A CHRONICUS LYMPHOCYTÁS LEUKAEMIA ÉS A DIFFÚZ NAGY B-SEJTES LYMPHOMA IMMUNGLOBULIN NEHÉZLÁNC GÉNJEINEK MUTÁCIÓS STÁTUSZA RICHTER SZINDRÓMÁBAN Doktori értekezés Dr. Timár Botond Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Matolcsy András egyetemi tanár, MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Magyarosy Edina egyetemi docens, Ph.D. Dr. Sápi Zoltán főorvos, orvostud. kandidátusa Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Demeter Judit egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Simon Károly osztályvezető főorvos, orvostud. kandidátusa Dr. Várkonyi Judit egyetemi adjunktus, Ph.D. Budapest 2006.
TARTALOMJEGYZÉK I. Összefoglalás 4 II. Summary 5 III. Bevezetés 6 III.1. A chronicus lymphocytás leukaemia 6 III.1.1 A B-CLL morfológiája 7 III.1.2 A B-CLL immunfenotípusa és genetikája 10 III.1.3. A B-CLL sejteredete 11 III.1.3.1 Az immunglobulin (Ig) gének szerveződése 11 III.1.3.2 Az IgH génátrendeződés 12 III.1.3.3 A B-sejtek fejlődési fázisai 14 III.1.3.4 A B-CLL sejteredete 16 III.2 A Richter szindróma 19 III.2.1 A lymphoma progresszió 19 III.2.2 A Richter szindróma 19 III.2.3 A diffúz nagy B-sejtes lymphoma 20 III.2.4 A Richter szindróma gyakorisága, klinikuma 21 III.2.5 A Richter szindróma morfológiája és immunfenotípusa 21 III.2.6 A Richter szindrómában előforduló genetikai változások 22 III.2.7 A B-CLL és a Richter szindróma klonális kapcsolata 24 IV. Célkitűzés 28 V. Anyag és módszer 29 V.1 Szövetminták 29 V.2 DNS izolálás 29 V.3 Az IgV H CDR3 régiójának PCR vizsgálata 31 V.4 Az IgV H gének PCR amplifikációja, klónozása és szekvenálása 32 VI. Eredmények 36 VI.1 Klonális kapcsolat a CLL és a kialakuló DLBCL minták között 36 VI.2 A mintákban előforduló V H géncsaládok 37 VI.3 Az IgV H gének szomatikus mutációi 38 VI.4 A szomatikus mutációk elemzése 38-2 -
VII. Megbeszélés 44 VIII. Eredeti megállapítások 49 IX. Rövidítések jegyzéke 50 X. Irodalomjegyzék 53 XI. Saját közlemények jegyzéke 66 XII. Köszönetnyilvánítás 68-3 -
I. ÖSSZEFOGLALÁS A chronicus lymphocytás leukaemia (CLL) indolens lefolyású lymphoproliferatív kórkép. Az esetek egy részében a megbetegedés klinikai és morfológiai progressziót mutat diffúz nagy B-sejtes lymphomába (DLBCL), amit Richter szindrómaként ismerünk. Az immunglobulin nehézlánc gének (IgV H ) mutációs státuszának prognosztikai szerepe van a CLL-ben. Azoknál a betegeknél, akik mutált IgV H gént hordoznak, a betegség jobb prognózisú, míg azon betegek esetében akiknek az IgV H génjük nem mutált, a betegség sokkal agresszívebb lefolyású. Azon CLL-ek mutációs státusza, amelyek DLBCL-be transzformálódnak, nem ismert. Tanulmányunkban ezért azt vizsgáltuk, hogy a Richter szindróma a mutált vagy a nem mutált IgV H génekkel rendelkező CLL-ből alakul-e ki. Nyolc eset mintapárjain végeztük el az IgV H gének mutációs státuszának elemzését. A CLL-es és a DLBCL-es tumorklónok öt esetben azonosnak és három esetben különbözőnek bizonyultak. Hat CLL-es minta nem mutált, két minta mutált IgV H gént hordozott. A hat nem mutált CLL esetből ötben a DLBCL-ek IgV H génje sem tartalmazott szomatikus hipermutációt és a DLBCL klónok a CLL-es tumorklónokból származtak. Egy nem mutált és két mutált CLL-es esetben a DLBCL mutált IgV H -t hordozott, de ebben a három esetben a tumorklónok nem egyeztek meg egymással, ami független, második tumor létrejöttét jelenti. Ezek alapján kijelenthetjük, hogy a klinikai lefolyás szerint egységes Richter szindróma keletkezési mechanizmusa alapján két úton, transzformációval és de novo második tumorként is kialakulhat. A CLL-ek DLBCL-be való transzformációja azonban csak a nem mutált altípusba tartozó CLL-ekben lép fel. - 4 -
II. SUMMARY Patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) may develop diffuse large B- cell lymphoma (DLBCL), also known as Richter s syndrome. Mutational status of immunoglobulin heavy chain variable region (IgV H ) genes have prognostic impact in CLL. Patients with mutated IgV H genes have stable disease, whereas patients with unmutated IgV H gene have more aggressive disease. The mutational status of CLLs that transform to DLBCL is unknown. To reveal whether Richter s syndrome occurs in CLLs with mutated or unmutated IgV H genes, we have performed mutational analysis on serial specimens from eight patients. CLL and DLBCL tumorclones were identical in five cases and they were different in three cases. Six CLL expressed unmutated and two cases expressed mutated IgV H genes. In five of the six unmutated CLLs, the DLBCL clones evolved from CLL tumorclones and the IgV H genes expressed by DLBCLs were also unmutated. In one unmutated and two mutated CLLs, the DLBCL expressed mutated IgV H genes, but in these three cases the DLBCL tumorclones developed as independent secondary neoplasm. These result suggest that Richter s syndrome may develop in both mutated or unmutated CLLs, but clonal transformation of CLL to DLBCL occur only in the unmutated subgroup of CLL. - 5 -
III. BEVEZETÉS III.1. A CHRONICUS LYMPHOCYTÁS LEUKAEMIA A chronicus lymphocytás leukaemia (CLL)/ kis lymphocytás lymphoma (SLL) klonális lymphoproliferatív megbetegedés, amelynek az incidenciája 3/100000 1, és amely az összes non-hodgkin lymphoma (NHL) 6,7 %-át alkotja. 2 Megjelenésekor az átlagos életkor 65-70 év, a betegség férfiaknál kétszer gyakoribb, mint nőknél. A 65 év feletti felnőtt lakosságban előforduló leukaemiák 40%-át teszi ki, a betegség az esetek 20-30%-ában az 55 év alatti populációban jelenik meg, ugyanakkor a 30 év alattiakban nagyon ritka. 1 A betegség klinikai lefolyása heterogén. A betegek többsége hosszabb-rövidebb ideig is tünetmentes lehet, és csak később jelentkeznek az általában aspecifikus tünetek, mint például gyengeség, fáradékonyság, súlyvesztés, jellemző lehet a splenomegalia, hepatomegalia, lymphadenopathia is. 3, 4 Vannak esetek, ahol a hosszú tünetmentes túléléshez sem kell terápiás beavatkozás, de vannak olyanok is, ahol az agresszív kezelés ellenére sem sikerül biztosítani a betegek túlélését. 5 A CLL diagnózisakor a betegekben a csontvelő lymphocytás infiltrációja és a perifériás vér abszolút lymphocytosisa (több mint 5000 érettnek tűnő lymphocyta/μl) figyelhető meg (B-CLL), az esetek kisebb részében csak a nyirokcsomók érintettek (B-SLL). A betegség ezen két megjelenési formája sem klinikailag, sem prognosztikailag nem különbözik egymástól. - 6 -
III.1.1 A B-CLL morfológiája A B-CLL/SLL az érett B-sejtek daganatos betegsége. A B-CLL-es betegek vérében és csontvelejében is kis, heterokromatinizált magvú, keskeny, enyhén basophil cytoplasmával rendelkező lymphocyták szaporodnak fel (1A. ábra). A vérből készült kenetben a daganatos sejtek mellett gyakran megfigyelhetők a szétesett sejteknek megfelelő felhők, az úgynevezett Grumprecht rögök, amelyek a kenetkészítés során széteső, fizikai behatásra érzékeny tumorsejtek maradványai (1B. ábra). A B 1. ábra CLL megjelenése perifériás kenetben. (A) Heterokromatinizált magvú, keskeny, enyhén basophil cytoplasmával rendelkező lymphocyták a beteg vérében. (Giemsa, 1000X) (B) A perifériás kenetben azonosítható károsodott lymphocyták (Grumprecht-rögök, nyíl) (Giemsa, 400X). CLL-ben a prolymphocyták száma kevesebb mint 3%. A 10% feletti prolymphocyta-arány a kórkép agresszívebb klinikai lefolyású variánsát jelzi, amelyet krónikus lymphocytás leukémia / prolymphocytás lymphoma (CLL/PLL) diagnózissal jelölnek. 7 A csontvelői infiltráció általában noduláris, intersticiális vagy diffúz jellegű, de a csontvelő peritrabecularis tereit nem érinti (2. ábra). - 7 -
