2.4.23. SZTERINEK ZSÍROS OLAJOKBAN

2.4.23. Szterinek zsíros olajokban Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-1 2.4.23. SZTERINEK ZSÍROS OLAJOKBAN 07/2011:20423 Ha a cikkely nem írja elő a vizsgálati módszert, az A-módszert kell alkalmazni. Az A-módszerről a B- módszerre történő módosításokat validálni kell. A módszer A szterinfrakció elválsztása (VRK) A zsíros olajból kivonjuk az el nem szappanosítható anyagokat, majd ebből 0,2 0,5 mm rétegvastagságú R VRK szilikagél lemezen, vékonyréteg-kromatográfia segítségével (2.2.27.) elkülönítjük a szterin-frakciót. Vizsgálati oldat (a). R betulin R diklórmetános oldatából (2 g/l) a meghatározandó minta szterintartalmának kb. 10 %-ával egyenértékű betulint tartalmazó térfogatot mérünk be egy visszafolyóhűtővel ellátott 150 ml-es lombikba. (Ha pl. olivaolajat vizsgálunk, 500 μl-t, míg egyéb növényi olaj vizsgálata esetében 1500 μl-t mérünk be a betulin-oldatból). Amennyiben a cikkely az egyes szterinek mennyiségét a szterin-frakció százalékában írja elő, betulin hozzáadására nincs szükség. Az oldatot R nitrogén-áramban szárazra párologtatjuk, és a maradékhoz 5,00 g (m) vizsgálandó anyagot mérünk. 50 ml R alkoholos 2 M kálium-hidroxid oldatot adunk hozzá, és gyakori rázogatás közben egy órán át vízfürdőn melegítjük. A melegítés befejeztével az oldatot 25 C alá hűtjük, majd 100 ml R vízzel választótölcsérbe öblítjük, és 3 100 ml R peroxidmentes éterrel óvatosan kirázzuk. Az éteres fázisokat egy másik 40 ml R vizet tartalmazó választótölcsérbe gyűjtjük. Néhány percig tartó, óvatos rázogatás után megvárjuk a fázisok szétválását, majd a vizes fázist elöntjük. Az éteres fázist annyiszor mossuk 40 ml R vízzel, amennyi elegendő ahhoz, hogy a vizes fázisban a fenolftalein már ne jelezzen lúgosságot. Az éteres fázist R peroxidmentes éterrel egy lemért lombikba öblítjük, majd az étert a megfelelő óvórendszabályok figyelembevételével ledesztilláljuk. A maradékhoz 6 ml R acetont adunk. Az oldószert R nitrogén-árammal gondosan elűzzük, és a maradékot 100 105 C-on tömegállandóságig szárítjuk. Exszikkátorban hagyjuk lehűlni, majd lemérjük, és ezután R diklórmetánnal egy kisméretű kémcsőbe mossuk át. Az oldatot R nitrogén-áramban kb. 1 ml-nyire bepárologtatjuk. Az oldat végső koncentrációját aszerint, hogy mennyi az olajban az el nem szappanosítható anyag 25 és 50 mg/ml közé állítjuk be. Vizsgálati oldat (b). 5,00 g R repceolajat az 50 ml R alkoholos 2 M kálium-hidroxid oldatot adunk hozzá kezdetű mondattól a vizsgálandó anyagra előírtak szerint kezelünk. Vizsgálati oldat (c). 5,00 g R napraforgóolajat az 50 ml R alkoholos 2 M kálium-hidroxid oldatot adunk hozzá kezdetű mondattól a vizsgálandó anyagra előírtak szerint kezelünk. Összehasonlító oldat. 25 mg R koleszterint és 10 mg R betulint 1 ml R diklórmetánban oldunk. A vizsgálati oldatok mindegyikét külön lemezen vándoroltatjuk. Az összehasonlító oldatból 10 μl-t viszünk fel, mégpedig a lemez aljától 20, a bal szélétől 10 mm távolságra, 10 mm szélességű sáv formájában; az a), a b) és a c) vizsgálati oldatból 0,5 0,5 ml-t viszünk fel, a lemez aljától 20 mm távolságra, 150 mm szélességű sáv formájában. A lemezeket 35 térfogatrész R éter és 65 térfogatrész R hexán elegyével 17 cm fronttávolság eléréséig kifejlesztjük, majd R nitrogén-áramban megszárítjuk. Ezután R diklórfluoreszcein R etanollal készült oldatával (2 g/l) bepermetezzük, és 254 nm-es ultraibolya fényben értékeljük. Az összehasonlító oldat kromatogramján a koleszterin és a betulin sávja látható. A vizsgálati oldatok kromatogramjain közel azonos R f -értékű szterin-sávok jelennek meg. A három vizsgálati oldat kromatogramjának szterinsávok által elfoglalt területéről melyeket az összehasonlító oldat kromatogramján látható zónák alatti és feletti 2 3 mm-es sávoknak megfelelő

2.4.23. Szterinek zsíros olajokban Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-2 területekkel megnövelünk leszedjük a réteget és külön-külön három 50 ml-es lombikba juttatjuk. A lombikok mindegyikébe 15 ml R diklórmetánt öntünk, és az így kapott szuszpenziókat keverőt és visszafolyóhűtőt alkalmazva 15 percen át melegítjük, majd zsugorított üvegszűrőn (40) (2.1.2.). vagy alkalmas szűrőpapíron egyenként megszűrjük. A szűrőket 3 15 ml R diklórmetánnal mossuk. A három szüredéket a megfelelő mosófolyadékokkal egyesítve külön-külön lombikba visszük és R nitrogén áramban 5 10 ml-nyire bepárologtatjuk. A bepárolt oldatokat kisméretű kémcsövekbe visszük, és R nitrogén áramban beszárítjuk. A szterinek meghatározása (GC) Gázkromatográfia (2.2.28.). A vizsgálat során ügyelünk a nedvesség kizárására, és az oldatokat frissen készítjük. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból vékonyréteg-kromatográfiásan elkülönített szterinekhez 0,04 ml R klór-trimetilszilán, 0,1 ml R hexametildiszilazán és 0,5 ml R vízmentes piridin frissen készített elegyét adjuk. Az így nyert keveréket legalább 5 percig állni hagyjuk. A továbbiakban a folyékony fázist használjuk. Összehasonlító oldat (a). Az R repceolajból vékonyréteg-kromatográfiásan elkülönített szterinekhez (9 rész) R koleszterint (1 rész) adunk. A keverékhez 0,04 ml R klór-trimetilszilán, 0,1 ml R hexametildiszilazán és 0,5 ml R vízmentes piridin frissen készített elegyét adjuk. Az így nyert keveréket legalább 5 percig állni hagyjuk. A továbbiakban a folyékony fázist használjuk. Összehasonlító oldat (b). Az R napraforgóolajból vékonyréteg-kromatográfiásan elkülönített szterinekhez 0,04 ml R klór-trimetilszilán, 0,1 ml R hexametildiszilazán és 0,5 ml R vízmentes piridin frissen készített elegyét adjuk. Az így nyert keveréket legalább 5 percig állni hagyjuk. A továbbiakban a folyékony fázist használjuk. Oszlop: anyaga: kvarcüveg; méretei: l = 20 30 m, = 0,25 0,32 mm; állófázis: R poli[metil(95)fenil(5)]sziloxán vagy R poli[(cianopropil)(7)(fenil)(7)(metil) (86)sziloxán] (filmvastagság: 0,25 μm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hidrogén vagy R kromatográfiás célra szánt hélium. Lineáris áramlási sebesség: 30 50 cm/s (hidrogén), ill. 20 35 cm/s (hélium). Mintaáram-elosztási arány: 1:50 (hidrogén), ill. 1:100 (hélium). Hőmérséklet: oszlop: 260 C; injektor: 280 C; detektor: 290 C. Detektálás: lángionizációval. Injektálás: 1 μl. Csúcsok azonosítása: az a) összehasonlító oldat kromatogramján négy fő csúcs a koleszterin, a brasszikaszterin, a kampeszterin és a β-szitoszterin csúcsa jelenik meg. A b) összehasonlító oldat kromatogramján szintén négy fő csúcs a kampeszterin, a sztigmaszterin, a β-szitoszterin és a Δ7-

