Vérképző szervek betegségeinek laboratóriumi diagnosztikája Vérkenet Csontvelő aspirátum (kenet+beágyazott) Csontvelő szövettan (crista biopsia) Áramlásos citometria Citogenetika/FISH Molekuláris diagnosztika Komplex diagnosztika malignus hematológiai megbetegedésekben Klinikai dg. morfológiai dg. Immunológiai dg. citogenetikai dg. Molekuláris dg. 1
A vizsgálatok egymásra építettsége a hematológiai diagnosztikában klinikum tünettan morfológia szövettan citológia fenotípu s immunhisztológia áramláscitometria genotípus molekulári s vizsgálat Áramlás citometriai panelek I. AL I. blasztok esetén IgG izotípus kontrollok CD14 HLA-DR CD45 CD13 CD7 CD19 AL, MDS, CMPD, CML blasztos kr. Myeloid vonal T-sejtes vonal B-sejtes vonal CD15 CD33 CD45 CD36 CD64 CD45 Co CD34 CD45 MPO CD34 CD45 CD7 CD8 CD4 CD5 CD7 CD3 iccd3 CD1a CD2 (ploiditás gyerek leukémiában) CD20 CD10 CD19 CD9 CD34 CD19 CD10 CD38 CD19 IgM CD19 CD45 Co CD19 CD45 icigm CD19 CD45 (ploiditás gyerek leukémiában) SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András 2
Áramlás citometriai panelek II. IgG izotípus kontrollok Ly I. Κ λ CD19 CD3 - CD8 CD4 CD10 CD19 CD45 T-sejtes vonal TCRα/β TCRγ/δ CD2 CD3 CD26 CD4 (Sezary szindr., Mycosis Fung. esetén) B-sejtes vonal CD5 CD23 CD19 CD38 CD56 CD19 CD103 CD22 CD20 Szűk CLL CD10 CD19 CD45 CD5 CD23 CD19 co CD38 CD19 Zap70 CD38 CD19 Szűk Myeloma multiplex. CD10 CD19 CD45 CD38 CD56 CD19 ha CLL Zap70 kontrollal SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András A crista biopszia indikációi Punctio sicca Citopénia, hypocelluláris hematológiai betegségek Ciológiai abnormitás további vizsgálta Csontvelői infiltráció megítélése Stromareakció megítélése Kezelés monitorozása, reziduális betegség vizsgálata Immunológiai, infektológiai, onkológiai indikációk 3
Aspiratio Biopszia Citológia Hisztológia Egyedi jelleg Struktúra Csontvelőbiopsziás előkészítés: biopszia Yamshidi tűvel a spina iliaca post. sup területéről 4
Crista biopsiás minta feldolgozása Fixálás (10%pufferezett formalin, min. 6 óra) Dekalcinálás (EDTA, 1 éjszaka) Víztelenítés Paraffinba ágyazás Metszés (2-4 um vastagság) Deparafinálás Rehidrálás Festés Feldolgozás ideje kb. 3 napi Szövettani vizsgálatai lehetőségek csontvelőmintákon I. Szöveti összefüggések vizsgálata hagyományos festésekkel Sejtmorfológia (dysmorfológia) Sejt- és stroma viszonya Csontvelő mennyiségi összetétele Sejtek elosztása (topográfia, sejtcsoportok) Speciális sejttípusok, zárványtestek, tárolási zavarok Csontos állományhoz, erekhez való viszony 5
Szövettani vizsgálatai lehetőségek csontvelőmintákon II. Szöveti komponensek feltüntetése speciális festésekkel Citológiai részletek, metachromasia (Giemsa) Enzimaktivitás (chloroacetát-eszteráz, eszteráz, mieloperoxidáz) Rácsrost (reticulin, Gömöri) Kollagén (Van Gieson, picrosyrius) Vas (Berlini-kék) Glikogén, komplex szénhidrátok (PAS) Szövettani vizsgálati lehetőségek csontvelőmintákon III. Immunhisztokémia Sejtes összetétel (B-sejt, T-sejt, histiocyta, stb.) Klonalitás (kappa, lambda) Sejtkiválasztás, sejtproliferáció (bcl-2, bcl-6, Ki-67) Aberráns markerek (CD5, cyclin D1) Terápia asszociált markerek (CD20, CD52) Ritka sejttípusok (Hodgkin-sejt, micrometastasis) 6