A B C D E F 2. ábra CLL szövettani megjelenése csontvelőben. (A) Kis, kerek magvú, keskeny cytoplasmájú sejtek diffúzan infiltrálják a csontvelőt (HE, 40X). (B) Az immuhisztokémiával láthatóvá válnak CD20+ infiltráló sejtek (CD20 immunhisztokémia, 40X). (C-D) Hasonló módon tehető láthatóvá a noduláris (HE, 40X; CD20, 40X) és az (E-F) intersticiális (HE 100X; CD20 100X) típusú infiltráció is. -8-
Nyirokcsomó érintettség esetén annak follicularis alapszerkezete felbomlik. Állományában a sötétebb, kisebb sejteket tartalmazó háttér mellett nagyobb sejteket tartalmazó világosabb területek, úgynevezett pseudofolliculusok vannak jelen. 6 Az infiltrátumban a kis 6-12 μm átmérőjű keskeny cytoplasmájú lymphocyták dominálnak, amelyeknek kerek, heterokromatinizált magjuk van 7 (3A. ábra). A mitotikus aktivitás általában nagyon alacsony. A pseudofolliculusok, vagy más néven proliferációs centrumok, kis, középnagy és nagy sejtekből állnak. A közepes méretű sejtek a prolymphocyták, melyek laza kromatinnal és kis nucleolusszal rendelkeznek. A paraimmunoblastok középnagy-nagy sejtek, amelyeknek kerek vagy ovális sejtmagjuk, centrálisan elhelyezkedő eosinophil nucleolusuk és enyhén basophil cytoplasmájuk van 8, 9 (3B. ábra). A lépben a betegség a fehér pulpában van jelen, de a folyamat előrehaladtával az infiltrátum diffúzzá válhat. 10 A B 3. ábra CLL szövettani megjelenése nyirokcsomóban és kenetben. (A) A nagyobb sejteket tartalmazó világosabb területek (pseudofolliculusok) a nyirokcsomó felbomlott állományában (HE, 40X). (B) A pseudofolliculuson belül nagyobb prolymphocyták, immunoblastok és paraimmunoblastok láthatóak a kis, kerek, tömött kromatinnal rendelkező sejtek mellett. (HE, 200X) - 9 -
III.1.2 A B-CLL immunfenotípusa és genetikája A tumorsejtek a B-sejtes markerek közül a CD19, CD20, CD23-at expresszálják a T-sejtekre jellemző CD5-tel együtt. Alacsony intenzitással fejezik ki a felszíni IgM-et és/vagy IgD-t. A tumorsejtek CD10, Cyclin D1, CD22 és FMC7 negatívak (4. ábra). 11-14 4. ábra CLL kimutatása áramláscitometria segítségével. A lymphocyták CD19-CD23-CD5 koexpressziót mutatnak lambda könnyűlánc izotípusexklúzió mellett, amely a CLL jellemzője. Az immunglobulin könnyű- és nehézláncok klonális átrendeződést mutatnak. Az immunglobulin nehézlánc variábilis régiójának (IgV H ) génjei 40-50%-ban nem hordoznak szomatikus mutációkat, 50-60%-ban azonban az IgV H gének szomatikus hipermutációja figyelhető meg, amivel jól korrelál a ZAP70 és a CD38 markerek expressziója (nem mutált IgV H esetén a CD38 és a ZAP70 emelkedett). Fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) az esetek 80%-ában mutatható ki valamilyen abnormális kariotípus 15 (5.ábra). A 12-es kromoszóma triszómiája az esetek 20%-ában, a 13q14 deléció az esetek 50%-ában fordul elő. 16, 17 Míg a 12-es triszómiás esetek nagy részében - 10 -
az IgV H nem mutált, addig a 13q14 deléciót hordozó esetekben gyakrabban írtak le mutációt 18. A 11q22-23 deléció 20%-ban, a 6q21 5%-ban és a 17p13 az esetek 10%-ában jelenik meg. 19 A B 11 13 C D 12 5. ábra CLL citogenetikai eltérései. (A) A 11q22 régió deléciója FISH (2 piros jel helyett csak 1 látható) és metafázis kromoszóma vizsgálattal. (B) 13q14 deléció. (C) A 12-es kromoszóma triszómiája (három zöld centroméra-specifikus jel látható a normális kettő helyett). (D) A 17p13 régió deléciója. III.1.3. A B-CLL sejteredete III.1.3.1 Az immunglobulin (Ig) gének szerveződése Az Ig nehézlánc-gének (IgH) a 14-es kromoszómán, a könnyűlánc-gének (IgL) közül a κ könnyűlánc a 2-es, a λ könnyűlánc a 22-es kromoszómán található. A konstans κ-lánc domént (C κ ) egyetlen exon kódolja, míg a variábilis domént a nagy számban jelenlévő V (variábilis) és J ( joining ) szegmentumok. A mintegy 40 V κ gén egyike a V-domén N-terminális szekvenciájának nagyobbik részét, míg a fennmaradó részt az 5 J κ szegmentum valamelyike kódolja (6A. ábra). A λ-láncokat kódoló gének 3 szegmentumba rendeződnek: 30 V λ, 4 funkcionális C λ, és mindegyik C λ mellett egy- - 11 -
egy J λ szegmentum található (6B. ábra). A nehézlánc variábilis doménjét kódoló ~40 V H, 25 D (diverzitás) és 6 J H szegmentum egy csoportban helyezkedik el. 20 A V H szegmentumot alkotó kb. 40 funkcionális gén a szekvenciáik homológiája alapján 6 géncsaládba (V H 1, V H 2,... V H 6) sorolható (6C. ábra). 6. ábra Az immunglobulin könnyű- (A, B) és nehézlánc-gének (C) szerveződése. III.1.3.2 Az IgH génátrendeződés A B-sejtek fejlődése során az Ig-gének előbb említett sorrendje a gének jellegzetes átrendeződése miatt megváltozik. A B-sejtek kivételével valamennyi sejt a csíravonalban (germline) található elrendeződésben tartalmazza az Ig-géneket. A B-sejt érés során megindul az Ig-gének átrendeződése. A folyamat első szakaszában egy véletlenszerűen kiválasztott D és egy J H gén kerül egymás mellé, majd az így kialakult D-J H szakaszhoz egy V H gén kapcsolódik. E szomatikus rekombináció során az egymás mellé kerülő szegmentumok közötti DNS-szakaszok kiesnek és létrejön a funkcionális V H DJ H génszegmentum. Az átrendeződött IgH génkonfiguráció az adott B-sejtre jellemző és végigkíséri a B-sejt fejlődés folyamatát. A V H -szegmentum kódolja a variábilis domén N-terminálisának nagy részét. A variábilis doménen belül, a vázszekvenciák között ( framework régió FR) hipervariábilis régiók helyezkednek el (komplementaritást meghatározó régiók CDR), amelyek az antigénkötő hely - 12 -
kialakításában vesznek részt. Ezeket CDR1-, CDR2 és CDR3-nak nevezzük, amelyek közül legutóbbi mutatja a legnagyobb variabilitást. A CDR3 variabilitását az átrendeződő génszakaszok pontatlan kapcsolódása (kapcsolódási diverzitás) és az ún. N-szekvenciáknak nevezett, a terminális deoxiribonukleotidil-transzferáz (TdT) enzim által véletlenszerűen beépített addicionális nukleotidok fokozzák (N-régió-diverzitás). A variábilis domént konstans domének követik (C H ) 20 (7. ábra). 7. ábra Az IgH génátrendeződés sematikus ábrája. - 13 -
III.1.3.3 A B-sejtek fejlődési fázisai Az a fejlődési folyamat, amelynek során a haemopoeticus őssejtek a B-lymphocyta-érés különböző fázisain keresztül ellenanyagokat termelő plazmasejtekké vagy memória sejtekké alakulnak, jellegzetes és jól karakterizálható szakaszokban zajlik (8. ábra). A szakaszokat az immunglobulin génátrendeződés és az immunglobulin nehéz- és könnyűláncok expressziója határozza meg. A legkorábbi B-sejt irányba elkötelezett sejt a progenitor tulajdonságokkal rendelkező pro-b-sejt. Ezekben a sejtekben történik az IgH gének átrendeződése. A korai pro-b-sejtekben a D-J H szakaszok, majd a késői pro-b-sejtekben a V H -DJ H szakaszok rendeződnek át. A produktív V H DJ H átrendeződés következménye a sejt μ-lánc termelése, ami már a következő fejlődési stádiumban levő pre-b-sejtekre jellemző. A μ-lánc a nagy pre-b-sejtekben termelődik és nagy része intracytoplasmatikusan található meg, egy része azonban a felszínen is megjelenik és a pót -L-lánccal (surrogate light-chain) együtt a pre-b-sejt receptort (pre-bcr) hozzák létre. A pre-bcr-en keresztül közvetített hatások eredményeképp a B-sejt befejezi az IgH-lókusz génjeinek további átrendeződését és néhány osztódás után megindítja az IgL-génátrendeződést, ami immár a kis pre-b-sejtekben zajlik. Amint létrejön egy működő könnyűlánc, a sejt teljes értékű IgM (BcR) komplexet expresszál a felszínén. A teljes értékű receptor viszont olyan jeleket közvetít, amelyek az átrendeződést vezérlő RAG-1, RAG-2 gének represszióját, következésképp a VDJ rekombináz aktivitás teljes megszűnését eredményezik. Ebben a stádiumban a sejteket éretlen B-sejteknek nevezzük. A fejlődés eddig a pontig a csontvelőben, antigéntől függetlenül zajlik. Ennél a pontnál történik a B-sejtek szelekciója is, amelynek eredményeképpen létrejön a nem-saját antigének felismerésére alkalmas, felszíni IgM és IgD molekulát hordozó érett B-sejt készlet 20 (8.ábra). - 14 -