2.4.23. Szterinek zsíros olajokban Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-3 sztigmasztenol csúcsa látható. A relatív retenciókat a β-szitoszterinre (főcsúcs) vonatkoztatva a 2.4.23.-1 táblázat foglalja össze. A belső standard (betulin) csúcsa egyértelműen különüljön el a meghatározandó szterincsúcsoktól. A vizsgálati oldat kromatogramján a vizsgálandó anyag szterinfrakciójának minden összetevőjét azonosítjuk, és az alábbi képlet alapján százalékban kifejezett mennyiségét is kiszámoljuk: A 100, S ahol A = a meghatározandó összetevő csúcsterülete; S = a 2.4.23.-1. táblázatban feltüntetett összetevők csúcsterületeinek összege; a betulin csúcsát elhanygoljuk. Amennyiben a cikkely előírja, kiszámoljuk az egyes szterineknek a vizsgálandó anyag 100 g-jára vonatkoztatott, milligrammban kifejezett mennyiségét. A számításhoz az alábbi képletet használjuk. 100 A m, A m ahol A = a meghatározandó összetevő csúcsterülete; A = a betulin csúcsterülete; m = a vizsgálandó minta mennyisége grammban; m = a hozzáadott R betulin mennyisége milligrammban. 2.4.23.-1. táblázat. Relatív retenciók a szterinek esetében β-szitoszterinre vonatkoztatva, két különböző oszlopon mérve. Poli(cianopropil)(7)(fenil(7)- (metil)(86)sziloxán Poli[metil(95)fenil(5)]sziloxán Koleszterin 0,64 0,63 Brasszikaszterin 0,70 0,71 24-Metilén-koleszterin 0,79 0,80 Kampeszterin 0,82 0,81 Kampesztanol 0,83 0,82 Sztigmaszterin 0,87 0,87 Δ7-Kampeszterin 0,93 0,92 Δ5,23-Sztigmasztadienol 0,95 0,95 Kleroszterin 0,96 0,96 β-szitoszterin 1 1 Szitosztanol 1,01 1,02 Δ5-Avenaszterin 1,03 1,03 Δ5,24-Sztigmasztadienol 1,09 1,08 Δ7-Sztigmasztenol (1) 1,13 1,12 Δ7-Avenaszterin 1,18 1,16 Betulin 1,4 1,4 (1) Az irodalomban Δ7-sztigmaszterin néven is szerepel

2.4.23. Szterinek zsíros olajokban Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-4 B módszer Az el nem szappanosítható anyagok kivonása Az el nem szappanosítható anyagokat a vizsgálandó anyag cikkelyének El nem szappanosítható anyagok pontban előírt módszer szerint vonjuk ki. Amennyiben ez nem sikerül, a 2.5.7. El nem szappanosítható rész fejezetben leírtak szerint végezzük el a kivonást. Az utolsó semlegesítési lépést követően elpárologtatjuk az alkoholt, 6 ml R acetont adunk a mintához, majd elpárologtatjuk az oldószert. A maradékot 100 105 C-on szárítjuk, de nem szükséges tömegállandóságig szárítani. Ezzel egyidejűleg R napraforgó olaj nem elszappanosítható részét ugyanilyen körülmények között kivonjuk. Ennek segítségével állapítjuk meg, hogy melyik frakciót kell összegyűjteni. A szterin frakció elválasztása (LC) Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. A maradékot 3 4 ml, az el nem szappanosítható rész kivonásakor használt oldószerrel (általában R éter, vagy R könnyű petroléter) átmossuk egy 15 ml-es kémcsőbe, majd R nitrogén-áram alatt szárazra párologtatjuk. A maradékot annyi mozgófázisban oldjuk, hogy kb. 40 mg/ml töménységű oldatot kapjunk. Az oldhatóság növelése érdekében néhány csepp R1 2- propanolt adunk az elegyhez (általában 3 csepp elegendő a teljes oldódás eléréséhez), majd membránszűrőn szűrjük (névleges pórusméret 0,45 μm). Összehasonlító oldat. Az R napraforgóolajból kapott el nem szappanosítható résszel, a vizsgálati oldatnál leírtak szerint járunk el. Előtétoszlop: méretei: l = 5 mm;ø = 4,6 mm; állófázis: 6 nm pórusméretű R kromatográfiás célra szánt szilikagél (5 μm). Oszlop: méretei: l = 0,25 m;ø = 4,6 mm; állófázis: 6 nm pórusméretű R kromatográfiás célra szánt szilikagél (5 μm). Mozgófázis: R1 2-propanol R hexán (1+99 V/V). Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: 210 nm-en, spektrofotométerrel. Injektálás: 50 μl. A szterincsúcsok azonosítása: a szterinek a kromatogram végén jelennek meg. Az összegyűjtött frakciót az összehasonlító oldattal kapott kromatogram alapján azonosítjuk, mely esetében két főcsúcs jelenik meg kb. 23 és 32 percnél. A detektorkimenetnél gyűjtsük össze a frakciót egy 15 ml-es csavaros kupakos kémcsőbe, majd az oldószert R nitrogén-áramban párologtassuk el. Szterinek meghatározása (GC) Gázkromatográfia (2.2.28). Vizsgálati oldat. Az előző, folyadékkromatográfiás lépésben kapott, a vizsgálati oldatnál leírtak szerint szárazra párologtatott szterinfrakciót 0,2 ml R vízmentes piridin és 0,2 ml R klór-trimetilszilán R N,O-bisz(trimetilszilil)trifluoracetamid (1+99 V/V) felhasználásával feloldjuk. A kémcsövet szorosan lezárjuk, és tartalmát 20 percen keresztül 80 C-on melegítjük. Az elegy lehűlését követően a folyadékfázist használjuk. Összehasonlító oldat. Az előző, folyadékkromatográfiás lépésben kapott, a referencia oldatnál leírtak szerint szárazra párologtatott szterinfrakciót 0,2 ml R vízmentes piridin és 0,2 ml R klór-

2.4.23. Szterinek zsíros olajokban Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-5 trimetilszilán R N,O-bisz(trimetilszilil)trifluoracetamid (1+99 V/V) felhasználásával feloldjuk. A kémcsövet szorosan lezárjuk, és tartalmát 20 percen keresztül 80 C-on melegítjük. Az elegy lehűlését követően a folyadékfázist használjuk. Önmagában koleszterin standard (R koleszterin), de a koleszterin standard napraforgóolaj szterinfrakciójával készített elegye is használható. A származékképzést a vizsgálati oldat készítésénél leírtak szerint végezzük. Oszlop: anyaga: kvarcüveg; méretei: l = 30 m, Ø = 0,25 mm; állófázis: R poli[metil(95)fenil(5)]sziloxán (filmvastagság 0,25 μm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szán hélium. Áramlási sebesség: 2,6 ml/perc. Mintáram-elosztásái arány: 1:25. Hőmérséklet: Idő (perc) Hőmérséklet ( C) Oszlop 0 38 260 38 44 260 290 44 49 290 Injektor 290 Detektor 290 Detektálás: lángionizációs detektor. Injektálás: 1 3 μl (attól függően, hogy mennyi a vizsgálandó minta várt szterintartalma). Csúcsazonosítás: a kampeszterin, sztigmaszterin, β-szitoszterin és Δ7-sztigmasztenol csúcsát az összehasonlító oldattal kapott kromatogram segítségével, a vizsgálati oldat kromatogramján a szterineknek megfelelő csúcsokat pedig az összehasonlító oldattal kapott kromatogram és a β- szitoszterinre (főcsúcs) vonatkoztatott, a 2.4.23.-1. táblázatban megadott relatív retenciók alapján azonosítjuk. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: csúcsfelbontás: legalább 4,0 a kampeszterin és sztigmaszterin között. A vizsgálati anyag szterinfrakciójában található minden egyes szterin százalékos tartalmát a következő képlet segítségével számoljuk ki: A 100, S ahol A = a meghatározandó komponens csúcsterülete; S = a 2.4.23.-1. táblázatban megadott komponensekhez tartozó csúcsterületek összege, a betulint nem számítva.

