1
Sztereotaxiás emlő core biopszia Részben eltávolított emlő a tumorral Teljes egészében eltávolított emlő (ablált emlő) Finomtű aspirációs biopszia (cytológia) 2
Bármelyik nap érkezhet Beérkezés napján a szövettani asszisztens indítja el kisanyagként Lediktáljuk a szövethengerek számát, hosszát, színét és a blokkszámot, majd megfestjük hemalaunnal (kiöntés) Az anyag egy éjszakát formalinban fixálódik, másnap víztelenedik automatában rövid programon, délután kiöntés és metszés 3
Indítás során, ha nem kifejezettek a szövethengerek (diktálhatjuk összességében szakadozott szövethengerek) Kiöntés során, ha nincsenek egy síkban a szálak, kiolvasztjuk a blokkot és újraöntjük A core biopsziát metszés előtt nem faragjuk be, épp az elfaragódás veszélye miatt! Terítés során, ha nincs jól kihúzva a metszet gyűrődések keletkezhetnek 4
5
Hemalaunnal megfestett, illetve festetlen biopsziák, utóbbi blokk metszésénél ez probléma lehet. 6
7
8
A specimen beérkeztét megelőzően végezzük el ezt a vizsgálatot. Ezen vizsgálatokra keddi és csütörtöki napokon kerül sor előzetes egyeztetéssel a központi műtő diszpécserével. A hónalji nyirokcsomók daganatos érintettsége, vagy áttétmentessége az emlőrák legfontosabb önálló prognosztikai és utókezelést meghatározó tényezője. Az őrszem nyirokcsomó a daganatos nyirokelvezetés első állomása, melynek eltávolítása és szövettani vizsgálata nagy pontossággal jelzi a daganatos regionális státuszt. A sentinel nyirokcsomó áttétmentessége esetén a formális blockdissectio elhagyható. 9
A vizsgálatot megfelelő technikai előkészület előzi meg a szakasszisztens részéről. A sentinel nyirokcsomó megérkezésekor az orvos és citológus szakasszisztens értesítése Szövettani szám adása a beküldött anyagnak (naplószám + beteg neve) Az orvos a beküldött zsírszövetben található nyirokcsomók keresztmetszetéről lenyomati keneteket készít immunlemezre, melyet a citológus asszisztens Hemacolor festéssel fest meg. A sentinel nyirokcsomó egy, vagy több részletéből fagyasztásos vizsgálat készül. 10
A keneteket citológus szakasszisztens festi meg Hemacolor festéssel. 11
A sentinel nyirokcsomó egy részletéből fagyasztásos vizsgálat készül. 12
A fagyasztás maradékát blokkokban indítjuk, formalin fixálás, paraffinblokk (tőkéről levett nyirokcsomót is) Szénsavhó / kriosztát gyorsfagyasztó funkciója A kriosztátban elkészített metszeteket 10 %-os pufferolt formalinban fixáljuk, majd deszt.vizes és alkoholos mosást követően Hemalaun-eozin festéssel festjük (orvos, eredmény) Technikai problémák: nem megfelelően beállított terelőlemez, sok zsírszövet a nyirokcsomó körül, nem megfelelően kiterített metszet, nem megfelelően megválasztott fagyasztási hőmérséklet, nem megfelelő metszetvastagság, festési hiba, penge élessége 13
Ideális esetben a fagyasztás napján érkezik a specimen is (fixálás) Ha a specimen nem megfelelő méretű tárolóedényben érkezett, akkor áthelyezzük egy nagyobb méretűbe A specimen előkészítése orvosi feladat szakasszisztens közreműködésével történik 14
Beküldőlappal történik, a pontos orientáció miatt (elváltozás elhelyezkedése, távolsága a sebészi szélektől) A rezekátum megfestése alciánkék festékkel Az emlő felszeletelése, minden szelet közé gézlapot helyezünk, nagy gézlapba csomagoljuk az emlőt, így kerül tiszta pufferelt formalinba a másnapi indításig. 15
16
17
Indítás előtt eltávolítjuk a gézlapokat és kimossuk az emlőt hideg folyóvízzel Elsőként az emlőket indítjuk (hosszabb fixálódási idő) Rezekátum mérete cm-ben, három dimenzióban A bőrön látható minden elváltozás leírása, mamilla mérete, elváltozásai Fascia, esetleg harántcsíkolt izom jelenléte a basalis felszínen A körülírt lézió méretének megadása a tér három irányába, rezekciós felszíntől való távolság megadása 18
Sorszámozva indítjuk a blokkokat úgy, hogy a makroszkópos leírásból vissza lehessen következtetni minden blokk elhelyezkedésére a preparátumon belül Makroblokk indítása is lehetséges elsősorban mirigydús preparátum esetén Minden kóros területet, minden mikrokalcifikációt tartalmazó állományt elindítunk Az elváltozáshoz legközelebb eső rezekciós felszíneket is elindítjuk A maradék szeleteket sorba rakva, gézbe csomagolva tároljuk vákuumos fóliahegesztővel lezárt nylon zsákokban 6 hétig 19
20