8.ábra A B-sejtek fejlődési fázisai. SHM: szomatikus hipermutáció, GC: centrum germinatívum, H-lánc: nehézlánc, L-lánc: könnyűlánc. - 15 -
Az érett B-sejtek elhagyják a csontvelőt és a perifériás nyirokszervekbe jutnak, ahol immár antigéntől függő módon tovább differenciálódnak. Az antigénnel való kapcsolat megfelelő specificitású B-sejtek klonális szelekcióját indukálja. Ezek a sejtek (centroblastok) jellegzetes morfológiai és funkcionális változáson mennek keresztül, amelynek módjai a következők: - Nehézlánc-izotípusváltás. Megfelelő hatásokra a felszíni IgM és IgD expressziót más izotípusba tartozó nehézláncokat tartalmazó Ig molekulák termelése váltja fel. - Affinitásérés. Az immunglobulin variábilis régiókban bekövetkező szomatikus hipermutációk (SHM), amelyeket az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) fehérje vezérel és aminek következtében az érett B-sejt receptorának antigén iránti affinitása fokozódik. A centroblastokból ezek után centrocyták lesznek, amelyek, ha megfelelő antigénnel találkoznak proliferálni kezdenek, míg antigénstimulus hiányában néhány napon belül elpusztulnak. Ez leggyakrabban a T-sejtektől függő folyamat és a nyirokcsomók centrum germinatívumaiban következik be. 21 Ebben az esetben mindig létrejön a variábilis régió szomatikus hipermutációja. Az érési folyamat azonban T-sejt független módon a centrum germinatívumokon kívül a marginális zónában is létrejöhet. Ilyenkor a további érésnek nem feltétele a variábilis régió szomatikus hipermutációja. 22-25 A B-sejt-érés utolsó fázisaként mindkét folyamat eredményeképpen memória B-sejt és ellenanyag termelő plazmasejt alakul ki (9. ábra). III.1.3.4 A B-CLL sejteredete A B-sejtes lymphomák csoportjába olyan betegség típusok tartoznak, amelyek a különböző mértékben differenciált B-sejtek daganatos megbetegedései. A lymphomás transzformáció a progenitor B-sejtektől a plazmasejtes differenciációt elérő B-sejtekig terjedő érési stádiumok közül bárhol előfordulhat. Az esetek többségében a tumorsejtek morfológiai megjelenésükben, fenotípus és genotípus jellegzetességeikben hasonlítanak a B-sejt-differenciáció egyes érési stádiumaira, illetve a normális nyirokszövetet felépítő B-sejt-populációkra. - 16 -
BN: Nyugvó naiv BA: Aktivált naiv CB: Centroblast CC: Centrocyta PC: Plazmasejt BM: Memória sejt T: T-sejt FDC: Follicularis dendriticus sejt Perifériás vér és T-sejt zóna BN BN T BN BA BA CB CB BA CC Sötét zóna Köpenyzóna Bazális világos zóna Apikális világos zóna Marginális zóna 9. ábra A nyirokcsomó folliculusban történő B-sejt érés sematikus ábrája. A folliculus több zónára osztható, amelyekben az érési folyamatok zajlanak. A B-sejtek antigéntől függő érése a másodlagos nyirokszervekben zajlik, ahol a T-helper-sejtektől kapják meg a további fejlődéshez szükséges ingereket. A folyamat azonban T-sejt független módon is létrejöhet. PC Klonális expanzió Apoptosis Differenciáció Szomatikus hipermutáció Izotípusváltás T CC FD PC BM BM Korábban azt tartották, hogy a CLL-es sejtek a follicularis köpenyzóna B1-sejtjeiből keletkeznek, amelyekre jellemző, hogy a sejtek CD5, CD23 pozitívak, CD38 negatívak, valamint felszíni IgM-et és IgD-t expresszálnak és nem mutált IgV H génekkel rendelkeznek. Ezt azzal magyarázták, hogy a sejtek a centrum germinatívumban (GC) még nem találkoztak antigénnel. 26-29 A korai vizsgálatok a V H géneket csíravonal konfigurációjúnak találták 30-34, ami úgy tűnt, hogy alátámasztja a naiv B-sejtes eredetet. Ez az elképzelés sokáig tarotta magát, azonban később az irodalomban megjelentek olyan munkák, ahol azt bizonyították, hogy az esetek 50-60%-ában az IgV H gének szomatikusan hipermutáltak, ami a centrum germinatívumon már áthaladt B-sejtekre jellemző. Az, hogy GC vagy post-gc stádiumot képvisel az adott tumorsejt, az ún. intraklonális diverzitás, vagyis a mutációk kontinuus ( ongoing ) jellegének vizsgálatával állapítható meg. Ez azt jelenti, hogy - 17 -
a neoplasticussá vált sejtek megőrzik hipermutációs aktivitásukat és folyamatosan újabb mutációkat szereznek, ami a tumorklónok genetikailag instabil állapotát jelenti. Az adatok szerint a CLL-ek biológiailag és klinikailag két különböző csoportra oszthatóak, az egyikre az IgV H gének csíravonal expressziója jellemző és rosszabb klinikai prognózist jelent, a másikra pedig az IgV H gének szomatikus hipermutációja jellemző és a klinikailag kedvezőbb csoportba tartozik. 18, 35-39 Frissebb tanulmányok szerint a CLL-re egy közös génexpressziós mintázat jellemző, amely leginkább a memória B-sejtekére hasonlít és az IgV H genotípustól független, jóllehet az IgV H régióban mutált és nem mutált esetek egy 30 génből álló expressziós panellel 40, 41 elkülöníthetőek. Fenotípus tekintetében az aktivációs markerek (CD23, CD69, CD71), valamint a memória sejtekre jellemző CD27 szintén a posztgerminális eredetet valószínűsíti. Ez ugyan nehezen egyeztethető össze azokkal az esetekkel, amelyeknél az IgV H szomatikus mutációja hiányzik. Ez az ellentmondás feloldható, ha feltételezzük, hogy a naiv B-sejtek a nyiroktüszőkön kívül T-independens antigénekkel, vagy szuperantigénekkel találkoznak, amelyek a sejtfelszíni immunglobulinhoz (BcR) nem az antigén-felismerő régiónál, hanem a framework 39, 42 régiónál kötődnek; így elmarad a IgV H szomatikus mutációin alapuló affinitás-érés. A CLL-ben leggyakrabban átrendeződő IgV H gének (V H 1-69, V H 3-7 és a V H 4-34) előfordulása is lényegesen magasabb, mint ami véletlenszerűen várható lenne. Tehát sejteredet szempontjából a CLL sejtek a legújabb kutatások alapján egységesek, 43, 44 mégpedig érett, antigénszelekción átesett B-sejtekből alakulnak ki. - 18 -
III.2. A RICHTER SZINDRÓMA III.2.1 A lymphoma progresszió A szolid tumorok kialakulásához hasonlóan a lymphomák létrejöttét is többlépcsős folyamatnak tartják, ahol a genetikai változások a lymphoid sejtek autonóm növekedését okozzák az érési folyamat különböző fázisaiban. Klinikai megnyilvánulása ennek a folyamatnak lehet lymphoma és/vagy leukaemia. Az új lymphoma klasszifikációk, amelyek egy-egy lymphoma entitás morfológiai, genetikai és klinikai tulajdonságait is figyelembe veszik, teret nyújtottak azoknak a szemléleteknek, amelyek dinamikus biológiai és morfológiai heterogenitásról beszélnek egyetlen lymphoma entitáson belül is. A lymphomagenezis többlépcsős modelljének megfelelően a lymphomák gyakran válnak agresszív fenotípusúvá a lefolyásuk során, amit lymphoma progressziónak nevezünk. 45-48 Habár a lymphoma progresszió morfológiai, klinikai és biológiai aspektusai nincsenek mindig átfedésben, a lymphoma morfológiájában történő változások gyakran együtt járnak a klinikai és biológiai viselkedésben történő változással. Egy progressziót mutató lymphoma eredeti és progrediált komponense közötti klonális kapcsolat esetén lymphoma transzformációról beszélünk. A progresszió azonban egy de novo másodlagosan kialakuló lymphomát is jelenthet, amely klonálisan független az azt megelőző komponenstől. Ezekben az esetekben kompozit lymphomáról beszélünk. III.2.2 A Richter szindróma A klinikailag indolens lefolyású alacsony malignitású B-CLL/SLL magas malignitású non-hodgkin lymphomába való progresszióját Richter szindrómának (RS) nevezzük. A szindrómát először Maurice N. Richter írta le 1928-ban, mint egy CLL-hez társuló, gyorsan progrediáló agresszív lymphomát, amely generalizált lymphadenopathiával és hepatosplenomegaliával jár. 49 1964-ben Lortholary és munkatársai vezették be a "Richter szindróma" megjelölést azokra az esetekre, ahol szövettanilag a CLL-ből "malignus reticulopathia" alakul ki. 50 A későbbiekben kiterjesztették a Richter szindróma fogalmát olyan más - 19 -