Oldószermaradványok azonosítása és ellenőrzése Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur. 7.2-1 2.4.24. OLDÓSZERMARADVÁNYOK AZONOSÍTÁSA ÉS ELLENŐRZÉSE 01/2008:20424 javított 7.2 Ezen általános módszer keretében előírt vizsgálati eljárásokat az alábbi célokra alkalmazhatjuk: i. az 1. és 2. osztályba sorolt oldószermaradványok többségének azonosítására hatóanyagokban, segédanyagokban vagy gyógyszerkészítményekben, amikor az oldószermaradványok ismeretlenek; ii. a hatóanyagokban, segédanyagokban és gyógyszerkészítményekben található, az 1. és 2. osztályba sorolt oldószerek határérték- vizsgálatára; iii. a 2. osztályba sorolt oldószerek mennyiségi meghatározására, ha a megengedett határértékek 1000 ppm (0,1%) felett vannak, vagy a 3. osztályba sorolt oldószerek mennyiségi meghatározására, ha ez a követelmény. Az 1., a 2. és a 3. osztályba sorolt oldószermaradványok jegyzékét az 5.4. Oldószermaradványok c. általános fejezet tartalmazza. A minta előkészítésére alkalmazható három oldószert, és a gőz-halmazállapotú minta gőztérinjektálásának körülményeit jelen fejezet írja elő. A megadott két kromatográfiás rendszer közül elsősorban az A) rendszert használjuk. A B) rendszer általában az azonosság megerősítésére szolgál. A minta előkészítési módjának megválasztása a vizsgálandó anyag oldékonyságától és bizonyos esetekben az ellenőrzendő oldószermaradványoktól függ. Az előírt gőztér-injektálási körülmények között a formamid, a 2-etoxietanol, a 2-metoxietanol, az etilénglikol, az N-metilpirrolidon és a szulfolán rosszul detektálhatók, az ilyen oldószermaradványok ellenőrzésére más, alkalmas módszereket kell alkalmazni. Ha a vizsgálati eljárást az oldószermaradványok kvantitatív meghatározására használjuk, a módszert validálni kell. VIZSGÁLAT Gázkromatográfiás vizsgálatot végzünk statikus gőztér-injektálással (2.2.28). Mintaelőkészítés (1). Ezt a módszert vízoldékony anyagokban lévő oldószermaradványok ellenőrzésére alkalmazzuk. Minta-oldat (1). 0,200 g vizsgálandó anyagot R vízzel 20,0 ml-re oldunk. Mintaelőkészítés (2). Ezt a módszert vízben nem oldódó anyagokban lévő oldószermaradványok ellenőrzésére alkalmazzuk. Minta-oldat (2). 0,200 g vizsgálandó anyagot R N,N-dimetilformamiddal (DMF) 20,0 ml-re oldunk. Mintaelőkészítés (3). Ezt a módszert N,N-dimetilacetamid és/vagy N,N-dimetilformamid vizsgálatára alkalmazzuk, ha tudjuk vagy feltételezzük, hogy egyikük vagy mindkettő jelen van a vizsgálandó anyagban. Minta-oldat (3). 0,200 g vizsgálandó anyagot R 1,3-dimetil-2-imidazolidinonnal (DMI) 20,0 ml-re oldunk. Olyan esetekben, amikor a minta előkészítésére a fentebb megadott eljárások egyike sem alkalmas, bizonyítani kell, hogy az a hígító oldószer, amelyet a minta-oldat elkészítéséhez használunk és azok a statikus gőztér-injektálási körülmények, amelyeket alkalmazunk, megfelelőek.

Oldószermaradványok azonosítása és ellenőrzése Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur. 7.2-2 Oldószer törzsoldat (a). 1,0 ml CRS I. osztályba sorolt oldószermaradvány-oldathoz 9 ml R dimetilszulfoxidot elegyítünk és az elegyet R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. Az összehasonlító oldatok az alábbi határértékeknek felelnek meg: benzol: 2 ppm, széntetraklorid: 4 ppm, 1,2-diklóretéén: 8 ppm, 1,1,1-triklóretán: 10 ppm. Oldószer-törzsoldat (b). A 2. osztályba sorolt oldószermaradványokból a megfelelő mennyiségeket R dimetilszulfoxidban oldjuk és az oldatot R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Ezt az oldatot úgy hígítjuk tovább, hogy koncentrációja az 5.4. Oldószermaradványok c. fejezet 2. táblázatában megadott határértékek huszadrésze legyen. Oldószer-törzsoldat (c). A vizsgálandó anyagban jelenlévő oldószer(ek)ből 1,00 g-ot R dimetilszulfoxidban vagy ha a víz is megfelelő R vízben oldunk, majd R vízzel 100,0 ml-re hígítunk. Ezt az oldatot úgy hígítjuk tovább, hogy koncentrációja az 5.4. Oldószermaradványok c. fejezet 1. ill. 2. táblázatában megadott határérték(ek) huszadrésze legyen. Üres oldat. Az oldatot a c) oldószer-törzsoldattal azonos módon, de a vizsgálandó anyagban jelenlevő oldószer(ek) hozzáadása nélkül készítjük (annak igazolására, hogy zavaró csúcsok nincsenek jelen). Vizsgálati oldat. A minta-oldat 5,0 ml-ét és az üres oldat 1,0 ml-ét injekciós üvegbe töltjük. Összehasonlító oldat (a) (1. osztály). Az a) oldószer-törzsoldat 1,0 ml-ét és a megfelelő hígítóoldószer 5,0 ml-ét injekciós üvegbe töltjük. Összehasonlító oldat (a 1 ) (1. osztály). A minta-oldat 5,0 ml-ét és az a) oldószer-törzsoldat 1,0 ml-ét injekciós üvegbe töltjük. Összehasonlító oldat (b) (2. osztály). A b) oldószer-törzsoldat 1,0 ml-ét és a megfelelő hígító-oldószer 5,0 ml-ét injekciós üvegbe töltjük. Összehasonlító oldat (c). A minta-oldat 5,0 ml-ét és a c) oldószer-törzsoldat 1,0 ml-ét injekciós üvegbe töltjük. Összehasonlító oldat (d). Az üres oldat 1,0 ml-ét és a megfelelő hígító-oldószer 5,0 ml-ét injekciós üvegbe töltjük. Az injekciós üvegeket jól záró, teflonbevonatú gumimembránnal zárjuk; a jó zárást megfelelő alumínium rásajtolásával is biztosítjuk. Az oldatokat összerázással homogenizáljuk. A statikus gőztér-injektáláshoz javasolt körülmények: Mintaelőkészítési eljárások Vizsgálati körülmények 1 2 3 az egyensúlybeállítás hőmérséklete ( C) 80 105 80 az egyensúlybeállítás ideje (perc) 60 45 45 az átvezetőcső hőmérséklete ( C) 85 110105 vivőgáz: megfelelő nyomású R kromatográfiás célra szánt nitrogén vagy R kromatográfiás célra szánt hélium a nyomás alá helyezés időtartama (s) 30 30 30 injektált mennyiség (ml) 1 1 1 A kromatográfiás vizsgálathoz javasolt körülmények:

