Citokin gén-polimorfizmusok jelentősége a kissúlyú koraszülötteket érintő perinatális szövődmények kialakulásában

Citokin gén-polimorfizmusok jelentősége a kissúlyú koraszülötteket érintő perinatális szövődmények kialakulásában Dr. Treszl András Témavezető: Dr. Vásárhelyi Barna Semmelweis Egyetem Budapest I.sz. Gyermekgyógyászati Klinika 2005 Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola 1

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke 1. Bevezetés 1.1. A citokinek 1.1.1. Döntően proinflammatórikus hatású citokinek 1.1.1.1. Interleukin 1 (IL-1) 1.1.1.2.Tumor nekrózis faktor-α (TNF-α) 1.1.2. Döntően anti-inflammatórikus hatású citokinek 1.1.2.1. Interleukin-4 (IL-4) 1.1.2.2. Interleukin-6 (IL-6) 1.1.2.3. Interleukin-10 (IL-10) 2. Célkitűzések 3. Betegek és módszerek 3.1.1. A citokin-polimorfizmusok és a neonatális szepszis kapcsolatának vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 3.1.2. A citokin-polimorfizmusok és az akut veseelégtelenség vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 3.1.3. A citokin-polimorfizmusok és a nekrotizáló enterocolitis vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 3.1.4. A citokin-polimorfizmusok és lélegeztetés kapcsolatának vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 3.2. Módszerek 3.3. Statisztikai analízis 3.3.1. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek szepszisének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások 2

3.3.2. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek akut veseelégtelenségének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások 3.3.3. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek nekrotizáló enterocolitisének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások 3.3.4. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek lélegeztetésének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások 4. Eredmények 4.1. Citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek szepszise 4.2. Citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek akut veseelégtelensége 4.3. Citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek nekrotizáló enterocolitise 4.4. Citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek lélegeztetésének összefüggései 5. Megbeszélés 5.1. A citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek szepszisének összefüggései 5.2. A citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek akut veseelégtelenségének összefüggései 5.3. A citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek nekrotizáló enterocolitisének összefüggései 5.4. A citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek lélegeztetésének összefüggései 6. Új megállapítások Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék 3

Rövidítések jegyzéke ARF - akut veseelégtelenség AVP arginin-vazopresszin CARS kompenzatórikus anti-inflammációs válasz-szindróma COX2 ciklooxigenáz-2 CRH kortikotropin releasing hormon DIC - disszeminált intravaszkuláris koaguláció IBD gyulladásos bélbetegség ICE - interleukin-1β konvertáló enzim IFN-γ - interferon-gamma IL-1α - interleukin-1 alfa IL-1β - interleukin-1 béta IL-4 - interleukin-4 IL-4 ra - interleukin-4 receptor alfa lánc IL-6 interleukin-6 IL-10 - interleukin-10 IL-1 ra - interleukin-1 receptor antagonista IL-1R-AcP - IL-1 receptor akcesszor fehérje inos - indukálható nitrogénmonoxid-szintáz LPS - lipopoliszaharid MOF - többszervi elégtelenség NEC - nekrotizáló enterocolitis NO - nitrogénmonoxid OR - Odds ratio PAF - platelet-activating factor (vérlemezke aktiváló faktor) PCR - polimeráz láncreakció 4

PDA - perzisztáló ductus arteriosus PGE 2 prosztaglandin E 2 PLA 2 - foszfolipáz A 2 RAS - renin-angiotenzin rendszer SIRS szisztémás inflammációs válasz szindróma TGF-β - transforming growth factor-β (transzformáló növekedési faktor-β) Th - T helper limfociták TNF-α - tumor nekrózis faktor-alfa TSH - thyreoidea stimuláló hormon VLBW - very low birth weight (nagyon kis születési súly) 5

1. Bevezetés A koraszülöttség miatt funkcionálisan éretlen szervezet fokozottan hajlamos a perinatális szövődményekre. Emiatt magas az éretlen, kissúlyú koraszülöttek morbiditása és mortalitása [1]. A nagyon kis születési súlyú ( 1500 gramm) koraszülött (very low birth weight - VLBW) populáció felelős az össz-perinatális mortalitás 70%-áért; az életben maradt VLBW koraszülöttek 40%-ában pedig élethosszan tartó szövődmények alakulnak ki [1]. A nagyon kissúlyú koraszülöttek esetében a szepszis [2], az akut veseelégtelenség [3], a nekrotizáló enterocolitis [4], a perzisztáló ductus arteriosus [5], a bronchopulmonális diszplázia [6], valamint a koraszülöttek retinopátiája [7] a leggyakoribb perinatális megbetegedések közé tartozik. Az utóbbi évek kutatási eredményei szerint az említett kórképek patogenezisében, majd a szövődmények kialakulásában a gyulladásos választ szabályozó rendszer funkcionális zavarai meghatározó szerepet játszanak [8]. Az immunválasz effektivitásának és intenzitásának a szabályozásában a citokin-kaszkád központi szerepet tölt be. A legutóbbi évek eredményei alapján nyilvánvalóvá vált, hogy a citokin-kaszkád működése nagyon kissúlyú újszülöttekben zavart, részben a populáció éretlensége miatt [9,10]. A citokin-kaszkád aktivitását számos tényező befolyásolja így többek között a fertőzés vagy az alkalmazott terápia. Emellett, nagy felnőtt populációkon végzett vizsgálatok alapján, öröklött tényezők (genetikai polimorfizmusok) is hatással lehetnek a citokin-termelésre [11,12], ezáltal pedig a citokin-mediált betegségek 6

kialakulására. Arra vonatkozóan kevés adat áll rendelkezésre, hogy a citokin-polimorfizmusoknak lehet-e patogenetikai jelentősége igen kissúlyú koraszülöttek citokin-mediált perinatális szövődményeinek kialakulásában. Értekezésem első részében bemutatom a citokin-kaszkád azon elemeit, melyek genetikai polimorfizmusait vizsgáltam VLBW populációban. Az irodalmi adatok alapján ismertetem a különböző citokinek perinatológiai kórképekben betöltött szerepét, az azokat kódoló gének polimorfizmusainak feltételezett funkcionális hatásait. Az értekezés második részében vizsgálataim eredményeiről számolok be. 7

1.1. A citokinek A citokinek viszonylag kis, 8.000-40,000 dalton molekulatömegű, farmakológiailag aktív fehérjemolekulák, melyeket bizonyos sejttípusok termelnek, hogy önmaguk (autokrin hatás), vagy más sejttípusok (parakrin hatás) működését, interakcióját befolyásolják. Jelenleg 27 citokint tartanak nyilván interleukin (IL) névvel. Más citokinek, például a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α) vagy interferon-gamma (IFN-γ) megtartották eredeti nevüket. A citokineket biológiai tulajdonságaik alapján osztályozzák, mivel nincs általános jellemző aminosav-szekvenciájuk vagy térbeli szerkezetük. A legtöbb citokint egészséges körülmények között nem termelik a sejtek, csak meghatározott ingerre. A kutatások során nyilvánvalóvá vált, hogy a citokin-gén expressziót kiváltó hatások gyakorlatilag azonosak a sejt stresszorokkal (például UV fény, hőhatás, hiperozmolalitás, vagy az idegen felszín) [13,14]. Bizonyos citokinek egyértelműen fokozzák a gyulladást, ezeket proinflammatórikus citokineknek [15] nevezzük, míg más citokinek ellensúlyozzák a proinflammatórikus citokinek aktivitását, ezeket antiinflammatórikus citokineknek [16] nevezzük. A kettő közötti határ nem egészen egyértelmű, bizonyos körülmények között egyes proinflammatórikus citokinek anti-inflammatórikus hatást fejtenek ki és viszont [17]. Az immunválaszt a gyulladásos fehérjék komplex és bonyolult hálózata alakítja ki (1. ábra). A pro- és anti-inflammatórikus citokinek egyensúlya, illetve ezen egyensúly felborulása befolyásolhatja az egyes betegségek kialakulását és azok kimenetelét (2. ábra). 8

