ROSSZINDULATÚ TÁMASZTÓSZÖVETI

ROSSZINDULATÚ TÁMASZTÓSZÖVETI Dr. Pápai Zsuzsanna Témavezetõ: Dr. Kopper László egyetemi tanár Programvezetõ: Dr. Jeney András egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Pathologiai Tudományok Doktori Iskolája Onkológiai Program Budapest 2002 2

TARTALOMJEGYZÉK 1. ÖSSZEFOGLALÁS - Angol 3. oldal ÖSSZEFOGLALÁS Magyar 4. oldal 2. BEVEZETÉS 5. oldal 3. CÉLKITÛZÉSEK 7. oldal 4. VIZSGÁLÓMÓDSZEREK 9. oldal 5. HAGYOMÁNYOS PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA OSTEOSARCOMÁBAN 13. oldal 6. ÚJABB PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA OSTEOSARCOMÁBAN 40. oldal 7. ÚJ GYÓGYSZERKOMBINÁCIÓ ALKALMAZÁSÁNAK VIZSGÁLATA ELÕREHALADOTT LÁGYRÉSZSARCOMÁBAN 58. oldal 8. LEGFONTOSABB ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK, ALKALMAZHATÓSÁGUK A GYAKORLATBAN 71. oldal 9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 75. oldal 10. IRODALOMJEGYZÉK 76. oldal 3

1. SUMMARY Musculosceletal tumors make out 2-3% of the malignant neoplasms. The past decades have brought essential changes in the diagnosis and treatment of sarcomas. Our aim is the analysis of prognostic factors known from the literature on our patient material having osteosarcoma and to search for methods, which could give further information on the prognosis helping to plan the treatment of these tumors. Apart from the conventional clinical, radiological and histological evaluation, we examined the p53 and mdm2 expression as well as the p53 and mdm2 expression in the biopsy material and the sample removed at the operation, using immunohistochemistry and molecular hybridization. Furthermore, the proliferative activity by Ki-67 MIB method, was measured. Results were evaluated by the middle- and long-term follow-up examination and analyzed by statistic methods. We did not find the age and sex of the patients of significant prognostic value, nor the pathological fracture or the radiographic appearance of the tumor. On the contrary, a tumor volume under 60cm 3, the wide or radical surgery, the highly distal location, a cartilagineous ground substance under 20% and a tumor necrosis above 90% after the preoperative chemotherapy are all positive prognostic factors. The last three factors proved to be significant in the multivariate statistical analysis and determinate survival. The increased expression its further application of the p53 protein may also be a prognostic factor, is recommend in addition to the recently applied prognostic factors. The life expectancy of patients with advanced soft tissue sarcoma is rather bad in spite of the radical surgical methods and the radiotherapy. Successful medication is limited. In a retrospective study we examined the efficiency of a new, drug combination, the VIP protocol (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin) at patients with advanced soft tissue sarcoma. Our results show that the efficiency of this newly introduced treatment exceeds the efficiency of the treatments applied so far in Hungary in this patient group. The side-effects of the treatment were acceptable. We consider the VIP combination a routinely applicable protocol in the treatment of patients with advanced soft tissue sarcoma. 4

1. ÖSSZEFOGLALÁS A támasztószöveti daganatok az összes malignus tumor 2-3%-át képezik. Az elmúlt évtizedekben lényeges változás következett be a sarcomák diagnosztikájában, kezelésében. Célunk az irodalomból ismert prognosztikai faktorok elemzése osteosarcomás beteganyagunkon, valamint olyan módszerek keresése volt, melyek további információkat adhatnak a prognózisra, segítséget nyújtva e daganatok kezelésének megtervezésében. Munkánk során a konvencionális klinikai, radiológiai, szövettani értékelésen túl vizsgáltuk a biopsziás anyagból, valamint a mûtét során eltávolított szöveti mintából a p53, mdm2 expressziót, valamint a p53 gén amplifikációt molekuláris hibridizációval, illetve mértük a proliferációs aktivitást Ki-67 MIB módszerrel. Eredményeinket betegeink közép- és hosszútávú utánkövetési vizsgálatával értékeltük, statisztikai módszerekkel elemeztük. Nem találtuk szignifikánsan prognosztikai értékûnek a betegek életkorát, nemét, a patológiás törést, a tumor röntgenmegjelenését. Ezekkel szemben megállapíthatjuk, hogy pozitív prognosztikai faktor a 60cm 3 -nél kisebb tumorvolumen, a széles vagy radikális sebészi kimetszés, az erõsen distális lokalizáció, a 20%-nál kisebb porcarány a tumoron belül és a 90% feletti tumornecrosis a praeoperativ kemoterápiát követõen. Ez utóbbi három tényezõ a többváltozós statisztikai analízis során is szignifikánsnak és a túlélés szempontjából maghatározónak bizonyult. Elmondhatjuk, hogy a p53 fehérje fokozott expressziója, újabb prognosztikus faktor lehet, gyakorlati alkalmazását javasoljuk az egyéb korábban alkalmazott prognosztikai faktorok Az elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegek életkilátása a kellõ radikalitású mûtéti eljárások, valamint a sugárkezelések ellenére meglehetõsen rossz. Sikeres gyógyszeres kezelése csak korlátozottan lehetséges. Retrospektiv vizsgálat formájában nagyszámú, elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegeken egy eddig ebben a betegcsoportban még nem alkalmazott új gyógyszerkombináció, a VIP séma (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin) hatékonyságát vizsgáltuk. Eredményeink szerint az általunk bevezetett kezelés hatékonysága meghaladja a Magyarországon e betegcsoportban alkalmazott kombinációk hatásosságát. A kezelés következtében kialakult mellékhatások elfogadhatóak voltak. A VIP kombinációt elõrehaladott lágyrészsarcomás betegeknél rutinszerûen alkalmazható kezelési formának véljük. 5

2. BEVEZETÉS A malignus támasztószöveti daganatok az összes malignus tumor mindössze 2-3%-kát képezik. Bár elõfordulásuk aránylag ritka, a sajátos diagnosztikai és kezelési eljárások, a magas kezelési költség, az osteosarcomában szenvedõ betegek átlagéletkora (20 év) teszi mégis indokolttá, hogy ezzel a daganatcsoporttal foglalkozzunk. Nem törekedtünk minden csontdaganat értékelésére, munkánk elsõsorban a leggyakrabban elõforduló centrális, nagy malignitású osteosarcomára korlátozódott. Az elmúlt évtizedekben lényeges változás következett be az osteosarcomák diagnózisában, kezelésében, valamint a túlélési eredményekben. A kemoterápia fejlõdésével, a neoadjuváns- és adjuváns kezelésekkel (1, 4, 11, 124, 125, 126) az ötéves túlélés 60-85%- ra emelkedett a korábban csak sebészi beavatkozással elért 15-20%-ról. Elõtérbe kerültek a végtagmegõrzõ mûtétek is. A javuló eredményekkel párhuzamosan egyre több közlemény foglalkozik a prognosztikai faktorok szerepével (8, 32, 56, 61, 68, 87, 109, 119, 129). Retrospektiv munkánk során a konvencionális klinikai, radiológiai, szövettani értékelésen túl, a biopsziás, valamint a mûtét során eltávolított szöveti mintán vizsgáltuk a p53, valamint az mdm2 gén expresszióját, a p53 génben a heterozigótaság elvesztését, és a Ki-67 proliferációs antigén jelenlétét. Munkánk során annak a lehetõségét kutattuk, hogy milyen módszerek jelenthetnek számunkra segítséget a mindennapos klinikai gyakorlatban az osteosarcomák várható biológiai viselkedésének, terápiás válaszkészségének, azaz prognózisának megítélésében, és ezen keresztül az optimális kezelési módok kiválasztásában. A lágyrészdaganatok rendkívül heterogén szövettani altípusú, biológiai viselkedésû daganatok, melyek malignitási fokának meghatározása sarkalatos pontja a kezelési terv felállításának. A lágyrészsarcomák diagnosztikájában, illetve kezelésében az elmúlt 10 év során jelentõs változás észlelhetõ. Míg korábban ezen daganatok kezelése kizárólag csak sebészi volt, addig az elmúlt évek során a daganat elsõdleges eltávolítása mellett jelentõsen emelkedett a radio- és a kemoterápia szerepe is (39, 67). A megoszló vélemények ellenére a magas malignitású, rossz prognózisú tumorok esetében kialakulóban van a neoadjuváns (40, 58, 164), illetve adjuváns (53, 54, 151, 152) kezelési formák bevezetése. A magas malignitású tumorok jelentõs részében a diagnózist követõ két éven belül hematogén szórás alakul ki, ezért számtalan próbálkozás lát napvilágot a gyógyszeres kezeléssel kapcsolatban (101, 107, 133, 138, 156). Az elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegek 6

életkilátása a kellõ radikalitású mûtéti eljárások, valamint a gyógyszeres-, illetve sugárkezelések ellenére.5 év, ötéves túlélése pedig 10% (99, 138). kombinációk kialakítására, melyek a legkevesebb szövõdménnyel járnak, megfelelõ terápiás hatás mellett. E megfigyelések vezettek arra, hogy a kezelés hatékonyságának növelése céljából korábban e betegcsoportban még nem alkalmazott gyógyszeres kombinációt alakítottunk ki: az ún. VIP sémát - Vepesid (122, 148), Ifosfamid (52, 107 (147). A kombinációt arra alapoztuk, hogy ezen vegyületek monoterápiában használva is hatásosak, s így együtt alkalmazva jobb terápiás eredményt reméltünk. Vizsgáltuk e gyógyszerekre adott válaszadási arányt, s a fellépõ mellékhatásokat. Célunk volt egy hatékonyabb, kevesebb mellékhatással járó gyógyszeres kombináció bevezetése. 7

3. CÉLKITÛZÉSEK 3.1. Osteosarcoma Retrospektív klinikai vizsgálat keretében 1986. januártól 1999. júniusig a Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinika Csonttumor Regiszterében nyilvántartott osteosarcomás beteganyag adatait a következõ szempontok alapján értékeltük ki. 3 3.1.1.1. Vizsgált paraméterek: - a betegek életkora, neme, a daganat röntgenmegjelenési formája, lokalizációja, mérete, szövettani alcsoportja, a stádiuma, a daganat kemoterápia iránti érzékenysége, a prae- és postoperativ kemoterápia szerepe, az ép mûtéti szél jelentõsége, a mûtét típusának (amputáció, vagy végtagmegtartó) szerepe; 3.1.1.2.Vizsgált kérdések: - a fent vizsgált tényezõk közül melyek tekinthetõk prognosztikai faktornak a túlélés függvényében; - a kemoterápia alkalmazása befolyásolja-e a túlélést: a prae + postoperativ, valamint a csak postoperativ kemoterápia eredményének összehasonlítása a túlélés - befolyásolja-e a helyi kiújulások megjelenését, illetve az össztúlélést a mûtét típusa - külön-külön, vagy együttesen van-e jelentõsége a fent vizsgált tényezõknek a betegség prognózisában; 3.1.2. A p53, valamint az mdm2 génexpresszió, mint lehetséges prognosztikai tényezõ vizsgálata - kimutatható-e p53, valamint mdm2 expresszió a biopsziás, illetve a mûtéti mintában; - észlelhetõ-e összefüggés a p53, illetve az mdm2 expresszió, valamint ezen tumorok kemoterápia iránti érzékenysége között; 8