Immunmarkerek differenciálódás szerint Blaszt fenotípus: CD34 CD117 CD72(transzferrin rec.) Tdt CG eredet: CD-10 bcl-6 Mono-/histiocyta: CD68 lizozim T-sejt: Megakaryocita: CD2, CD3 CD5, CD7 CD4, CD8 CD31, CD61, VIII- faktor Érett B-sejt: Plazmasejt: CD19 CD20 CD79 felszíni kappa, lambda CD138 MUM1 citoplasmat. kappa, lambda Erythroid sejtek: Granulocyta: Dendritikus sejtek: glycophorin A MPO CD21 CD23 Langerhans sejtek: S-100 CD1a A csontvelő biopsziás lelet fő részei Értékelhetőség Cellularitás Hemopoietikus sejtvonalak aránya Hemopoietikus aktivitás jellemzése Patológiás sejtszaporulat jellemzése Lymphoid sejtek és egyéb reaktiv jelenségek Nem hemopoietikus sejtek és folyamatok (stroma, tárolás, stb.) Összefoglaló vélemény Diagnózis 7
Lymphadenomegaliával jelentkező beteg anamnézise Infekció? Háziállatok? Macskakarmolás? Gyógyszerszedés? Utazás egzotikus külföldi országba? Autoimmun betegség? Szexuális irányultság? Lymphomás beteg a családban? Fizikális vizsgálat: nyirokcsomó status? hepatosplenomegalia? vena cava superior syndroma? Lymphoma klasszifikáció : WHO 2000 B sejtes tumorok prekurzor B-sejtes tumor érett B-sejtes tumorok T-sejtes és K-sejtes tumorok prekurzor T-sejtes tumorok érett T-sejtes és K-sejtes tumorok 8
Érett (perifériás) B-sejtes tumorok B-sejtes krónikus lymphocytás leukémia /kis lymphocytás lymphoma B-sejtes prolymphocytás leukémia Lymphoplasmocitás lymphoma Splenikus marginális zóna lymphoma Hajassejtes leukémia Plazmasejtes myeloma/plasmocytoma Nodális marginális zóna B-sejtes lymphoma Extranodális marginalis zóna B-sejtes lymphoma MALT típus Follikularis lymphoma Köpenysejtes lymphoma Diffúz nagy B-sejtes lymphoma Mediastinalis (thymikus) nagy B-sejtes lymphoma Intravascularis nagy B-sejtes lymphoma Primer effusionalis lymphoma Burkitt lymphoma Lymphomatoid granulomatosis WHO felosztás, 2000 Érett perifériás T- és K-sejtes tumorok T-sejtes prolymphocytas leukémia T-sejtes large granularis lymphocytas leukémia Aggresszív NK-sejtes leukémia Adult T-sejtes lymphoma/leukémia (HTLV1+) Extranodális NK/T-sejtes lymphoma, nasalis típus Enteropathia-típusú típusú T-sejtes lymphoma Hepatosplenikus γ/δ T-sejtes lymphoma Subcután panniculitisszerű T-sejtes lymphoma Blastos NK-sejtes lymphoma Mycosis fungoides/sezary szindróma Anaplasztikus nagysejtes lymphoma, T/0 sejtes, primér cután típus Periferiás T-sejtes lymphoma (másképpen nem meghatározott) Angioimmunoblastos T-sejtes lymphoma Anaplasztikus nagysejtes lymphoma, T/0 sejtes, szisztémás típus. WHO felosztás, 2000 9
2008.09.26. A BB-sejtes nem nem--hodgkin lymphomák klinikai felosztása Prognosztikus csoportok B-Sejtes Mérsékelt malignitású (indolens) Krónikus lymphoid leukémia (CLL) Waldenström macroglobulinaemia Hajas sejtes leukémia (HSL) Splenikus marginális zóna lymphoma Follicularis lymphoma Grade II-II Plasmocytoma/myeloma Mérsékelten agresszív lymphomák Köpenysejtes lymphoma Follicularis lymphoma Grade III Agresszív lymphoma Diffúz nagynagy-b-sejtes NHL Nagyon agresszív lymphomák Prekurzor B B-- Lymphoblastos lymphoma/all Burkitt lymphoma A lymphomák prognosztikai csoportosításának alapja Szövettani vizsgálat A betegség stádiumának meghatározása Nyak Nyak mellkas és hashas-kismedence CT Csontvelőbiopszia Nemzetközi prognosztikai index (IPI score) kiszámítása 10
a rituximab-éra A CD20 antigén, mint az immunterápia célpontja Őssejt Pre-Pre- éretlen érett Activált Plasma B sejt Pre-B sejt B sejt B sejt B sejt sejt sigm sigm +D sigm sigg siga HCR HCR HCR κr/d HCR λr/d Antigén independens Antigén dependens IgM IgG IgA CD20 expresszió Malignitások: Precursor B-sejt leukémiák B-sejtes lymphomák/cll M. Waldenström/ myeloma 11