Gyulladásos válasz 1. ábra. A pro- és anti-inflammatórikus citokinek bonyolult hálózata alakítja ki az immunválaszt. 9

Hatás T- és B-sejtek, NK sejtek, makrofágok Proinflammatórikus válasz: IL-1, TNF-a, IL-6 Anti-inflammatórikus válasz: IL-10, IL-4, IL-6 Szisztémás gát Hiper-inflammációs státusz Hipo-inflammációs státusz SIRS Szisztémás inflammációs válasz szindróma CARS Kompenzatórikus anti-inflammációs válasz szindróma Kardiovaszkuláris következmények (sokk), apoptózis, szervi diszfunkciók (MOF) Az immunrendszer szuppressziója 2. ábra. A szervezetet érő stresszhatásra bekövetkező pro- és antiinflammatórikus citokinválasz. 10

Az immunrendszer pro- és anti-inflammatórikus citokinjei között dinamikus és állandóan változó egyensúly áll fenn. A gyulladás szabályozásának megértését tovább nehezíti az a tény, hogy az immunválasz egyes útjai redundánsak és több elemnek igen hasonló fiziológiai hatása van. Emellett, az IL-1 receptor antagonista kivitelével valamennyi antiinflammatórikus citokinnek van proinflammatórikus hatása is. Egy citokin végső hatását ezért több tényező is befolyásolja, így többek között: a citokin szekréciójához szükséges idő, az a környezet, ahol hatását kifejti, szinergista vagy antagonista hatású elemek jelenléte, a citokin-receptorok mennyisége, illetve az adott szövet/sejt citokin iránti érzékenysége [15]. Az ugyanazon stresszorra adott citokin válasz egyénenként eltérő. Ennek oka részben a citokineket termelő gének egyéni különbözősége (polimorfizmusa). A polimorfizmus érintheti a gén közbefogott (flanking) régióját, intronját, ritkábban exonját [18,19,20]. Ez utóbbi esetben a génpolimorfizmus aminosav eltéréssel járhat. Emellett nem csak az adott génen, hanem annak szabályozó, promoter/enhancer régiójában levő mutációk is befolyásolhatják a géntranszkripció aktiválódásának mértékét [20]. A citokineket szabályozó géneket érintő polimorfizmusoknak azért van nagy jelentősége, mert egy-egy citokinnek az optimálistól eltérő mennyiségű szintézise az egész gyulladásos kaszkád hatékonyságát befolyásolhatja. A citokin gének polimorfizmusa hatással lehet azon betegségek kialakulására és lefolyására, melyekben a citokin termelődés megváltozása kóroki szerepet játszhat. 11

1.1.1. Döntően proinflammatórikus hatású citokinek 1.1.1.1. Interleukin-1 (IL-1) Az interleukin-1 családot három, struktúrálisan rokon polipeptid: az IL-1α, az IL-1β, valamint a hatásukat gátló IL-1 receptor antagonista (IL-1 ra) alkotja [21]. A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete Az IL-1α és IL-1β génje a 2-es kromoszóma hosszú karján helyezkedik el. Az IL-1β génjének több SNP-je is ismert (az adott polimorfizmus elkülönítésére használt restrikciós endonukleáz alapján: Mwo I, MspAI1, Alu1, TaqI, BsoF1). Vizsgálataimban az 5-ös exon 3954-es helyén található citozin timin (C T) tranzíció jelenlétét vizsgáltam (TaqI). Irodalmi adatok szerint a T jelenlétében nagyobb mennyiségű IL-1β termelődik [22]. Az IL-1β polimorfizmus hordozása együttjárt a koraszülöttség kialakulásának fokozódásával [23]. A chorioamnitisben mérhető nagy IL-1β szintek befolyásolják a magzat fejlődését és az újszülöttkori morbiditást [24]. Az IL-1α és IL-1β aminosav sorrendje eltérő, de másod- és harmadlagos szerkezetük hasonló, ugyanazon a sejtfelszíni receptorokon 12

keresztül hatnak és biológiai hatásaik is hasonlóak. Az IL-1α-t és az IL-1β-t a mononukleáris sejtek, elsősorban a fagociták szintetizálják gyulladásos stimulusok vagy bizonyos mikroorganizmusok hatására. Mindkét citokin 31.000 dalton molekulatömegű prekurzor molekulákból képződik; a hatékony fehérjék molekulasúlya 17.000 Dalton [15]. Hatásmechanizmus A legtöbb IL-1α molekula a sejt citoszoljában marad, ahol valószínűleg az IL-1 termelődés autokrin szabályozásában van szerepe. A prekurzor a sejt felszínéhez kerül és ott a membránhoz kötődik. A membránkötött prekurzor biológiailag aktív, a szomszédos sejtek parakrin szabályozásában játszhat szerepet. Az IL-1α-val szemben nagy mennyiségű IL-1β szecernálódik az extracelluláris térbe és a keringésbe. Az IL-1β prekurzorát az intracellulárisan elhelyezkedő interleukin-1β konvertáló enzim (ICE) alakítja aktív fehérjévé (3.ábra) [25]. 13

Stimululs sejtmag IL1α - mrna IL1β - mrna IL1β - prekurzor IL1α - prekurzor ICE IL1β - prekurzor érett IL-1β Proteáz Membrán kötött IL-1α IL1α - prekurzor érett IL-1α 3. ábra. Az interleukin-1α és interleukin-1β termelődése. Az IL-1 α-t és β-t (továbbiakban IL-1) kétféle sejtfelszíni receptor köti. A 80 kda méretű, I. típusú receptor a legtöbb sejten megtalálható, az IL-1 hatásának transzdukciójában tölt be fontos szerepet. A 68 kda-os, II. típusú receptor elsősorban neutrofil granulociták, monociták, csontvelői sejtek és B-limfociták felszínén található. Leírtak emellett egy, a receptor működéséhez szükséges fehérjét, az IL-1 receptor akcesszor fehérjét is (IL- 1R-AcP) [26]. A receptorok és az akcesszor fehérje extracelluláris részei az immunglobulin-családba tartoznak, három IgG szerű doménből állnak, az IL-1 kötő helyeik hasonlóak. Sejtfelszínenként általában 50-nél több I. típusú receptor jelenik meg. Az IL- 1β szignáltranszdukcióhoz szükség van az I. típusú receptor/il-1β/il-1r- AcP komplex kialakulására [27]. 14