- van-e összefüggés az osteosarcomák (kemoterápia elõtti) biopsziás anyagában észlelt p53, illetve mdm2 expresszió és a túlélés között. 3.1.3. A p53 gén heterozigozitás vesztésének (LOH) vizsgálata, mint lehetséges prognosztikai faktor - kimutatható-e összefüggés a p53 gén allélvesztése és a tumor prognózisa között. 3.1.4. A tumor proliferációs aktivitásának, mint lehetséges prognosztikai tényezõnek a vizsgálata - változik-e a Ki 67 proliferációs index a biopsziás anyagban; - nyújthat-e segítséget a tumor kimenetelének elõrejelzésében a proliferációs aktivitás ismerete a többi prognosztikai faktor mellett; 3.2. Lágyrészsarcomák Az elõrehaladott lágyrészsarcomák sikeres kezelése napjainkban is csak korlátozottan lehetséges. Jelen munkánkban egy korábban ebben a betegségben még nem alkalmazott három vegyûletbõl álló gyógyszerkombináció hatékonyságát vizsgáltuk, elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegeken. Az alkalmazott kombináció: VIP séma (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin). Vizsgált kérdések: - a fenti kombináció hatékonynak bizonyul-e elõrehaladott lágyrészsarcomában; - milyen mértékû mellékhatások alakulnak ki; - növelhetõ-e az össz-, illetve a betegségmentes túlélési idõ az adott kombináció alkalmazásával; 9

4. VIZSGÁLÓMÓDSZEREK Retrospektiv tanulmány keretében biopsziával igazolt, kezeletlen, nagy malignitású, centrális osteosarcomában szenvedõ betegek klinikai vizsgálatát végeztük el, melyet a betegek biopsziás, illetve mûtéti szövettani mintáin végzett immunhisztokémiai, valamint molekulárbiológiai vizsgálatokkal egészítettünk ki. 4.1.1. Valamennyi betegnél feltárásos sebészi biopsziával történt a diagnózis 4.1.2. A stádium megállapítása, valamint a terápiás terv meghatározása céljából az alábbi vizsgálatokat végeztük el: kétírányú csontröntgen, mellkasröntgen, a tumoros régió CT, illetve MRI vizsgálata, csontscan, hasi UH; 4.1.3. Laboratóriumi vizsgálatokat, valamint képalkotó eljárásokat végeztünk a kezelés és a betegség ellenõrzése során; - a vizsgálat kezdetekor: laboratóriumi vizsgálat (teljes vérkép, vese-, májfunkciós értékek, ionok meghatározása), mellkasröntgen, az adott tumoros régió kétirányú - neoadjuvans kezelés során: laboratóriumi vizsgálat (minden kemoterápiás ciklus elõtt); - a kuratív mûtét elõtt: mellkasröntgen, mellkas CT, az adott tumoros régió CT, illetve MRI vizsgálata, csontscan; - adjuváns kezelés során: laboratóriumi vizsgálat (minden kemoterápiás ciklus elõtt). 4.1.4. A klinikai dokumentáció, valamint a mûtéti leírások értékelését statisztikai módszerekkel végeztük; A statisztikai elemzéshez standard teszteket alkalmaztunk. Egyváltozós túlélési analízisekhez a Kaplan-Meier- féle (78) túlélési görbét, a Fisher egzakt tesztet, a t-tesztet és a Mann-Whitney próbát használtuk. A Kaplan-Meier túlélési táblázatok görbéi közötti szignifikanciát Cox-Mantel teszttel számoltuk. A prognosztikai faktorok többváltozós túlélési 10

analíziseihez Cox-féle (28) proporcionális regressziós hazard modellt, illetve a diszkriminancia 4.1.5. Immunhisztokémiai eljárással a gének (p53, mdm2) fehérjetermékeinek meghatározása a biopsziás anyagból, valamint a mûtét során eltávolított tumorból; A p53, valamint mdm2 fehérje expressziójában bekövetkezett változásokat határoztuk meg antihumán (DO 7 DAKO-clone, HK 090-5K Bio-Genex) monoklonális antitestet alkalmazva. A p53 expressziót decalcinált, paraffinba ágyazott szövetmintákon végeztük, ami speciális metodikát igényelt. A decalcinált szövetekhez antigénfeltáró oldatra volt szükség. Ezt követõen 2.5 percre 750W mikrohullámba helyeztük a metszeteket, majd néhány perces várakozás után peroxidáz blokkolás következett. A p53 monoklonális antitesttel (DAKOclone-DO-7) nedves kamrában 2 órán át inkubáltunk, melyet pufferos mosás követett. Újabb inkubálást végeztünk 20 percen át a másodlagos antitesttel (biotinylated anti-mouse antibody, Amersham) szobahõmérsékleten, majd ismételten pufferos mosás következett. Ezután 20 percen át inkubáltuk peroxidázzal jelzett streptavidin-biotinnal, majd desztilláltvíz + Naacetátos (0.1 M) mosás után a reakciót chromogennel hívtuk elõ (AEC, aethyl-carboxol). A magfestéshez Mayer-féle haematoxylint használtunk. Pozitív kontrollnak p53 pozitív fibromyxosarcomat használtunk. Az értékelést fénymikroszkóppal végeztük. Az immunreakciókat a következõképpen értékeltük: +++, a tumorsejteknek több mint 40%-a pozitív; ++, a tumorsejteknek 5-40%-a pozitív; +, a tumorsejteknek kevesebb, mint 5%-a pozitív; -, a tumorsejtek negatívak (legalább 500 sejtet vizsgáltunk). 4.1.6. A proliferációs aktivitás meghatározása paraffinos metszeteken Ki-67 immunhisztokémiai vizsgálatával; A Ki-67 antigénexpresszió vizsgálatát decalcinált, paraffinba ágyazott szövetmintákon végeztük. A metszeteket deparaffinálást és endogén peroxidázgátlást követõen fél órára de Cl antigénfeltáró oldatba tettük, majd 100%-os, illetve 70%-os methanolban mosás következett. A metszeteket ezután kuktában, túlnyomáson, hot start eljárással 30 percig forraltuk. Kihûlés után pufferes öblítés történt, majd immunhisztokémiai reakciót végeztünk a primer antitesttel (inkubálás 37 o C-on, 1 órán át). Újabb pufferos mosás, majd inkubálás 11

következett a másodlagos antitesttel. Az enzimaktivitás elõhívása, és a magfestés a p53-nál leírtak szerint történt. Valamennyi megfestõdött sejtmagot, tekintet nélkül a festõdés intenzitására, pozitívnak értékeltünk. A proliferációs aktivitást a Ki-67 pozitív sejtek százalékos arányában adtuk meg. Minden esetben legalább 500 sejtet értékeltünk. A Ki-67 a sejtciklusban lévõ sejteket jelöli. Ha a sejt kilép a sejtciklusból, akkor a Ki-67 gyorsan lebomlik, ezért a nem proliferáló sejt negatív. 4.1.7. A p53 delécióinak kimutatása polimeráz láncreakcióval; Vérbõl és tumorszövetbõl izoláltuk a DNS-t. A 17-es kromoszómát érintõ allélvesztések meghatározására, négy a kromoszóma rövid karján lévõ, a TP53 régiót és a hosszú karon lévõ BRCA 1 régiót lefedõ markert használtunk (TP53CA, THRA1, D17S855, D17S579). Ezek mindegyike dinukleotidismétlõdésû polimorfizmust mutatott. Az allélvesztést (LOH) a normális és a tumoros szövet allélmintázatának egybevetésével határoztuk meg, autoradiográfiás módszerrel, lézer denzitométer felhasználásával, az adott beteg tumorából és vérébõl izolált DNS-ek összehasonlításával. A specifikus DNS-részek amplifikációját polimeráz láncreakcióval (PCR) végeztük. A PCR reakciókat Perkin-Elmer Cetus DNA µl reakciótérfogatban végeztük, standard pufferek felhasználásával. A mikrosatellita markerek priméreit T4 polinukleotid kináz B enzimmel 32 P- ATP izotóp beépítésével radioaktívan jelöltük. A PCR termékeket 2% agaróz gélen futtattuk és etidiumbromid festéssel tettük láthatóvá. Azokat az eseteket minõsítettük heterozigóták elvesztéseként, ahol a tumormintában a két allél intenzitásának aránya több mint 50%-al eltért a vérmintából származó DNS amplifikálásával kapott intenzitásaránytól. 4.2. Lágyrészsarcoma A prospektív klinikai tanulmányba, melyet 1990. január és 1999. június között végeztünk szövettanilag igazolt, inoperábilis, metasztatikus vagy helyileg kiújult lágyrészsarcomában szenvedõ betegeket választottunk be. 4.2.1. A stádium meghatározását a következõ módszerekkel végeztük: mellkasröntgen, mellkas CT, hasi UH, csontscan, a tumoros régió CT, illetve 12

MRI vizsgálata; 4.2.2. Minden kezelési ciklus elõtt laboratóriumi vizsgálatok vese-, májfunkciós-, ionvizsgálatok, teljes vérkép, valamint EKG történtek; 4.2.3. A gyógyszeres kezelés: 28 naponta 5 napig VIP (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin) séma szerinti kezelések a progresszióig, maximum hat alkalommal; 4.2.4. A kezelésre adott választ kéthavonta értékeltük az adott régió CT, illetve 4.2.5. A klinikai dokumentáció értékelése; 4.2.6. Betegkövetés - mûtét után betegeinket (csont-, illetve lágyrészsarcomában) 10 éven át követjük. Átlagos követési idõ: 54 hónap (12-120 hó). Az 1.- 2. évben 3 havonta, a 3. évben félévente, ezt követõen évente a tumor felismerésekor alkalmazott módszerekkel történik a beteg ellenõrzése (l.d. 4.1.2. részt). 13

5. HAGYOMÁNYOS PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA OSTEOSARCOMÁBAN 5.1.1. Bevezetés, klasszifikáció, epidemiológiai adatok A csontok primer malignus daganatai a tumorok kb. 0.5-1%-át képezik. Viszonylagos ritkaságukat mutatja, hogy a leggyakoribb rosszindulatú csontdaganat, az osteosarcoma éves.5/egymilló lakos. Magyarországon évente 15-20 új osteosarcoma esetet ismernek fel. Férfi-nõ arány 2:1. Csontdaganatok bármely életkorban elõfordulhatnak, de a 60%-uk az elsõ két évtizedben keletkezik, az elõfordulás csúcsa a serdülõkorra esik, így a gyermekkori és fiatal felnõttkori összes daganatos megbetegedés 8%-át képviseli (35), 50 év körül ismételt kiugrás észlelhetõ, mely azonban lényegesen alacsonyabb a serdülõkorinál. Az osteosarcoma progressziója során elsõsorban a környezõ szövetek felé terjed (pericapsularis, direct articularis), valamint haematogén úton metasztatizál, leggyakrabban a tüdõbe. Rendkívül rossz prognózist jelent az úgynevezett skip metastasis (ugráló áttét) megjelenése, mely ugyanabban a csontban lép fel, ahol a primer tumor, de ott discontinualisan terjed. Egyéb malignus tumorokhoz képest ritkábban ad nyirokcsomókba (35, 36, 92). áttétet a regionális Az osteosarcoma a csontrendszeren, illetve adott csonton belül is praedilekciós helyeken alakulhat ki. Leggyakoribb legtöbb a hosszú csöves csontok metaphysisében keletkezik, és áthatolhat az epiphysisekbe, a növekedési porcon keresztül. Az extrasceletalis elhelyezkedések ritkák, de ezek között leggyakoribb elõfordulási hely a retroperitoneum, a mediastinum és az emlõ (82). 1. ábra 14