Oldószermaradványok azonosítása és ellenőrzése Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur. 7.2-3 A) RENDSZER térhálós poli[(cianopropil)-fenilsziloxán]-nal (6%) és poli[dimetilsziloxán]-nal (94%) bevont, 30 m hosszú hagyományos vagy nagy átmérőjű (0,32 vagy 0,53 mm) kapilláris-kvarcoszlop (a filmbevonat vastagsága: 1,8 vagy 3 μm), a vivőgáz R kromatográfiás célra szánt nitrogén vagy R kromatográfiás célra szánt hélium, a mintaáram-elosztási arány 1:5, a lineáris áramlási sebesség kb. 35 cm/s, lángionizációs detektor (tömegspektrométer vagy az 1. osztályba sorolt klórtartalmú oldószermaradványokhoz elektronbefogásos detektor is használható). Az oszlop hőmérsékletét 20 percen át 40 C-on tartjuk, majd 240 C-ig percenként 10 C-kal emeljük, végül 20 percen át 240 C-on tartjuk; az injektor hőmérséklete: 140 C, a detektor hőmérséklete: 250 C. Ha a mátrix zavarja a vizsgálatot, a B) rendszert alkalmazzuk. B) RENDSZER R makrogol 20000-rel bevont, 30 m hosszú, hagyományos vagy nagy átmérőjű (0,32 vagy 0,53 mm) kapilláris-kvarcoszlop (a filmbevonat vastagsága: 0,25 μm), A vivőgáz R kromatográfiás célra szánt nitrogén vagy R kromatográfiás célra szánt hélium, a mintaáram-elosztási arány 1:5, a lineáris áramlási sebesség kb. 35 cm/s, lángionizációs detektor (tömegspektrométer vagy az 1. osztályba sorolt klórtartalmú oldószermaradványokhoz elektronbefogásos detektor is használható). Az oszlop hőmérsékletét 20 percen át 50 C-on tartjuk, majd 165 C-ig percenként 6 C-kal emeljük, végül 20 percig 165 C-on tartjuk; az injektor hőmérséklete: 140 C, a detektor hőmérséklete: 250 C. Az a) összehasonlító oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk az A) rendszerhez előírt oszlopra és felvesszük a kromatogramot; a körülményeket úgy szabályozzuk, hogy az 1,1,1-triklóretánra vonatkoztatott jel/zaj arány mérhető legyen. A jel/zaj arány értéke legalább 5 legyen. A 2.4.24.-1. ábrán egy jellegzetes kromatogram látható. Az a 1 ) összehasonlító oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk az A) rendszerhez előírt oszlopra. Az 1. osztályba sorolt oldószermaradványok csúcsai még detektálhatók legyenek. A b) összehasonlító oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk az A) rendszerhez előírt oszlopra és felvesszük a kromatogramot; a körülményeket úgy szabályozzuk, hogy az acetonitril és a diklórmetán közti csúcsfelbontás meghatározható legyen. A rendszer alkalmasnak tekinthető, ha az így kapott kromatogram, jellegét tekintve megegyezik a 2.4.24.-2. ábrán bemutatott kromatogrammal, továbbá az acetonitril és a diklórmetán közti csúcsfelbontás legalább 1,0. A vizsgálati oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk az A) rendszerhez előírt oszlopra. Amennyiben a kapott kromatogramon nincs olyan csúcs, amely megfelel az a) vagy a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható valamelyik oldószermaradvány-csúcsnak, a vizsgálandó anyag megfelel a vizsgálat követelményeinek. Amennyiben a vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő bármelyik csúcs megfelel az a) vagy a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható valamelyik oldószermaradvány-csúcsnak, a B) rendszert kell alkalmazni. Az a) összehasonlító oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk a B) rendszerhez előírt oszlopra és felvesszük a kromatogramot; a kromatogram felvételéhez a körülményeket úgy szabályozzuk, hogy a benzolra vonatkoztatott jel/zaj arány mérhető legyen. A jel/zaj arány értéke legalább 5 legyen. A 2.4.24.-3. ábrán egy jellegzetes kromatogram látható. Az a 1 ) összehasonlító oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk a B) rendszerhez előírt oszlopra. Az 1. osztályba sorolt oldószermaradványok csúcsai még detektálhatók legyenek.

Oldószermaradványok azonosítása és ellenőrzése Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur. 7.2-4 A b) összehasonlító oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk a B) rendszerhez előírt oszlopra és felvesszük a kromatogramot; a körülményeket úgy szabályozzuk, hogy az acetonitril és a triklóretilén közti csúcsfelbontás meghatározható legyen. A rendszer alkalmasnak tekinthető, ha az így kapott kromatogram, jellegét tekintve megegyezik a 2.4.24.-4. ábrán bemutatott kromatogrammal, továbbá az acetonitril és a triklóretilén közti csúcsfelbontás legalább 1,0. A vizsgálati oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk a B) rendszerhez előírt oszlopra. Amennyiben a kapott kromatogramon nincs olyan csúcs, amely megfelel az a) vagy a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható valamelyik oldószermaradvány-csúcsnak, a vizsgálandó anyag megfelel a vizsgálat követelményeinek. Amennyiben a vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő bármelyik csúcs megfelel az a) vagy a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható valamelyik oldószermaradvány-csúcsnak és ez a megfelelés megerősíti az A) rendszer alkalmazásakor kapott eredményt, az alábbiak szerint kell eljárni. A c) összehasonlító oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk az A) vagy a B) rendszerhez előírt oszlopra. Szükség esetén úgy szabályozzuk a rendszer érzékenységét, hogy az azonosított oldószermaradványnak megfelelő csúcs magassága elérje a regisztráló teljes skálaszélességének legalább 50%-át. A d) összehasonlító oldat gázfázisának 1 ml-ét injektáljuk az oszlopra. Zavaró csúcsok nem jelenhetnek meg a kromatogramon. A vizsgálati oldat gőzfázisának 1 ml-ét majd a c) összehasonlító oldat gőzfázisának 1 ml-ét injektáljuk az oszlopra. Az injektálásokat még két ízben megismételjük. A vizsgálati oldat kromatogramjain az oldószermaradvány(ok) átlagos csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján a megfelelő oldószermaradvány(ok) átlagos csúcsterületének fele. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha a vizsgált csúcsokat illetően a c) összehasonlító oldat és a vizsgálati oldat három-három párhuzamos injektálással kapott kromatogramjain az egymásnak megfelelő csúcsterületek közti különbség relatív szórása legfeljebb 15%. A vizsgálat menete a 2.4.24.-5. ábrán látható. Amennyiben valamelyik 2. vagy 3. osztályba sorolt oldószermaradvány mennyisége eléri a 0,1%-ot vagy ennél nagyobb, kvantitatív meghatározásához a standard addíciós módszer alkalmazható. 1. 1,1-diklóretilén 2. 1,1,1-triklóretán 3. széntetraklorid 4. benzol 5. 1,2-diklóretán

Oldószermaradványok azonosítása és ellenőrzése Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur. 7.2-5 2.4.24.-1. ábra Az 1. osztályba sorolt oldószerek jellegzetes kromatogramja (A) rendszer, 1. eljárás, lángionizációs detektor. 1. metanol 5. cisz-1,2-diklóretilén 9. 1,2-dimetoxietán 13. piridin 16. klórbenzo 2. acetonitril 6. nitrometán 10. 1,1,2-triklóretilén 14. toluol 17. xilol (orto, meta, para) 3. diklórmetán 7. kloroform 11. metilciklohexán 15. 2-hexanon 18. tetralin 4. hexán 8. ciklohexán 12. 1,4-dioxán l 2.4.24.-2. ábra A 2. osztályba sorolt oldószerek jellegzetes kromatogramja (A) rendszer, 1. eljárás, lángionizációs detektor. 1. 1,1-diklóretilén 2. 1,1,1-triklóretán 3. széntetraklorid 4. benzol 5. 1,2 diklóretán 2.4.24.-3. ábra Az 1. osztályba sorolt oldószerek jellegzetes kromatogramja (B) rendszer, 1. eljárás, lángionizációs detektor.