Az I. típusú receptor citoplazmatikus része hosszabb és affinitása nagyobb az IL-1α-hoz, míg a II. típusú receptor rövidebb, 29 aminosavból álló citoplazmatikus szegmenssel rendelkezik, affinitása viszont az IL-1β felé kifejezettebb. A II. típusú receptor valószínűleg csapdát jelent az IL-1 számára, ugyanis ezen típusú receptor nem rendelkezik a szignáltranszdukcióhoz szükséges citoplazmatikus doménnel [21,23]. A szervezetben mindig kimutatható solubilis IL-1 receptor, mely a II. típusú receptor extracelluláris részének proteolítikus hasításával jön létre. Specifikusan köti az IL-1-t, gátolva annak sejtfelszíni receptorhoz való kötődését [21]. Az IL-1 szerepe egészségesekben Egészségesek monocitáiban sem az IL-1α, sem az IL-1β mrns-ét nem mutatták ki. Az IL-1α kimutatható a bőrben, ahol valószínűleg a keratinociták érésében játszik szerepet. Egyes epitheliális sejtekben, neuronokban és adrenális sejtekben kimutatható IL-1, azonban ennek a homeosztázis fenntartásában betöltött szerepe nem ismert [28]. Egészségesekben az IL-1β plazma-koncentrációja 40 pg/ml alatti; szepszisben, akut szervkilökődésben, valamint a rheumatoid arthritis akut exacerbációjában szenvedő betegek esetében azonban ennél nagyságrendileg magasabb mérhető szérumszintek alakulhatnak ki [22, 23]. Az IL-1 patogenetikai szerepe egyes kórképekben Az IL-1 stimulálja a T- és a B-limfocitákat. [24, 25] 15

Az IL-1 emeli egyes mediátorok, így a PAF, a prosztaglandinok és a nitrogén monoxid szintézisét [29]. Az IL-1 ra másik kiemelkedően fontos szerepű proinflammatórikus citokinnel, a TNF-α val szinergista módon hat (4. ábra). IL-1, TNF-α, IFN-γ PLA 2 (II), COX2, inos, endoteliális adhéziós molekulák, kemokin-szintézis PAF, PGE 2 leukotriének, NO, neutrofil endoteliális adhézió, neutrofilek migrációja, neutrofilek aktivációja Gyulladás, szöveti destrukció, funkció-veszteség 4. ábra. Az IL-1, IFN-γ és a TNF-α által létrehozott gyulladásos kaszkád. Az IL-1α és IL-1β lázat, étvágytalanságot és hipotenziót válthat ki. Fokozza a hipofízis-hormonok elválasztását és a kollagén-szintézist; a prosztaglandinok szintézisének fokozásával pedig csökkenti a fájdalomküszöböt. Az IL-1-nek emellett szerepe van a Langerhans-szigetek 16

béta sejtjeinek pusztulásában, a mieloid leukémia-sejtek növekedésében, az arthritises és colitises gyulladásos folyamatokban, valamint az atheroszklerotikus plakkok kialakulásában [25, 26, 30]. Az interleukin-1 szerepe egyes megbetegedések kialakulásában Szeptikus sokkban az IL-1 közvetlenül az érfalra hatva a PAF (platelet-activating factor) és a nitrogénmonoxid szintézise révén vazodilatációt okoz, mely sokk kialakulásához vezet [31]. Colitis ulcerosában és Crohn-betegségben jellemzőek a bélfal aktivált neutrofilokban gazdag infiltratív léziói. Az IL-1 patogenetikai hatását alátámasztja az, hogy állatkísérletekben, akut, immunkomplex mediált colitisben az IL-1 hatásának gátlása csökkenti a gyulladást. Humán vizsgálatok szerint a nyálkahártya IL-1β/IL-1 ra arányának megváltozása fontos patogenetikai tényező a gyulladásos bélbetegségek kialakulásában [32]. Akut és krónikus mieloid leukémiás sejtek számára az IL-1β valószínűleg növekedési faktort jelent. Az IL-1β normál esetben sem a perifériás mononukleáris sejtekben, sem a csontvelői aspirátum sejtjeiben nem mutatható ki, akut mieloid leukémiában szenvedő betegek sejtjeiben viszont detektálható. IL-1β elleni antitestek szignifikánsan csökkentik ezen sejtek spontán proliferációját és in vitro kolónia-képző képességét [33]. Az 1. típusú cukorbetegség patogenezisében az IL-1β fontos szerepet játszik. Izolált Langerhans-szigeteket IL-1β-val inkubálva a béta-sejtek elpusztultak. Spontán autoimmun diabéteszes patkányokban az IL-1-ra adásakor a diabétesz később lépett fel [34]. 17

Az IL-1β szerepe újszülöttkori kórképekben Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt. Berner és mtsai [35] szeptikus újszülöttek köldökzsinórvérében határozták meg többek között az IL-1β szérumszintjét. Szeptikus újszülöttekben a citokin szintje lényegesen magasabb volt egészséges, illetve szepszis-gyanús, de nem szeptikus újszülöttekkel összehasonlítva. A szepszis esetén a felszabaduló citokinek jelentősen befolyásolják a vesefunkciót nem csak szisztémás, hanem helyi hatásaik révén is. A vese-specifikus gyulladásos citokin-válasz a TNF-α elválasztásával kezdődik, ezt követi az IL-1β. Ε két citokin pedig fontos szerepet töltenek be a súlyos fertőzéssel összefüggésben levő akut veseelégtelenség (ARF) kialakulásában [36]. Korábbi tanulmányok szerint az IL-1β megváltozott termelése szerepet játszhat a nekrotizáló enterocolitis (NEC) kialakulásában is. NECes újszülöttek szérumában magasabb IL-1β szintet mértek. Kimutatták, hogy az IL-1β mrns-e a NEC-es újszülöttek bélrezekátumainak a mucosájában és a teljes bélfal vastagságában emelkedettebb [37]. Bronchopulmonáris diszpláziában (BPD) szenvedő újszülöttek esetén már az amnionfolyadék IL-1β szintje magasabb volt a kontroll újszülöttekéhez képest. BPD-s újszülötteknél a légutak IL-1β szintje közvetlenül a születés után megemelkedik és ezen gyulladásos markerek szintje magasabb marad [38]. 18

1.1.1.2. Tumor nekrózis faktor-α (TNF- α) Bevezetés A TNF-α nemcsak a természetes immunitás egyik legfontosabb mediátora, hanem direkt citotoxikus hatása révén számos betegség patogenezisében is meghatározó szerepet játszik. Kiemelkedő sajátsága, hogy befolyásolja egyéb citokinek termelődését. A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete A TNF-α gén a 6-os kromoszóma rövid karján, a 21:3 lokuszon helyezkedik el [39]. 4 exon és 3 intron kódolja azt a 230 aminosavból álló 25 kda-os prekurzor molekulát, ami a TNF-α-t termelő sejtek membránjában helyezkedik el. Bár ennek is lehet biológiai hatása, mivel befolyásolja a sejtek közötti kapcsolatot, az aktív forma proteolízis során keletkezik. Az így létrejövő, 157 aminosavból álló 17 kda-os monomerek hármasával összekapcsolódva alkotják az aktív trimer TNF-α molekulákat [40]. Felnőttekben széles körben tanulmányozták a TNF-α polimorfizmusait, ezen belül is kiemelt figyelmet kapott a promoter régió 308-as helyén található guanin-adenin (G A) tranzíció jelenléte (ezt a polimorfizmust TNF2-nek, vagy a tranzíciónál hasító endonukleáz alapján NcoI-nek is nevezik). Az A jelenlétében nagyobb a keringő TNF-α plazmaszintje a gén fokozott transzkripciója miatt [41]. A promoter régió egy másik helyén, a 238-as pozícióban ismert egy másik guanin-adenin (G A) polimorfizmus (MspI), mely - legalábbis pszoriázisban szenvedő betegekben - csökkent TNF-α termeléssel járt [42]. A TNF-α, de más citokinek, így az IL-1β, IL-6 és IL-8 emelkedett 19