CHOP versus CHOP+ rituximab diffúz nagy B-sejtes lymphomában (DLBCL) Coiffier et al, N Engl J Med 236, 346, 2002 MabThera: Egér/humán kiméra monoklon lonális antitesttest Kiméra IgG 1 Variábilis régió (egér) specifikusan kötődik a CD20-hoz Humán κ konstans régió Humán pre-b- és B-sejtek CD20 molekulájához kötődik 12
B-CLL: mérsékelt malignitású NHL Perif vér flow citometria CD5+/CD19+ sejtek CLL-ben Monomorph lymphoid csontvelőinfiltrátum CLL-ben 13
CLL diagnosztikára vonatkozó ajánlások NCI 1996 Fizikális vizsgálat Teljes vérkép, ly morfológia, reticulocyta Felszíni markerek a fő sejtpopul.b-markerekre +(CD19, CD20,CD23) és CD5+ a B sejtek monoklonálisak, vagy kappa vagy lambda expresszióval a sejtfelszíni immunglobulinok denzitása alacsony Elkülönítendő kórképek T-CLL prolymphocytás leukémia hajas sejtes leukémia és variáns formája Splenikus lymphoma villosus lymphocytákkal LGL-sejtes leukémia non-hodgkin lymphomák leukémiás fázisa (folliculus centrum sejtes vagy MCL) CD19+ Malignus B sejt CD20+ CD52+ 14
Új prognosztikai (a kórjóslatot elősegítő) tényezők a lassú és a gyors kórlefolyású esetekben Kétféle B sejttípus elkülönítése sejtfelszíni tulajdonságok pl. CD 38 ZAP70 citogenetikai eltérések pl. 17-es kromoszóma egyik karjának hiánya Diagnózis : -morfológia -flow cytometria Mikor történjék CLL-ben az új prognosztikai markerek meghatározása CLL-ben? Prognosztikai értékelés : -Klinikai stádium -Interfázis FISH -IgVH mutációs státusz -ZAP-70 -CD38 Fiatal(abb) CLL-es betegen a diagnóziskor Alacsony, közepes és magas kockázat 15
Hajas sejtes leukémia (HSL) Incidencia: Klinikum: Vérkép: Immunológia: 3 eset / millió lakos / év splenomegalia nincs tapintható lymphadenomegalia - pancytopenia, - monocytopenia, - hajas sejtek aránya kicsi kimutatás: buffy coat készítményben CD103+, CD19+, CD21, FMC-7+, CD11c+ 16
Myeloma multiplex: diagnosztika Süllyedés, vérkép Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat 17
Diagnosztika myeloma multiplexben Süllyedés, vérkép M-komponens kimutatása fehérje elektroforézissel Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat Diagnosztika myeloma multiplexben Süllyedés, vérkép Lytikus csontelváltozások Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat 18
Diagnosztika myeloma multiplexben Süllyedés, vérkép Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat Aspirált csontvelő: Diffúz plazmasejtes infiltráció Diagnosztika myeloma multiplexben Süllyedés, vérkép Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat Szövettani vizsgálat: Diffúz plazmasejtes infiltráció 19
Klinikai stádium megállapítása (Durie-Salmon, 1975) I. Stádium: A sejttömeg kicsi (0,6 x 10 12 /m 2 ) II. Stádium: a kettő közt III. Stádium: A sejttömeg nagy (1,2 x 10 12 /m 2 ) haemoglobin < 100 g/l szérum kalcium > 2,6 mmol/l előrehaladott csontdestrukció monoklonális szérum IgG > 7 g / dl, IgA > 5 g/dl vizelet könnyűlánc-ürítés > 4 g / 24 óra A: szérum kreatinin <170 µmol/l (<2 mg/dl) B: szérum kreatinin >170 µmol/l (<2 mg/dl) International Staging System of the International Myeloma Working Group Stádium β2 2 microglobulin (mg/dl) serum albumin (g/dl) Átlagos túlélés (hónap) I. < 3.5 > 3.5 62 II. < 3.5 < 3.5 44 II. 3.5 5.5 NA 44 III. > 5.5 NA 29 20
Képalkotó eljárások myeloma multiplexban A betegség kiterjedtségének és súlyosságának megállapítása a diagnóziskor Csontröntgenek CT Mellkasrtg (PA) Nyaki gerinc rtg (AP- oldalirányú+nyitott szájjal) DL gerinc Humerus, femur rtg. koponya AP+oldalir. Medence AP +tüneteket okozó területek MRI Myelodysplasia syndroma 21