Oldószermaradványok azonosítása és ellenőrzése Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur. 7.2-6 1. metanol 5. cisz-1,2-diklóretilén 9. 1,2-dimetoximetán 13. piridin 17. xilol (orto, meta, para) 2. acetonitril 6. nitrometán 10. 1,1,2-triklóretilén 14. toluol 18. tetralin 3. diklórmetán 7. kloroform 11. metilciklohexán 15. 2-hexanon 4. hexán 8. ciklohexán 12. 1,4-dioxán 16. klórbenzol 2.4.24.-4. ábra A 2. osztályba sorolt oldószerek jellegzetes kromatogramja (B) rendszer, 1. eljárás, lángionizációs detektor.

Oldószermaradványok azonosítása és ellenőrzése Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur. 7.2-7 2.4.24.-5. ábra Oldószermaradványok azonosításának és a határérték-vizsgálat alkalmazásának folyamatábrája.

2.6.20. ANTI-A ÉS ANTI-B HEMAGGLUTININEK 07/2011:20620 A MÓDSZER: KÖZVETETT MÓDSZER A vizsgálandó készítményből R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával két párhuzamos hígítási sorozatot készítünk. Az egyik sorozat minden egyes hígításához A 1 csoportú vörösvérsejtek 5 %V/V-os, a nátrium-klorid-oldattal előzőleg háromszor mosott szuszpenziójának azonos térfogatait mérjük. A másik sorozat minden egyes hígításához B csoportú vörösvérsejtek 5 %V/V-os, a nátrium-klorid-oldattal előzőleg háromszor mosott szuszpenziójának azonos térfogatait mérjük. A szuszpenziókat 30 percig 37 C-on inkubáljuk, majd a sejteket a nátrium-klorid-oldattal háromszor mossuk. A sejteket polivalens anti-humánglobulin reagenssel együtt 30 percen át állni hagyjuk. MIkroszkóp alatt minden egyes szuszpenziót agglutinációra vizsgálunk, centrifugálást nem végzünk. B MÓDSZER: KÖZVETLEN MÓDSZER ANYAGOK Nátrium-klorid-tartalmú foszfát tompítóoldatban (PBS). 8,0 g R nátrium-kloridot, 0,76 g R vízmentes dinátrium-hidrogén-foszfátot, 0,2 g R kálium-kloridot és 0,2 g R kálium-dihidrogén-foszfátot R vízzel 1000 ml-re oldunk. Az oldathoz, amennyiben több napon át kell tárolni, a mikrobiológiai szennyeződés elkerülése céljából 0,2 g R nátrium-azid adható. PBS-BSA oldat. 2 g/l R szarvasmarha szérumalmumint (V. Cohn frakció, ELISA céljára) tartalmazó PBS. Az oldatot 2-8 C-on tároljuk, de felhasználás előtt hagyjuk, hogy 19-25 C-ra melegedjen. Papain-oldat. Kereskedelmi forgalomban levő, szerológiai tisztaságú, validált aktivitású papain-oldatot használunk. Vörösvérsejtek. Lehetőleg 3 donorból származó, egyesített D-negatív A 1 (A 1 rr), D negatív B (Brr) és D negatív 0 (0rr) vörösvérsejteket használunk. Mindenképpen 3 donor szükséges a BRP anti-a és anti-b ellenanyagok határérték-vizsgálatára szánt immunglobulin alkalmazása esetén. Az A 2 vörösvérsejtek használata nem javasolt, mert ezek gyengébb reakciót adnak. A sejteket a PBS-sel négyszer mossuk, vagy addig, amíg a felülúszó tiszta nem lesz. Minden egyes mosás alkalmával a sejteket legalább két térfogatnyi PBS-ben szuszpendáljuk, majd a sejteket 5 percen át tartó centrifugálással (1800 g) tömörítjük, és a felülúszót elöntjük. A vörösvérsejtmasszát a gyártó előírásai szerint papain-oldattal kezeljük, majd a sejteket PBS-sel négyszer mossuk. A vörösvérsejtek legfeljebb 1 hétig tárolhatók, tartósító oldatban, 2-8 C-on. A következő összetételű készítmény megfelelő: Trinátrium-citrát D-Glükóz Citromsav Nátrium-klorid Inozin Adenozin-trifoszfát (ATP) Klóramfenikol Neomicin-szulfát 8 g/l 20 g/l 0,5 g/l 4,2 g/l 0,938 g/l 0,4 g/l 0,34 g/l 0,1 g/l

Ha tárolt sejteket használunk, a sejteket felhasználás előtt PBS-sel legalább kétszer mossuk, vagy addig, amíg a felülúszó ki nem tisztul. Mikrotiter lemezek. V-aljú, merev mikrotiter lemezeket használunk. Referencia standardok. Pozitív kontrollként BRP (anti-a és anti-b ellenanyag vizsgálat pozitív kontroll) immunglobulin, negatív kontrollként pedig BRP (anti-a és anti-b ellenanyag vizsgálat pozitív kontroll) immunglobulin használható. A közvetlen módszer beállításánál és kivitelezésénél ezeket a kontrollokat kell iránymutatóként alkalmazni. A BRP anti-a és anti-b ellenanyagok határérték-vizsgálatára szánt immunglobulin a humán immunglobulin gyártási tételeire ajánlott legnagyobb megengedhető határértékeket határozza meg, ezért csak olyan humán immunglobulin gyártási tételekkel való összehasonlításra szabad felhasználni, amelyek a pozitív kontrolloknál magasabb titerrel rendelkeznek. MÓDSZER Az ebben a fejezetben leírt vizsgálatot a pozitív kontroll oldatokon, a negatív kontroll oldatokon és a vizsgálati oldatokon egyidőben és azonos körülmények között, szobahőmérsékleten kell elvégezni. Ha szükséges, a vizsgálatot BRP anti-a és anti-b ellenanyagok határérték-vizsgálatára szánt immunglobulinnal is el kell végezni. Össszehasonlító oldatok. A pozitív kontrollt és a negatív kontrollt az előírásoknak megfelelően feloldjuk. Az immunglobulin G (IgG) koncentráció minden egyes feloldott készítményben 50 g/l legyen. PBS-BSAoldattal minden egyes feloldott készítményből felező hígítást készítünk, hogy 25 g/l töménységű IgG oldatokat nyerjünk. PBS-BSA oldattal sorozatban hét további felező hígítást készítünk minden egyes készítményből, hogy a hígítási tartományt 1/256 hígításig (0,195 g/l IgG) kiterjesszük. Minden egyes készítmény minden egyes hígításából a mikrotiter lemez lyukaiba 3 párhuzamos beméréssel 20-20 µl mintát viszünk. Vizsgálati oldatok. A vizsgálandó készítményt PBS-BSA oldattal úgy hígítjuk, hogy az IgG kiindulási koncentrációja 25 g/l legyen. 50 g/l töménységű készítmény esetében ez felező hígítást jelent. Az 50 g/l IgG koncentrációtól eltérő töménységű készítmény esetében a hígítási faktort úgy állítjuk be, hogy a vizsgálat céljára 25 g/l kiindulási koncentrációt kapjunk. Ehhez a 25 g/l oldathoz, a referenciaoldatokkal történő összehasonlítás céljából, névlegesen kétszeres hígítási faktort rendelünk hozzá, még abban az esetben is, ha ez nem azt a valós hígítási faktort tükrözi, amelyet a 25 g/l töménység beállítására használtunk. A készítményből PBS-BSA-oldattal sorozatban további hét felező hígítást készítünk, hogy a névleges hígítási tartományt 1/256 hígításig (0,195 g/l IgG) kiterjesszük, az azonos koncentrációtartományba eső IgG referenciakészítményekkel történő összehasonlítás céljából. Minden egyes hígításból a mikrotiter lemez lyukaiba 3 párhuzamos beméréssel 20-20 µl mintát viszünk. Papainnal kezelt D-negatív A 1, B és 0 csoportú vörösvérsejtekből PBS/BSA oldatban 3 %V/V-os szuszpenziókat készítünk. A vizsgálandó készítmény, a pozitív kontroll, illetve a negatív kontroll első, második és harmadik hígítási sorozataihoz rendre A 1, B, illetve 0 csoportú D negatív vörösvérsejtszuszpenziók 20-20 µl-ét adjuk. A lemezt homogenizálás céljából rázógépen 10 másodpercig (vagy a sejtek szuszpendálásáig) rázatjuk. A lemezt a sejtek tömörítése érdekében szobahőmérsékleten 80 g-vel 1 percig centrifugáljuk. A lemezt mintegy 70 -os szögben megdöntve helyezzük el, és az eredményt 4-5 perc múlva olvassuk le, illetőleg akkor, amikor a negatív kontrollok (D-negatív 0-ás vörösvérsejtek és a negatív kontroll oldat) már folynak A lyuk alján megjelenő sejtgömb pozitív eredményt jelez. A folyó sejtek a negatív eredményt jelzik. Végpont titerként a pozitív eredményt adó legnagyobb hígítás reciprokát jegyezzük fel. A pozítív kontroll névleges anti-a- és anti-b-titere 32 (32-64 közötti tartomány az anti-a-ra; 16-32 közötti tartomány az anti-b-re), a negatív kontrollok (D- negatív 0-ás vörösvérsejt és negatív kontroll oldat) nem