szérumszintjei következményekkel járnak az anyára és a magzatra is. [43,44,45,46]. A TNF-α G -308 A alléljének a prevalenciáját vizsgálták spontán koraszülő nőkben. Dizon-Townson és mtsai nem találtak különbséget a polimorfizmus előfordulásában kontroll és spontán koraszülő nők között [47]. Ezzel ellentétben mások összefüggést írtak le a TNF-α -308 A hordozása és a chorioamnionitis és a spontán koraszülés között. [48,49]. Bioszintézis és szabályozás A TNF-α-t döntően a makrofágok termelik, elsősorban endotoxinstimuláció, interferon-γ, vagy migrációgátló faktor hatására. A citokin produkciójában részt vesznek az aktivált T-sejtek, hízósejtek, natural killersejtek, Kupffer-sejtek, asztrociták, gliasejtek, oszteoblasztok. A TNF-α termelés egyik legkifejezettebb stimulusát az endotoxint vagy lipopoliszacharidot termelő Gram-negatív baktériumok jelentik [50]. A Gram-pozitív baktériumok, vírusok és paraziták a makrofág sejtek serkentése révén indukálnak fokozott TNF-α szintézist. A TNF-α termelését proinflammatórikus és anti-inflammatórikus citokinek is befolyásolják. Az IFN-γ a TNF-α termelés egyik fontos, szinergista hatású stimulánsa, az IL-10 viszont csökkenti a TNF-α szintézist. Szérumszintje diurnális ingadozást mutat: legnagyobb mennyiségben éjjel és a hajnali órákban található a keringésben [51,52]. A TNF-α-gén átírása és emiatt a TNF-α vérszintje egészséges emberben a jelenlegi metodikákkal a kimutathatósági küszöböt nem éri el. Aktiváció, pl. gyulladás hatására a TNF-α-mRNS szintje 15-30 percen belül kezd emelkedni, de ezt proteinszintézis egyelőre nem kíséri. 20

Az mrns-ről átíródó, a membránba kihelyeződő 25 kda-os prekurzor molekula hasítását egy metalloproteáz enzim, a TNF-α konvertáló enzim végzi. Az enzim aktivitását, ezáltal az aktív forma képződését lipopoliszacharidok és citokinek, többek között maga a TNF-α is befolyásolja. A plazminogén és a plazmin fokozza az enzim termelődését és elősegíti a biológiailag hatékony forma kialakulását. [53, 54] A TNF-α hatásmechanizmusa A TNF-α hatásait specifikus receptor család közvetíti. A receptorok apoptotikus, illetve proliferatív szignált közvetítenek. Közös jellemzőjük, hogy két egyforma transzmembrán doménből állnak, melyekben a receptorcsaládra jellemző módon ciszteinben gazdag extracelluláris láncszakaszok vannak. Ezek az aminosav-szekvenciák általában 3-6-szor ismétlődnek. Egyes receptorokban egy 60 aminosavból álló citoplazmatikus szekvencia is jelen van, ami felelős az apoptotikus szignál közvetítéséért [55]. A receptorokat a nagyfokú ligand-specificitás jellemzi. Általában 3 ugyanolyan molekulából felépülő, ún. homotrimer ligandumokat kötnek. A TNF-α két receptorhoz, az 55 kda-os és a 75 kda-os receptorhoz egyforma affinitással kapcsolódik. Ezen receptorok a szervezet szinte valamennyi testi sejtjén megtalálhatók. A 75 kda-os típus nagyobb mennyiségben van jelen az endotél- és hemopoetikus sejteken [56]. A két receptor eltérő hatásokat közvetít (5. ábra). 21

Gram-negatív baktériumok Lipopoliszacharid Makrofág sejtek TNF-α 55 kda-os receptor 75 kda-os receptor Fokozza az 55 kda-os receptor által mediált hatásokat Apoptózis T-sejt proliferáció Tumorsejt lízis in vitro Dermális nekrózis Tumor hemorrhágiás nekrózisa Inzulinrezisztencia Sokk, szövetkárosodás Láz 5. ábra. A TNF receptorok által közvetített hatások. 22

A TNF-α receptorok aktiválódása két lépcsőben történik. Ennek során a keringő TNF-α trimer egyik molekulája a két alegységből álló receptor egyik kötőhelyéhez kötődik. Ezután a receptor másik, szabad alegységén lévő kötőhely úgy mozdul el, hogy a TNF-α trimer egy másik alegysége hozzá tudjon kötődni. A receptornak ez az elmozdulása felel azután az intracelluláris válasz kiváltásáért [57]. A transzmembrán receptorok mellett létezik egy, a véráramban keringő receptortípus is, ami a transzmembrán receptorok extracelluláris doménjének lehasításából származik. A hasítást végző enzim a TNF-α konvertázhoz hasonlóan szintén metalloproteáz. Az enzim aktivitását elsősorban a keringő lipopoliszacharidok mennyisége, a TNF-α és más citokinek szabályozzák. Az oldott receptor a TNF-α moláris koncentrációjához képest kb. 1000-szeres többletmennyiségben van jelen, de funkciója még nem teljesen ismert. Elképzelhető, hogy a szolubilis TNF receptor megkönnyíti a citokin prezentációját a célsejtek számára, vagy a szervezet számára veszélyes immunsejt-túlstimulációtól védi a szöveteket a biológiailag aktív TNF-α megkötésével. Lehet, hogy mindkét folyamat végbemegy, vagyis excesszív TNF-α termelődés esetén a szolubilis receptor megköti a citokint, majd ebből a raktárból a TNF-α kisebb mennyiségekben távozik. Több betegségben (pl. szisztémás lupus (SLE), malignomák, szepszis, krónikus infekció) megfigyelték a szolubilis receptortípus mennyiségének növekedését [58]. A TNF-α által kiváltott hatások A TNF-α-t eredetileg elsősorban a tumorok növekedését gátló fehérjének tartották, mivel BCG-vel, majd endotoxinnal beoltott állatok szérumával kezelve előzőleg tumor-transzplantáción átesett egerekben a 23

daganat hemorrhágiás nekrózisát és regresszióját tapasztalták [59]. Később kiderült, hogy a citokin nemcsak a tumorsejtek, hanem a szervezet más, szöveti sejtjeinek differenciálódását, növekedését és metabolizmusát is befolyásolja. Kis koncentrációban a TNF-α aktiválja a védekező gyulladásos reakciókat. Elősegíti az érendotél sejteken az ELAM-1, VCAM-1 és ICAM- 1 adhéziós molekulák expresszálódását, ezáltal adhezívvé teszi azokat a neutrofilek, monociták és limfociták számára. Fokozza a neutrofil és eozinofil sejtek, makrofágok bactericid hatását. A TNF-α részt vesz a specifikus immunválasz koordinálásában is: hatására fokozódik a B- limfociták immunglobulin- és a fibroblasztok kolóniastimuláló faktor termelése. Akutan, nagy koncentrációban a TNF-α pirogén hatású. Emellett aktiválja az alvadási rendszert és ennek révén szövetkárosodást (akut renális tubuláris nekrózist, gasztrointesztinalis nekrózist, akut légzési distresszt, diffúz intravaszkuláris koagulopátiát és sokkot) vált ki. A TNF-α hosszú ideig tartó túltermelésekor a cachexia tünetei lépnek fel. 24