Myelodysplasia syndroma - általános jellemzők Mono- bi vagy tricytopenia a perifériás vérben A csontvelő normo-/hypercelluláris (ritkán hypoplastikus) Ineffektív hemopoezis, fokozott apoptosis A betegek egy részében akut leukémia alakul ki Myelodysplasia syndroma - általános jellemzők Medián életkor 64 év. Éves incidencia 4-5/100 000 az általános populációban, ezen belül <50 év: 0.5/100 000, >80 év 89/100 000 emi arány: férfi:nő=1.2:1 22
MDS- diagnózis Anaemia Granulopenia tünetei Thrombocytopenia vagy thrombocytosis + kóros, diszfunkcionáló granulocyták, thrombocyták Csontvelőkenet+cristabiopszia + citogenetika Myelodysplasia syndroma - csontvelőkenet Dyserythropoesis Dysgranulopoesis dysmemegakaryopoesis Matolcsy, Udvardy, Kopper Hematológiai betegségek atlasza, Medicina, 2006 23
MDS- WHO klasszifikáció Refrakter anémia (RA) RA gyűrűs (Ring) szideroblasztokkal (RARS) Refrakter cytopénia több rendszert érintő dysplasiával RAEB-1 (Refrakter anaemia with excess of blasts) RAEB-2 MDS/MPDS Del(5q) Myelodysplasia syndroma- refrakter anaemia Ring (gyűrűs) sideroblastokkal 24
MDS - 5q- szindróma Anaemia, makrocytosis Thrombocytosis Jellegzetes megakar.morfológia -Indolens klinikai lefolyás - Az AML kialakulásának esélye kicsi International Prognostic Score System (IPSS) MDS-ben - A csontvelői blastaránytól - Citogenetikától és a - Citopenia mértékétől függ Ezen besorolás alapján becsülhető - a várható túlélés - az akut myeloid leukaemiává transzformálódás valószínűsége 25
International Prognostic Scoring System (IPSS) kockázati csoportok Kis Intermed- 1 Intermed- 2 Nagy score 0 0,5-1,0 1,5-2,0 2,5 v. felett AML kial. 19% 30% 33% 45% Medián idő AL-ig Medián túlélés 9,4 év 3,3 év 1,1év 0,2 év 5,7 év 3,5 év 1,2 év 0,4 év Heveny leukémiák 26
Akut leukémia- általános jellemzők Csontvelő eredeű, nagy malignitású, klonális, heterogén betegségcsoport, Hasonlóság mellett különböző célsejt (AML-ALL) immunfenotípus,citogenetikai eltérés, klinikai megjelenés,terápiás válasz. Tüneteit általában nem maga a daganatsejt okozza,hanem az általa elnyomott normális vérképzés hiánya: anémia, thrombocytopenia,neutropenia Akut leukémiák általános jellemzői Diagnózis kritériumai: a csontvelőben a nonerythroid elemek több mint 20%-a blast (vagy Auer pálca észlelhető.) A blastok myeloid,monocyta,ritkán erythroid ill megakaryocyta irányú=aml, vagy B és T sejt irányú=all differenciálódást mutatnak. Bi-fenotípusos: a blastok néha myeloid és lymphoid jeleket is expresszálnak AML: - de novo ill - szekunder (myelodysplasiából vagy krónikus myeloproliferativ betegség talaján) ALL : B, T sejtes ill. érett B sejtes. 27
AML WHO felosztás 28
Akut leukémia : Általános jellemzők Epidemiológia AML 3-4 beteg/100 000 lakos/év 30 év alatt 17beteg/100 000 lakos/év 75 év felett mérsékelt férfi predominancia ALL:1,4 beteg/100 000 lakos/év(időskorban ez is emelkedik) AML/ALL= 3 Akut leukémia: prognózis Prognózis:általában rossz, függ: - életkortól, - citogenetikától, - általános állapottól 60 év alatt jó cytogenetika és jó általános állapot 80% CR és 50% gyógyulás!! 29
Etiológia Akut leukémia I Általános jellemzők Környezeti:kémiai anyagok, sugárzás, cytostatikumok Genetikai: Down kór (22-es trisomia) del). Ataxia-teleangiektázia (ATM 11q 23 Akut leukémia: laboratóriumi diagnosztika LABORATORIUMI VIZSGÁLATOK: vérkép: leukocytosis, blastsejtek (Auer pálca), anemia, thrombocytopenia kémia: magas hugysav, LDH hemostasis:dic thrombocytopenia Citokémia:POX,Sudán fekete stb-(ma már nem jelentős Flow Cytometria: CD 13-14-33-34 AML CD 2-3-10-19- ALL Citogenetika: konvencionális és FISH PCR:molekuláris vizsgálatok 30