A kóros elváltozáson kívül, minden kvadránsból, az emlőbimbóból és a rezekciós felszínekből is indítunk Az axillában fellelt összes nyirokcsomót elindítjuk Az emlőből indított blokkokat teljesen külön formalinba helyezzük a többi nagyanyagtól, általában a fagyasztás maradékával Mikrohullámú sütőben ráfixálunk a blokkokra Víztelenítés előtt kimossuk a blokkokat hideg folyóvízzel, majd acetonba helyezzük azokat Víztelenítés automatában hosszú programon 21
22
Tipp: a kiöntési folyamat végén öntjük ki az emlőket, így hosszabb ideig állnak a blokkok paraffinban Jól lenyomjuk a szeleteket a kiöntő formába csipesz segítségével, makroblokk esetén főként Kiöntés után befaragjuk a blokkokat, így kerülnek jégre Ha nincs jól lenyomva egy szelet, kiolvasztjuk és újraöntjük 23
24
Szánkás mikrotómmal történik 3-4 mikronos metszeteket húzunk Ha a zsír kitörik (víztelenedési hiba), vagy melegítjük, vagy hűtjük a blokkot Fontos a terítővíz hőmérséklete, ha túl forró, festés során könnyen leúszik a metszet Immunlemez használata, makroblokk esetén zsírtalanított tárgylemez Hosszabb ideig szárítjuk a metszeteket, termosztát Ha több napon keresztül úsznak metszetek, a blokkokat visszavisszük sárga paraffinba Hemalaun-eozin festéssel festjük a metszeteket automatában (makroblokkot szintén) 25
26
27
28
29
30
Antigén-antitest kapcsolódáson alapuló reakció A szövetekben minden olyan anyag kimutatására alkalmas módszerek, melyek antigénként viselkednek, elsősorban fehérjék Indirekt módszer: a kimutatandó antigén epitópjához kötjük az ellene termeltetett primer antitestet, majd ehhez peroxidáz enzimmel (HRP) konjugált szekunder antitestet kapcsolunk. Az előhívás diaminobenzidinnel(dab) történik H2O2 jelenlétében. A peroxidáz enzim H2O2 jelenlétében a DAB-t barna színű csapadékká alakítja 31
Deparaffinálás xylolban Alkoholos mosás (többször váltva) Deszt.vizes öblítés Endogén peroxidáz gátlás H2O2-ban 10 Feltárás citrát pufferben ph 6,00 (kuktában 25 ) Hűtés, deszt.víz PBS puffer ph 7,4 10 Protein blokkolás 20 Primer antitest 30 Mosás PBS pufferben Szekunder antitest 30 Mosás PBS pufferben Előhívás DAB-bal Deszt.víz Hemalaun-eozin festés 10 Kékítés kútvízben 10 Víztelenítés, fedés 32
Nem megfelelő endogén peroxidáz gátlás háttérfestődést okozhat: a H2O2-t akár kétszer is kicserélhetjük a metszeteken Úszik a metszet: immunlemez használata, a metszetek leitatása szűrőpapírral, szárítás termosztátban, pótlemezek készítése Primer kimerül : minden nap higítunk, pl. Ki67 esetén már nem használjuk az előző napi higítást, változtatjuk a higítás fokát, meghosszabbítjuk az inkubációs időt A szövet mechanikai károsodása, fixálás előtti kiszáradása, tökéletlen fixálás és az autolysis mind aspecifikus háttérfestődést válthatnak ki (megfelelő kontrollok használata) 33
Ösztrogén, progeszteron: hormonreceptorok; az ER receptor egy sejtmagban található transzkripciós faktor, mely az emlőszövet növekedéséért, differenciálódásáért, tumorgenezisért felelős. Szabályozza egyes gének expresszióját, pl. progeszteron. Így a progeszteron receptor jelenléte egy tumorban jelzi, hogy az ER receptor funkcionál. Fontos prognosztikai és prediktív faktorok. Meghatározásuk %-ban történik, illetve a reakció intenzitását is figyelembe kell venni! Ki67: nagy nuclearis protein, mely a sejtciklus aktív fázisaiban expresszálódik(g1,s,g2,m), nyugvó sejtekben (G0) nem mutatható ki. A nukleáris expresszió a proliferációs aktivitás jele. A szövettani diagnosztikában a normál és daganatos sejtek növekedési funkciói monitorozhatók. Ki67 index számítása, 500-1000 sejtben hány pozitív sejtet látunk. 34
Her-2: proto-onkogén, epidermális növekedési faktor család tagja, mely egy transzmembrán tirozin-kináz receptort kódol. Számos szabályozási útvonalban érintett. Pozitív reakciót a setmembránban ad, a citoplazmapozitivitás artefaktum. Score 0: a tumorsejtek <10%-ában inkomplett membránpozitivitás, vagy a festődés hiánya Score 1+: inkomplett gyenge festődés a tumorsejtek >10%- ában Score2+: gyenge, vagy közepes intenzitású komplett membránpozitivitás a tumorsejtek >10%-ában, vagy erős, komplett pozitivitás a tumorsejtek <10%-ában Score 3+: komplett, körkörös, erős festődés a sejtek > 10%- ában FISH: IH-val bizonytalan HER-2 státuszú esetekben kötelező elvégezni!!!! 35
36
37
38
39
40