A TNF-α tumorsejtekre kifejtett direkt citotoxikus hatását több in vitro kísérlet bizonyította [60,61]. Emellett a TNF-α más citokinek és citotoxicus faktorok (pl. nitrogénmonoxid) aktiválásával közvetve is részt vesz a tumorsejtek elleni immunválaszban. A TNF-α daganatellenes hatását kifejezettebbnek találták vaszkularizált daganatok esetében [62]. A központi idegrendszerben a nagy TNF-α szint szövetkárosító hatású. Kis koncentrációban viszont az agyi homeosztázis fenntartásának egyik fontos eleme; fokozza az asztrociták [63] és a neuronális progenitor [64] sejtek proliferációját, elősegítve a károsodott idegszövet regenerációját. A TNF-α ezt a hatását nagy valószínűséggel az idegi növekedési faktor termelésének stimulálásával fejti ki [65]. Nagyobb (néhány nanogramm/liter) koncentrációban a TNF-α fokozza az endotélsejtek prokoaguláns aktivitását [66]. Az endothél sejtek aktin filamentumainak újrastruktúrálásával a sejtek közötti kapcsolat erőssége csökken (a sejtek elvesztik "tight junction" összeköttetéseiket) [67]. Ez plazmaproteinek vesztéséhez és a szövetközti folyadék felhalmozódásához vezet. A miokardiumon a TNF-α a nitogénmonoxid termelés serkentésével negatív inotrop hatást fejt ki [68,69]. A TNF-α szerepe újszülöttkori kórképekben Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt. Endotoxin sokkban a TNF-α magas szintje szerepet játszik a perifériás vaszkuláris rezisztencia kialakulásában és a szív teljesítményének csökkenésében. A kapillárisok résein keresztül fokozódik a folyadékvesztés az extracelluláris térbe. A pulmonalis endotélsejtek aktiválódása, a granulociták degranulációja és a kapillárisokon 25

keresztüli folyadékvesztés miatt az alveolusokban folyadék halmozódik fel és respiratórikus distressz szindróma fejlődik ki. Berner és mtsai szeptikus újszülöttek köldökzsinórvérében határozták meg a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-8 szérumszintjét. A koraszülöttségtől függetlenül szeptikus újszülöttekben valamennyi citokin szintje lényegesen magasabb volt egészséges, illetve olyan újszülöttekkel összehasonlítva, akiknél felmerült a szepszis lehetősége [35]. Atici és mtsai szerint a TNF-α szérumszintje szeptikus újszülöttekben szignifikánsan magasabb [70]. Súlyos infekció hatására romlik a vese perfúziója, ennek a folyamatnak a mediátorai többek között a gyulladásos citokinek. Szepszisben a keringő citokinek mind szisztémás, mind helyi hatásaik révén is befolyásolják a vesefunkciót. A gyulladásos citokin-válasz a TNF-α szecernálásával kezdődik, ezt követi az IL-1β, majd ezután jelenik meg az anti-inflammatórikus IL-6. Egyes irodalmi adatok szerint a TNF-α, fontos szerepet játszik a NEC patogenezisében [71,72]. A patkányoknak parenterálisan beadott TNF-α hatására sokk és gasztrointesztinális nekrózis alakult ki. NEC-es újszülöttekben magasabb szérum TNF-α szintet mértek [73]. Viscardi és mtsainak vizsgálatai szerint a TNF-α és az IL-1β szintje a NEC-es újszülöttek bélrezekétumainak teljes vastagságában magasabb, ami felveti ezen citokinek patogenetikai szerepét a helyi gyulladásos folyamat mediálásában [74]. A BPD-s újszülöttekben mind az amnionfolyadékban, mind pedig a légutakban magasabb TNF-α szintet mértek [75]. 26

A gyulladásos bélbetegségek kialakulásának vizsgálata során már korábban felvetődött a gyulladáskeltő citokinek, ezen belül a TNF-α fokozott termelődésének a lehetősége. Állatkísérletben rekombináns TNF-α hatására a vékonybélben iszkémiás nekrózis alakult ki [76,77]. Szoros összefüggést találtak a gyulladásos bélbetegség súlyossága és a szérum, illetve széklet TNF-α koncentráció között [78]. 1.1.2. Döntően anti-inflammatórikus hatású citokinek 1.1.2.1. Interleukin-4 (IL-4) A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete Az IL-4 20000 daltonos glikoprotein. Pleiotrop hatású, mely befolyásolja a T helper (Th) sejtek differenciálódását. Az IL-4-et az érett Th 2 sejtek, valamint a hízósejtek és a bazofil sejtek termelik [79]. Az IL-4 hatására a Th prekurzor sejtek Th 2 irányba differenciálódnak. A Th 2 sejtek ugyancsak termelnek IL-4-et, mely így a citokin autokrin termelődése révén tovább erősíti a sejtproliferációt (6. ábra). A Th 2 sejtek termelte IL-4 és IL- 10 a makrofág eredetű IL-12 termelés csökkentése révén a Th 1 válasz szuppressziójához vezet. Az IL-4 hatását az IL-4 receptor közvetíti. A receptort kódoló gén a 16-os kromoszóma rövid karján helyezkedik el. A receptor α lánca egy 140 000 daltonos fehérje, mely nagy affinitással köti az IL-4-et, emellett 27

receptora az IL-13-nak is. A receptor α lánc génjének 1902-es hely leírtak egy adenin guanin (A G) tranzíciót, mely MspI restrikciós endonukleáz enzimmel hasítható. A guanin jelenlétében az 576-os aminosav argininra változik. Funkcionális vizsgálatok szerint az arginin hatására fokozott szignáltranszdukciós aktivitású receptor keletkezik [80], melynek szerepet tulajdonítanak az atópia kialakulásában [81]. Biológiai hatás Az IL-4 részt vesz a Th 2 válasz irányításában: aktiválja a hízósejtek és stimulálja az IgE antitestek termelését azáltal, hogy a B sejteket IgE szekretáló sejtekké alakítja [82]. Az IL-4 több, strukturális sejt működését is befolyásolja. Fokozza a vaszkuláris endotél és a bőr fibroblasztjainak proliferációját, gátolja viszont a felnőtt humán asztrociták és vaszkuláris simaizomsejtek proliferálódását [83]. Az IL-4 patogenetikai szerepe Az IL-4 gátolja a gyulladásos citokinek expresszióját és elválasztását. A monocita eredetű citokinek (például a IL-1, TNF-α, IL-6) hatását blokkolja. Emellett gátolja a makrofágok citotoxikus tevékenységét és nitrogénmonoxid termelését. Fokozza viszont az IL-1 ra termelődését [84]. Bakteriális fertőzés esetén az IL-4 hatása összetett és még nem minden részletében felderített. A Gram-negatív bakteriális pneumonia állatmodelljében az IL-4 fokozta a Pseudomonas aeruginosa elleni aktivitást [85]. Gram-pozitív baktériumok okozta fertőzésben viszont az IL-4 a 28

Staphylococcus aureus számára növekedési faktort jelentett, mely szisztémás infekcióhoz és fokozott szeptikus mortalitáshoz vezetett [86]. Th2 sejtek Vizsgált gének: IL-4, IL-4 Rα, IgERβ B sejt Th0 sejtek IgE termelés Hízósejt Leukotriének Hisztamin PAF ACE bronchokonstrikció 6. ábra. Az IL-4 hatása a Th sejtek differenciálódására. Az IL-4 immunregulációs és anti-inflammatórikus hatású és centrális szerepet tölt be a bél immunológiájában. Gátolja a makrofágok kolóniaképződését, a monociták H 2 O 2 termelését, és egyes gyulladásos mediátorok, így a TNF-α és az IL-1β szintézisét [87,88]. 29