Akut leukémia III leukemogenezis A leukémiát mutációk hozzák létre: two-hit hipotézis - a II csoportú mutáció a sejtek érésében fontos transzkripciós faktorokat károsítja, ezáltal az érés szempontjából fontos fehérjék messengerrns ei nem képződnek,a sejt nem tud kiérni, de még nincsen proliferációs előnye(van-vegetál) az I. csoportú mutációk adják meg a proliferációs előnyt azáltal,hogy a sejtmembrán növekedési receptor jelátvitelét zavarják.ligand nélküli folyamatos jelátvitel lesz (III tip receptorok flt-3, c-kit,ill RAS,STAT rendszer aktiválódás) Egyed M: Heveny leukémiák in: Dank, Demeter (szerk): Fókuszban az onkológia, onkohematol,, 2006 II. Mutációs csoport - CBF (core binding faktor) mutációk (t 8;21) AML1-ETO Inv(16) CBFβ-MYH11 - RA receptort érintő transzlokációk t(15;17) 31
Akut leukémia csoportosítás WHO beosztás FAB(French-American-British) AML: M0-M7 ALL:L1- L3 Cytogenetika: jó prognózisú t(8;21), t(15;17), inv (16) - neutralis progn.:normal karyotípus,8-as trisomia,del llq 23 - rossz prognózis:komplex abnormalitás, jelentős genetikai anyagvesztés stb. Akut leukémia (AML) IV kezelés 32
Az FLT3 (fms-szerű tirozin kináz-3) gén mutációinak AML-ben prognosztikus szerepe van [FLT3 ITD]; az FLT3 gén ITD (internal tandem duplikáció) mutáció kimutatása: DNS-mintából fluoreszcens PCR-t követő kapilláris elektroforézissel [FLT3 D835]: az FLT3 gén 835. pozíciójában (tirozin kináz domén, TKD) található aszparaginsav (D835) pontmutációinak kimutatása DNS-mintából PCR-t követő restrikciós fragmens hossz analízissel (RFLP) A mutációk jelenléte fontos az AML-es beteg prognózisának megítélésekor és esetlegesen a kezelést is befolyásolhatja. Akut myeloid leukémia kezelési elvek Egyed M: Heveny leukémiák in: Dank, Demeter (szerk): Fókuszban az onkológia, onkohematol,, 2006 33
A felnőttkori akut lymphoid leukémia ALL előfordulása: 1,4 beteg / 100 000 lakos férfiakban kissé gyakoribb WHO besorolás - prekurzor B-sejtes lymphoblastoslymphoma/leukemia - T-sejtes - Burkitt lymphoma/leukémia Rizikóbecslás akut lymphoid leukémiában 34
Idült myeloproliferatív betegségek Idült myeloproliferatív betegségek Krónikus lefolyású, őssejt eredetű klonális megbetegedések A csontvelőben egy- vagy több sejtvonal proliferációja Jellemző: leukocytosis thrombocytosis + hepatosplenomegalia 35
Idült myeloproliferatív betegségek Miért idült? Akut és krónikus myeloproliferatív betegség megkülönböztetése akut myeloid leukémiát definiáló sajátság alapján: 20 %-os vagy afeletti blast-arány a csontvelőben és/vagy a perif. és ennek következményei A krónikus myeloproliferatív betegségek WHO felosztása Krónikus myeloid leukémia Polycythemia vera [Ph kromoszóma, t(9;22)(q34;q11), BCR/ABLpozitív] Krónikus idiopathiás myelofibrosis (extramedullaris hematopoiesissel) Essentialis thrombocythaemia Krónikus neutrofil leukémia Krónikus eosinofil leukémia(és a hypereosinofilia syndroma) 36
Krónikus myeloid leukémia (CML): Az összes leukémia esetek 15-20%-a Incidencia: 1,7-2,2 /100 000 lakos/év, az életkorral nő Kórlefolyás: a CML fázisai Krónikus fázis Akcelerált fázis Előrehaladott fázisok Blasztos krízis átlagosan 5-6 év Átlagos tartam 6 9 hónap Átlagos túlélés 3 6 hónap A dg. az esetek 50%-ban rutin labor vizsgálatok során derül ki Az esetek 85%-ra a krónikus fázisban derül fény Fehérvérsejt érési sor 1. 2. 3. 4. 5. 6. myeloblast; promyelocyta myelocyta; metamyelocyta pálca szegment GAP (granulocyta alk. phosph.). aktivitás GAP negatív granulocyta GAP ++++ granulocyta 37