5 Az osteosarcoma keletkezésének oka ismeretlen, de számos hajlamosító tényezõt ismerünk, amelyek bizonyítják genetikai, és környezeti hatások genetikai tényezõk különösen gyermekeknél fontosak, például a retinoblastomás betegek 40%-ának örökletes praediszpozíciója van más rosszindulatú megbetegedésekre. Ha ezeknél a betegeknél a 13q14 kromoszómahelyen mutáció jön létre, akkor az osteosarcoma keletkezésének a kockázata 500-szor nagyobb, mint a normál populációban (55, 69). Magasabb kockázati tényezõ szerepel a veleszületetten p53 hiányt mutató Li-Fraumeni szindrómában (145). A genetikai tényezõk között szerepel a nem (férfiaknál gyakoribb), a fiatal életkor (a szokásosnál sokkal aktívabb csontnövekedés, pl. pubertás). való hosszantartó kontamináció, ionizáló sugárzás, radioterápia (retinoblastoma vagy Wilms tumor miatt kezelt gyerekekben) második primer tumorként alakulhat ki osteosarcoma (35, 136). A fentiek alapján az osteosarcomákat két csoportba osztják: primer és secunder. A primer osteosarcomák rejtett csontbetegség vagy ismert carcinogén behatás nélkül keletkeznek. A szekunder osteosarcomák már meglévõ csontbetegségekbõl alakulhat ki, pl. Paget-kórból, többszörös örökletes exostosisból, csontinfarctusból, polyostoticus fibrosus displasiából, vagy pedig ismert carcinogén behatások, pl. csontbesugárzások 5.1.3. Patológia Az osteosarcoma a leggyakoribb malignus csonttumor, az összes rosszindulatú csontdaganat 30%-a. Megjelenésre az osteosarcoma szürkésfehér tumortömeg, amely gyakran tartalmaz vérzéses és cisztikus területeket. Sok esetben áttör a cortexen és a periosteumon, mire diagnózisra kerül. Feltételezik, hogy az osteosarcoma olyan mesenchymalis õssejtbõl származik, amely fibrosus szövetté, porc-, és csontszövetté képes differenciálódni, ezeket a szöveteket osteosarcomában - ha különbözõ mértékben is - gyakran meg lehet találni. Igy az uralkodó tumorszövet jellegétõl függõen megkülönböztethetõ osteoblastos, fibroblastos, 15

chondroblastos, teleangiectasias, óriássejtes, kissejtes altípus. Bár a tu-moros szövetféleségek aránya tág határok között váltakozik, elõfordulhat, hogy pl. a tumoros porcszövet a tumor több mint 90-95%-át is kiteszi. Alapvetõen mindegyik mesenchymalis tumor, melyeknek közös jellemzõje, hogy osteoid matrixot, tumoros csontot kell termelniük. A tumoros osteoid kimutatása az osteosarcoma diagnózis feltétele, ennek alapján különíthetõ el a csontban szintén elõforduló, de ritkább chondrosarcomától, malignus fibrosus histiocytomától, fibrosarcomától. A mesenchymális sejtek gyakran erõsen anaplasticusak, atipikus mitózisokkal, hyperkromáziát mutatnak, és gyakran képeznek óriássejteket (9, 29, 35, 36). Az egyes alcsoportok között vannak ugyan különbségek, de valamennyi malignus. Ritkán multifokalis is lehet (azaz egyidejûleg több csontban fordul elõ). Megkülönböztetünk még parossealis, valamint periostealis formákat is, aszerint, hogy a periosteumból vagy a parostealis szövetbõl erednek (102). Kevésbé malignusak, idõsebb korban jelentkeznek és prognózisuk is jobb, mint a klasszikus centrális formáké. Az osteosarcomák részletes felosztását mutatja be az 1. táblázat. 16

A. Szövettan szerint B. Aetiologia szerint 1. Intramedullaris osteosarcoma Elsõdleges Másodlagos 1/a Conventionális, nagy malignitású centrális - familiáris - postirradiációs - Osteoblastos (Li-Fraumeni) - Paget kór talaján - Chondroblastos - retinoblastoma kialakuló - Fibroblastos (13q,14 mutáció) - fibrosus dysplasia, - Malignus-fibrosus histiocytomaszerû - csontinfarktus - Osteoblastomaszerû - óriássejtes csonttumor - Kissejtes talaján kialakuló - Teleangiectasias - Óriássejtes 1/b Jól differenciált (low-grade intraossealis) C. Lokalizáció szerint 2. Parossealis (juxtacorticalis) - Jól differenciált - centrális, intramedulláris - Dedifferenciált - intrakortikális - csont felszínén növekvõ 3. Periostealis - multifokális 1. táblázat: Osteosarcoma felosztása (Bone Tumors: H.D. Dorfman, B.Czerniak 1998, módosított) 17

5.1.4. Klinikai tünetek és diagnosztikai vizsgálatok A betegek túlnyomó többsége az érintett végtagon érzett fájdalommal, érzékenységgel és duzzadással jelentkezik, és anamnézisében általában több hónapig tartó, eredménytelen reumatikus kezelés szerepel. A több hónapja fennálló fájdalomhoz - fõként az agresszív, gyorsan progrediáló formáknál - az érintett terület fokozatosan növekvõ, meleg tapintatú duzzanata csatlakozik. A közeli izületben mozgáskorlá-tozottság is lehet. A tumor gyors növekedése a végtag körfogatának növekedéséhez vagy hirtelen töréshez vezethet, amely a folyamat elsõ tünete is lehet. Utóbbi fõleg a distalis femurvégben észlelhetõ (a patológiás törések gyakorisága 1%). Fizikális vizsgálatnál tömött terime tapintható, ami az alatta lévõ csonthoz rögzített. A felette lévõ bõr gyakran melegebb a tumor vaszkularizációja miatt. A szomszédos ízületben reaktív synovitis alakulhat ki, de a mozgás normális (92). Különbözõ képalkotó technikák segítik az osteosarcoma diagnózisát. A panaszok alapján elvégzett kétirányú röntgenfelvétel az esetek jelentõs részében felkelti az osteosarcoma gyanúját. A metaphysisbõl eredõ tumor rendszerint korán áttöri a corticalist. A tumor és a környezõ ép szövetközti határ elmosódott. A csont normális trabecularis szerkezetét a tumor területén elvesztette. A lágyrészekbe terjedõ, a corticalist áttörõ formáknál szokványos periostealis reakciónak számít a spiculum képzõdés és a Codmann háromszög. A csontdefektus, illetve a tumor lehet lytikus, sugáráteresztõ, ha az osteosarcoma kevés tumoros csontot termel és dominál a csont- lebontás (22%). Ilyen röntgenképet adnak típusosan a fibroblastos és teleangiectatikus formák. Ha az osteosarcoma nagymennyiségû tumoros csontot termel, akkor sclerotikus formákról beszélünk, amely jellemzõen sugárfogó röntgenképet mutat (32%). Leggyakrabban azonban, a nagyobb lyticus gócos felritkulások mellett scleroticus területek is jelen vannak, a tumor vegyes röntgenmegjelenésû (46%) (9, 98, 131, 143). A daganat kiterjedésének megállapítására, a skip metasztázisok észlelésére (31, 93), illetve a megfelelõ mûtéti beavatkozás megtervezéséhez elengedhetetlen az érintett régió CT, és/vagy MRI vizsgálatának elvégzése (31, 72, 121, 130). A multifokális tumor kizárása céljából csontscan elvégzése is ajánlatos. A betegek 10-20%-a tüdõáttétekkel jelentkezik, amelyek mellkasröntgennel, illetve CT-vel igazolhatók. Természetesen az anamnézis felvétele, 18

fizikális-, valamint laborvizsgálatok is a kivizsgálás részét képezik. Egyes szerzõk az alkalikus foszfatáz értéknek prognosztikai jelentõséget tulajdonítanak, mivel ismételt emelkedése recídivára, áttét jelenlétére utalhat (3). Az emelkedett érték azonban nem diagnosztikus értékû, mivel jelentkezik más csontbetegségekben is. A végleges diagnózist a daganat biopsziája igazolja (35, 99). 5 Az osteosarcomák döntõ többsége magas malignitású, kezeletlenül a betegek 100%- ában 1 éven belül halálhoz vezet. A betegség kezelésében az elmúlt 30 évben igen nagy fejlõdés észlelhetõ: - 1970 es években kizárólag sebészi kezelést alkalmaztak (radikális amputációt, exarticulatiót) az osteosarcomat kemoterápiarezisztens tumornak beavatkozással 10-20%-os ötéves túlélést tudtak biztosítani (43, 49, 75). - 1970 es évek vége felé a kemoterápia hatásosságát elõször monoterápia bizonyította nagydózisú methothrexat, doxorubicin; (51, 74), majd a kombinált kezelést kezdték alkalmazni (125, 126). A domináló ablativ sebészet mellett egyes esetekben végtagmegtartó mûtéteket is megkíséreltek. A kemoterápia bevezetésével az ötéves túlélés 40-70-%-ra emelkedett. - 1980- as évek második felétõl alkalmazták rutinszerûen a prae-, és posztoperaív kombinált kemoterápiát. (123, 124, 128, 169). Az egyik ilyen nemzetközileg elfogadott - általunk is használt kezelési séma a COSS (Cooperative Osteosarcoma Studie) protokoll (11, 167, 168,). Az esetek 50-60-%-ában végeztek végtagmegtartó mûtéteket, jelentõsen fejlõdtek a rekonstrukciós sebészeti eljárások (protézis, homograft), így az ötéves túlélést 60-75 %-ra sikerült emelni. - A multicentrikus osteosarcoma munkacsoportok létrejötte, az kemoterápiás protokollok kidolgozása, a képalkotó eljárások fejlõdése (CT, MRI), és a fejlesztése az eredményeket tovább javította, így a 90-s évek elejére a is sikerült elérni (1, 2, 10, 37, 91, 127, 140). Az idõben felismert esetek 80-85%-ában nyílik lehetõség végtagmegtartó mûtétek elvégzésére, s egyre nagyobb számban kerül sor metasztazektómiára is (23, 77). A jelenleg elfogadott kezelési terv: 19

biopszia neoadjuváns kemoterápia mûtét (végtagmegtartó/amputáció) adjuváns kemoterápia 5.2.1. Beteganyag és módszer A sajátos diagnosztikai és kezelési eljárások, a magas kezelési költségek indokolják, hogy a csontdaganatos betegeket centrumokban lássák el. A Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinikáján 1970. óta mûködik a Csonttumor Regiszter, amelyben 262 osteosarcomás, 185 chondrosarcomás, 103 Ewing sarcomás, 97 óriássejtes csonttumoros, 1251 benignus csonttumoros, 351 áttéti csonttumoros, illetve 761 tumorszerû csontelváltozásos beteg klinikai, radiológiai szövettani anyagát tartják nyilván. Átlagosan évi 10-14 új osteosarcomás beteg komplex ellátására kerül sor. A biopszia és a definitív mûtét a SE Ortopédiai Klinikán, a kemoterápia a SE II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Onkológiai Részlegén, valamint az Országos Onkológiai Intézet Kemoterápiás A csontdaganatok ritkasága miatt különösen fontos a mûtéti ellátást, illetve a gyógyszeres kezelést végzõ intézetek közti, valamint a nemzetközi együttmûködés, és a tumorregiszter anyagának rendszeres értékelése. 1986. januártól 1999. júniusáig 121 végtagi, nagymalignitású, centrális osteosarcomás beteg került ellátásra a fent említett intézetekben. Jelen munkánkban e 121 osteosarcomás beteg kezelési eredményein keresztül értékeljük az egyes prognosztikai tényezõk szerepét. Az értékelésbõl kizártunk 25 beteget az alábbi okok miatt: 12 beteg az utánkövetés számára elveszett, vagy más intézetben folytatták a kezelést. Õt esetben a betegek általános állapota, a tumor kiterjedt volta miatt eltekintettünk a kezeléstõl, három beteg pedig nem egyezett bele a kemoterápiába. Négy beteg a kemoterápia szövõdményeiben (infekció, nagydózisú Methotrexat intolerancia), egy pedig egyéb betegségben hunyt el. A fennmaradó 96 beteget három csoportba soroltuk. I. csoportba kerültek azok (75 beteg), akik a protokoll (COSS) szigorú betartásával kapták a kemoterápiát: 9 hetes neoadjuváns kemoterápia, a 10. héten mûtét, a mûtétet követõen további 14 hét adjuváns kemoterápia. A kezelési ciklusok elõtt rendszeresen labor, 20