lymphoid malignitásokra is, amelyek a CLL-es páciensekben alakulnak ki. Ezekben az esetekben prolymphocytás leukaemia (PLL), kis nem hasadt sejtes lymphoma 51, lymphoblastos lymphoma 52, hajas sejtes leukaemia 53 és Hodgkin lymphoma (HL), amely a Richter transzformáció Hodgkin variánsaként ismert 54, alakulhat ki. Leggyakrabban azonban a progresszió során DLBCL alakul ki. III.2.3 A diffúz nagy B-sejtes lymphoma A diffúz nagy B-sejtes lymphoma (DLBCL) az érett B-sejtek tumoros megbetegedése. A felnőttkori NHL-ák 30-40%-át teszi ki. A DLBCL-ek mind morfológiailag, fenotípus és molekuláris tulajdonságok tekintetében valamint a klinikai viselkedés szempontjából is heterogén csoportot alkotnak. A tumor az esetek többségében a nyirokcsomóból vagy az extranodalis szövetekből indul ki és csak másodlagosan érinti a csontvelőt. Morfológiai megjelenésük alapján centroblastos, immunoblastos, multilobulált, T-sejt/histiocyta gazdag, plasmoblastos és anaplasticus variánsokra oszthatóak. 8 A génexpressziós vizsgálatok alapján két fő csoportot különítettek el az alapján, hogy a tumorsejtek az aktivált B-sejtek expressziós mintázatához (ABC-DLBCL), vagy a centrum germinatívum B-sejtjeinek (GCB-DLBCL) mintázatához hasonlítanak. Tanulmányok szerint klinikailag a GCB-DLBCL a betegség sokkal kedvezőbb lefolyását jelenti, míg az ABC-DLBCL sokkal rosszabb prognózissal jár. 55 A DLBCL kialakulhat de novo vagy megelőző alacsony malignitású lymphoma talaján (pl. CLL). A DLBCL tumorsejtjei az IgV H régióiban szomatikus mutációkat hordoznak, ami alapján két csoportra lehet őket osztani aszerint, hogy az ún. intraklonális divergencia kimutatható-e vagy sem. Tanulmányok szerint az esetek egy részében kimutatható a kontinuus ( ongoing ) jellegű mutáció, ami ezen sejtek GC eredetére utal. A többi esetben antigén szelektált B-sejtes eredetre (post-gc) jellemző mutációkat találtak. 56-59 Azonban egyik tanulmány sem említi, hogy a Richter szindróma DLBCL-jeiben milyen az IgV H gének mutációs profilja. - 20 -
III.2.4 A Richter szindróma gyakorisága, klinikuma A CLL-es betegekben a kialakuló RS gyakoriságát 3-10%-ra teszik, azonban a valós incidencia ennél nagyobb lehet, mivel post mortem ritkán történnek ez irányban vizsgálatok. 60 Egy 1011 B-CLL-es betegen végzett vizsgálat szerint a betegek 2,2%-ában alakult ki RS, ebből 1,8%-ban DLBCL és 0,4%-ban HL. Felfigyeltek arra is, hogy a fiatalabb ( 55 év) és az idősebb (>55év) betegek közül a fiatalabbakban az RS előfordulása magasabb (5,9% ill. 1,2%), aminek legvalószínűbb oka az, hogy az idősebb, kezelésre nem reagáló betegeknél kevesebbszer végeznek biopsziát. 61 Egy másik retrospektív vizsgálat során, ahol 1374 CLL-el diagnosztizált beteget kezeltek 1972 és 1992 között, 39 betegben (2,8%) észlelték a RS kialakulását. Egy harmadik tanulmány szerint 1992-2002 között 2147 beteg követése során 105-ben (4,9%) figyeltek meg RS-t. A transzformáció incidenciája a sorozatos kezelések következtében nőtt meg. 62 Földrajzilag a B-CLL Európában és az Egyesült Államokban a leggyakoribb haematológiai megbetegedés, ezért a kialakuló RS-át is ezekben az országokban észlelik a legtöbbször. Más földrajzi területeken a pontos előfordulás nem ismert, de nagyon ritka, bár Japánban és Tajvanon is írtak már le eseteket. 63 A Richter szindrómát általános tünetek (láz, súlycsökkenés, éjszakai izzadás) megjelenése és az általános állapot gyors romlása jellemzi. Emellett nyirokcsomó megnagyobbodás, valamint hasi panaszokat okozó hepatomegalia és/vagy splenomegalia esetleg központi idegrendszeri érintettségre utaló jelek kísérik. 64-67 A leggyakoribb közös tulajdonság a RS-ás eseteknél az emelkedett LDH szint, amely a tumornövekedés egyik markere. Egy tanulmány szerint az RS esetek 82%-ában az LDH szint a normálisnak legalább kétszerese volt, míg ugyanezt a CLL-es esetek csupán 8%-ában találták. Paraproteinemiát a betegek 44%-ában figyeltek meg. 62 Természetesen a RS diagnózisának megállapításához nyirokcsomó biopszia szükséges. III.2.5 A Richter szindróma morfológiája és immunfenotípusa 1928-ban Richter a leírt eset szövettani vizsgálata során a nyirokcsomókban, a májban és a lépben leukaemiás és tumorsejteket egyaránt leírt. A leukaemiás sejteket kis méretű lymphocytaként, a tumorsejteket pedig számos, a lymphocytánál néhányszor - 21 -
nagyobb, bő basophil cytoplasmával, határozott maggal és néhány prominens nucleolusszal rendelkező polymorph endotheloid sejtként azonosította. 49 Ez a szövettani kép a jelenlegi WHO osztályozás szerint a DLBCL immunoblastos variánsának (DLBCL-IB) felel meg 8 (10. ábra). Irodalmi adatok szerint a DLBCL centroblastos variánsa (DLBCL-CB) is előfordulhat. 68 Ebben az esetben a centroblastok diffúz, monoton proliferációját lehet látni, amibe esetenként immunoblastok is keveredhetnek. Az összes DLBCL közül az IB esetek aránya kb. 10% 69, de RS-ban ez az arány jóval magasabb. A RS immunfenotípusáról igen kevés irodalmi adat áll rendelkezésre. Bizonyos esetekben a RS megőrzi a megelőző B-CLL immunfenotípusát (IgM +, IgD +/-, CD5 +, CD19 +, CD23 + ) 70, 71, egyéb esetekben viszont a RS immunhisztokémiai megjelenése eltér a B-CLL-től (CD5 -, IgD - ). 72-74 A proliferáló sejtek aránya a CLL-hez képest jelentősen megemelkedik. III.2.6 A Richter szindrómában előforduló genetikai változások A legtöbb indolens B-sejtes NHL a lymphomagenezis jelenleg elfogadott elvei szerint leginkább az apoptotikus folyamatok zavarával jellemezhető. 75 A lymphocyták hiperproliferációja az agresszív lymphomák velejárója, ami számos esetben a másodlagosan bekövetkező genetikai zavaroknak tudható be. 76 Ezek a másodlagos genetikai zavarok különböző alacsony malignitású B-sejtes NHL progresszióját egyaránt jellemezhetik, függetlenül azok típusától. 77-79 A jelenség független 68, 80 a kemoterápiától, kemoterápiában nem részesült betegekben is előfordulhat. A megfigyelt genetikai eltérések gyakran komplex módon fordulnak elő. A leírt eltérések közé tartozik a 12-es triszómia, 14q expanzió, a 11q23, 13q és a 17p régió deléciója. Citogenetikai vizsgálatok eredményei megerősítették azt a feltételezést, miszerint a B-CLL-ben detektálható komplex kariotípus-eltérések nagyobb valószínűséggel vezetnek RS-hoz, mint a kromoszomális eltérések hiánya, 62, 81-83 vagy a 12. triszómia önmagában. - 22 -