A CML diagnózisának sine qua non-ja: a Ph kromoszómapozitivitás: 9 9 (q+) 22 Ph (22q-) bcr abl citogenetika: t(9;22)transzlokáció transzlokáció Molekulárisan: BCR/ABL pozitivitás bcr-abl Fúziós protein tirozinkináze aktivitással CML: klonális megbetegedés genetikai oka a 9. és 22. Kromoszóma hosszú karjai közti reciprok transzlokáció következtében a 22. Kromoszómán ( ún. Philadelphia kromoszóma) létrejövõ bcr/abl fúziós gén, melynek fehérje terméke kóros tirozinkináz aktivitással rendelkezik és felelős a leukémiás folyamatért. A fokozott TK aktivitás miatt - növekedési faktor független proliferáció, - csökkent apoptózis - csökkent adhézió áll fenn. 38
Az integrált megközelítés lehetősége malignus hematológiai megbetegedésekben: CML Klinikai adatok: leukocytosis, basophilia, thrombocytosis. splenomegalia Morfológia: perifériás vér és csontvelőkenet Diagnosztikai komplexitás CML-ben Szövettani szubtípus meghatározás Kariotípus t (9;22) FISH BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás 39
Diagnosztika krónikus myeloid leukémiában Szövettani szubtípus meghatározás 9 9 (q+) Kariotípus 22 Ph t (9;22) FISH (22q-) BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás abl bcr bcr-abl Fuziós PROTEIN TYROSINKINASE aktivitással Diagnosztika CML-ben Szövettani szubtípus meghatározás normális Kariotípus t (9;22) FISH (Fluoreszcens in situ hibridizáció) t (9;22) BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás 40
Diagnosztika krónikus myeloid leukémiában Szövettani szubtípus meghatározás Kariotípus t (9;22) FISH BCR-ABL fúziós gén képződése BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás A CML kezelése során végzett utánkövetéses vizsgálatok Hematológiai válasz Citogenetikai válasz t (9;22) FISH Molekuláris válasz: BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás Normalis vérsejtszámok Fvs <10 x 10 9 /L Thrc <450 x 10 9 /L éretlen sejtek hiánya splenomegalia norm. fizikális status a kezelést a beteg tolerálja 41
A CML kezelése során végzett utánkövetéses vizsgálatok Szövettani szubtípus meghatározás Citogenetikai válasz t (9;22) FISH BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás (G sávozással vizsgált mintában, legalább 20 metafázis alapján) Minimális (MCgR) Ph+ sejtosztódás: 35-95 %, de a kiindulási értékhez képest kevesebb Parciális (PCgR) Ph+ sejtosztódás: 1-34 % Komplett (CCgR) Ph+ sejtosztódás: 0 % A CML kezelése során végzett utánkövetéses vizsgálatok Szövettani szubtípus meghatározás Klonális evolúció Citogenetika t (9;22) FISH BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás 42
A CML kezelése során végzett utánkövetéses vizsgálatok Molekuláris monitorozás mint a klinikai döntéshozatal alapja Szövettani szubtípus meghatározás Kariotípus t (9;22) FISH BCR-ABL fúziós gén képződése Molekuláris válasz: BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás Időpont Fvs X G/l 2002.12 79,0 Blast: 25% Thr X G/l Hb g/l Citogenetika FISH Kvant. RT-PCR (TaqMan) 3268 84 46, X,Y (1) 46, XY t(9,22)( 29) - 1309 CML score: 4277 (nagy rizikó) 2003.03 4,1 500 134 46, X,Y (24) 46, XY t(9,22)( 6) 12% bcr/abl+ 2003.05 4,9 179 146 Neg. negatív - Csv.hypoplasia 2003.o6 4,9 211 141 Neg. negatív Csv: extrém hypoplasia 92 32 2003.o8 4,1 163 147 Neg. - negativ 2003.11 4,9 150 141 Neg.. - 0,75 2008. 09. 4,6 186 146 Neg. t (9;22) negativ negativ 43