illetve EKG vizsgálatokat végeztünk. A mûtét elõtt ismételt kivizsgálás történt esetleges metasztázis kizárása céljából. Mind a neoadjuváns, valamint adjuváns kezelés Ifoszfamid, Cisplatin, Adriamycin és nagydózisú Methotrexat kombinált adásával történt a protokoll által meghatározott sorrendben. Az Ifosfamid adásakor, illetve 4 és 8 óra múlva Mesna (mercaptoetanolsulfidnatrium) kezelésben részesülnek a betegek, a gyógyszer hólyagkárosító mellékhatásának (haemorrhagias cystitist okozhat) kivédése céljából. A nagydózisú MTX alkalmazása esetén a gyógyszer beadását követõen 24 h múlva 6 óránként Leucovorin (15 mg/m 2 ) adása szükséges a gyógyszer lebontása céljából, a MTX szérumszintjének normalizálódásáig, emiatt a MTX A tumor stádiumbeosztása Enneking módszere szerint történt (42), mely figyelembe veszi a tumor diffenrenciáltsági fokát (G), a lokalizációt (T) és a metasztázist (M) (2. táblázat). Eszerint nagy malignitású intracompartmentalis II/ felismeréskor metasztatizáló III. stádiumú osteosarcomákat különítettünk el. Az I. csoportban 75 betegbõl 15 II/A, míg 60 beteg II/B csoportba tartozott. G1: alacsony fok T1: intracompartmentalis M0: nincs metasztázis G2: magas fok T2: extracompartmentalis M1: van metasztázis Stage IA: G1, T1, M0 Stage IB: G1, T2, M0 Stage IIA: G2, T1, M0 Stage IIB: G2, T2, M0 Stage IIIA: G1/G2, T1, M1 Stage IIIB: G1/G2, T2, M1 G: differenciáltsági fok T: elhelyezkedés M: metasztázis Stádiumbeosztás (Enneking szerint) A II. csoportba azokat a betegeket soroltuk, (9 beteg), akiknél már a diagnózis megállapításánál multiplex tüdõ metasztázis volt jelen. A daganat stádiuma szerint az összes beteg III/B stádiumú volt. A III. csoportba soroltuk azon betegeket (12 beteg), akiknél valamilyen oknál fogva (pszichés tényezõ, kooperálókészség hiánya, interkurrens megbetegedés, kemoterápia intolerancia, stb.) a kemoterápia nem protokoll szerint, csak késéssel, suboptimális vagy inkomplett formában történt. Nyolc beteg II/B, míg négy beteg III/B stádiumú volt. 21

A betegek általános állapotának meghatározására a WHO skálát használtuk (0:normális aktivitásra képes, panaszmentes, 1:önellátásra alkalmas, enyhe betegségtünetek, 2:mozgáskorlátozott, de a nap kevesebb, mint 50%- mozgáskorlátozott, a nap több mint 50%-át ágyban tölti, 4:100%-ig ágyban fekvõ). E skála szerint 64 beteg (67%) 0, míg 32 beteg (33%) 1-es fokozatú volt. A betegek teljes kórtörténete rendelkezésre állt, ennek alapján határoztuk meg a tünetek jelentkezésétõl a diagnózis felállításáig eltelt idõt (anamnézis idõ). A stádium meghatározására a 4.1.2. részben leírt módszereket használtuk. A feltárásos biopsziát követõ szövettani vizsgálat alapján felállított diagnózis idõpontja jelentette az utánkövetés kezdetét, végét pedig a beteg halála, illetve az utolsó kontrollvizsgálat idõpontja (2000.06.). Átlagos utánkövetési idõ: 54 hónap (minimum 12 hónap, maximum 120 hó). Számítottuk az átlagos túlélési idõt, a tumormentes és az összes ötéves túlélést. A tumor méretét kétirányú röntgenfelvételek, illetve CT vagy MRI alapján a három dimenzióban mért legnagyobb méret jelentette, térfogatát a fenti méretek felhasználásával az ellipszoid formula alapján számítottuk ki (abszolút magasság x abszolút szélesség x abszolút.52). Mint említettük, radiomorfológiailag litikus, szklerotikus és kevertsejtes megjelenésû formákat különböztettünk meg. A szövettani vizsgálattal a domináló sejttípus szerint (szemiquantitativ értékelés alapján minimum 60-80%) osteoblastos, chondroblastos, fibroblastos, teleangiectatikus, kissejtes és kevert formákat különböztettünk meg. Különválasztottuk azokat az eseteket, ahol a metaplasiás porcszövet aránya a daganatban meghaladta a 20%-ot (9). A praeoperativ kemoterápia hatását, a tumor szövettani regressziójának mértékét az irodalomból ismertetett szemikvantitativ módszerekkel vizsgáltuk (71, 113, 124, 132). Ezek nagyjából megegyeznek abban, hogy kemoterápia érzékenynek minõsítik a tumort, ha a praeoperativ kemoterápiát követõen a tumorban a nekrózis aránya 90% vagy annál nagyobb, tehát a túlélõ tumorsejtek csak kisebb gócokban, elszórtan, összeségükben 10% alatti mennyiségben fordulnak elõ. Túl részletesnek tartjuk Salzer-Kuntschik és mtsai (132) 6 skálás beosztását, 1-1 túlélõ tumorsejt fellelése egy 300-600 cm 3 volumenû tumorban kétséges. Gyakorlati szempontból alakítottuk ki Picci és mtsai (113) értékeléséhez hasonló 22

A preoperatív gyógyszeres kezelés eredményességének mértéke alapján - a jobb értékelhetõség, nagyobb betegszám miatt - a betegeket három csoportba soroltuk: preoperatív kemoterápiára jól reagáló tumorok (szöveti necrosis 90% fölött, túlélõ sejtek 10% alatt), mérsékelten reagáló tumorok (túlélõ tumorsejtek 10-50% között), és kemoterápiára nem reagáló tumorok (túlélõ tumorsejtek 50% felett). A sebészi beavatkozás alapján két csoportba osztottuk a betegeket: végtagmegtartó, ill. csonkoló (amputációs és rotációs plasztika) mûtéten estek át. A sebészi radikalitás meghatározásánál Enneking beosztás (42) kritériumait használtuk, de a statisztikai analízisre alkalmatlan kis betegszám miatt összevontan értékeltük a radikális és széles (66 beteg), illetve marginális és intralézionális (9 beteg) csoportokat. 5.2.2. Statisztikai módszerek 4.1.4. pontban. A statisztikai elemzéshez standard teszteket alkalmaztunk. Részletes leírását lásd a 5.2.3. Eredmények Az általunk vizsgált prognosztikai faktorok és a túlélés összefüggése (egyváltozós I. csoport: Ebbe a csoportba 75 nagy malignitású, metasztázismentes, centrális osteosarcomában szenvedõ beteg került. Átlagéletkoruk 17.4 év (szélsõ értékek: 8 évestõl 55 éves korig), a nemek megoszlása alapján 35 nõ, 40 férfi. A daganat elhelyezkedése szerint: distális femur (30 eset), proximális tibia (21 eset), proximális humerus (10 eset), distális tibia (6 eset), proximális femur (3 eset), distális humerus (2 eset), calcaneus, proximális fibula, distális radius (1-1 eset). A tumor mindössze 15 esetben (20%) nem törte át a corticalist és maradt rekeszen belüli (II/A stádium), míg a többi 60 (80%) már beterjedt a lágyrészekbe (II/B). Anamnézisidõ 23

változott (átlag 3.3 hónap). Anyagunkban nem találtunk statisztikai összefüggést az anamnézis idõ hossza és a túlélés között. Kor A 75 beteg átlagéletkora 17.4 év. Életkor szerint betegeinket 3 csoportba osztottuk. Az elsõbe (0-13 év) 21 beteg, a másodikba (14-29 év) 47 beteg, a harmadikba (30 év, illetve e felett) 7 beteg került. Vizsgáltuk az életkor és a túlélés közötti összefüggést. Az elsõ valamint a második csoportba került betegek esetén a két görbe lefutása szinte azonos volt (2. ábra p=0.75), ezért a továbbiakban statisztikai értékelés szempontjából a betegeket harminc év alatti, illetve feletti csoportokra bontottuk. A két csoportban megközelítõen azonos arányban történt végtagmegtartó mûtét és amputáció, a betegek intenzív kemoterápiában részesültek. A különbözõ életkorú betegek életkilátásai - amennyiben a teljes, protokoll szerinti kemoterápiában részesülnek - megegyeznek. A két csoport túlélése között nem találtunk szignifikáns különbséget (3. ábra p=0.85). Életkor 120 Összes túlélés % 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Idõ (hónap) 2. ábra: Életkor és túlélés összefüggése (p=0.75) <13 év (n=21) 14-29 év (n=47) >30 év (n=7) 24

Életkor Összes túlélés % 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Idõ (hónap) < 30 év (n=68) > 30 év (n=7) 3. ábra: Életkor és túlélés összefüggése (p=0.85) Nem Vizsgáltuk, hogy a nemnek van-e szerepe a túlélésben. Egyváltozós statisztikai analízisünk szerint (Kaplan-Meier) a nõbetegek (35 beteg) életkilátásai valamelyest jobbnak bizonyultak a férfiakénál (40 beteg), azonban szignifikáns különbséget nem észleltünk (4. ábra p=0.15). Többváltozás regressziós analizissel (Cox-féle hazard modell) azonban a nem is bár a legkisebb mértékben - de túlélést befolyásoló prognosztikai faktorként szerepel. Nem Összes túlélés % 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Idõ (hónap) nõ (n=35) férfi (n=40) 4. ábra: Nem és a túlélés összefüggése (p=0.15) 25

Megjelenés a röntgenfelvételen esetben szklerotikus, 18 esetben lytikus, míg 43 esetben vegyes megjelenésû osteosarcomat észleltünk. A röntgenmegjelenési forma és a túlélés között semmilyen statisztikai összefüggést A daganat lokalizációját tekintve eseteinket három csoportba soroltuk. Proximális elhelyezkedésûnek vettük a humerus proximális, femur proximális és diaphysealis (14 eset) megjelenését, míg distálisnak (distal a) a femur distális és tibia, fibula proximális részében kialakulókat (51 eset), és törzstõl távolinak, úgynevezett távoli distálisnak (distal b) a radius distális, tibia, fibula distális és lábtõcsontokon kifejlõdõ (10 eset) osteosarcomákat. Míg a proximális és distális (distal a) csoport túlélése lényegében megegyezett, addig a távoli distális (distal b) csoport túlélése lényegesen jobb volt (5. ábra p=0.03). Míg az elõbbi csoportokban az ötéves túlélés 62-63% volt, addig az un. távoli distális lokalizációjú Lokalizáció Összes túlélés % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 proximalis (n=14) distal a (n=51) distal b (n=10) 0 20 40 60 80 26 100 120 140 160 Idö (hónap)

5. ábra: Tumor elhelyezkedése és a túlélés közti összefüggés (p=0.03) A tumor mérete, illetve térfogata Különbözõ csoportosításokat használva vizsgáltuk az osteosarcomák diagnózisakor mért különbözõ nagyságú, illetve térfogatú daganatok és a túlélés közötti összefüggést. A daganat legnagyobb átmérõjét véve alapul cm-ként növekvõ méretû csoportokat alkottunk, melybe különbözõ átmérõjû, illetve térfogatú daganatok kerültek. Eszerint vizsgáltuk a daganat átmérõjét, valamint a számított térfogatot, mint a túlélést befolyásoló tényezõt. Megállapítottuk, hogy a növekvõ térfogattal egyenes arányban csökkent a túlélõk arányának a száma. Vizsgáltuk a 60 cm 3 -nél kisebb (12 eset), valamint annál nagyobb (63 eset) térfogatú daganatok és a túlélés közötti összefüggést. Csupán a daganat átmérõjét tekintve nem észleltünk szignifikáns különbséget a túlélést illetõen, azonban a térfogatot vizsgálva a 3 alatti és feletti térfogatú osteosarcomák túlélése között észleltünk szignifikáns eltérést (6. ábra p=0.061). 60 cm 3 -nél kisebb térfogatú tumorok esetében (12 beteg) mindegyik beteg tumormentes túlélõ. Többváltozós Cox-regressziós modellnél a térfogat, mint prognosztikai faktor értékelhetõ. Tumor térfogat Összes túlélés (%) <60 cm 3 (n=12) >60 cm 3 (n=63).061) 27

