaactctgtg ccacttctta agctgaacgt taagtagaag 1140 gttaacacat tctagtggaa ctggcgactg cagtactgaa tgtaggtgtt ctacctgcga 1200 tgatagaacc ttctgaccgt taagccaaac tgaggtggtg gtaggcgaag gaaccttctg 1260 tgaatgtcta agcagtgaag gtgacgatag tggacagttt tcttgtgagg tggtttccca 1320 ttccttctgg gtaacttcct gatgtacaag acccttcagc tgaacttcct tttcaagaga 1380 cgactgaacc tggttaaggg taacccatct ttcaagaaca acgttcgacc aaacgttcga 1440 tctggtttca acttctctgg tcgatcgaga cgaggttctt gaaggtggtt cttcttcttc 1500 cagttctcta tt 1512 SZABADALMI IGÉNYPONTOK Nukleinsavmolekula, amely nukleotidok olyan szekvenciáját tartalmazza, amely 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV52 L1 fehérjét kódol, és a nukleotidszekvencia nukleotidok 1. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciáját tartalmazza. 2. Vektor, amely 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz. 3. Gazdasejt, amely 2. igénypont szerinti vektort tartalmaz. 4. A 3. igénypont szerinti gazdasejt, ahol a gazdasejt élesztõsejt. 5. A 4. igénypont szerinti gazdasejt, ahol az élesztõsejt a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe. 6. A 4. igénypont szerinti gazdasejt, ahol a gazdasejt Saccharomyces cerevisiae. 7. Eljárás HPV52 L1 vírusszerû részecskék (VLP), elõállítására, amely magában foglalja a következõket: (a) élesztõ transzformálása 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekulával; (b) a transzformált élesztõ tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik a nukleinsavmolekula expresszióját a rekombináns papillomavírus-fehérje termeléséhez; és (c) a rekombináns papillomavírus-fehérje izolálása a HPV52 L1 VLP¹k létrehozásához. 15

16 1 HU T Eljárás HPV-asszociált méhnyakrák kezelésére vagy megelõzésére szolgáló vakcina elõállítására, amely eljárás magában foglalja HPV52 L1 VLP¹k 7. igénypont szerinti eljárással történõ elõállítását. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina legalább egy további HPV-típus VLP¹it is tartalmazza. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a legalább egy további HPV-típus a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 és HPV A 10. igénypont szerinti eljárás, ahol a legalább egy HPV-típus a HPV A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz HPV18 VLP-ket is. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz HPV6 VLP-ket és HPV11 VLP-ket is. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz HPV31 VLP-ket is. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz HPV45 VLP-ket is. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz HPV58 VLP-ket is. 16

17 HU T2 Int. Cl.: C07K 14/025 17

18 HU T2 Int. Cl.: C07K 14/025 18

19 HU T2 Int. Cl.: C07K 14/025 19

20 HU T2 Int. Cl.: C07K 14/025 20