Évek A CML kezelésének és a terápiás válasz monitorozásának lehetőségei Gyógyszer Monitorozás Várható túlélés 1950-5959 busulphan fvs, lépméret 3-4 év 1960-6969 hydroxyurea 4-5 év (Litalir) 1970-7979 allogén csontvelőátültetés citogenetika 55-60% hosszú távú túlélés 1980-8989 interferon-a (Intron-A, Roferon-A) citogenetika 1999 óta (imatinib, Glivec) citogenetika kvantitativ RT-PCR 6-7 év még nem ismert 2005 óta (dasatinib, Sprycel) Prof. Dr Kelemen Endre 44
Európai Őssejttranszplatációs Csoport tevékenységének alakulása CML-ben www.ebmt.org Az új szerekkel (tirozinkinázgátlókkal) végzett kezelés során a CML fázisai közti határok eltolódhatnak Krónikus fázis Akcelerált fázis Előrehaladott fázisok Blasztos krízis átlagosan 5-6 év stabilizáció Átlagos tartam 6 9 hónap Átlagos túlélés 3 6 hónap A klasszikus 3 fázisú kórelfolyás megváltozhat Baccarani, 2006 45
POLYCYTHAEMIA RUBRA VERA (PRV) Pancytosissal járó krónikus myeloproliferativ megbetegedés. Mindhárom csontvelői sejtrendszer autonom proliferációja, a vörösvérsejtrendszer hyperplasiája dominál. Előfordulása: általában 55 éves kor felett Férfi:nő arány: 1: 1 A polycythaemia vera diagnózis kritériumai: A kategória: 1. megnövekedett vörösvértest volumen (Cr 51 izotóp) B kategória: 2. Artériás vér oxigén telítettsége >92% 3. splenomegalia 1. thrombocytosis 2. leukocytosis (láz és fertőzés nélkül) 3. a granulocyta alkalikus foszfatáze aktivitás növekedett 4. serum B12 növekedett Dg kimondható: ha 3 A kategóriás kritérium, vagy az 1 és 2 A kritérium + 2 B kategóriás kritérium teljesül. 46
Polycythaemia verában javasolt (kiegészitő) vizsgálatok: Csontvelőbiopszia Polimorf megakaryocytaszaporulat, nagy megakaryocyták, fokozott csontvelői cellularitás: panmyelosis lehet rácsrostszaporulat szérum erythropoetin (Epo) szint meghatározás Csontvelőhisztológia: normal cellularitás 47
PV Csontvelőbiopszia: fokozott cellularitás trilineáris hyperplasiával Szerzett JAK2 mutáció Pontmutáció a JAK2 gén JH2 pseudokináz doménjében (V617F) A tirozinkináze fehérje 617-es poziciójában a Valin helyett Phenylalanin van 48
JAK V 617 F mutációanalizis a JAK-2 pozitivitás gyakorisága PV ET MF (65-97%) (23-57%) (35-90%) 78 35 50 % Erősebb poiztiv, mint negativ prediktiv érték a DNS vizsgálat nem helyettesiti ugyan a csontvelőbiopsziát, de nagyon hasznos Áramlás citometriai panelek I. AL I. blasztok esetén IgG izotípus kontrollok CD14 HLA-DR CD45 CD13 CD7 CD19 AL, MDS, CMPD, CML blasztos kr. Myeloid vonal T-sejtes vonal B-sejtes vonal CD15 CD33 CD45 CD36 CD64 CD45 Co CD34 CD45 MPO CD34 CD45 CD7 CD8 CD4 CD5 CD7 CD3 iccd3 CD1a CD2 (ploiditás gyerek leukémiában) CD20 CD10 CD19 CD9 CD34 CD19 CD10 CD38 CD19 IgM CD19 CD45 Co CD19 CD45 icigm CD19 CD45 (ploiditás gyerek leukémiában) SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András 49
Ly I. Áramlás citometriai panelek II. IgG izotípus kontrollok Κ λ CD19 CD3 - CD8 CD4 CD10 CD19 CD45 T-sejtes vonal TCRα/β TCRγ/δ CD2 CD3 CD26 CD4 (Sezary szindr., Mycosis Fung. esetén) B-sejtes vonal CD5 CD23 CD19 CD38 CD56 CD19 CD103 CD22 CD20 Szűk CLL CD10 CD19 CD45 CD5 CD23 CD19 co CD38 CD19 Zap70 CD38 CD19 Szűk Myeloma multiplex. CD10 CD19 CD45 CD38 CD56 CD19 ha CLL Zap70 kontrollal SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András Real-time PCR assay-k 1. BCR-ABL minor génfúzió, t(9;22)(q34;q11) felnőtt ALL-ben 25-30%, gyerek 2-5%, AML-ben ritkábban, CML nagy részében 2. BCR-ABL major génfúzió, t(9;22)(q34;q11) CML nagy