Az intesztinális traktus extenzív gyulladásával járó gyulladásos bélbetegségekben (IBD) az IL-4 meghatározó szerepet tölt be. IBD-s betegekben a gyulladt nyálkahártya IL-4 termelő sejtjeinek száma csökkent. Emellett a gyulladt bélszakasz lamina propriájából izolált mononukleáris sejtjei kevesebb IL-4 mrns-t tartalmaznak és a citokint is kisebb mennyiségben szekretálják mint a kontroll sejtek [89,90]. A nagyon hasonló citokin-profil miatt felmerült, hogy a NEC és a Crohn-betegség, kialakulásának pathomechanizmusában jelentős hasonlóságok mutathatók ki [91]. Bár a NEC és az IL-4 kapcsolatáról nem állnak rendelkezésre irodalmi adatok, mégis felvethető ennek a citokinnek a jelentősége a betegség kialakulásában. 30

1.1.2.2. Interleukin-6 (IL-6) A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete Az IL-6 gén a 7-es kromoszóma rövid karján van. A gén 5 exonból és 4 intronból áll, transzkripcionális szabályozása meglehetősen összetett [92]. Az IL-6 promoterének 174-es pozíciójában található guanin citozin (NlaIII) polimorfizmus funkcionálisan jelentős, mivel a citozin jelenlétében kisebb plazma IL-6 szinteket mértek [93]. A C allél esetében kisebb a bazális, valamint a LPS-re és az IL-1-re adott transzkripciós válasz, mint a G allél esetében. Egyes kisebb vizsgálatokban hasonlónak találták a spontán abortáló és kontroll nők között az IL-6 G-174C, IL-10 G-1082A, IFNγ A-874 T és TNF-α G-308A polimorfizmusok előfordulási gyakoriságát [94,95,96,97]. Az IL-6 promoter -174 C/C genotípusa ritkább volt koraszülő nőkben [98]. Az IL-6 funkcionális formája egy homodimer, ahol az alegységek 4 α-helikális globuláris doménből állnak. Hatásmechanizmus Az IL-6 hatásait az egyetlen transzmembrán fehérjéből álló IL-6 receptoron keresztül fejti ki. A citokin hatására a receptor egy másik transzmembrán receptort, a gp 130-at homodimerizálja és ez indítja el a szignál-transzdukciót. Az IL-6 receptor T-sejteken, aktivált B-sejteken, valamint perifériás monocitákon és makrofágokon található meg. Az IL-6- nak van szolubilis formája is, mely a membránreceptor extracelluláris 31

doménjéből áll. A citokin a gp 130-at még a szolubilis receptoron át is képes aktiválni, még akkor is, ha a sejtek felszínén nincs is transzmembrán receptor [99]. Biológiai hatás Az IL-6-ot monociták, makrofágok és endotélsejtek termelik. Sokáig proinflammatórikus citokinnek tekintették, mely LPS hatására a TNF-α-val és az IL-1-gyel együtt aktiválódik [99]. A legtöbb citokinhez hasonlóan az IL-6-nak is van pro- és anti-inflammatórikus tulajdonsága. Bár az akut fázisfehérjék aktiválásában is részt vesz, kifejezett anti-inflammatórikus hatásokkal rendelkezik. A citokin limfoid és nem-limfoid sejtekben is képződik és befolyásolja T és B-sejtek differenciálódását és proliferációját. Emellett az IL-6-nak igen sokrétűek a hatásai, részt vesz az endokrin és a metabolikus folyamatok szabályozásában is (2. táblázat) [100]. 32

Hematológiai hatások Multipotens hematológiai őssejtek proliferációja Mielóma és plazmocitóma sejt-növekedés Immunológiai hatások B-sejtek differenciálódása és érése B-sejtek immunoglobulin termelése T-sejtek differenciálódása és érése Hepatológiai hatások Hepatocita stimuláció Az akut fázis reakció génjeinek (C-reaktív protein, haptoglobin, fibrinogen) indukciója Neurológiai hatások Idegsejt differenciálódás Gliózis (transzgén egérben) Kardiológiai hatások Miokardium hipertrófia Endokrin hatások Termogenezis indukciója (endogen pirogén) Hipotalamo-adrenális tengely stimulációja Vazopresszin szekréció stimulációja Növekedési-hormon elválasztás stimulációja Thyreoid tengely szuppressziója Szérum lipid-szintek csökkentése Oszteoporózis (posztmenopauzás, vagy a hipogonadizmus miatt) 2. táblázat. Az IL-6 hatásai. Az IL-6 csökkenti a TNF-α és az IL-1 termelődését. Ugyancsak csökkenti egyéb, proinflammatórikus hatású fehérjék (GM-CSF, IFN-γ) szintézisét, viszont nem befolyásolja más anti-inflammatórikus citokinek, mint az IL-10 és a transforming growth factor-β (TGF-β) termelődését [101]. Az IL-6 fokozza az IL-1 ra ás a szolubilis TNF-α receptorok elválasztását. A katekolaminok fokozzák az IL-6 termelődését, az ösztrogének és az androgének viszont csökkentik. Az IL-6 fokozza a kortikotropin releasing 33

hormon (CRH), növekedési hormon (GH) és az arginin-vazopresszin (AVP), csökkenti a thyreoidea stimuláló hormon (TSH) termelődését (7. ábra) [102]. Stressz Kortizol Katekolaminok Ösztrogének, androgének Kortizol Lipidek 7. ábra. Az IL-6 endokrin és metabolikus hatásai. Az IL-6 újszülöttekben Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt. Romagnoli és mtsai szeptikus koraszülöttekben nagyobb IL-6 és IL-10 szintet mértek egészséges koraszülöttekhez képest [103]. Berner és mtsai szeptikus újszülöttek köldökzsinórvérében határozták meg az IL-6 szérumszintjét [104]. A koraszülöttségtől függetlenül szeptikus újszülöttekben az IL-6 szérumszintje lényegesen magasabb volt egészséges, 34

illetve olyan újszülöttekkel összehasonlítva, akiknél felmerült a szepszis lehetősége. Kashlan szerint a köldökzsinór vér IL-6 koncentrációja igen érzékeny indikátora a koraszülöttek szepszisének [105]. Egy nemrégiben megjelent vizsgálatban Krueger és mtsai azt találták, hogy a szepszis diagnózisát a szérum IL-6 és IL-8 mérésekkel meg lehet erősíteni [106]. A szepszis fennállásakor a keringésbe jutó mediátorok, így a citokinek is jelentősen befolyásolják a vesefunkciót nemcsak szisztémás, hanem helyi hatásaik révén is. A vesében a gyulladásos citokin-válasz a TNF-α elválasztásával kezdődik, ezt követi az IL-1β, majd ezután jelenik meg az anti-inflammatórikus IL-6. Korábbi tanulmányok szerint az immunregulációs citokinek (TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10) megváltozott termelése szerepet játszhat a NEC kialakulásában. NEC-es újszülöttek szérumában magasabb IL-6, szintet mértek. A köldökzsinórvér IL-6 szintje magasabb volt azon újszülöttek esetében, akiknél a születés után közvetlenül nekrotizáló enterocolitis alakult ki [107]. Egy másik vizsgálatban az anti-inflammatórikus IL-6 és IL-10 citokinek szérumszintje a NEC-es gyulladásos folyamat progressziójával párhuzamosan fokozódott [108]. Bronchopulmonáris diszpláziában szenvedő újszülötteknél az amnionfolyadékban a születés előtt 5 nappal már magasabb IL-6 szintet mértek [109] A BPD-s újszülöttek pulmonáris mosófolyadékában magasabb IL-6 szintet mértek [110]. 35