Szövettani alcsoportok A domináló sejtféleség szerint megkülönböztetünk osteoblastos (42 eset), chondroblastos (8 eset), fibroblastos (6 eset), teleangiectaticus (6 eset), kissejtes (3 eset), valamint vegyes (10 eset) formákat, mely utóbbinál nem lehetett egyértelmûen domináns sejtféleséget megállapítani. Az osteoblastos alcsoporttól eltekintve a többi csoportba statisztikai analízisre alkalmatlan számú minta került, ezért ezeket összevonva két csoportot: osteoblastos (42 eset) és összes egyéb (33 eset) alakítottunk ki. A két csoport között nem találtunk szignifikáns túlélést illetõen (7. ábra p=0.32). Más felosztásban azonban szignifikáns különbséget észleltünk a túlélésben akkor, ha a tumor porcszövettartalmát vettük alapul. Azoknál az eseteknél (59 eset), ahol a porcszövet mennyisége 20% alatt maradt az ötéves túlélés 80% felett volt, míg ellenkezõ esetekben (16 eset) ez csupán 50%-nak bizonyult (8. ábra p=0.006). Szövettani alcsoportok Összes túlélés (%) 7. ábra: Szövettani alcsoport és a túlélés közti összefüggés (p=0.32) Szövettani alcsoportok Összes túlélés % 120 100 80 60 40 20 0 (n=59) Porcszövet <20% porcszövet <20% (n=59) porcszövet >20% (n=16) 0 20 40 60 28 80 100 120 140 160 Idõ (hónap)

8. ábra: Tumor porcszövettartalma és a túlélés közti összefüggés (p=0.006) Neoadjuváns kemoterápia A vizsgálatban résztvevõ betegek közül 54 beteg mind neoadjuváns, illetve adjuváns, 21 beteg pedig csak adjuváns kezelésben részesült. Az utóbbi esetek többsége már felismeréskor nagy, lágyrészeket, idegképleteket infiltráló daganatban szenvedett, így végtagmegõrzés lehetõsége eleve kizárt volt, ezért rögtön amputáció történt. A túlélést tekintve szignifikáns (9. ábra p=0.02) különbség volt a preoperativ kemoterápiában részesült betegek javára, ahol az ötéves túlélés 81% volt szemben a csupán postoperatív kemoterápiában részesültek 58%-ával. E csoportban a túlélési eredményeket fenntartással kell értékelnünk, mivel a betegek etikai okok miatt nem voltak randomizálva, valamint a jobb eredményt befolyásolhatta a tumorméretek eltérõ volta is. 120 Neoadjuváns kemoterápia Összes túlélés % 100 80 60 40 20 igen (n=54) nem (n=21) 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Idõ (hónap) 29

9. ábra: A neoadjuváns kemoterápia és a túlélés összefüggése (p=0.02) Kemoterápia érzékenység 46 betegnél volt lehetõség a preoperativ kemoterápia hátásának, a tumor regresszió mértékének meghatározására. 21 beteg (46%) tartozott a kemoterápiára jól reagálók csoportjába, 14 beteg (30%) a nem regálók, míg 11 beteg (24%) a mérsékelten reagálók közé. Kisebb mértékben, de szignifikánsan különbözött a túlélés, ha a Kaplan-Meier görbe két csoportot tartalmazott: jól reagálók (21 beteg), illetve összevontan a mérsékelten jól és rosszul reagálók (25 beteg) csoportjait (10. ábra, p=0 csoportot külön-külön vizsgáltuk, úgy kitûnt, hogy a jól és a mérsékelten jól reagálok csoportja majdnem ugyanúgy viselkedett a túlélés függvényében, míg a rosszul reagálók csoportja, szignifikánsan (11. ábra p=0.001) rosszabb túlélést mutatott az elõzõ két csoporténál. Az osteosarcomák kemoterápiával szembeni érzékenysége, mint a prognózist meghatározó faktor elsõ helyre került a többváltozós statisztikai analízisben is (3. táblázat). 10. ábra: A kemoterápia iránti érzékenység és a túlélés összefüggése (p=0.043) 30

Kemoterápia iránti érzékenység 120 Összes túlélés % 100 80 60 40 20 Nem érzékeny (n=14) Mérsékelten érz. (n=11) Kemoterápia érz. (n=21) 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Idõ (hónap) 11. ábra: A kemoterápia iránti érzékenység és a túlélés összefüggése (p=0.001) Változók Regr. Standard Koeff./s.e. p-érték koeffic.hiba (s.e.) Kemoterápia iránti -2.0105 0.6462-3.1111 0.0002 érzékenység Lokalizáció -1.6278 0.6088-2.6738 0.0032 Porcos alapállomány 1.6251 0.6903 2.3542 0.0222 mennyisége globalis χ 2 : p=0.0016 3. táblázat: Többváltozós Cox-féle regressziós modell a túlélést befolyásoló tényezõk szempontjából (kemoterápia érzékenység vizsgálatával, n=46) Sebészi eredmények (sebészi beavatkozás szerint vizsgálva): a) Végtagmegõrzõ mûtét 39 betegnél (52%) történt, míg amputáció 36-nál (48%). Az átlagtúlélés mind a 75 betegre vonatkoztatva 76 hónapnak bizonyult, míg a betegek ötéves átlagos túlélése 73%, ötéves tumormentes túlélése 72% volt. Ugyanez a végtagmegtartó mûtéteknél 73%-nak, illetve 72%-nak, míg az amputált csoportnál 71-71%-nak mutatkozott. Helyi kiújulást 3 esetben (7%) észleltünk a 39 végtagmegõrzõ mûtétet követõen, amputáció 31

után egy alkalommal (2%). Végtagmegtartó mûtétet követõen 8 betegnél (20%) észleltünk tüdõáttétet, míg amputáció után 14 esetben (39%). A tüdõáttétben szenvedõ betegek 1 betegtõl eltekintve - a mûtét után öt éven belül meghaltak. Egyváltozós statisztikai analízissel nem volt szignifikáns különbség a végtagmegõrzõ mûtétek és az amputáción átesett betegek túlélése között (12. ábra p=0.67 ). b) sebészi szél alapján: radikális tumorresectió vagy marginális/intralesionális beavatkozás; A sebészi beavatkozás 66 betegnél (88%) radikális, vagy szélesen az épben történt, míg 9-nél (12%) marginálisan, illetve intralesionálisan. Ez utóbbiaknál helyi kiújulást 5 esetben (2 amputáció és 3 végtagmegtartást követõen) észleltünk. A radikálisan operált betegek ötéves túlélése 80%-nak bizonyult, míg a marginálisan, illetve intralesionálisan operáltaké csupán 44% volt. Erõsen szignifikáns különbséget mutatott az eltérõ radikalitással operált csoportok túlélése (13. ábra, p=0.017), mely szignifikánsnak bizonyult a Cox-féle regressziós modellben amputáció (n=36) végtagmegtartó 12. ábra: A végtagmegtartó mûtét, ill. amputáció és a túlélés összefüggése (p=0.67) 32

Sebészi szél Radikális (n=66) Marginalis (n=9) 13. ábra: Sebészi radikalitás és túlélés összefüggése (radikális/marginális) (p=0.017) Mûtéti stádium Az osteosarcoma Enneking beosztás szerinti sebészi stádiumai között meghatározóan nagy különbség van a túlélést illetõen. Míg a II/A(15 beteg) és a II/B (60 beteg) sebészi stádiumok között nem észleltünk szignifikáns különbséget a túlélést illetõen, az ötéves átlagos túlélés 60-75%-os a megfelelõ komplex kezeléssel (14. ábra, p=0.30), addig a III. stádiumban (9 beteg), ahol az osteosarcoma felismerésekor már tüdõáttétek is jelen voltak, jelentõs szignifikáns különbséget tapasztaltunk, itt mindösze 10-20 % (15.ábra, p=0.004). 33

Mûtéti stádium 120 Összes túlélés % 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Idõ (hónap) II/A (n=15) II/B (n=60) 14. ábra: A mûtéti stádium és a túlélés összefüggése (p=0.30) Mûtéti stádium 120 100 Összes túlélés % 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Idõ (hónap) II/A (n=15) II/B (n=60) III/B (n=9).004) Többváltozós statisztikai analízis A betegek és módszerben feltüntetett összes változót együttesen is vizsgáltuk többváltozós statisztikai analízis módszereivel (Cox féle regressziós modell). A többváltozós analízist két formában végeztük, tekintettel arra, hogy a neoadjuváns kemoterápia iránti érzékenység vizsgálatát csak 46 betegnél tudtuk elvégezni az I. csoport 75 betege közül. A 46 betegnél a kemoterápia iránti érzékenység bevonásával (3. táblázat), illetve mind a 75 betegnél a kemoterápia iránti érzékenység, mint változó elhagyásával (4. táblázat). A Cox-féle hazard módszerrel a kemoterápiás érzékenység igen erõs, a túlélést jelentõsen befolyásoló 34

tényezõnek bizonyult, ezt követte a tumor lokalizációja, majd porcszövettartalma, melyet a tumor mérete, illetve a betegek neme követ. Ha a kemoterápiás érzékenységet nem vettük figyelembe, akkor a 75 betegre nézve a túlélést leginkább befolyásoló tényezõnek a tumor porcszövettartalma, a lokalizációja és a sebészi radikalitás mértéke bizonyult (4. táblázat). A regresszió validitását a globalis x 2 -el teszteltük, p=0.0016-nak, illetve p=0.0007-nek adódott, azaz a Cox-regresszió mindkét mintán erõsen szignifikáns összefüggést mutatott a fenti változók és a túlélés között. Regr. Standard Koeff./s.e. p-érték koeffic.hiba (s.e.) Porcos alapállomány 1.3690 0.4948 2.7670 0.0080 mennyisége Lokalizáció -0.7319 0.3558-2.0572 0.0371 Sebészi radikalitás 0.9496 0.4908 1.9348 0.0331 globalis χ 2 : p=0.0007 4. táblázat: Többváltozós Cox-féle regressziós modell a túlélést befolyásoló tényezõk szempontjából (kemoterápia érzékenység, mint változó nélkül, n=75) II. csoport Kilenc beteg került ebbe a csoportba, akiknél már a diagnózis idején távoli metasztázist észleltünk. Mûtétet követõen adjuváns kemoterápiában részesültek. Átlagéletkoruk 26.1 év volt. Amputációra került sor 6 esetben, míg 3 betegnél végtagmegtartó mûtétre nyílt lehetõség. Pulmonális metastasectomiat végeztek 3 beteg esetében. A betegek összes túlélési ideje 30 hónap volt, 3 beteg perzisztáló tüdõmetastasisokkal él (3-, 2-, illetve 1 évvel a tumor felismerését követõen). Egy 72 éves nõbeteg esetében észleltük, hogy a diagnózis felállítását követõen 9 évig perzisztáló 35

III. csoport alkalmazott gyógyszerekkel szembeni túlérzékenység - miatt 12 beteg nem kapott megfelelõ dózisban, illetve idõintervallumban kemoterápiát. A betegek átlagéletkora az I csoport 17.4 évével szemben 28.6 év volt. Az össztúlélési idõ az adott 12 betegnél átlagosan 18 hónap volt. Nyolc beteg meghalt, 4 jelenleg tumormentesen túlélõ (2, illetve 1 évvel a betegség felismerését követõen). A betegek túlélési görbéi a II. és a III. csoportban hasonló lefutást mutatnak, és szignifikánsan rosszabbat az I. csoportnál.0001)..0001) 5.2.4. Megbeszélés A prognosztikai faktorok vizsgálatára igazán csak az I. betegcsoport alkalmas, ahova homogén (nem metasztatikus) statisztikailag értékelhetõ esetszám tartozott (75 beteg), és a kezelések a meghatározott kezelési séma szerint történtek. Az I. csoport 5 éves túlélése az amputáción átesett betegeknél (71%), a végtagmegtartó mûtétben részesítetteknél (73%), mely megfelel az irodalomban közölt 55-80%-os értékeknek (37, 109, 110, 118, 128, 171). 36

