Doktori értekezés. Dr. Reiniger Lilla. I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet

Az aktiváció-indukált citidin deamináz és az aberráns szomatikus hipermutáció szerepe a krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformációjában Doktori értekezés Dr. Reiniger Lilla I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológia Tudományok Doktori Iskolája Témavezető: Dr. Szepesi Ágota, egyetemi adjunktus, PhD Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Demeter Judit, egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Kulka Janina, egyetemi docens, PhD Dr. László Terézia, egyetemi adjunktus, PhD Hivatalos bírálók: Dr. Tarkovács Gábor, egyetemi docens, PhD Dr. Kappelmayer János, egyetemi docens, PhD Budapest, 2007

I. TARTALOMJEGYZÉK I. TARTALOMJEGYZÉK...2 II. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...4 III. IRODALMI HÁTTÉR...7 1. A krónikus lymphocytás leukaemia és agresszív lymphomába történő transzformációja...7 1.1 A krónikus lymphocytás leukaemia...7 1.1.1 A CLL előfordulása és klinikai jellegzetességei...7 1.1.2 A CLL stádiumbeosztása...8 1.1.3 A CLL kezelése...9 1.1.4 A CLL morfológiája...10 1.1.5 A CLL immunfenotípusa...12 1.1.6 A CLL genotípusa...13 1.1.7 A CLL prognózisa, prognosztikai faktorok...13 1.1.8 A CLL eredete...14 1.2 A krónikus lymphocytás leukaemia transzformációja Richter és prolymphocytás transzformáció...15 1.2.1 A Richter transzformáció...16 1.2.2 A prolymphocytás transzformáció...19 2. A genom instabilitás szerepe a lymphomák kifejlődésében...21 2.1 Az aberráns szomatikus hipermutáció...22 2.2 Az aktiváció-indukált citidin deamináz...24 IV. CÉLKITŰZÉSEK...29 V. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK...30 1. Beteganyagok...30 2. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mrns expressziójának vizsgálata kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval...32 2.1 Lézer mikrodisszekció...32 2.2 RNS izolálás...33 2.3 Reverz transzkripció...34 2.4 Kvantitatív RT-PCR és az AID mrns expressziós szintek meghatározása...34 2.5 Statisztikai analízis...38 2

3. Az IgVH, c-myc, Pax-5 és RhoH gének szekvencia vizsgálata...39 3.1 DNS izolálás...39 3.2 Az IgVH, c-myc, Pax-5 és RhoH gének PCR amplifikációja...40 3.3 A PCR termékek detektálása...43 3.4 A PCR termékek tisztítása...43 3.5 A szekvenáló reakció...43 3.6 A szekvenáló reakció termékeinek tisztítása...45 3.7 Kapilláris elektroforézis és szekvencia analízis...45 VI. EREDMÉNYEK...47 1. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mrns expressziójának vizsgálata kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval...47 2. A c-myc, a Pax-5 és a RhoH gének szekvencia vizsgálata...49 3. Az IgVH gének szekvencia vizsgálata...52 VII. MEGBESZÉLÉS...56 VIII. KÖVETKEZTETÉSEK...60 IX. ÖSSZEFOGLALÁS...61 X. SUMMARY...62 XI. IRODALOMJEGYZÉK...63 XII. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE...76 XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...78 3

II. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A : adenin ABC : aktivált B-sejtes (DLBL altípus) AID : aktiváció-indukált citidin deamináz AIDS : szerzett immunhiányos tünetegyüttes AIHA : autoimmun haemolyticus anaemia ALL : akut lymphoblastos leukaemia AS : antisense primer ASHM : aberráns szomatikus hipermutáció BCL-1 : B-cell leukaemia/lymphoma 1 gén BCL-6 : B-cell leukaemia/lymphoma 6 gén bp : bázispár C : citozin CB : centroblast CD : cluster of differentiation, sejtdifferenciálódási antigének cdns : komplementer DNS CDR : complementarity determining region, antigén kötődéséért felelős régió CG : centrum germinativum, csíraközpont CLL : krónikus lymphocytás leukaemia Cµ : az immunglobulin nehézlánc gén konstitutív szakasza c-myc : protoonkogén C T : cycle treshold CSR : class switch rekombináció, izotípusváltás D : diversity, diverzitás régió, az IgH gén kapcsolódási szakasza DEPC : dietil-pirokarbonát DLBL : diffúz nagy B-sejtes lymphoma DNS : dezoxiribonukleinsav dntp : dezoxi-nukleotidtrifoszfát EDTA : etilén-diamin-tetraecetsav FISH : fluoreszcens in-situ hibridizáció FL : follicularis lymphoma 4