A B C * * ** 10. ábra A Richter szindróma szövettani megjelenése nyirokcsomóban és perifériás kenetben. (A) A CLL sejtjei keverednek a DLBCL nagyobb sejtjeivel (nyíl) (HE, 200X). (B) DLBCL-IB. A csontvelőt infiltráló immunoblastok nagy, mérsékelten pleiomorph sejtek és centrálisan elhelyezkedő, erősen bazofil nagy nucleolusszal rendelkeznek (HE, 200X). (C) A kenetben a CLL lymphocytái (*) mellett nagy, közepesen széles cytoplasmájú, laza kromatin szerkezetű multiplex nucleolust tartalmazó centroblast sejtek láthatók (**). (Giemsa, 1000X). A p53 gén mutációját először B-sejtes RS-ában írták le. 84 Akkoriban azt gondolták, hogy a p53 gén mutációja lehet a kulcs az alacsony malignitású lymphoma magas malignitású lymphomába való progressziójához. Kutatási eredmények viszont azt mutatták, hogy a RS előfordulhat p53 mutációval illetve anélkül is, és hogy a p53 inaktiválódása már a B-CLL stádiumban is bekövetkezhet, így nem feltétlen velejárója - 23 -
a RS-nak sem. 84-86 A p16 INK4A/ARF gén inaktiválódása is kapcsolatba hozható a RS kialakulásával. 87, 88 A p16 INK4A/ARF gátló hatással van a sejtciklusra azáltal, hogy a CDK4 és CDK6 enzimek regulatorikus alegységeihez kapcsolódva inaktiválja a ciklind/ CDK4/6 komplex hatását a G1/S fordulóponton. 89 A p16 INK4A/ARF inaktivációját a progrediált CLL, follicularis lymphoma (FL) és a köpenysejtes lymphoma blastos variánsának 33%-ában, azonban ezek indolens megfelelőjében csak 5%-ában észlelték. 90 p53 mutáció és/vagy p16 INK4A/ARF homozigóta deléció a RS-ás esetek 60%-ában fordul elő. 84, 85, 90, 91 A többszörös genetikai léziók a CLL transzformált stádiumában arra utalhatnak, hogy szerzett genetikai instabilitás van jelen genomszerte, ami a Richter szindróma kialakulását segíti. 92, 93 Munkacsoportunk egy korábbi tanulmányában azt a kérdést vizsgálta, hogy a B-CLL Richter transzformációja során szerepet tölt-e be a mikroszatellita instabilitás (MSI), és az instabilitás kialakulásának hátterében állhat-e a hmlh1 és hmsh2 mismatch repair gének esetleges genetikai alterációja. 19 CLL-es betegből 9 beteg volt RS-ás. Eredményeink arra utaltak, hogy a B-CLL Richter transzformációjának egyes eseteiben a hmlh1 gén epigenetikai inaktiválódása által kiváltott genetikai instabilitás hozzájárulhat a B-CLL progressziójához, ugyanakkor a hmlh1 és hmsh2 gének a folyamat során strukturálisan nem érintettek 92 III.2.7 A B-CLL és a Richter szindróma klonális kapcsolata A megelőző B-CLL-ből kialakuló DLBCL nem mindig az eredeti tumorklónból származik, de novo is kialakulhat. A molekuláris genetikai vizsgálómódszerek elterjedése előtt a klonalitást a B-sejtek sejtfelszíni immunglobulin könnyűlánc (IgL) immunfenotípusa alapján állapították meg. Amennyiben a RS és a B-CLL neoplasztikus B-sejtjei ugyanazon IgL-t hordozták, akkor a RS feltételezhetően a megelőző B-CLL klónból alakult ki, különböző IgL-k detektálása de novo megjelenő RS-ra utalt. 94-96 A molekuláris biológia fejlődése lehetővé tette a molekuláris technikák alkalmazását a klonális kapcsolat bizonyítására. A korai vizsgálatok során a Southern hibridizáció bizonyult a legalkalmasabbnak ennek eldöntésére. Ehhez az immunglobulin nehézlánchoz (IgH) kötődő próbát alkalmaztak, amivel ki lehetett mutatni, a csíravonal konfigurációt és a génátrendeződést is. Az átrendeződés mérete alapján lehetett - 24 -
a klonális kapcsolatra következtetni. 96-99 Amennyiben a Southern blottal a génátrendeződés azonos méretű sávot eredményez mind a B-CLL, mind a másodlagosan kialakuló DLBCL mintában, akkor ez a tumoros sejtek közös eredetére utalhat. Azonban eltérő migrációs kép esetén egy új malignitás meglétét támasztja alá 100-104 (11. ábra). 1 2 3 4 G 23 kb 9 kb 6.6 kb 11. ábra Southern-blot analízis klonalitás meghatározása céljából. EcoRI restrikciós endonukleáz emésztést követően a J H régióra tervezett próba segítségével mutatható ki a klonális génátrendeződés. Az 1-2 minták migrációs mintázata azonos, ami közös klonális eredetre utal. A 3-4-es minták esetén a migrációs mintázat különbözik, vagyis a két minta között klonális kapcsolat nem mutatható ki. A lymphomák klonális kapcsolatának modern módszerekkel történő igazolása szükségessé teszi az IgH harmadik komplementaritást determináló régiójának (CDR3) polimeráz láncreakcióval (PCR) történő vizsgálatát. A CDR3 régió tartalmazza a B-sejtekben átrendeződő variábilis (V H ), diverzitás (D) és J H génszakaszok egyedi, adott sejtre specifikus kombinációját, 105, 106 amely végigkíséri az adott B-sejt differenciálódásának folyamatát. 107 A CDR3 régió PCR-amplifikációja a V H és J H -génekre specifikus primerpárokkal érhető el. A megegyező hosszúságú és bázissorrendű amplifikált CDR3 szekvenciák a lymphomák közös klonális eredetére utalnak, a különböző hosszúságú termékek kizárják a klonális kapcsolatot 108 (12.ábra). - 25 -
1 2 3 4 5 6 M 100 bp 12. ábra PCR vizsgálat a minták klonalitásának meghatározására. A CDR3 régióra tervezett specifikus primerekkel végzett PCR reakció segítségével is meghatározható a klonalitás és a két minta közötti kapcsolat is kimutatható. Az 1-es, 2-es minták klonális génátrendeződést mutatnak, azonban az termékek hossza nem azonos, ami arra utal, hogy a két minta klonális eredete különbözik. A 3-as, 4-es mintákban reaktív eredetre utaló futási mintázat látható. Az 5-ös, 6-os mintában is klonális génátrendeződés figyelhető meg, a termékek hossza megegyezik, ami a minták közös klonális eredetére utal. Kevés irodalmi adat áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a RS esetek hány százaléka mutat valódi klonális evolúciót a megelőző B-CLL-ből, és hány százalékban alakul ki de novo a B-CLL mellett. Az esetek nagy részében Southern blot 60, 109, 110 hibridizációval következtetnek a klonális eredetre. Eddig kevés olyan tanulmány jelent meg, ahol a klonalitást az IgV H gének szekvencia elemzésével mutatják ki. Ilyen az (a) egyik korábbi tanulmányunk, ahol a CLL és DLBCL minták mindössze négy Richter szindrómás betegben lettek összehasonlítva. Az eredmények azt mutatták, hogy a klonális progresszióban stabil, nem mutált IgV H szekvenciák vettek részt. 85 (b) Cherepakhin és munkatársai azonban ongoing jellegű szomatikus hipermutációt mutattak ki, igaz csak egy esetben. 111-26 -
(c) Nakamura munkacsoportja két esetet közölt, ahol a DLBCL-es tumorklónok mutált IgV H szekvenciákkal rendelkeztek, de ezek a tumorklónok klonálisan függetlenek voltak az eredeti CLL-től. 63 Sajnos ezekből az adatokból az esetek alacsony száma miatt konklúziót levonni nagyon nehéz. - 27 -
IV. CÉLKITŰZÉS Tanulmányunkban a közelmúltban leírt eredményeket figyelembe véve arra kerestük a választ, hogy a Richter szindróma kialakulását az eddigi ismeretek mellett, milyen más genetikai hatások befolyásolják. Főbb kérdéseink a következők voltak: 1. A korábbiaknál nagyobb számú Richter szindrómás eset keresése, amelyhez az adott betegből mind a progressziót megelőző CLL, mind a DLBCL minta rendelkezésre áll. 2. Az ugyanazon betegekből származó CLL-es és DLBCL-es mintákban kimutatható-e klonális kapcsolat? 3. Az IgV H gének szomatikus hipermutációjának elemzése a CLL-es és a DLBCL-es mintákban. 4. Van-e összefüggés a lymphoma transzformáció és a CLL IgV H génjeinek mutációs profilja között? - 28 -