A betegek életkorát, mint prognosztikai tényezõt vizsgálva is ellentmondóak az irodalmi eredmények. A szerzõk többsége nem észlelt különbséget az egyes korcsoportok eredményei között (35, 37, 99, 109), míg mások 13 év alatti, illetve 30 év feletti (127) betegeknél rosszabb túlélést észleltek. A 30 év feletti betegeket gyakran kizárják az értékelésekbõl részben kemoterápia intolerábilitás, részben a csekély betegszám miatt. Saját eredményeink szerint nincs különbség az egyes korcsoportok túlélése között: a 30 év feletti betegek túlélési esélyei megegyeznek a fiatalabb korcsoportokéval, ha protokoll szerinti kezelésben részesülnek. Idõsebb betegeknél azonban lényegesen gyakrabban tapasztalunk rosszabb kooperációt, kemoterápia intoleranciát, illetve egyéb szövõdményeket, ami miatt a kemoterápiát nem a kezelési terv szerint, hanem késéssel tudtuk biztosítani. Ezeket a betegeket a protokollból kizártuk és a III. csoportba soroltuk. Ennek megfelelõen a csoport átlagéletkora az I. csoport 17.4 évével szemben 28.6 évnek bizonyult. Glasser és mtsai (56), anyagában a nõi nem, míg Petrilli és mtsai (110) szerint a férfi nem bizonyult negatív prognosztikai tényezõnek. Anyagunkban a nõk túlélése valamivel jobb volt, de az eredmény nem tekinthetõ szignifikánsnak (p=0.15). A nemet sok értékeléshez hasonlóan nem tartjuk lényeges prognosztikai faktornak (35, 99). A lokalizáció axialis elhelyezkedést (gerinc, medence, borda) rossz prognózisúnak tartják (11, 56, 60, 63, 80), Bielack (10) szerint a proximalis humerus lokalizáció jobb eredményeket adott, míg Proviser (118) szerint a humerus és femur elhelyezkedés negatív prognosztikai faktor a proximalis tibia, illetve a törzstõl egyre távolibb lokalizációkkal szemben. Anyagunkban az úgynevezett távoli distális (csukló-, bokatáji, lábközépcsontból kiinduló) lokalizációjú daganatok prognózisa egy és többváltós analízissel szignifikánsan (p=0.03) jobbnak bizonyult. A megállapítás értékét csökkenti a viszonylag kis esetszám. kevésbé tartották fontos tényezõnek a tumor sebészi stádiumával szemben (56) és felhívták a figyelmet a térfogatmérés pontatlanságára. A COSS munkacsoport (11, 12) vizsgálatai szerint a kétirányú röntgenfelvételek alapján történõ tumorvolumen mérés az ellipszis képlet segítségével jól korrelál a CT vagy MRI alapján történõ komputerizált térfogatméréssel (12, 81, 121). Eredményeik szerint 53 beteg közül csak négy esetben alakult ki metasztázis, akiknél a tumorvolumen 60 cm 3 alatt volt, míg a többi esetben 40-60% relapszus következett be. Saját anyagunkban is észleltük a neoadjuváns kemoterápia megkezdése elõtt számított 37

tumortérfogatok növekedésével fordítottan változó túlélési esélyeket, de szignifikáns 3 alatti és feletti csoportoknál észleltünk. A szövettani alcsoportok és a túlélés közötti összefüggés kimutatására is számos próbálkozás történt. A szerzõk többsége nem talált összefüggést (98), jobb prognózisúnak találta a teleangiectasias formát, Petrilli és mtsai (109) pedig az osteoblastos alcsoportot, egyéb szövettani alcsoportokkal szemben. Saját anyagunkban is ez utóbbit észleltük, de az eredmény nem volt szignifikáns (p=0.32). Eseteink 16%-a vegyes szöveti szerkezetet mutatott, tehát egy sejt illetve szövetféleség sem dominálta a szöveti képet, így ez az értékelést feltehetõen befolyásolta. A COSS munkacsoport korábban szoros összefüggést talált a tumor porcszövettartalma és a kemoterápiás érzékenysége között. A 20%-ot meghaladó porcszövetet tartalmazó osteosarcomás betegek szignifikánsan rosszabb túlélést mutatnak (p=0.006). A csonttumor munkacsoportok közül számos (2, 56, 91, 113, 118, 132) foglalkozott a összefüggés kérdésével. Mind egyváltozós, mind többváltozós statisztikai analízisekben erõs prognosztikai faktorként szerepel az osteosarcoma kemoterápiás érzékenysége. A kemoterápia érzékeny esetek ötéves túlélése 91-95% között mozog, a kemoterápia rezisztens daganatoknál ez mindössze 50-60%. A helyi kiújulások aránya is lényegesen magasabb (56, 110, 118). A semiquantitativ szövettani értékeléshez használt beosztási skálák (71, 113, 132) megegyeznek abban, hogy kemoterápia érzékenynek minõsítik a tumort akkor, ha a preoperativ kemoterápiát követõen a szövetnecrosis 90%, vagy annál nagyobb, tehát a túlélõ tumorsejtek csak kisebb gócokban, elszórtan, összeségükben 10% alatti mennyiségben fordulnak elõ. Saját vizsgálatunkban a jól reagáló csoport 90% feletti, a mérsékelten jól reagáló formák 50-90% közötti, a rosszul reagáló esetekben 0-50% közötti tumornecrosist jelent. Szignifikáns különbséget találtunk a jól reagáló és a többi osteosarcomás beteg túlélése.043). Meglepõ volt anyagunkban, hogy a mérsékelten reagáló csoport túlélési görbéje azonban inkább a jól reagáló csoporthoz mutatott hasonló lefutást. A rosszul reagáló formák ötéves túlélése mintegy 40%-nak bizonyult. Végtagmegtartó mûtét akkor javasolható, ha a betegek életkilátásai nem csökkennek az amputációval szemben. Az irodalmi adatokat (137, 139) saját tapasztalataink is alátámasztják, miszerint végtagmegõrzõ mûtéteknél valamelyest fel kell adni a radikalitásból, 38

emiatt minimális mértékben, de emelkedik a helyi recidívák száma (anyagunkban 7% volt az amputációknál tapasztalt 2%-al szemben), azonban lényegesen jobb életminõség érhetõ el, azonos ötéves túlélés mellett, ami ebben a fiatal életkorban lényeges szempont. Helyes indikáció mellett az egyes mûtéti megoldások között a túlélést illetõen nincs statisztikailag szignifikáns különbség (94). Lokalis recidiva recidiva radikális eltávolítása (amputáció) esetén is igen rossz az ötéves túlélés, kb. azonos a felismeréskor már áttétet adó osteosarcomákéval, mely 10-20% (114). Simon és mtsai anyagában (137) 17 helyi recidivában szenvedõ beteg közül 16, Winkler és mtsai (166) 23 betege közül 19 halt meg a recidivák radikális eltávolítása ellenére. Anyagunkban is minden helyi kiújulást mutató beteget (4 eset) elvesztettünk tüdõáttétek miatt. Glasser (56), Springfield (144) Winkler (166), Sluga (139) munkái felhívják a figyelmet a vizsgálata alapján a sebészi radikalitás és a helyi kiújulás, illetve az ötéves túlélések közötti szoros összefüggésre (171). Hét marginális, valamint két intralézionális sebészi beavatkozást követõen négy esetben észleltünk lokális recidivát, ezeket a betegeket elvesztettük. Nem meglepõ, hogy a széles + radikális, illetve marginális + intralézionális betegcsoport túlélése között szignifikáns különbség.017). Az osteosarcoma Enneking beosztás szerinti sebészi stádiumai között meghatározóan nagy különbség van a túlélést illetõen. Míg a II/A és a II/B stádiumok között nem észleltünk szignifikáns intra-, akár extracompartmentalisan helyezkedtek el átlagosan 60-75%-os ötéves túlélést lehet elérni megfelelõ komplex kezeléssel, addig a III. stádiumban, ahol az osteosarcoma felismerésekor már tüdõáttétek is jelen vannak, ez mindössze 10-20%. Nagyobb statisztikák (23, 63, 96) szerint a diagnózis idején felismert osteosarcomás esetek kb. 10-15%-nál kell pulmonális metasztázissal is számolni. A túlélés ebben a csoportban gyakorlatilag független a primer tumor lokalizációjától, a praeoperativ kemoterápiától vagy az azonnali sebészi beavatkozástól. A fentiek alapján a metasztatikus és nem metasztikus osteosarcomás sorolják és különbözõ protokollokkal kezelik és értékelik. Saját eredményeink is igazolják az irodalmi adatokat: a II. csoport 9 betege közül mindössze 1 élte túl tüdõáttétekkel az öt évet, a többi beteg átlag túlélési ideje 20 hónap volt. Meglepõ eredményeket kaptunk a III. betegcsoport adatainak kiértékelésekor, ahol a 39

kemoterápia alatt és toleranciája a gyógyszerekkel szemben szintén fontos prognosztikai faktor. Alacsonyabb dózisban, késleltetve alkalmazott kemoterápia a polirezisztens tumorsejtpopulációk kialakulásához vezethet. Bár a III. csoportunk esetszáma csekély (12 beteg), de itt nagyobb arányban fordult elõ rezisztencia a kemoterápiával szemben. A fentieket magyarázhatja a betegek magasabb életkora (az átlagéletkor itt 28 évével szemben). A harminc év feletti betegek tapasztalataink alapján nehezebben viselik az agresszív, nagydózisú kemoterápiát, gyakrabban alakulnak ki szövõdmények, így a kezeléseket alkalmanként csak késve kaphatják. A COSS protokollok, illetve egyéb munkacsoportok vizsgálatainak kiértékelése mutatott rá arra, hogy mennyire fontos a kezdeti stádiumtól alkalmazott intenzív, halasztás nélküli, nagydózisú kemoterápia (1, 11, 110, 111, 128, 167, 168, 169). Anyagunkban a III. csoport túlélési görbéje (16. ábra) a nem megfelelõ kemoterápiát követõen éppolyan rossz túlélést mutatott, mint a II. csoport túlélési görbéje. Az ötéves túlélési arány megegyezik a történelmi kontroll csoportok (1970-s évek csak sebészi kezelés; ld. bevezetés) 10-20-%-os ötéves túlélési eredményeivel (43, 49, 75). A fentieket összefoglalva a 65-75%-os tumormentes ötéves túlélési eredmények eléréséhez elengedhetetlenül szükséges a tumor megfelelõ sebészi eltávolítása szélesen vagy radikálisan, és az intenzív, nagydózisú protokoll szerint alkalmazott kemoterápia. Ezek hiányában a helyi kiújulások és a tüdõáttétek kialakulása következtében a túlélési arány visszaesik a felismeréskor már metasztatikus osteosarcomák, illetve a történelmi kontroll csoport 15-20%-os szintjére. Önmagában a harminc év feletti életkor nem tekinthetõ rossz prognosztikai faktornak, de ezen betegeknél rosszabb kooperációra, illetve gyógyszeres kezelést követõen gyakrabban fellépõ szövõdményekre számíthatunk, ami a túlélési esélyeket ronthatja. Vizsgálatunkban egyváltozós statisztikai analízissel sem bizonyult szignifikáns prognosztikai tényezõnek az életkor, az anamnézis idõ, a tumor röntgenmegjelenése, a beteg neme. Pozitív prognosztikai faktor a 60 cm 3 -nél kisebb tumortérfogat, a széles vagy radikális sebészi kimetszés, a törzstõl távoli lokalizáció, a 20%- nál kisebb porcarány a tumoron belül és a kemoterápia iránti érzékenység. Ezek a tényezõk a többváltozós statisztikai analízis során is szignifikánsnak bizonyultak. 40