mutathatnak agglutinációt a kiindulási, illetőleg az első és második hígításban. A felhasználóknak saját vizsgálati körülményeiket validálniuk kell, abban az esetben pedig, ha az eredmények a várt értékektől jelentősen különböznek, a mérési körülményeket és a reagenseket is vizsgálniuk kell. Ha a negatív kontrollokkal nem sikerül negatív reakciót kapni, azt jelentheti, hogy például a sejtek elfolyósodásig nem telt el elegendő idő, vagy hogy a vizsgálatot közvetlenül a hidegen tárolt reagensekkel végezték el. Ha a vizsgálandó készítmény anti-a vagy anti-b titere nagyobb, mint a pozitív kontroll titere, amennyiben mindkét készítményt 25 g/l töménységű oldatból titrálták, a vizsgálati készítményt BRP anti-a és anti-b ellenanyagok határérték-vizsgálatára szánt immunglobulinnal kell összehasonlítani. Amennyiben a készítményt 25 g/l töménységű oldatból titráltuk, a legnagyobb megengedhető titer 64.

2.6.26. Intravénás alkalmazásra szánt humán immunglobulin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-1 2.6.26. INTRAVÉNÁS ALKALMAZÁSRA SZÁNT HUMÁN IMMUNGLOBULIN ANTI-D ELLENANYAGAINAK MEGHATÁROZÁSI MÓDSZERE 07/2009:20626 ANYAGOK Nátrium-klorid tartalmú foszfát tompítóoldat (PBS). 8,0 g R nátrium-kloridot, 0,76 g R vízmentes dinátrium-hidrogén-foszfátot, 0,2 g R kálium-kloridot és 0,2 g R káliumdihidrogén-foszfátot R vízzel 1000 ml-re oldunk. Ha az oldatot néhány napig el kell tartani, akkor a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében 0,2 g R nátrium-azidot adhatunk hozzá. PBS-BSA oldat. 2,0 g/l R szarvasmarha albumint tartalmazó PBS (ELISA-hoz V. Cohn-frakció). Az oldatot 2 8 C között tároljuk, de felhasználás előtt hagyjuk, hogy a hőmérséklete 19 25 C közé álljon be. Papain oldat. Kereskedelmi forgalomban beszerezhető, szerológiai minőségű, validált aktivitású papaint használunk. Vörösvérsejtek. Legalább három, lehetőleg OR 2 R 2 vércsoportú donortól származó D-pozitív vörösvérsejt keveréket használunk. A D-pozitív vörösvérsejteket OR 1 R 1 vagy OR 1 R 2 donoroktól is beszerezhetjük. A különböző fenotípusok keverését nem vizsgálták, ezért használatuk nem ajánlott. Lehetőleg legalább három Orr-vércsoportú donortól származó D-negatív vörösvérsejt-keveréket használunk. Amennyiben csak egy Orr-vércsoportú donor áll rendelkezésre, úgy ettől az egy donortól származó D-negatív vörösvérsejtek is használhatók. A sejteket PBS-sel négyszer, vagy mindaddig mossuk, míg a felülúszó tiszta nem lesz. Minden egyes mosás során a sejteket legalább 2 ml PBS-sel mossuk, utána 1800 g-vel 5 percig centrifugáljuk, míg a sejtek kiülepednek, majd elöntjük a felülúszót. A vörösvérsejtmasszát papain oldattal a gyártó előírásainak megfelelően kezeljük és négyszer PBS-sel mossuk. A vörösvérsejtmassza legfeljebb egy hétig tartható el 2 8 C között a tartósító oldatban. A következő összetételű tartósító oldat megfelelő: Nátrium-citrát 8 g/l D-glükóz Citromsav Nátrium-klorid Inozin Adenozin-trifoszfát (ATP) Klóramfenikol Neomicin-szulfát 20 g/l 0,5 g/l 4,2 g/l 0,938 g/l 0,4 g/l 0,34 g/l 0,1 g/l Amennyiben tárolást követően használjuk fel a sejteket, az eljárás megkezdését megelőzően legalább kétszer, de addig mossuk azokat PBS-sel, míg a felülúszó tiszta nem lesz. Mikrotiter lemezek. V-alakú mélyedéseket tartalmazó, merev anyagú mikrotiter lemezeket használunk.