V. ANYAG ÉS MÓDSZER V.1 Szövetminták Tanulmányunkhoz nyolc beteg szövettani mintáit használtuk, akiknél CLL-t, illetve DLBCL-be történő progressziót diagnosztizáltak. A betegek klinikai adatait az 1.táblázat tartalmazza. Vizsgálatainkhoz molekuláris biológiai vizsgálatok végzésére alkalmas fagyasztott biopsziás mintákat, illetve vérmintákat használtunk. A szövettani diagnózis hisztopatológiai, immunfenotípus és immungenotípus vizsgálatokon alapult a WHO lymphoma klasszifikációjának megfelelően. 8 Az összes DLBCL-es mintában a tumorsejtek aránya meghaladta a 90%-ot. Mind a nyolc esetben a CLL és az ennek megfelelő DLBCL azonos fenotípust mutatott (CD5 +, CD19 +, CD20 +, CD23 + ). V.2 DNS izolálás Genomikus DNS-t a szövetmintákból telített NaCl felhasználásával, kisózásos módszerrel nyertük. 112 A fagyasztott szövetmintákat 20 μm vastagságú szeletekre metszettük, majd 3ml maglízis pufferből (10 mm Tris-HCl, 400 mm NaCl, 2 mm EDTA), 20 μl 20%-os Na-dodecilszulfátból (SDS), és 50 μl Proteináz K-ból (1 mg Proteináz K, 2 mm EDTA) álló oldatban homogenizáltuk. A sejteket egy éjszakán át 37 C-on inkubáltuk, majd 1 ml telített NaCl hozzáadását követően az elegyet intenzíven ráztuk egy percig. 20 perces, 2500 fordulat/perc fordulatszámmal történő centrifugálást követően a felülúszóból a DNS-t kétszeres térfogatnyi 100%-os etanol segítségével csaptuk ki. A kivont DNS-t kétszeri 70%-os alkohollal történő mosás után 200 μl TE pufferben (10 mm Tris-HCl, 2 mm EDTA) oldottuk fel, koncentrációját 260 nm-es hullámhosszon fotométer (Gene Quant II, Cambridge, UK) segítségével határoztuk meg. A DNS minták tárolása 4 C-on történt. Vérmintákból a mononuclearis sejteket, Histopaque (Sigma, St. Louis, MO) segítségével, sűrűség-grádiens centrifugálással különítettük el. A szeparálást követően a DNS izolálása a sejtekből az előbb leírtaknak megfelelően történt. - 29 -
1. táblázat Nyolc beteg klinikai adatai, valamint a mintavétel helye és ideje. PB: perifériás vér; BM: csontvelő; LN: nyirokcsomó; CLL: chronicus lymphocytás leukaemia; DLBCL: diffúz nagy B-sejtes lymphoma; N: nő; F: férfi Eset Nem Életkor Minta Mintavétel Mintavétel Szövettan (év) dátuma helye 1 N 83 A 1989-01-05 BM CLL B 1989-01-28 LN DLBCL 2 N 92 A 1989-11-09 PB CLL B 1989-11-13 LN DLBCL 3 N 73 A 1988-10-28 PB CLL B 1988-10-26 LN DLBCL 4 F 63 A 2001-02-20 PB CLL B 2003-01-21 LN DLBCL 5 F 62 A 1999-05-05 PB CLL B 2003-01-27 LN DLBCL 6 F 51 A 1990-08-20 BM CLL B 1992-09-21 LN DLBCL 7 N 78 A 1991-10-28 PB CLL B 1992-10-26 LN DLBCL 8 N 77 A 2001-12-10 LN CLL B 2003-02-03 LN DLBCL - 30 -
V.3 Az IgV H CDR3 régiójának PCR vizsgálata A mintapárok klonalitásának elemzéséhez az IgH-gén CDR3 régiójának szekvenciáját vizsgáltuk polimeráz láncreakcióval (PCR). A vizsgálathoz az IgH-gén 3. framework régiójában (FR3) előforduló veleszületett polimorfizmus kiküszöbölésére az FR3 régióra tervezett degenerált sense primer keveréket és az IgH kapcsolási régióra tervezett (J H ) univerzális antisense primert használtunk fel 85 (13. ábra). Primer Szekvencia FR3 5 - ACA CGG C[C/T][G/C] TGT ATT ACT GT -3 JH 5 - ACC TGA GGA GAC GGT GAC C -3 13. ábra Az IgH CDR3 PCR reakciókban használt primerek szekvenciája és kötődési helyének sematikus ábrázolása. A PCR reakciók 25 μl végtérfogatban, 100 ng DNS templát, 10 μm sense és antisense primer, 1.5 mm dntp, 50 mm KCl, 10 mm Tris-HCl ph8, 1 mm MgCl 2, 1 unit (U) Taq polimeráz jelenlétében zajlottak. A Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR készülékben végzett reakciók optimális körülményei a következők voltak: denaturálás 94 C-on 1 percig, annealing 57 C-on 1 percig, extenzió 72 C-on 1 percig, 30 cikluson keresztül. Negatív kontrollként minden reakciósorozathoz reaktív nyirokszövetből izolált DNS-t használtunk. Az amplifikálást követően a polimeráz láncreakció termékeinek detektálása ethidium-bromidot tartalmazó 3%-os agaróz gélelektroforézissel történt. Abban az esetben, ha a vizsgált DNS monoklonális sejtpopulációból származott, diszkrét DNS sávok megjelenése volt várható 70-120 bázispár magasságában. Ha egy adott beteg mindkét biopsziás mintájából amplifikált PCR termékek azonos hosszúságot - 31 -
mutattak (azonos magasságban helyezkedtek el a gélben), az az IgH génátrendeződés egyezésére, az adott mintapár klonális kapcsolatára utalt (14. ábra). 14. ábra Az IgH PCR termékek migrációs mintázatának sematikus ábrája. Abban az esetben, ha a mintapárok klonálisak, a migrációs mintázat mindkét mintánál azonos magasságban egy sávot mutat (1-2 minta). Ha mindkét minta monoklonális, de közöttük nincs klonális kapcsolat, akkor a sávok különböző magasságban helyezkednek el. (3-4) Reaktív minta esetén a minta migrációs képe egy smear, amit a számos B-sejtből amplifikált különböző méretű termék ad. (5) V.4 Az IgV H gének PCR amplifikációja, klónozása és szekvenálása A mintapárok DNS-ét a különböző V H (1-6) géncsaládokra tervezett specifikus sense és a J H régió konszenzus szakaszára tervezett antisense primerekkel amplifikáltuk külön-külön reakcióban (15. ábra). A PCR reakcióelegyek az V.3 pontban leírtakkal azonosak, azonban a ciklusparaméterek a következők voltak: denaturálás 30 másodperc, 95 C; annealing 30 másodperc, 60 C; elongáció 45 másodperc, 72 C, 35 cikluson át. A PCR termékeket pcr-2.1 vektorba klónoztuk a TOPO TA klónozó kit (Invitrogen, San Diego, CA) segítségével. A kompetens sejtek transzformációját követően, legalább 10 olyan kolóniának a plazmid DNS-ét izoláltuk, amelyek a megfelelő méretű inzertet tartalmazták. Az inzert jelenlétének meghatározására a plazmidban az inzerttől 5 és 3 irányban is megtalálható M13 szekvenciára specifikus PCR reakciót végeztünk el. - 32 -
Primer Szekvencia VH1-FR1 5 -GGC CTC AGT GAA GGT CTC CTG CAA G-3 VH2-FR1 5 -GTC TGG TCC TAC GCT GGT GAA ACC C-3 VH3-FR1 5 -CTG GGG GGT CCC TGA GAC TCT CCT G-3 VH4-FR1 5 -CTT CGG AGA CCC TGT CCC TCA CCT G-3 VH5-FR1 5 -CGG GGA GTC TCT GAA GAT CTC CTG T-3 VH6-FR1 5 -TCG CAG ACC CTC TCA CTC ACC TGT G-3 JH 5 -CTT ACC TGA GGA GAC GGT GAC C-3 15. ábra Az IgV H gének PCR reakcióiban használt primerek szekvenciája. Ezt követően az inzertek szekvenálását BigDye 3.1 cycle sequencing kittel ABI 310 automata kapilláris elektroforézis készülékkel (Applied Biosystems, Foster City, CA) végeztük el (16. ábra). A kapott szekvenciákat összehasonlítottuk az Immunogenetics Information System (IMGT) adatbázisban lévő IgV H szekvenciákkal és meghatároztuk a legközelebbi csíravonal (germline) megfelelőjét. Ha a csíravonal szekvenciától való eltérés 2%-nál nagyobbnak mutatkozott, akkor a Casali-Chang formulát 113 alkalmaztuk (2. táblázat). A formula felhasználásával a CDR és az FR régió R mutációt elemezve az IgV H gének antigénszelekció általi érintettségére következtettünk. - 33 -
2. táblázat A Casali-Chang formula. (A) Az IgV H gén CDR és FR régióiban várható R mutációk száma. (B) Annak a valószínűsége, hogy az R mutáció a CDR ill. FR régióban van (C) Binomiális modell annak a valószínűségnek a meghatározására, hogy a megfigyelt R mutációk a véletlen folytán alakulnak-e ki. A. Rmut = N RF CDR v. FR L CDRrel v. Frrel Rmut a várt R mutációk száma N a megfigyelt mutációk száma RF a CDR és FR régiók szekvenciából adódó mutációs gyakoriság L a CDR és FR régió mérete B. q = RF CDR v. FR L CDRrel v. Frrel C. n! k p = q (1 q) k! n k! ( ) n k n megfigyelt mutációk száma k megfigyelt R mutációk száma a CDR illetve az FR régióban q annak a valószínűsége, hogy az R mutáció a CDR ill. FR régióban van p = annak a valószínűsége, hogy az R mutációk a véletlen folytán alakulnak ki - 34 -
klónozás vektor PCR termék baktérium transzformációja Inzert ellenőrzése A helyes inzert mérete klónok az agar táptalajon kék nincs inzert fehér van inzert SZEKVENÁLÁS 16. ábra A klónozás és a szekvenálás sematikus folyamatábrája. - 35 -