6. ÚJABB PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA OSTEOSARCOMÁBAN 6.1. Molekuláris szabályzók vizsgálata 6 Talán a legtöbbet vitatott és vizsgált antiproliferációs, illetve proapoptotikus gén a TP53 (17p13, terméke a p53), melynek hibája (általában pontmutáció és/vagy deléció) fordul elõ leggyakrabban emberi daganatokban (64, 83, 142, 161, 162). A 393 aminosavból álló p53 fehérje képes kötõdni más fehérjékkel (pl. vírusfehérjékkel) és oligomerizálódni saját magával (ami összefügg a transzformációs képességgel). A p53-ban különbözõ domének felelõsek a génátírás aktivációjáért, a szekvenciaspecifikus DNS kötõdésért, az oligomerizációért és a károsodott DNS-hez való kötõdésért. A p53 fehérje szerkezetét és ezen keresztül a mûködését alapvetõen befolyásolja a molekula foszforilációja és defoszforilációja (34). Mivel a p53-hiányos egér normálisan fejlõdik, arra következtettek, hogy a p53 nem elengedhetetlen a normál sejtosztódáshoz, differenciálódáshoz. Az viszont, hogy ezekben az egerekben megnõtt a legkülönbözõbb daganatok iránti érzékenység arra utal, hogy a p53-nak mégis van valamiféle általános védõhatása a tumorképzõdéssel szemben (34). Számos kísérlet alapján bizonyítottnak tekinthetõ hogy a p53 õrködik a sejt genetikai apparátusának épsége felett, ha a sejt károsodik, akkor a p53 expressziója fokozódik, stabilizálódik és meggátolja a proliferációt addig, amíg a károsodást a sejt nem javítja ki. Ha ez nem sikerül, akkor a p53 beindíthatja a programozott sejthalált (apoptosist), megakadályozva így azt, hogy a génhiba az utódsejtekbe kerüljön. A p53 ellenõrzõ funkciójának kiesése következtében a sejt genetikailag instabillá válhat és ez a genetikai hibák felhalmozódásához vezethet (83, 84, 86, 90). 6.1.2. A proliferáció gátlása A proliferáció gátlásával ismertté vált a p53 a G1-S átmenet ellenõrzõ pontjának egyik kulcsfontosságú eleme. Tetramer szerkezetû transzkripciós faktorként mûködik, igen kis 41

mennyiségben fordul elõ normális sejtekben, azonban a sejtet érõ stressz különbözõ formái aktiválják a p53-at, ez pedig azokat a géneket, amelyek a sejtciklust gátolják vagy az apoptózist indukálják (142, 162). A p53 egyik legfontosabb célpontja a WAF1/Cip1 gén (wild-type p53 activated fragment/cdk interacting protein), melynek promoterregiójához kötõdve stimulálja a WAF1 gén expresszióját, a p21 WAF1 hoz (proliferating cell nuclear antigen, 37kDa, DNS-polimerázhoz kapcsolódó, sejtciklusfüggõen megjelenõ fehérje) kötõdve gátolja azok mûködését. Gátlódik így a Cdkfüggõ foszforiláció, ami pl. a prb-t (retinoblasztoma génrõl termelt fehérje) inaktiválná, amely elengedhetetlen ahhoz, hogy a sejt a sejtciklusban továbbhaladjon. Kimutatták, hogy a DNS-t WAF1 DNS károsodáskor a p53 indukcióján keresztül ez a p21 WAF1 késleltetve a DNS szintézist (41, 70, 89, 160, 161). küszöb megemelkedik, 6 A p53 normál funkcióját befolyásolhatja/szabályozhatja, pontosabban gátolhatja egy hozzá kapcsolódó fehérje, az mdm2 (12q14-15 murine double minute, 2 Funkcionálisan az mdm2 túltermelõdése (pl. amplifikáció miatt) ugyanolyan inaktiváló hatású lehet, mint a p53 mutációja, vagy a p53 bizonyos virális fehérjékkel való kapcsolata. Tovább bonyolítja a szabályozást, hogy az mdm2 gén expresszióját a p53 indukálni képes, ami egyben a p53 önszabályozásának lehetõségét jelenti (6, 62, 95). Az mdm2 gátló hatását a p53 aktivációs doménjének elfedésével éri el. Az mdm2 és a CDK4 gén együttes amplifikációja additiv vagy szinergikus hatású lehet, talán ezért helyezkednek el egy replikonon. A p53 és mdm2 arány igen szorosan szabályozott egyensúlyként mûködik a sejtproliferáció során. Az mdm2 gén amplifikációját figyelték meg humán sarcomák egyharmadában, fõleg osteosarcomában, liposarcomában, illetve malignus fibrosus hystiocytomában (84, 85, 87, 161). 6.1.3. A p53 és az apoptózis 42

A p53 lehetséges hatása - a proliferáció gátlás - mellett az apoptózis indukálása. (pl. ha a sejt nem képes a génhibákat kijavítani), a funkciózavar egyik megnyilvánulása pedig az apoptózis elmaradása. A p53 és az apoptózis kapcsolatának pontos mechanizmusa ismert, de feltételezik, hogy elsõsorban a proapoptotikus Bax expresszióját fokozza és az antiapoptotikus Bc1-2-t gátolja. 6.1.4. Génhibák és funkcionális zavarok A p53 funkciózavarának egyik oka nyilván a gén hibája (mutáció, deléció), a másik pedig az, ha a normál p53 fehérjét valami inaktiválja. Inaktiválhatják az mdm2-n kívül- A mutációk többsége az 5.-8. exonban a 130-290 kodon között fordult elõ. Ezek között is forró pontokat jelentenek (gyakoriságuk miatt) a 175. a 248. és a 273. kodonok (170). Azzal általában mindenki egyetért, hogy a p53 gén hibája hozzájárul emberben a rosszindulatú daganatok keletkezéséhez és/vagy terjedéséhez, arról azonban megoszlanak a vélemények, hogy az egyes tumortípusokat tekintve a daganatok életének korábbi vagy késõbbi szakaszában játszik-e nagyobb szerepet a p53 zavara. Említésre méltó, hogy a p53 mutációjával nemcsak rossz, hanem jóindulatú tumorokban, sõt olyan állapotokban is találkozhatunk, melyeket nem tartunk daganatelõtti állapotnak, pl. prostatahiperplázia. Ez alátámasztja azt az elképzelést, hogy a p53 kóros mûködésének, valamint a normál mûködés hiányának különlegesen fontos szerepét elsõsorban az jelenti, hogy lehetõséget teremt a genetikai instabilitásra, egyéb génkárosodások megjelenésére. A génhibák és a prognózis közötti kapcsolat vizsgálatának alapja a hibás p53 mûködés felismerése. A p53 kóros mûködésére következtethetünk, pl. adott mutáció kimutatásával, vagy a kóros fehérje kimutatásával. Utóbbi vált a legelterjedtebbé, hiszen a mutáció miatt a sejtben a fehérje felhalmozódásának kimutatása elméletileg nem nehéz. Ennek ellenére az egyes közlemények adatai igen gyakran ellentmondásosak. Ennek oka lehet: eltérõ antitestek alkalmazása, a pozitivitás/negativitás és az intracellularis lokalizáció eltérõ értékelése, valamint olyan molekuláris szabálytalanságok, mint a mutáció miatti epitóp elvesztése, vagy éppen az, hogy a mutáció nem jár feltétlenül a fehérje féléletidejének meghosszabbításával (73). 43

Az egyes tumortípusok közül hasonló problémák miatt ellentmondásos a p53 génhiba prognózisban játszott szerepének megítélése. Általában a pozitív hisztokémia egyezik a mutációk jelenlétével, azonban nem mindig. Tüdõrákban, pl. aránylag gyakoriak az intronban bekövetkezõ és a nonszensz mutációk, melyeknél az immunreakció természetesen negatív (153). Vastagbélrákban is számos közlemény szólt a p53 felhalmozódás prognosztikai szerepe mellett azonban ellene is. Újabb megfigyelések szerint nemcsak a fehérje felhalmozódás maga, hanem a helye is fontos. Így, pl. vastagbélrákoknál (különösen a bal colonfélbõl és a rectumból kiindulóknál) a p53 citoplazmatikus (nem magi!) felhalmozódása a legfontosabb prognosztikai marker a stádiummal együtt (18). Emlõrákoknál nyirokcsomóáttét nélküli betegeknél 5.-8. exonra vonatkoztak, ami ahhoz az általános vélekedéshez vezetett, hogy a mutációk ezeken a szakaszokon vannak (65, 149). Az újabb vizsgálatok alapján nyilvánvaló, hogy sok p53 mutáció ezen a szakaszon kívül esett, sok a missense pontmutáció, ami stabil, de inaktív fehérjeszintézishez vezet. A p53 fehérje akkumulációja és a p53 génmutációja közti korreláció kb. 80%-os mivel pl. frameshift mutációk nem vezetnek p53 fehérje felszaporodásához (66). Teljes génszakaszt kell vizsgálni, mivel elveszíthetünk olyan információkat, amiknek klinikai jelentõségük lehet (13, 26). Ez magyarázhatja azt a heterogenitást, ami a publikált vizsgálatok eredményeiben mutatkozott. Malignus csonttumorokban is keresték a génhibák és a prognózis közti kapcsolatot (8, 16, 61, 85, 97, 103, 134). Vizsgálták a különbözõ szövettani altípusok és a prognózis, valamint a p53 kóros mûködése és a betegség kemoterápia iránti érzékenysége, valamint prognózisa közti korrelációt (16, 68, 84, 97, 119, 153, 154). A legtöbb tanulmány a p53 expresszió fokozódása és a kemoterápia iránti érzékenység, valamint a túlélés között szignifikáns 44

6.2. Klinikai és patológiai vizsgálat Retrospektív klinikai vizsgálatot végeztünk 1995. január és 1999. június között, hogy megvizsgáljuk a p53, valamint mdm2 fehérje expresszióját, és a p53 gént illetõen a heterozigótaság elvesztését. Vizsgálatainkat kiegészítettük a Ki-67 proliferációs antigén meghatározásával osteosarcomában szenvedõ betegek biopsziás, ill. mûtéti szövettani anyagán. A vizsgálatokat immunhisztokémiai módszerekkel a Szent János Kórház Pathológiai osztályán és polimeráz láncreakcióval (PCR) az OOI Molekulárbiológiai laboratóriumában végeztük. A vizsgálatok leírását és az értékelés elveit a vizsgálómódszerek rész tárgyalja (4.1.5., 4.1.6., 4.1.7.). 6.2.1. Beteganyag Az immunhisztokémiai vizsgálatokat 42 biopsziával igazolt, malignus, centrális, kezeletlen osteosarcomás beteg biopsziás, illetve mûtéti preparátumából nyert szövettani mintáin végeztük el. A 42 beteg közül 24 férfi és 18 nõ volt, az átlagéletkor 20 év (15-25 év). A primer tumor lokalizációja csökkenõ gyakorisági sorrendben: distális femur, proximális tibia, proximális humerus, calcaneus és distális tibia (5. táblázat). A szövettan szerinti megoszlást a 6. táblázat mutatja be. Distális femur 18 (43%) Proximális tibia 14 (33%) Proximális humerus 8 (19%) Calcaneus Distalis tibia 1 (2%) 1 (2%) 5. táblázat: A primer tumor lokalizációja 45

Szövettani diagnózis A betegek száma Osteoblastos 25 (60%) Kevert sejtes 6 (14%) Fibroblastos 4 (10%) Kissejtes 3 (7%) Teleangiectásiás 2 (5%) Chondroblastos 2 (5%) 6. táblázat: Szövettani megoszlás A tumorstádium megállapítása Enneking beosztás szerint történt (részletesen lásd 2. általános állapota a WHO skála szerint 0-1 (7. táblázat). A stádiumú, míg 34 beteg (81%) II/B stádiumú volt. A betegek 0 26 (62%) 1 16 (38%) 7. táblázat mintáiból tudtuk elvégezni, mivel ehhez a vizsgálathoz friss, fagyasztott tumorszövetre, valamint az adott betegtõl származó vérmintára volt szükség. A 20 beteg közül 5 II/A (25%), míg 15 II/B (75%) stádiumú volt. A II/A stádiumú betegeknél allélvesztést nem észleltünk, így a kiértékelésbe a II/B stádiumú betegek adatait vontuk be. A 15 betegbõl 11 férfi és 4 nõ volt, 10 és 29 éves kor között, az átlagéletkor 17 év volt. A primer tumor elhelyezkedése a gyakoriság sorrendjében: femur (8), tibia (4), humerus (3). Szövettani megoszlás szerint osteoblastost 6, teleangiectaticust 3, kevertsejtes formát 3, míg fibroblastost 2, és chondroblastost 1 esetben észleltünk. sziás mintából a diagnózist felállították, elkezdtük a COSS terápiás protokoll szerinti kemoterápiát (részletes leírását lásd 19. oldal). 46