1.1.2.3. Interleukin-10 (IL-10) Az IL-10-et a CD4+/CD8+ T-sejtek, valamint B-sejtek, makrofágok, aktivált hízósejtek és keratinociták termelik. A citokin génje az 1-es kromoszómán helyezkedik el. Az IL-10 a humán immunválasz legfontosabb anti-inflammatórikus hatású citokinje; gátolja a Th1 eredetű gyulladásos fehérjék szintézisét. Gátolja emellett a monocita/makrofág eredetű proinflammatórikus proteinek termelődését. A makrofágokra kifejtett hatékony immunszuppresszív hatásával ellentétben az IL-10 stimulálja a B- sejtek proliferációját, differenciálódását és antitesttermelését. A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete Az IL-10 két, 160 aminosavból álló, szorosan összekapcsolódó 18 kda-os homodimer formájában van jelen a keringésben. Az IL-10 génjének promoter régiójában több polimorf hely is ismert (-1082, -819, -592). A 1082-es helyen lévő G A tranzíció hatására a stimulált T- sejtek kisebb mennyiségű IL-10-et termeltek. Egyes tanulmányok szerint ugyanakkor a magasabb IL-10 szintek mellett, infekciós kórképekben szereplő betegek között magasabb a mortalitás [111]. Egy meta-analízisben a nagy IFNγ és kis IL-10 termelődéssel járó polimorfizmus hordozó nők között gyakoribb volt a koraszülés [112]. Egy másik vizsgálat alapján azon nők esetében, akik kis Th2/Th3 és nagy Th1 citokin szinttel járó polimorfizmus mintázatuk volt, gyakoribb volt a koraszülés [113]. 36

A citokin receptora egy 110 kda-os sejtfelszíni molekula, mely közvetíti a TNF-α, IL-1, IL-6, GM-CSF termelődését gátló hatást. Csökkenti emellett a TNF-α receptorok sejtfelszíni expresszióját [116]. Szisztémás fertőzésekben az IL-10 szintje a plazmában is mérhetővé válik és jelentősen befolyásolja az immunválaszt. Megfigyelték például, hogy magas IL-10 és kis TNF-α szérumszintű betegek kisebb valószínűséggel halnak meg meningococcus-okozta fertőzésekben. Állatkísérletben az IL-10 adására javult az endotoxémia túlélése. Az IL-10 génkiütött egerek sokkal érzékenyebbek az endotoxin kiváltotta sokkra, mint a normál állatok. Az IL-10 knock-out egerekben a humán gyulladásos bélbetegségekhez igen hasonló krónikus gyulladásos enteritis alakul ki. Jelenleg már klinikai vizsgálatok folynak az IL-10 gyulladásos bélbetegségekben való terápiás alkalmazásával kapcsolatosan [114]. Az IL-10 szerepe újszülöttekben Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt. Szeptikus koraszülöttekben nagyobb IL-6 és IL-10 szintet mértek egészséges koraszülöttekhez képest [115]. A génpolimorfizmusok hatását ezidáig főként vesetranszplantációban tanulmányozták. Egyes vizsgálatok szerint az IL-10 polimorfizmusa befolyásolja a graft túlélését [115]. A rendelkezésre álló adatok szerint az IL-10 citokin szintjei megváltoznak NEC-ben. Egy másik vizsgálatban az anti-inflammatórikus IL-6 és IL-10 citokinek szérumszintje a NEC-es gyulladásos folyamat progressziójával párhuzamosan fokozódott [108]. 37

2. Célkitűzések 1. A citokin-gén polimorfizmusok a gyulladásos fehérjék termelésének megváltoztatásával befolyásolják a bakteriális infekcióra adott immunválasz mechanizmusát is. Felnőttek esetében több vizsgálatban is összefüggést mutattak ki egyes genetikai polimorfizmusok és a szepszis lefolyása és kimenetele között [11]. Újszülöttek esetében azonban eddig csak a TNF-β gén NcoI polimorfizmusának hatását vizsgálták neonatális infekcióban. Nem ismert ugyanakkor egyéb, a citokin-kaszkád más tagjait érintő polimorfizmusok patognosztikus és prognosztikus szerepe a koraszülöttek szepszisének kialakulásában. Vizsgálataink célja az volt, hogy egyéb immunmoduláns citokinek, így a TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6 és IL-10 polimorfizmusainak hatását tanulmányozzuk az infekció, illetve a szepszis kialakulására és progressziójára kissúlyú koraszülöttekben. 2. A súlyos szisztémás infekció az akut veseelégtelenség (ARF) kialakulásának egyik fontos kockázati tényezője. A kapcsolat - legalábbis részben a renális hipoperfúzión keresztül valósul meg. Az állatkísérletes és felnőttekben végzett vizsgálatok adatait extrapolálva felvetődik egyes gyulladásos citokinek, így a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 szerepe. Ezek a fehérjék a glomeruláris endotél és mezangiális sejtek károsításával közvetlenül, a vazoaktív mediátorok (endotelin, prosztaglandinok és a nitrogénmonoxid) révén pedig közvetve is befolyásolhatják a renális hemodinamikát. Vizsgálatunk célja az volt, hogy a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 citokinek polimorfizmusainak szerepét vizsgáljuk a kissúlyú koraszülöttek renális diszfunkciójának kialakulásában. 38

3. A nekrotizáló enterocolitis (NEC) a gasztrointesztinális traktus súlyos, életet veszélyeztető megbetegedése, mely VLBW újszülöttek közel 10%-át érinti. A NEC kialakulásának főbb kockázati tényezői a bakteriális kolonozáció, a szepszis, a hipoxia, a hipoperfúzió és intesztinális iszkémia, éretlenség, umbilikális katéterezés és a korai enterális táplálás. Ugyanakkor a NEC pontos patomechanizmusa még ma sem ismert. Korábbi tanulmányok szerint az immunregulációs citokinek (TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10) megváltozott termelése szerepet játszhat a NEC kialakulásában. NEC-es újszülöttek szérumában magasabb TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 és IL-11 szintet mértek. Emellett a gasztrointesztinális rendszer gyulladásos folyamataiban az IL-4 csökkent szintézisét is leírták. NEC-es újszülötteknél azonban a citokin-gének funkcionális polimorfizmusainak esetleges patogenetikai szerepére vonatkozóan nincs irodalmi adat. Vizsgálatunk célja ezért a TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6, és IL- 10 gének polimorfizmusainak a NEC kialakulásában és prognózisában betöltött szerepének vizsgálata volt. 4. Koraszülöttekben megszületéskor a tüdő még nem fejlődött ki teljesen. A tüdő fejlődése során az analikuláris állapotból a szakkuláris állapot kialakulása a 22. gesztációs héten kezdődik, a másodlagos szeptumképződés pedig a 30-32. héten indul meg. A koraszüléshez igen gyakran társul proinflammatórikus állapot [116]. Több vizsgálat is foglalkozott a gyulladás tüdőérést befolyásoló és károsító hatásával. Nem álltak azonban rendelkezésre irodalmi adatok a funkcionális citokin polimorfizmusok BPD kialakulását befolyásoló hatásáról. Vizsgálatunk célkitűzése az volt, hogy tanulmányozzuk a funkcionális citokin génpolimorfizmusok összefüggését a mechanikus lélegeztetés és az oxigénszupplementáció idejével. 39