2.6.26. Intravénás alkalmazásra szánt humán immunglobulin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-2 Összehasonlító standardok. A BRP Immunglobulin (anti-d antitestek vizsgálatára) és a BRP Immunglobulin (anti-d antitestek negatív kontroll vizsgálatára) alkalmas pozitív-, illetve negatív kontrollként történő felhasználásra. MÓDSZER Az ebben a fejezetben leírt vizsgálatot szobahőmérsékleten végezzük, a pozitív kontroll oldatokat, a negatív kontroll oldatokat és a vizsgálati oldatokat egyidejűleg, azonos körülmények között vizsgáljuk. Összehasonlító oldatok. A pozitív kontrollt és a negatív kontrollt az előírásoknak megfelelően feloldjuk. Az immunglobulin G (IgG) töménysége mindegyik feloldott készítményben 50 g/l legyen. Minden egyes feloldott készítményből PBS-BSA oldattal felező hígítást készítünk, úgy, hogy 25 g/l IgG-tartalmú oldatokat nyerjünk. Ezt követően mindegyik készítményből PBS-BSA oldattal további 7 felező hígítást készítünk, 1/256-ig (0,195 g/l IgG) kiterjesztve ezáltal a hígítási sort. A mikrotiter lemez mélyedéseibe minden egyes hígításból 20 µl-t mérünk. Mindegyik hígításból két párhuzamost mérünk be. Vizsgálati oldatok. A vizsgálandó készítményt PBS-BSA oldattal úgy hígítjuk, hogy 25 g/l töménységű kezdeti IgG-koncentrációt kapjunk. 50 g/l töménységű termékek esetében ez kétszeresre való hígítást jelent; a nem 50 g/l töménységű mintákra a hígítási faktort úgy állítjuk be, hogy a vizsgálathoz 25 g/l kezdeti töménységet érjünk el. A referenciakészítményekkel való összehasonlításkor ehhez a 25 g/l töménységű oldathoz egy névlegesen kétszeres hígítási faktort rendelünk, még akkor is, ha ez nem fejezi ki a 25 g/l elérésére használt valódi hígítási faktort. A névleges hígítási sornak 1/256-ig (0,195 g/l IgG) való kiterjesztésére PBS-BSA oldattal mindegyik készítménnyel további 7 felező hígításból álló hígítási sort készítünk. Ezt a sort az azonos IgGkoncentrációt tartalmazó referenciakészítményekkel történő összehasonlítás céljából készítjük. Minden egyes készítményből 2 különálló hígítási sorozatot készítünk. A mikrotiter lemez mélyedéseibe minden egyes hígításból 20 µl-t mérünk. Mindegyik hígításból két párhuzamost mérünk be. A papainnal kezelt D-pozitív (lehetőleg OR 2 R 2 donoroktól származó, de OR 1 R 1 vagy OR 1 R 2 eredetű is használható) és D-negatív (Orr) vörösvérsejtekből PBS-BSA oldattal 3 %V/V töménységű szuszpenziókat készítünk. A vizsgálandó készítmény, a pozitív- és a negatív kontroll egyik hígítási sorozatának minden egyes hígításához 20 µl D-pozitív sejtet adunk, a vizsgálandó készítmény a pozitív- és a negatív kontroll másik hígítási sorozatának minden egyes hígításához pedig 20 µl D- negatív sejtet mérünk. A lemezt 10 másodpercen át (vagy addig, míg a sejtek újra szuszpendálódnak) rázógépen rázatva végezzük el a keverést. A lemezt szobahőmérsékleten 80 g-vel 1 percen át centrifugáljuk, hogy a sejtek kiülepedjenek. A lemezt ezután megközelítőleg 70 -os szögbe állítjuk. A lemez leolvasását 4-5 perc elteltével, vagy akkor végezzük, amikor a negatív kontrollok (D-negatív sejtek és negatív kontroll oldat) szabadon áramlanak.. A mélyedés alján képződő sejtcsomó pozitív eredményt jelez. A sejtek szabad áramlása negatív eredményt jelent. A végpont titernek a pozitív eredményt adó legnagyobb hígítás reciprok értékét tekintjük. A pozitív kontroll névleges titerének 8-nak kell lennie, a negatív kontroll (D-negatív sejtek és negatív kontroll oldat) esetében pedig nem keletkezhet agglutináció 1:2 arányú kezdeti hígítás esetén sem. A felhasználónak az adott mérési körülmények validálását, a vizsgálati reagensek és a meghatározás körülményeinek ellenőrző vizsgálatát el kell végeznie, abban az esetben, ha az eredmények szignifikánsan eltérnek a várt eredménytől. Nem megfelelésnek tekintjük a negatív kontroll esetén tapasztalt negatív reakciót, mely azt jelezheti, hogy nem telt el elegendő idő ahhoz, hogy a sejtek szabadon áramolhassanak, vagy a reagenseket közvetlenül a hidegen történt tárolást követően használtuk fel.

2.6.26. Intravénás alkalmazásra szánt humán immunglobulin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-3 A vizsgálandó készítmény titere nem lehet nagyobb, mint a pozitív kontroll titere, ha mindkét készítményt 25 g/l töménységből titráltuk.

Pertusszisz vakcina (teljes sejtes) hatóértékénke meghatározása Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur 7.2-1 07/2011:20207 2.7.7. PERTUSSZISZ-VAKCINA (TELJES SEJTES) HATÓÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA A pertusszisz-vakcina (teljes sejtes) hatóértékét úgy határozzuk meg, hogy a vakcinának azt a mennyiségét, amely az egereket az intracerebrálisan beadott halálos dózisú Bordetella pertussis hatása ellen megvédi, összehasonlítjuk egy Nemzetközi Egységekre beállított referenciakészítmény azonos védelmet nyújtó mennyiségével. A Nemzetközi Egység a Nemzetközi Standard meghatározott mennyiségének a hatóértéke. A Nemzetközi Standard szárított pertusszisz-vakcina. A Nemzetközi Standard Nemzetközi Egységekben kifejezett egyenértékét az Egészségügyi Világszervezet (WHO) állapítja meg. A kísérleti állatok kiválasztása és csoportosítása. A vizsgálatokat megfelelő törzshöz tartozó, azonos állományból származó, egészséges, legfeljebb 5 hetes egereken végezzük. A legnagyobb és a legkisebb állat testtömege között legfeljebb 5 g különbség lehet. Az egerekből hat olyan csoportot képezünk, melyeknek létszáma egyenként legalább tizenhat és további négy csoportot, melyeknek létszáma egyenként tíz. Az egereknek vagy azonos neműeknek kell lenniük, vagy a hímeket és a nőstényeket egyformán kell elosztani a csoportok között. A fertőző törzs kiválasztása és a fertőző szuszpenzió készítése. Olyan B. pertussis törzset választunk, amelyet intracerebrálisan oltva, 14 napon belül képes elpusztítani az egereket. Ha az egereknek több, mint 20%-a elpusztul a beadást követő 48 órán belül, a törzs nem alkalmas a vizsgálatra. A törzsből egy átoltást készítünk és a learatott B. pertussis baktériumokat olyan oldatban szuszpendáljuk, amely literenként 10 g R kazein-hidrolizátumot és 6 g R nátrium-kloridot tartalmaz, ph-ja pedig 7,0 7,2. A szuszpendálást más, alkalmas oldatban is végezhetjük. Ezután meghatározzuk a szuszpenzió zavarosságát. A szuszpendáláshoz alkalmazott oldattal hígítási sorozatot készítünk és mindegyik hígítással egy-egy tízes létszámú állatcsoportot fertőzünk. A fertőzés során a különböző hígítások egy-egy adagjával, azaz 0,02 ml vagy 0,03 ml mennyiségével intracerebrálisan oltjuk az egereket. 14 nap elteltével valamennyi csoportban megszámoljuk a túlélő egereket. Az eredményekből kiszámoljuk a fertőző adagonként 100 LD 50 -et tartalmazó szuszpenzió várható zavarosságát. A vizsgálandó vakcina ellenőrzésére B. pertussis ugyanazon törzséből frissen átoltott tenyészetet állítunk elő és a learatott tenyészetből olyan szuszpenziót készítünk, amely a zavarosság alapján fertőző adagonként kb. 100 LD 50 -et tartalmaz. A fertőző szuszpenzióból három hígítást készítünk. A hatóérték meghatározása. A vizsgálandó vakcinából három hígításból álló sorozatot készítünk, és ehhez hasonlóan három hígítást készítünk a referenciakészítményből is, oly módon, hogy a középső hígítások az egereknek várhatóan kb. 50 %-át védjék meg a B. pertussis fertőző adagjának letális hatásával szemben. Az ajánlott adagok a vizsgálandó vakcinából a humán dózis 1/8-ad, 1/40-ed és 1/200-ad része, a referenciakészítményből pedig 0,5, 0,1 és 0,02 NE legfeljebb 0,5 ml térfogatban. A hígítások egy-egy adagjával a 16 egérből álló állatcsoportok egereit intraperitoneálisan immunizáljuk, majd 14 17 nap múlva az immunizált állatokat a fertőző szuszpenzió egy-egy adagjával intracerebrálisan fertőzzük. A fertőző szuszpenzió különböző hígításainak egy-egy adagjával a tíz egérből álló kontroll-csoportok állatait intracerebrálisan fertőzzük. Az értékelésből minden olyan egeret kizárunk, amely a fertőző szuszpenzió beadását követő 48 órán belül elpusztul. A 14 napot túlélő egereket megszámoljuk. A vizsgálandó vakcinának a referenciakészítményhez viszonyított hatóértékét a legalább tizenhatos létszámú csoportokban talált túlélők száma alapján számoljuk ki. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha: mind a vizsgált vakcina, mind a referenciakészítmény esetében az 50 %-os védelmet nyújtó adag az egereknek adott legnagyobb és legkisebb adag közé esik; a fertőző szuszpenzióval és hígításaival kezelt négy, egyenként tíz állatból álló csoportban az elpusztult állatok száma azt mutatja, hogy a fertőző adag kb. 100 LD 50 ;

Pertusszisz vakcina (teljes sejtes) hatóértékénke meghatározása Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur 7.2-2 a statisztikai elemzés szerint az összefüggések lineárisak és párhuzamosak. A vizsgálat megismételhető, de ha több meghatározást végzünk, akkor az összes érvényes meghatározás eredményeit egyesíteni kell.

