3. gyakorlat: nukleinsav-tisztítás, polimeráz láncreakció

Átírás

1 3. gyakorlat: nukleinsav-tisztítás, polimeráz láncreakció A vírus genetikai anyagának vizsgálata (direkt víruskimutatási módszer) biztosítja a legrészletesebb és legspecifikusabb információkat a kimutatott kórokozóról. A nukleinsav vizsgálata számos módszerrel lehetséges, a gyakorlaton a (hagyományos) polimeráz láncreakciót (polymerase chain reaction [PCR]) mutatjuk be. A PCR egy vagy néhány DNS-molekula mesterséges megsokszorozására (amplifikációjára) használható módszer, mellyel a DNS meghatározott szakaszáról milliós nagyságrendű másolat készíthető. A PCR használata a virológiai diagnosztikában számos előnnyel és hátránnyal is jár. Előnyök: - gyors eljárás, óra alatt eredményt biztosít, - specifikus: a specifikus primerek használatával a mintában levő vírus azonosítható, - érzékeny: kis mennyiségű DNS is kimutatható, akár károsodott (autolizált) mintából, - a genom vizsgálatával részletes adatok nyerhetők a vírusról, melyek felhasználhatók a vírus azonosításában, rendszertani besorolásában, vírus-változatok összehasonlításában, vírusok evolúciójának vizsgálatában, molekuláris járványtani vizsgálatokban stb. Hátrányok: - különleges eszközöket, berendezéseket igényel - célzott vizsgálat (Csak azokat a vírusokat tudjuk kimutatni a mintából, amelyek detektálására alkalmas primereket használunk a reakcióban) - érzékeny: a kontamináció elkerülésére különös gondot kell fordítani! - fals negatív eredményeket kaphatunk (pl. a minta károsodott nukleinsavat tartalmaz, vagy inhibitorok vannak a mintában, mutáció lépett fel a vírusban: ezek mind befolyásolják a primerek tapadását) - fals pozitív eredményt kaphatunk (a primerek nem a megfelelő szakaszt erősítették fel; ezért az eredménynek önmagában nincs diagnosztikai értéke, csak kiegészítő vizsgálatként használható) A PCR-vizsgálatban a mintából kivont, tisztított nukleinsavat (NS) használjuk.

2 1. Nukleinsav-tisztítás (kivonás) - A minta proteináz K-val történő emésztése után a virális nukleinsav kivonásához speciális szűrőket, géleket vagy gyöngyöket is használhatunk, melyek kereskedelmi forgalomban, kitekben megvásárolhatók. Bár ez az eljárás jelentősen több műanyag-hulladékkal jár, mégis gyors és egyszerű, a DNS és RNS elkülönítetten vonható ki a mintából, illetve lehetőség van csak vírus-nukleinsav kivonására. A kromatográfiás eljárás általános leírása: A sejtek és vírus-részecskék fehérjéinek emésztéséhez proteináz K-t keverünk a vírusszuszpenzióhoz. Rövid inkubációs idő után a nukleinsavat tömény etanol hozzáadásával kicsapjuk, és a keveréket egy silica-filtert tartalmazó csőbe mérjük. Az ezt követő centrifugálás során a folyadék szűrőn való áthaladása során a vírus-nukleinsav specifikusan kötődik a filterhez. A szűrőn mosófolyadékot centrifugálunk át, mellyel a PCR-t esetlegesen akadályozó, emésztett fehérje-molekulákat, sókat, lipideket távolítjuk el. Az utolsó lépésben egy speciális, DNáz- és RNáz-mentes ún. eluáló pufferrel a filterről lemossuk a kötődött nukleinsavat. Az így előállított NS-szuszpenzió a PCR-ben közvetlenül felhasználható, illetve felhasználásig vagy a vizsgálatot követően -80 C-on tárolható. A NS-tisztítás lépései DNS izolálás szövettenyészet-felülúszóból 1. Egy Eppendorf csőbe mérjünk 20 µl Proteináz K enzimet. 2. Mérjünk hozzá 200 µl szövettenyészet-felülúszót. 3. Adjunk az elegyhez 200 µl AL puffert. Néhányszori átfordítással keverjük össze a csőben levő elegyet. 4. Inkubáljuk szobahőmérsékleten 5 percig. 5. Adjunk 200 µl 100%-os etanolt az elegyhez, és néhányszori átfordítással keverjük össze a cső tartalmát. 6. Mérjük a csőben levő elegyet (620 µl) a szilika-oszlopot tartalmazó centrifuga csőbe. 7. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 8. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy új gyűjtőcsőbe. 9. Mérjünk 500 µl AW1-es mosópuffert a centrifuga csőbe. 10. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 11. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy új gyűjtőcsőbe. 12. Mérjünk 500 µl AW2-es mosópuffert a centrifuga csőbe.