3. Betegek és módszerek A vizsgálatban részt vevő újszülötteket a Semmelweis Egyetem II. sz. Nőgyógyászati Klinikáján születtek és az ottani, illetve a Semmelweis Egyetem I. sz. Gyermekgyógyászati Klinikájának Perinatális Intenzív Centrumaiban kezelték. Vizsgálatunkba 216 VLBW koraszülöttet (születési súly: 1500 gramm) vontunk be. A kórtörténet mellett a betegek nevét, valamint születés idejét és helyét is feljegyeztük. A szülők tájékozott beleegyezésüket adták a szűrőpapírra szárított vérminták diagnosztikus és tudományos célú felhasználásához. A vérmintákat a születést követő 5. napon vették le anyagcsere-betegség szűrés céljából, majd a Budai Gyermekkórház PKU laboratóriumában tárolták. A betegek adatait kizárólag arra használtuk, hogy a PKU-laborban tárolt szűrőpapírjait azonosítsuk, a mintákat ezután anonim módon kezeltük; valamennyi minta sorszámot kapott, a további analízis és adatfeldolgozás során ezeket a számokat használtuk a betegek neve helyett. Az anyagcsere-szűrés a megszületést követő 5. napon vagy az oralis táplálás megkezdését követően történik, ezért vizsgálataink retrospektív jellegéből adódóan azok az újszülöttek, akik ezen időpont előtt haltak meg, már nem kerültek be az analízisünkbe A vizsgálati protokollt a Semmelweis Egyetem II. sz. Nőgyógyászati Klinikájának, az I. sz. Gyermekklinikájának és a Budai Gyermekkórház intézeti etikai bizottsága jóváhagyta (TUKEB engedély száma: 16/2003). 40

3.1.1. A citokin-polimorfizmusok és a neonatális szepszis kapcsolatának vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 103 igen kissúlyú koraszülött betegségének lefolyását vizsgáltuk az első posztnatális hét alatt. Feljegyeztük a legmagasabb CRP értékeket, a klinikai tüneteket, a disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC), szívelégtelenség, akut veseelégtelenség és májelégtelenség esetleges kialakulását. (A többszervi elégtelenség (MOF) diagnózisát akkor állítottuk fel, ha az említett komplikációk közül kettő, vagy annál több is jelen volt.) Az infekció klinikai jeleit és tüneteit Doellner szerint [117] hat kategóriába soroltuk: (1) pallor és ikterusz; (2) letargia, apnoe, bradikardia, irritábilitás és idegrendszeri görcsök; (3) tachipnoe és diszpnoe; (4) hipotenzió, tachikardia és a mikrocirkuláció zavara; (5) hányás és hasi disztenzó; (6) láz, illetve hőmérséklet instabilitás. Szepszisben (legalább 1 tünet jelenléte legalább 3 kategóriában és emelkedett (>10 mg/l) CRP értékek) 33 újszülött szenvedett (1. csoport). A hemokultúra 26 újszülöttnél bizonyult pozitívnak, 7 esetben Gram-pozitív, 17 esetben Gram-negatív baktérium, 2 esetben pedig Candida tenyészett ki. 7 újszülöttnél, akik korábban antibiotikum kezelést kaptak, a hemokultúra negatívnak bizonyult, azonban a betegek a szeptikus sokk klinikai jeleit mutatták. A súlyos fertőzésben szenvedő csoportba 35 újszülöttet soroltunk, esetükben emelkedett CRP értékek (>10 mg/l) mellett egy vagy két kategória legalább 1 tünete volt jelen (2. csoport). A kontroll csoportba (legfeljebb egy kategória egyetlen tünetének fennállása és normális CRP értékek) 35 újszülött került, esetükben az első 41

posztnatális hét folyamán nem alakult ki fertőzés (3. csoport). A betegek jellegzetességeit foglalja össze a 3. táblázat. Szeptikus újszülöttek 1. csoport Fertőzésban szenvedő újszülöttek 2. csoport Kontroll újszülöttek 3. csoport A betegek száma 33 35 35 Gesztációs kor (átlag [szélső 28,6 [24-37] 29,2 [25-34] 29,7 [24-34] értékek]) Születési súly(átlag [szélső 1143 [760 1098 [640-1500] 1104 [660-1480] értékek]) 1500] C-reaktív protein (mg/l) (átlag 90,1 [16-190]*+ 58,2 [13.2-97]* 3,02 [0-9.8]+ [szélső értékek] Az alábbi kórképekben megbetegedettek száma Disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC), 5*+ 0 0 Akut veseelégtelenség 16* 13* 5 Szívelégtelenség 17 12 6 Májelégtelenség 5 1 1 Többszörös szervi elégtelenség 19* 8 2 3. táblázat. Klinikai jellemzők és perinatális komplikációk előfordulása a vizsgálatban szereplő kissúlyú koraszüköttekben. * p<0,05 összehasonlítva a 3. csoporttal; + p<0,05 összehasonlítva a 2. csoporttal. 42

3.1.2. A citokin-polimorfizmusok és az akut veseelégtelenség vizsgálatában részt kissúlyú koraszülöttek A vizsgálatban részt vevő betegek az alábbi kritériumoknak feletek meg: 1., az első posztnatális hét során akut veseelégtelenség alakult ki náluk; 2., az alábbi, szepszis vagy súlyos infekció kialakulását jelző klinikai tünetek közül legalább két kategória fennált a vizsgált időszakban. A klinikai tüneteket hét kategóriára osztottuk: (1) sápadtság és ikterusz, (2) letargia, aponoe, irritábilitás és görcsök, (3) tachipnoe és diszpnoe, (4) hipotenzió, tachikardia és a mikrocirkuláció zavara; (5) hányás és hasi disztenzó; (6) láz, illetve hőmérséklet instabilitás, (7) 30 mg/l-nél magasabb CRP értékek. Az ARF kritériumait Modi [118] szerint állapítottuk meg: a szérum kreatinin 120 μmol/l és/vagy szérum karbamid 9 mmol/l felett, a diurézis pedig 1,0 ml vizelet/kg alatt. Az oliguria átlagos időtartama 85±27 óra volt. Az ARF-s újszülötteket az oliguria oldódásáig furosemiddel (1 mg/kg) és dopaminnal (0,5-2 μg/kg/perc) kezelték. Az újszülöttek kezelésében teofillint nem alkalmazatak. Egy újszülött szorult peritoneális dialízisre. 120 óra elteltével valamennyi újszülöttnél megszűnt a veseelégtelenség. Az ARF-fel járó, súlyos infekcióban vagy szepszisben szenvedő csoportba 38 újszülöttet soroltuk be, melyek részben azonosak voltak az előbbi vizsgálatban részletezettekkel. Hasonló gesztációs korú és súlyú, szepszisben vagy súlyos infekcióban igen, de ARF-ben nem szenvedő 54 újszülött alkotta a kontroll csoportot. A betegek klinikai jellemzőit és a kockázati tényezők előfordulását mutatja a 4. táblázat. 43