A praeoperativ kemoterápia hatásosságát, a tumor szövettani regressziójának mértékét ugyancsak az irodalomból ismertetett szemikvantitativ módszerekkel vizsgáltuk (leírását lásd a 21. oldalon). Az általunk kialakított három csoport kemoterápiára jól reagáló (responder), mérsékelten reagáló (intermedier responder), és nem reagáló (non-responder) csoportokba soroltuk a betegeket (részletesen lásd a 21. oldalon). 6.3. Eredmények 6.3.1. A p53 fehérje expresszióváltozásának kimutatása A p53 fehérje expressziójának változását a kezdeti biopsziák 33%-ában és a mûtéti minták 38%-ában észleltük (8. táblázat). p53 fehérje expresszió anyag Mûtéti anyag - + ++ +++ - + ++ +++ IIA 8 0 0 0 7 1 0 0 IIB 20 1 7 6 19 4 5 6 8. táblázat beteg a diagnózis felállítása után kb. 1.5 éven belül meghalt. Hét esetben észleltünk a biopsziás anyagban ++ p53 pozitivitást a mûtéti resecatumokban öt ++ pozitiv maradt, a másik kettõ + pozitivvá vált a kemoterápiát követõen. A ++ p53 esetek közül 4 esetben alakult ki tüdõmetasztázis és 2 esetben lokális recídiva. Egy negativ biopsziás anyag + pozitivvá vált. A 28 p53 negativ esetbõl 3 betegnél alakult ki pulmonális metasztázis, 5 esetben észleltünk lokális recidívát. A statisztikai analizis szempontjából a p53 pozitiv (+, ++, +++) eseteket összevontuk, ez alapján a biopsziás anyagban a 14 p53 pozitiv eset közül 12 (86%) betegnél 47

alakult ki a daganat progressziója a három éves után követés során (pulmonális metasztázis, illetve lokális recidiva), míg a 28 p53 negativ esetben csak 8 (28%) betegnél. Szignifikáns különbség mutatkozott a daganat progressziója és a p53 expressziója között (p=0.032). Az mdm2 fokozott expresszióját 29 esetben észleltük a biopsziás anyagban ebbõl 28 betegnél a p53 negativnak bizonyult, míg a 14 p53 pozitiv esetben 13 biopsziás mintában észleltünk mdm2 negativitást, azaz a két aktivitás kizárta egymást. Pozitiv p53 reakció (+++) osteosarcomában (17. ábra), pozitiv p53 reakció (++) osteosarcomában (18. ábra). Pozitiv mdm2 reakció (+++) osteosarcomában (19. ábra). 17. ábra: Pozitiv p53 reakció (+++) osteosarcomában 200X-nagyítás 48

18. ábra: Pozitiv p53 reakció (++) osteosarcomában 200X-nagyítás 19. ábra: Pozitív mdm2 reakció (+++) osteosarcomában 200X nagyítás A következõ táblázat bemutatja a p53, valamint az mdm2 expresszióváltozás mértékét, a Ki67 proliferációs index meghatározását a biopsziás, illetve a mûtéti anyagban, a kemoterápiára való reagálás mértékét, illetve a túlélési idõt a vizsgált 42 esetben (9. táblázat). 49

NR: non-responder (nem reagált), IR: intermediaer responder (közepesen reagált), R: responder (reagált). 50

Szövettan St. p53 expressio biopsia mûtét Mdm2 expressio Biopsia mûtét Ki67 Respons Túlélés (hónap) Megjegyzés 1. Osteoblastos II/B -- -- +++ ++ n.é. R 69 2. Osteoblastos II/B ++ + - - n.é. NR 27 3. Kevertsejtes II/B --- -- +++ +++ 25 NR 40 4. Osteoblastos II/B +++ +++ - - 35-40 NR 10 (meghalt) 5. Osteoblastos II/B +++ +++ - - 35-40 NR 12 (meghalt) 6. Fibroblastos II/B - - +++ ++ 20 IR 30 7. Kevertsejtes II/B ++ ++ - - 20-25 NR 18 (meghalt) 8. Osteoblastos II/A - - +++ +++ n.é. R 59 9. Osteoblastos II/B - - ++ ++ 10 alatt IR 42 10. Chondroblast. II/B - - ++ - n.é. NR 26 11. Osteoblastos II/B - - ++ ++ n.é. IR 41 12. Osteoblastos II/B - - + + 20-25 NR 24 (meghalt) 13. Osteoblastos II/B - + ++ ++ n.é. R 50 14. Fibroblastos II/A - - +++ +++ n.é. R 56 15. Osteoblastos II/A - - ++ +++ n.é. R 52 16. Osteoblastos II/B - - ++ +++ n.é. NR 12 (meghalt) 17. Teleangiect. II/B - - +++ +++ 20 IR 48 18. Chondroblast. II/B - - +++ +++ 20 IR 37 19. Fibroblastos II/B - - +++ +++ 15-20 NR 14 (meghalt) 20. Osteoblastos II/A - - +++ +++ 20 R 61 21. Kevertsejtes II/B - - ++ ++ 10 alatt IR 30 22. Osteoblastos II/B ++ ++ - - 20 NR 18 (meghalt) 23. Osteoblastos II/B - - ++ +++ n.é. NR 16 (meghalt) 24. Osteoblastos II/B - - ++ +++ n.é. IR 36 25. Osteoblastos II/B - - +++ +++ 20 IR 48 26. Osteoblastos II/B - - +++ +++ 10 NR 12 (meghalt) 27. Kissejtes II/B - - +++ +++ n.é. NR 16 (meghalt) 28. Osteoblastos II/A - + +++ +++ n.é. R 56 29. Osteoblastos II/B ++ ++ - - 20 NR 14 (meghalt) 30. Osteoblastos II/B ++ ++ - - n.é. NR 10 (meghalt) 31. Osteoblastos II/B +++ +++ - - 35-40 NR 11 (meghalt) 32. Osteoblastos II/A - - +++ +++ n.é. R 64 33. Kevertsejtes II/B +++ +++ - - 35-40 NR 11 (meghalt) 34. Osteoblastos II/A - - +++ +++ 15-20 IR 38 35. Osteoblastos II/B ++ ++ - - n.é. NR 13 (meghalt) 36. Osteoblastos II/B +++ +++ - - 10 alatt NR 10 (meghalt) 37. Fibroblastos II/A - - +++ +++ 20-25 R 62 38. Kevertsejtes II/B ++ + - - n.é. NR 15 39. Kissejtes II/B + + ++ ++ n.é. IR 31 40. Kevertsejtes II/B +++ +++ 25-30 NR 17 41. Teleangiect. II/B - - ++ ++ 10 alatt IR 45 42. Kissejtes II/B - - ++ ++ 15 IR 46 9. táblázat 51

6 Pozitív p53 expresszió esetén rövidebb átlagos túlélési idõt észleltünk (10. táblázat). A fenti táblázatból látható, hogy mind a 28 p53 negativ beteg több mint 1 évet élt, és az átlagos túlélési idõ 3.3 év volt. Ez hosszabb, mint a p53 pozitív esetek átlagos túlélési ideje (+++ pozitiv eseteké 12 hónap, a ++ pozitiv eseteké 17 hónap). A p53 pozitiv eseteket összevonva az átlagos túlélési idõ 20 hó szemben a p53 negativ betegek 40 hónapos túlélési mutatójával. Öszefüggés észlelhetõ a p53 expresszió és a túlélés között (p= 0.02). p53 expresszió a biopsziás anyagban Átlagos túlélési idõ A betegek száma (n) +++ 12 hónap (1.0 év) 6 ++ 17 hónap (1.3 év) 7 + 31 hónap (2.5 év) 1-40 hónap (3.3 év) 28 10. táblázat: A p53 expresszió és a túlélés közti összefüggés 6.3.3. Korreláció a p53 expresszió és a kemoterápiás érzékenység között Az esetek (n=42) megoszlása a különbözõ csoportok között a köve (21) nem reagált, 29% (12) közepesen reagált és 21% (9) reagált. A 14 p53 pozitív beteg közül 13 (93%) nem reagált a kezelésre, és ezek között található az összes erõsen p53 pozitív eset. Ez felveti a p53 fokozott expresszió és a kemoterápia-rezisztencia közötti pozitív korrelációt. A 28 p53 negatív beteg közül 20 reagált a kezelésre (71%), míg 8 (28%) nem reagált. Azok a betegek, akiknél fokozott p53 expresszió mutatható ki nem reagálnak a kemoterápiára és az utánkövetés során a túlélési idejük is rövidebbnek bizonyult. A reagálók csoportjában az átlagos túlélési idõ 3.3 év volt. A közepesen reagálók csoportjában egy esetben észleltünk + pozitivitást mind a biopsziás ill. 52

mütététi anyagban, ennek a betegnek az átlagos túlélése is meghaladta az egy évet (p=0.03) A betegek száma (n) +++ 6 (100%) nem volt nem volt n=6 ++ 7 (100%) nem volt nem volt n=7 + Nem volt 1 nem volt n=1-8 (28%) 11 (39%) 9 (32%) n=28 11. táblázat: A kemoterápiára való reagálás 6.3.4. Az mdm2 expresszió és a kemoterápiára való reagálás közti összefüggés vizsgálata A biopsziás mintákban 29 esetben észleltünk mdm2 pozitivitást. A statisztikai analízis miatt a +, ++ és +++ pozitív eseteket összevontuk (12. táblázat). Ezek közül 8 (28%) beteg nem reagált a kezelésre, míg 21 (72%) reagált. Az összes mdm2 negatív beteg 13 eset, a kemoterápiára érzéketlen csoportba tartozott. kemoterápiára való reagálás negativ pozitiv összes eset ) 13 8 21 Reagált (R) + közepesen reag. (IR) 0 21 21 Összes eset 13 29 42 12. táblázat: mdm2 expresszió változás a biopsziás anyagban 53

6.3.5. A Ki 67 proliferációs index meghatározása A Ki67 a sejtciklusban lévõ sejteket jelöli. Ezzel egyértelmûen mutatja a proliferáló sejtek arányát a szöveten belül. Jelen vizsgálatunkban alkalmazott immunhisztokémiai módszer (dekalcinálási problémák miatt) a csonttumorok esetében nem mutatott megbízható eredményt (jóval gyengébb reakciót észleltünk, mint más daganatoknál), így a minták 43%-ában (18/42) a vizsgálat nem volt értékelhetõ. A hat +++ p53 mintából 4 esetben 35-45%-ban fokozott proliferációs indexet a hét ++ p53 pozitiv esetbõl 4 esetben 20-25% proliferaciós indexet észleltünk a biopsziás anyagban illetve a mûtéti mintákban is, ami arra enged következtetni, hogy a fokozott p53 expressióval összhangban, magasabb proliferációs indexet tapasztaltunk a kemoterápiára nem reagáló, rosszabb prognózisú daganatok esetében. A kevés értékelhetõ esetre való tekintettel (technikai nehézség miatt) statisztikailag szignifikáns következtetéséket levonni nem lehetett. A fenti vizsgálatokkal. A Ki-67 proliferációs aktivitás kimutatása immunhisztokémiai vizsgálattal (20. 54

20. ábra: Osteosarcoma Ki-67 proliferációs aktivitás kimutatása 200x nagyítás 6.3.6. A heterozigótaság elvesztésének vizsgálata A 15 vizsgált tumorból 6 (40%) mutatott allélvesztést a TP53 locusban, 4 (27%) a D17S579-re, 3 (20%) a D17S855-re, 2 (13%) mutatott a THRA 1-re. Minden minta legalább 1 markerre nézve informatív volt. A vizsgált esetek 53%-ában legalább egy locusban észleltünk allélvesztést a 17-es kromoszómán. A vizsgálat során a II/ betegek esetében nem észleltünk allélvesztést, míg a II/B (15/20) stádiumú betegek mindegyikénél kimutatható volt allélvesztés (21. ábra). Tumor LOH 55