3 13. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 14. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy tiszta Eppendorf csőbe. 15. Mérjünk 200 µl AE puffert a centrifuga csőben levő szilika-filterre. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. Az Eppendorf csőben összegyűlt DNS-t tartalmazó elegyet használjuk a PCR reakcióban. RNS izolálás szövettenyészet felülúszóból 1. Mérjünk 140 µl szövettenyészet-felülúszót az Eppendorf csőben levő 560µl AVL pufferhez, és néhányszori átfordítással keverjük össze a cső tartalmát. 2. Inkubáljuk az elegyet szobahőmérsékleten 5 percig. 3. Adjunk 560 µl 100%-os etanolt az elegyhez, és néhányszori átfordítással keverjük össze a cső tartalmát. 4. Mérjünk 630 µl folyadékot a szilika-oszlopot tartalmazó centrifuga csőbe. 5. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 6. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy új gyűjtőcsőbe. 7. Ismételjük meg a 4-6. lépéseket. 8. Mérjünk 500 µl AW1-es mosópuffert a centrifuga csőbe. 9. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 10. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy új gyűjtőcsőbe. 11. Mérjünk 500 µl AW2-es mosópuffert a centrifuga csőbe. 12. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 13. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy tiszta Eppendorf csőbe. 14. Mérjünk 60 µl AVE puffert a centrifuga csőben levő szilika-filterre. 15. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. Az Eppendorf csőben összegyűlt RNS-t tartalmazó elegyet használjuk az RT-PCR reakcióban. 2. PCR A PCR a reakcióelegy hőmérsékletének ciklikus változásán alapul. A reakció különböző hőmérsékleten lezajló lépései során a DNS két szála szétválik, és a reakcióelegyhez adott polimeráz enzim a nukleinsav egy meghatározott szakaszáról másolatot készít. A reakció későbbi szakaszában a további másolatok készítéséhez az újonnan keletkezett DNS-darabok is templátként szolgálnak (láncreakció). Optimálsi körülmények között, amennyiben korlátlan mennyiségű szubsztrát és reagens áll az enzim rendelkezésére, minden ciklusban megduplázódik a DNS mennyisége a reakcióelegyben, mely végeredményben a DNS mennyiségének exponenciális növekedését jelenti. Az eljárás igen érzékeny, segítségével kis mennyiségű DNS is kimutatható a mintából. A PCR fajlagossága (specifikussága) a reakcióelegyhez adott ún. primereken múlik. A primerek rövid, nukleotidból álló szimpla szálú nukleinsav darabok, melyek a kimutatni kívánt vírus genomjának meghatározott részén egy nukleotid hosszú szakasszal komplementerek. A primer-tervezéshez számítógépes programokat használunk, mely a