részében, ALL ~35%-ban 3. BCL2-IgH génfúzió, t(14;18) FL 4. PML-RARA génfúzió, t(15;17)(q22;q21) M3 AML-ben, 5. CBFB-MYH11 génfúzió Inv(16)(p13q22) 8-9% of newly diagnosed AML, 6. TEL-AML1 génfúzió t(12;21)(p13;q22) gyerek precursor-b-all ~25%-ban 7. MLL-AF4 génfúzió t(4;11)(q21;q23) leggyakoribb 11q23 transzlokáció precursor B-ALL-ben, a terápia indukált ALL mintegy 40-60%-ában. 8. AML1-ETO génfúzió t(8;21)(q22;q22) AML ~8% 9. SIL-TAL1 génfúzió, 1p32 intrakromoszómális mikrodelécio a leggyakoribb kromoszómaaberráció gyerek T-ALL-ben. Az esetek 5-25%-ban,CD3- és TCR ab+ esetekben. SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András 50
FISH PRÓBÁK I Akut myeloid leukaemia t(9;22) ES t(8;21) DF t(15;17) DF 11q23 split inv16 split ES - extra signal DC - dual color BCR/ABL AML1/ETO PML/RARA MLL CBFB B-sejtes akut leukaemia t(12;21) ES t(9;22) ES 11q23 split TEL/AML1 BCR/ABL MLL Chronicus lymphoid leukaemia CEP12 12 17p13 13q14 p53 13q14 11q22.2 ATM SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András FISH PRÓBÁK II Chronicus myeloid leukaemia t(9;22) ES 22q11 split CEP8 8 BCR/ABL BCR Burkitt lymphoma CEP8/t(8;14) TC 8q24 split c-myc/igh c-myc Myelodysplasias syndroma CEP7/7q31 7/7q317q31 5p15/5q33 5p15/5q335q33 Follicularis lymphoma t(14;18) DC 14q32 split 18q21 split Igh/BCL2 IgH BCL2 ES - extra signal DC - dual color SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András 51
Köpenysejtes lymphoma t(11;14) DC 11q13 split CCND1/IgH CCND1 Myeloma multiplex, új beteg 17p t(11;14) t(4;14) ES - extra signal DC - dual color FISH PRÓBÁK III t(11;14) DC 13q14 t(4;14) p53 11q Myeloma multiplex CCND1/IgH Myeloma multiplex, relapszus 1q 17p SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András FISH PRÓBÁK IV 3q27 split CEPXY Egyéb próbák BCL6 XY CEP17 17 CEP3/3p 3/3p3p Anaplasias nagysejtes lymphoma 2p23-2424 split ALK1 ES - extra signal DC - dual color SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András 52
A morfológia szerepe a congenitalis thrombocytopeniák osztályozásában A May-Hegglin anomália: egy autosomalis dominánsan öröklődő, a fehérvérsejtekben látható un. Döhle-szerű testekkel járó macrothrombocytopenia. Egy család két tagján, anyán és fián diagnosztizáltuk a betegséget és észleltük a társuló veseérintettséget (Demeter J, Lelkes G, emes emesl, Kenéz A, Turbucz P,de Chatel R: Familial occurrence ofmay-hegglin anomaly: isthe accompanying renal failure part ofanew subentity? Ann Haematol 80, 368-371 371, 2001). 53
1996-ban egy 41 éves nőbeteget vettünk fel klinikánkra magas láz miatt. Anamnézisében 1984-ben ITP dg-al (vélelmében) végzett splenektomia. Thrombocytaszám: 40 G/. A perifériás vérkenetben óriásthrombocyták és fehérvérsejtek többségében Döhle-szerű kék zárványteseket láttunk. Elektronmikroszkóposan a zárványtestek párhuzamos filamentumokból állnak 54
Klinikai tünetek Vérzési idő (Ivy) Thrombocyta Automatával FK-Mikroszkóppal Anya 16-39x10 9 /l 39-60x10 9 /l Easy bruising Simplate II: 15 perc felett Beteg fiúgyermek 20-27x1027x10 9 /l 40-43x1043x10 9 /l MPV 11,5-12,212,2 11-11,511,5 Thrombocyta morfológia Fvs morfológia Vesefunkció Óriás thrombocyták Orsó alakú kék zárványtestek Krónikus uraemia Normális Proteinuria 2,7-3,5 g/die 1,92 g/die Audiológia May-Hegglin anomáliában szenvedő betegeink klinikai adatai Súlyos retrocochleáris halláscsökkenés Normális Kék zárványtestek, un. Döhle-szerű testek a betegek neutrophil granulocitáiban (May-Grünwald-Giemsa) Giemsa) 55