VI. EREDMÉNYEK VI.1 Klonális kapcsolat a CLL és a kialakuló DLBCL minták között A CLL és a DLBCL minták klonális kapcsolatát az IgV H gén CDR3 régiójára specifikus PCR-rel határoztuk meg. Minden, a vizsgálatban szereplő minta monoklonális Ig nehézlánc (IgH) génátrendeződést mutatott. Öt esetben (1.-5. esetek), az adott mintapárok DNS-éből származó PCR termékének hossza és az IgV H -D-J H szekvenciája azonosnak bizonyult, ami a tumorminták közös klonális eredetét támasztja alá. Három esetben (6.-8. esetek) az első és a második biopsziás minta PCR termékének hossza és az IgV H -D-J H szekvenciák sem egyeztek meg, ami az egy betegben kialakult CLL és DLBCL különböző klonális eredetére utal (17. ábra, 3. táblázat). M 1A. 1B. 2A. 2B. 3A. 3B. 6A. 6B. T1 T2 125 bp 100 bp 17. ábra A CDR3 régió PCR amplifikációját követő agaróz gélelektroforézis képe néhány reprezentatív mintával. Az 1.,2., 3. és 6. minta az egy beteghez tartozó CLL-ből (A) illetve az abból kialakult DLBCL-ből (B) származik. A migrációs mintázat alapján az 1.,2.,3. esetek szekvenciális mintái között klonális kapcsolat mutatható ki. A 6A és 6B minta esetén eltérő a migrációs mintázat, ami kizárja a közös klonális eredetet. M - DNS marker; T1, T2 negatív kontroll - 36 -
VI.2 A mintákban előforduló V H géncsaládok A minták IgV H génjeit a 6 V H géncsaládra specifikus sense és a J H -ra specifikus antisense PCR segítségével amplifikáltuk. A minták azzal a V H specifikus primerrel adtak terméket, amely V H család a tumorklón IgH génjét alkotja (18. ábra). A teljes IgV H gén (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3) amplifikációja is alátámasztotta a monoklonális minták közötti klonális kapcsolatot vagy annak hiányát. 300 bp 300 bp 18. ábra 6 V H régió PCR amplifikációját követő agaróz gélelektroforézis két reprezentatív eset mintpárjain. Látható, hogy 2A. és a 2B. minta a V H 3 régióra specifikus primerekkel amplifikált és adott azonos méretű terméket. A 7A. minta a V H 1, a 7B. minta a V H 5-ben adott megfelelő méretű terméket. A klónozást és a kompetens baktérium transzformációját követően a klónozott PCR terméket egy újabb PCR reakció segítségével ellenőriztük (19. ábra). Megfelelő méretű terméket adó reakció esetén a mintákat szekvenáltuk (20A, B, C. ábra). 500 bp * * * * 19. ábra A pcr2.1 plazmid M13 szekvenciájára specifikus PCR amplifikáció egy reprezentatív minta esetén. A *-gal jelölt termékek tartalmazzák a megfelelő inzertet. - 37 -
Minden mintában a vizsgált IgV H -D-J H szekvenciák funkcionális génátrendeződést mutatnak, mivel nem tartalmaznak stop kodont vagy crippling mutációt. A minták V H génjeit az adatbázisban levő csíravonal szekvenciákkal hasonlítottuk össze. Négy CLL-es eset (1., 3., 4., 7.) a V H 1, három eset (2., 5., 6.) a V H 3 és egy eset (8. eset) a V H 4 családba tartozó génszegmenst hordozott. Öt esetben (1-5. eset) a DLBCL és a hozzá tartozó CLL-es minta azonos V H génszegmenst tartalmazott. Három esetben (6-8) a DLBCL-es minta és a CLL-es minta V H génszegmense különböző volt. A három DLBCL-es mintából kettőben (6., 8.) a V H 3, egyben (7.) pedig a V H 5 volt megtalálható (3. táblázat). VI.3 Az IgV H gének szomatikus mutációi A vizsgált IgV H gének csíravonal szekvenciától való báziseltéréseinek száma alapján a nyolc CLL-es esetet két csoportra tudtuk osztani. Azokat az eseteket, amelyeknél a báziseltérések száma kevesebb volt 2%-nál, a nem mutált csoportba soroltuk (1.-6. eset). Azokat az eseteket, amelyeknél a báziseltérések száma meghaladta a 2%-ot mutáltnak tekintettük (7.-8.). Abban az öt Richter szindrómás esetben, ahol a CLL és a DLBCL minták IgV H génjei azonosnak bizonyultak (1.-5. eset), az IgV H gének a nem mutált csoportba tartoztak. Három esetben (6.-8. eset), ahol az egy betegből diagnosztizált CLL-es és DLBCL-es minták IgV H génjei különbözőek voltak, a DLBCL-es minták IgV H génjei 91,8-96,9%-os homológiát mutattak a hozzájuk legközelebb eső csíravonal szekvenciákkal. Egy tumormintában sem észleltük az IgV H gének intraklonális diverzitását. VI.4 A szomatikus mutációk elemzése Egy génre gyakorolt negatív vagy pozitív szelekciós hatás hiányában a báziscserék amelyek aminosav cserében nyilvánulnak meg (R, replacement mutációk), illetve amelyek esetében a mutáció nem jár aminosav cserével (S, silent mutációk) az egész kódoló szekvenciában random módon helyezkednek el. Ha egy DNS szakaszon az R mutációk száma nagyobb, mint a véletlenből fakadóan várt - 38 -
mutációk száma, akkor valószínűsíthető, hogy a génen pozitív szelekciós hatás érvényesült. 3. táblázat Nyolc Richter szindrómás betegből vett CLL és DLBCL mintákban előforduló V H géncsaládok és azok mutációinak és klonális kapcsolatának összehasonlítása. *, V H szekvenciák, ahol a CDR régióban több, az FR régióban kevesebb R mutációt találtunk, mint ami a véletlen folytán is létrejött volna (p<0.05); CLL, chronicus lymphocytás leukaemia; DLBCL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma Eset Minta V H géncsalád Mutációk Száma Szekvencia homológia (%) Klonális kapcsolat 1 CLL V H 1-08 2 99.3 Van DLBCL V H 1-08 2 99.3 2 CLL V H 3-11 0 100 Van DLBCL V H 3-11 0 100 3 CLL V H 1-02 0 100 Van DLBCL V H 1-02 0 100 4 CLL V H 1-24 0 100 Van DLBCL V H 1-24 0 100 5 CLL V H 3-11 0 100 Van DLBCL V H 3-11 0 100 6 CLL V H 3-74 0 100 Nincs DLBCL* V H 3-48 13 95.6 7 CLL V H 1-18 10 96.6 Nincs DLBCL V H 5-51 9 96.9 8 CLL V H 4-61 20 93.3 Nincs DLBCL* V H 3-30 24 91.8-39 -
Ezzel ellentétben, ha az észlelt R mutációk száma kevesebb, mint a várt mutációk száma, az a negatív szelekciós nyomással magyarázható, amely így tartósítja azt a struktúrát, amelyet a gén kódol. A mutált DLBCL-es esetek szomatikus mutációinak elemzéséhez a Casali-Chang formulát alkalmaztuk 113. A modell binomiális eloszlást használ, ami alapján kiszámolható, hogy a CDR régiók többlet R mutációi illetőleg az FR régió R mutációinak hiánya a véletlen folytán alakul-e ki. A számolás eredményeit a 4. táblázat tartalmazza, amiből kiderül, hogy a három esetből kettőben a CDR régiók a vártnál több, az FR régiók a vártnál kevesebb R mutációt hordoztak, tehát antigén szelekciós hatásra alakultak ki. 4. táblázat Az IgV H gének analízise azokban a Richter szindrómás betegekben, ahol a DLBCL-es minták mutáltnak bizonyultak. DLBCL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; R, az észlelt és zárójelben feltüntetve a várt R mutációk száma; S, az észlelt S mutációk száma; p, valószínűség; *, szignifikáns különbség (p<0.05) CDR1 és CDR2 FR1, FR2 és FR3 Eset Minta V H géncsalád R S P R S P 6 DLBCL VH3-48 5 (1.63) 2 0.008* 2 (6.90) 4 0.005* 7 DLBCL VH5-51 2 (1.80) 0 0.301 4 (5.10) 3 0.198 8 DLBCL VH3-30 9 (5.00) 1 0.032* 9 (15.9) 8 0.004* - 40 -