4 génbanki adatbázisból kiválasztott vírus-nukleinsav szekvenciáját végigelemezve bizonyos paraméterek alapján (pl. GC-arány, szekvencia) primerként alkalmazható rövid szakaszokat választ ki. Mivel a primereket a kimutatni kívánt vírus genomszekvenciája alapján tervezzük, egy adott PCR-reakcióban csak azt a vírust tudjuk kimutatni, amelynek nt hosszú genom-szakaszaival a primer komplementer. A primer a polimeráz-enzim munkáját segíti: a primer tapadási helye jelöli ki a DNS-másolás kezdőpontját a genomon. A PCR-reakcióelegy ( master mix ) komponensei: - templát DNS: a vírus DNS-e a mintában, melyet amplifikálni kívánunk. - Primerpár, melynek egyik tagja a kódoló, másik tagja a komplementer DNS-szál nt hosszú szakaszával megegyezik. - Hő rezisztens polimeráz enzim, melynek optimális működési hőmérséklete kb. 70 C. RNS PCR esetén a reakcióelegyhez adott enzim-keverék a DNSpolimerázon kívül az RNS DNS-sé alakításához szükséges reverz transzkriptázt is tartalmazza. - Deoxinukleoid trifoszfátok (dntp-mix): az új DNS-molekulák építőköveiként szolgáló nukleotidok keveréke. - Puffer, mely összetétele révén az enzim működését segíti és stabilitását szolgálja - DNáz- és RNáz-mentes víz - RNáz PCR esetén a reakcióelegyhez RNáz inhibitort is adunk, mely az esetlegesen a mintába / reakcióelegybe kerülő RNS-bontó enzimeket inaktiválja. A reakcióelegyet µl térfogatú, vékonyfalú műanyag csövekbe adagoljuk ( ml / cső), melyeket speciális készülékbe (PCR gép, thermocycler) helyezünk. A gép meghatározott időtartamokra, előre beprogramozott sorrendben a reakció egyes lépéseiben szükséges hőmérsékletre melegíti vagy hűti az elegyet.

5 PCR-reakcióelegy (master mix) pontos összetétele (a számokat nem kell megtanulni!) DNS-vírusokhoz Polimeráz láncreakció (PCR) Master-Mix ( =25µl/reakció) 1 (µl) 2 (µl) H 2 O Puffer 5 10 dntps (10 nm) 1 2 Primer F+R (40 pmol/µl) 1 2 Taq polimeráz 1 2 Templát DNS (minta) / 2.5 (K+) Primerek: - Equine herpesvírus 1: EHV1_1f EHV1_2r - Canine parvovírus: CPV_1f CPV_2r - Aujeszky-betegség vírus: PHV1_1f PHV1_2r RNS-vírusokhoz: Reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR) Master-Mix ( =25µl/reakció) 1 (µl) 2 (µl) H 2 O 13, Puffer (RN-áz In 5 10 dntps (10 nm) 1 2 Primer F+R (50 pmol/µl) 1 2 RN-áz inhibitor 1 2 Enzim-mix 1 2 Templát RNS (minta) / 2.5 (K+) Primerek: - Parainfluenza 3: PI3_1f PI3_2r - Baromfipestis: NDV_1f NDV_2r - Madárinfluenza: AIV_1f AIV_2r