4.1.1. Reagensek Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.7.2-1 4.1.1. REAGENSEK Dekanal. C 10 H 20 O. (M r 156,3). 1149200. [112-31-2]. Decil-aldehid. 07/2011:40101 Olajszerű, színtelen, jellemző narancsszagú folyadék. Vízben gyakorlatilag nem oldódik, kloroformban oldódik. A gázkromatográfiás célra szént dekanal feleljen meg az alábbi követelménynek is. Tartalmi meghatározás. Az Aurantii dulcis aetheroleum (1811) cikkelyben előírtak szerint gázkromatográfiás vizsgálatot végzünk (2.2.28). Tartalom: legalább 97%, normalizációs eljárással számítva. (RS)-Metotrexát. C 20 H 22 N 8 O 5. 1120200. [60388-53-6]. (RS)-2-[4-[[(2,4-Diaminopteridin-6-il)metil]metilamino]benzoilamino]-pentándikarbonsav. Tartalom: legalább 96,0%. op: kb. 195 C. Szilikagél, kromatográfiás célra (szánt), dodekaszililezett, utókezelt. 1179700. Nagyon kis szemcseméretű dodecilszilil-csoportok bevitelével a felületén kémiailag módosított szilikagél. A bázisos vegyületekkel való kölcsönhatás csökkentésére a visszamaradó szilanolcsoportok zömét gondosan utókezelik.

N-acetyltyrosinum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-1 07/2011:1384 N-ACETYLTYROSINUM N-Acetiltirozin C 11 H 13 NO 4 M r 223,2 DEFINÍCIÓ Az N-acetiltirozin szárított anyagra vonatkoztatott (2S)-2-(acetilamino)-3-(4-hidroxifenil)propánsavtartalma 98,5 101,0 %. SAJÁTSÁGOK Fehér, kristályos por vagy színtelen kristályok. Vízben bőségesen oldódik; ciklohexánban gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS Első azonosítás: A, B. Második azonosítás: A, C, D. A. Az anyag feleljen meg a Fajlagos optikai forgatóképesség vizsgálatban előírt követelménynek (lásd Vizsgálatok). B. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS N-acetiltirozinnal. C. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Vizsgálati oldat 80 mg vizsgálandó anyagot 3 térfogatrész R víz, 3 térfogatrész R tömény ecetsav és 94 térfogatrész R etanol elegyével 10 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat. 80 mg CRS N-acetiltirozint 3 térfogatrész R víz, 3 térfogatrész R tömény ecetsav és 94 térfogatrész R etanol elegyével 10 ml-re oldunk. Lemez: R VRK szilikagél F 254 lemez. Kifejlesztőszer: R víz R tömény ecetsav R etil-acetát (10+15+75 V/V). Felvitel: 5 μl. Kifejlesztés: a lemezmagasság kétharmadáig. Szárítás: levegőn. Előhívás: 254 nm-es ultraibolya fényben.

N-acetyltyrosinum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-2 Értékelés: A vizsgálati oldat kromatogramján a főfolt nem lehet intenzívebb az összehasomlító oldat kromatogramján látható főfoltnál. D. Az S oldat (lásd Vizsgálatok) erősen savas kémhatású (2.2.4). VIZSGÁLATOK S oldat. 2,50 g anyagot R vízzel 100,0 ml-re oldunk. Az oldat külleme. Az S oldat tiszta (2.2.1) és színtelen legyen (2.2.2, II. módszer). Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): +46 és +49 között. A vizsgálathoz 10,0 ml S oldatot R vízzel 25,0 ml-re hígítunk, és az eredményt a szárított anyagra vonatkoztatjuk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). A vizsgálatokat fénytől védve végezzük. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag 50,0 mg-ját az A-mozgófázissal 50,0 ml-re oldjuk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az A-mozgófázissal 100,0 ml-re hígítunk. A kapott oldat 1,0 ml-ét az A-mozgófázissal 10,0 ml-re tovább hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 20,0 mg CRS tirozint (A-szennyező) 2 ml 40 g/l töménységű R nátriumhidroxid oldatban oldunk, majd 20,0 ml-re hígítjuk R vízzel. Az oldat 1,0 ml-ét R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). 1,0 ml b) összehasonlító oldatot az A-mozgófázissal 10,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (d). 1,0 ml b) összehasonlító oldatot az A-mozgófázissal 20,0 ml-re hígítunk. Oszlop: l = 0,15 m, = 3 mm; állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (3 µm; gömbök); hőmérséklet: 40 C. Mozgófázis: -mozgófázis. 1,0 ml R tömény foszforsav é s1000 ml R kromatográfiás célra szánt víz elegye. B-mozgófázis. R1 acetonitril; Idő (perc) A-mozgófázis (%V/V) B-mozgófázis (%V/V) 0 2 97 3 2 15 97 62 3 38 Áramlási sebesség: 0,7 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 219 nm-en. Injektálás: 2 µl vizsgálati olfat, a), c) és d) összehasonlító oldat. Relatív retenciók az N-acetiltirozinra (retenciós ideje kb.6 prc) vonatoztatva: A-szennyező kb. 0,5.. Rendszeralkalmasság: d) összehasonlító oldat: csúcsfelbontás: legalább 5,0 a főcsúcs és az A-szennyező csúcsa között. Követelmények: A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs területének 0,8-szerese (0,8%);

N-acetyltyrosinum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.7.2-3 egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs területe (0,1%); szennyezők összesen: legfelejbb 1,0%.; elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs területének fele (0,05%). Klorid (2.4.4): legfeljebb 200 ppm. A vizsgálathoz az S oldat 10 ml-ét R vízzel 15 ml-re hígítjuk. Szulfát (2.4.13): legfeljebb 200 ppm. A vizsgálathoz 1,0 g anyagot R desztillált vízzel 20 ml-re oldunk. Ammónium (2.4.1. B-módszer): legfeljebb 200 ppm. 0,100 g anyagot vizsgálunk. Az összehasonlító oldatot 0,2 ml R ammónia-mértékoldattal (100 ppm NH 4 ) készítjük. Vas (2.4.9): legfeljebb 20 ppm. 0,5 g anyagot rázótölcsérben 10 ml R hígított sósavban oldunk, majd az oldatot 3 10 ml R1 izobutilmetil-ketonnal kirázzuk. Egy-egy kirázás időtartama 3 perc legyen. Az egyesített szerves fázist 10 ml R vízzel 3 percig rázzuk. A vizsgálathoz a vizes fázist használjuk. Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 10 ppm. 2,0 g anyagot R vízzel 20 ml-re oldunk. Az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot R ólom mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,5%. 1,000 g anyagot szárítószekrényben 100 105 ºC-on szárítunk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1 %. 1,0 g anyagot vizsgálunk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 25 NE/g, ha az anyagot parenterális gyógyszerkészítmény előállítására szánják és a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas további eljárást. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Az anyag 0,180 g-ját 50 ml R szén-dioxid-mentes vízben oldjuk. Az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20), 0,1 M nátrium-hidroxid mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M nátrium-hidroxid mérőoldattal 22,32 mg C 11 H 13 NO 4 egyenértékű. ELTARTÁS Fénytől védve. Amennyiben az anyag steril, légmentesen záró, garanciazáras, steril tartályban. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034)) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10) című általános fejezetet):b.