IGVH1-8 CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC 1. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 1. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR1 IGVH1-8 AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACC AGT TAT GAT ATC AAC TGG GTG CGA CAG GCC ACT GGA CAA GGG 1. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 1. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR2 IGVH1-8 CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATG AAC CCT AAC AGT GGT AAC ACA GGC TAT GCA CAG AAG TTC CAG GGC 1. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 1. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- IGVH1-8 AGA GTC ACC ATG ACC AGG AAC ACC TCC ATA AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT 1. eset (CLL) --- --- --- --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 1. eset (Richter) --- --- --- --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR3 IGVH1-8 GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT.................................... 1. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA TCC ATT TAT TAC TAT GAT AGT AGT GGT TAC 1. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 20A. ábra Az 1. eset IgVH szekvenciája. Ebben az esetben a CLL és a DLBCL szekvenciája (IgVH1-8) megegyezik és mindkettő ugyanazt a két mutációt hordozza. Piros betű: replacement mutáció, Kék betű: silent mutáció. - 41 -
IGVH3-11 CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC AAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR1 IGVH3-11 GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT GAC TAC TAC ATG AGC TGG ATC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR2 IGVH3-11 CTG GAG TGG GTT TCA TAC ATT AGT AGT AGT GGT AGT ACC ATA TAC TAC GCA GAC TCT GTG AAG GGC 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- IGVH3-11 CGA TTC ACC ATC TCC AGG GAC AAC GCC AAG AAC TCA CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR3 IGVH3-11 GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT.......................................... 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA GAT TGG GCC GCC TGG TGG TTC GGG GAG TCC CAC TTT 2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA GAT TGG GCC GCC TGG TGG TTC GGG GAG TCC CAC TTT IGVH3-11...... 2. eset (CLL) GAC TAC 2. eset (Richter) GAC TAC 20B. ábra Az 2. eset IgVH szekvenciája. Ebben az esetben a CLL és a DLBCL szekvenciája (IgVH3-11) megegyezik és egyik eset sem hordoz mutációt. - 42 -
IGVH1-18 CAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC 7. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR1 IGVH1-18 AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTT ACC AGC TAT GGT ATC AGC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG 7. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- -GT -A T- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- --- CDR2 IGVH1-18 CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC AGC GCT TAC AAT GGT AAC ACA AAC TAT GCA CAG AAG CTC CAG GGC 7. eset (CLL) --- --- --- --- --G --- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- --- -T- --G --- --- IGVH1-18 AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC ACG AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGG AGC CTG AGA TCT 7. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- --- --- --- --- --- CDR3 IGVH1-18 GAC GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT.............................. 7. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA GAT CAT CTT CCC ACT ACG ATT TTT IGVH5-51 GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG AAG ATC TCC TGT 7. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR1 IGVH5-51 AAG GGT TCT GGA TAC AGC TTT ACC AGC TAC TGG ACC GGC TGG GTG CGC CAG ATG CCC GGG AAA GGC 7. eset (Richter) --- -A- --- --- --- --- --- --- -C- --- --- -A- -A- --- --- --- --- --- --- --- --- --- CDR2 IGVH5-51 TTG GAG TGG ATG GGG ATC ATC TAT CCT GGT GAC TCT GAT ACC AGA TAC AGC CCG TCC TTC CAA GGC 7. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -A- --- --- --- --- --- --- --- --- IGVH5-51 CAG GTC ACC ATC TCA GCC GAC AAG TCC ATC AGC ACC GCC TAC CTG CAG TGG AGC AGC CTG AAG GCC 7. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --C --- --- --T --- --- --T --A --- --- --- --- --- --- --- CDR3 IGVH5-51 TCG GAC ACC GCC ATG TAT TAC TGT.................................... 7. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA CAG ACT ACA CTG ACT ATG TCC ATT GAC GAC 20C. ábra A 7. eset IgVH szekvenciája. Ebben az esetben a CLL (IgVH1-18) és a DLBCL (IgVH5-51) szekvenciája nem egyezett meg és mindkettő tartalmaz mutációkat. Piros betű: replacement mutáció, Kék betű: silent mutáció. - 43 -
VII. MEGBESZÉLÉS A hisztológiai transzformáció jelensége follicularis lymphoma, köpenysejtes lymphoma és CLL esetén jöhet létre, amikoris a progressziót követően sokkal agresszívebb lefolyású betegség alakul ki. Richter szindrómának nevezzük az alacsony malignitású CLL talaján másodlagosan kialakuló magas malignitású DLBCL-t. A folyamat során a betegség terápia rezisztenssé és klinikailag rossz prognózisúvá válik. Munkánk során arra kerestük a választ, hogy a Richter szindróma mutált vagy nem mutált IgV H génekkel rendelkező CLL-ből alakul-e ki. Ehhez az IgV H gének mutációs státuszát elemeztük olyan betegek mintapárjaiban, ahol az egyik minta a betegség korai CLL-es stádiumából származik, a másik pedig a Richter szindróma fennállását megállapító DLBCL-t tartalmazó nyirokcsomó volt. A vizsgálat időpontjában nyolc beteg mintapárja állt rendelkezésünkre, ami kevésnek tűnhet, azonban a RS előfordulását és a szekvenciális minták ritkaságát figyelembe véve mindenképpen jelentős. Az 1-3. esetben a CLL és a DLBCL diagnózisa gyakorlatilag egyidőben került felállításra. Ezekben az esetekben a DLBCL okozta nyirokcsomómegnagyobbodás miatt végzett teljes kivizsgálás során derült fény a feltehetően korábban meglévő, panaszt nem okozó CLL-re. Eredményeink arra utalnak, hogy a DLBCL mind mutált, mind nem mutált IgV H génnel rendelkező CLL-es betegekben is kialakulhat, de csak a nem mutált IgV H gént hordozó DLBCL fejlődik ki a CLL-es tumorklónból, amely szintén nem mutált. A mutált IgV H génnel rendelkező DLBCL-ek klonálisan független, másodlagos tumorként jönnek létre. Munkacsoportunknak e dolgozat alapját képző cikk megjelenése óta 5 újabb Richter szindrómás esetet sikerült vizsgálni. Az újabb esetek IgV H génjeinek szekvenálása és elemzése megerősíti a fent leírtakat. 114 A RS során a DLBCL kialakulása biológiai szempontból két különböző utat foglal magába. A DLBCL kifejlődhet a már meglévő CLL-es tumorklónból, vagy kialakulhat mint egy másodlagos, független tumor 47, 85. Ezt figyelembe véve javasolták a következő terminológiák használatát. A lymphoma transzformáció olyan eseteket jelöl, ahol a DLBCL a CLL-es klónból alakul ki. Ezzel ellentétben a kompozit lymphoma fogalmát azokra az esetekre tartják fenn, ahol a DLBCL és a CLL klonálisan függetlenek egymástól 115 (21. ábra). - 44 -
21. ábra A V H gének mutációs státusza és a DLBCL kialakulásának útvonalai közötti kapcsolat Richter szindrómában. (A, lymphoma transzformáció) A CLL klonális transzformációja DLBCL-be a nem mutált V H génnel rendelkező CLL-es esetekben történik. (B, kompozit lymphoma) A CLL-től klonálisan független DLBCL, amely mutált V H gént hordoz, kialakulhat mutált illetve nem mutált V H géneket hordozó CLL mellett is. A munkánk során végzett IgV H gén mutációs státuszának analízise arra enged következtetni, hogy a lymphoma transzformáció -val kialakult DLBCL csak nem mutált IgV H génnel rendelkező CLL-es betegekben fordul elő. A nem mutált CLL gyakran hordoz egyéb genetikai eltéréseket is, amelyek között meg kell említeni a 12-es triszómiát, a 17p és a 11q deléciót. 18, 116, 117 Ezeket az eltéréseket leírták a transzformált DLBCL klónokban is, de leírtak más a Richter transzformációval társuló molekuláris és kromoszómális szintű anomáliát is 92, 118 (5. táblázat). Ezen tanulmányok alapján arra - 45 -