6 A reakcióban a mintákat tartalmazó csövek mellett kontrollokat is alkalmazunk, melyek a vizsgálat megbízhatóságát igazolják. A pozitív kontroll csőbe templátként a vizsgálni kívánt vírusra korábban pozitívnak talált mintából származó nukleinsavat adunk. A pozitív kontrollal a reakció körülményeinek megfelelőségét teszteljük: amennyiben a pozitív kontrollt az eredmény ellenőrzésekor negatívnak találjuk, az hibát jelez. Ebben az esetben a reakciót meg kell ismételni, a minták eredményeit nem szabad valódi eredménynek tekinteni. A pozitív kontrollt (amennyiben pozitív) a mintákból előállított PCR-termékek (amplikonok) azonosítására is használhatjuk: a reakció eredményének ellenőrzésekor az agarózgélelektroforézis végén a mintákban előállított amplikonok méretét a pozitív kontrollban képződött PCR-termékek méretéhez hasonlítjuk. Amennyiben ezek megegyező méretűek (mivel ugyanazokat a specifikus primereket használtuk a minta és a kontroll esetében is), biztosak lehetünk abban, hogy a pozitív kontrollal megegyező (azaz a vizsgálni kívánt) vírust mutattuk ki a mintában. Ha a minta és a pozitív kontroll amplikonja eltérő méretű termék, a minta nem tartalmazza a vizsgálni kívánt, illetve pozitív kontrollal megegyező vírust. Annak biztosítására, hogy a pozitív kontroll cső és a minta-cső (a templát nukleinsavon kívül) ugyanazt a reakcióelegyet tartalmazza, 2 adagnyi reakcióelegyet keverünk össze egy csőben, majd a kétadagnyi elegyet a templát NS hozzáadása előtt két csőbe szétosztjuk, az egyikhez a mintából izolált, a másikhoz a pozitív kontroll nukleinsavat adjuk. A PCR folyamata A polimeráz láncreakció általában szer ismételt, rendszerint 3, különböző hőmérsékleten lezajló lépésből összetevődő ciklusból áll. Az első ciklust egy magas hőmérsékleten (94 96 C) 1 15 percig tartó bevezető lépés előzi meg, melyre a reakcióelegyhez adott DNS-polimeráz aktiválásához van szükség. A tulajdonképpeni láncreakció (ciklusok) 3, ismétlődő lépései: 1. Denaturáció: C-on, mp-ig, a hidrogén-hidak felbontásával a két DNS-szál szétválását eredményezi.

7 2. Az annealing (primer-kötődés) C (a primerek tulajdonságaitól függ), mp - során a primerek a DNS-szálak velük komplementer szakaszaihoz tapadnak (hidrogénkötések alakulnak ki köztük). 3. Extenzió: a reakcióban használt DNS polimeráz optimális hőmérsékletén (75 80 C; Taq-polimeráz: 72 C) játszódik le. A polimeráz enzim a primer-tapadással kijelölt DNS-pozícióban megkezdi az eredeti DNS szál másolását, azaz egy komplementer szál építését. A lépés időtartama az amplifikálni kívánt DNSszakasz hosszától függ: optimális esetben az enzim percenként 1000 nt beépítésére képes. Az utolsó ciklust követő lépésben (70 74 C, 5 15 percig) lehetőséget adunk arra, hogy az enzim befejezze a megkezdett DNS-szálak felépítését, majd 4 C-ra hűti, és ezen a hőmérsékleten tárolja a reakcióelegyet, amíg a csöveket ki nem vesszük a gépből. A gyakorlaton használt PCR program DNS vírusok kimutatásához: PCR Lépés Hőmérséklet Időtartam Ciklus száma program Polimeráz 95 C 5 perc 1 aktiválása DNS-szálak 94 C 40 másodperc szétválasztása Polimeráz Primerek 55 C 50 másodperc 40 láncreakció kötődése Extenzió 72 C 1 perc Végső extenzió 72 C 7 perc 1 Tárolás 4 C 1 RNS vírusok vizsgálata esetében reverz transzkripciós polimeráz láncreakciót (RT-PCR) használunk. Ez a reakcióelegy összetételén kívül a reakció első lépésében különbözik a DNS

8 PCR-től: az 50 C-on 30 percig tartó reverz transzkripció során a reverz transzkriptáz enzim a minta RNS-ét DNS-sé írja át. Ez a DNS szolgál templátként a következő (bevezető) lépéssel kezdődő, a DNS PCR-rel a továbbiakban megegyező reakcióban. A gyakorlaton alkalmazott RT-PCR lépései: RT-PCR program Reverz transzkripció Polimeráz láncreakció Lépés Hőmérséklet Időtartam Ciklus száma RT 50 C 30 perc 1 RTáz 95 C 15 perc 1 denaturálása DNS-szálak 94 C 40 másodperc szétválasztása Primerek 55 C 50 másodperc 40 kötődése Extenzió 72 C 1 perc Végső extenzió 72 C 7 perc 1 Tárolás 4 C 1 A PCR eredményének ellenőrzésére a legegyszerűbb módszer az agarózgél-elektroforézis, mely a 4. gyakorlat egyik témája lesz.