FR : G : g : GAPDH : GCB : GTP : Hb : HE : HL : IB : Ig : IgH : IgVH : IL : IMGT: JAK : J H : kb : LDH : LPS : M : MALT: MGG : m.perc : mrns : NA : NaCl : NCAM : NCBI : ND : NF-κB : NHL : NM : p16 INK4A : framework, szerkezeti régió guanin nehézségi gyorsulás glyceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz centrum germinatívum B-sejtes (DLBL altípus) guanozin-trifoszfát haemoglobin hematoxilin-eozin Hodgkin-lymphoma immunoblast immunglobulin immunglobulin nehézlánc gén immunglobulin nehézlánc gén variábilis regió interleukin International immunogenetics Information System Janus-kináz joining régió, az IgH gén kapcsolódási szakasza kilobázis laktát dehidrogenáz lipopoliszacharid mutált (IgVH gén) mucosa asszociált lymphoid szövet May-Grünwald-Giemsa másodperc messenger (hírvivő)-rns nem amplifikált nátrium-klorid nerve cell adhesion molecule National Center for Biotechnology Information nem determinált nukleáris faktor-κb non-hodgkin lymphoma nem mutált (IgVH gén) tumorszuppresszor gén 5

p53 : tumorszuppresszor gén Pax5 : protoonkogén PBS : phosphate-buffered saline PCR : polimeráz láncreakció Pim1 : protoonkogén Plt : platelet, thrombocyta PLT : prolymphocytás transzformáció PV : perifériás vér Q : quencher qrt-pcr : kvantitatív valós-idejű PCR R : reporter Ras : rat-sarcoma fehérje szupercsalád RGYW : szekvcencia-motívum (R=A/G; Y=C/T; W=A/T) RhoH : protoonkogén RNS : ribonukleinsav rpm : percenkénti fordulatszám RT : reverz transzkripció RT : Richter transzformáció S : sense primer SDS : nátrium-dodecil-szulfát SHM : szomatikus hipermutáció SSC : side scatter STAT-6 : signal transducer and activator of transcription 6 T : timin TAE : Tris-acetát-EDTA tart. : tartomány TE : Tris-EDTA T reg : szabályozó T-sejt TSR : template suppresion reagent U : unit, nemzetközi egység V H : variábilis régió, az IgH gén kapcsolódási szakasza WHO : World Health Organization - Egészségügyi Világszervezet ZAP-70 : zéta-asszociált protein-70 6

III. IRODALMI HÁTTÉR 1. A krónikus lymphocytás leukaemia és agresszív lymphomába történő transzformációja 1.1 A krónikus lymphocytás leukaemia A krónikus lymphocytás leukaemia (CLL) érett kis B-lymphocyták klonális expanziója daganata, amely a WHO (World Health Organization) osztályozás alapján az érett B-sejtes non-hodgkin lymphomák (NHL) csoportjába tartozik. A CLL mérsékelt malignitású, legtöbbször leukaemiás formában zajló folyamat, mely progresszíven infiltrálja a csontvelőt és a lymphoid szerveket. Korábban a CLL definíció szerint magába foglalta a 2-3 %-ban T-sejtes folyamatokat is a B-sejtesek mellett, de ma már a T-sejtes betegség önálló kategóriát T-sejtes prolymphocytás leukaemia képez 1. 1.1.1 A CLL előfordulása és klinikai jellegzetességei A CLL a leggyakoribb leukaemia felnőttkorban a nyugati országokban és előfordulása az életkorral nő, az esetek 75 %-át 60 év feletti betegekben diagnosztizálják 2, 3. Incidenciája 3-5/100 000 lakos, Magyarországon kb. 400 új beteggel lehet számolni évente. A betegség mintegy kétszer gyakoribb férfiakban 4. A betegség kezdete rendszerint lappangó, 25 %-ban tünetmentes, így a CLL-t gyakran más okból történő vérvétel során észlelt lymphocytosis vagy tünetmentes 4, lymphadenopátia kivizsgálása során fedezik fel 5. A tünetekkel rendelkező betegeknek általában nem specifikus panaszaik vannak, mint például láz, fáradtság, étvágytalanság, súlyvesztés és éjszakai izzadás. A megnagyobbodott lép és hasi nyirokcsomók miatt hasi teltségérzés és a megnagyobbodott mediastinális nyirokcsomók miatt terhelési nehézlégzés is jelentkezhet bevezető tünetként. A korai leletek közé tartozik a generalizált lymphadenopátia, amely gyakran először a nyaki és supraclavicularis régiókat érinti, továbbá a minimális vagy mérsékelt máj- és lépmegnagyobbodás is 5. A betegség előrehaladottabb stádiumában az anaemia miatt sápadtság és gyengeség, a hypogammaglobulinaemia és a granulocytopenia következtében bakteriális-, vírus- 7

és gombafertőzésekre való fokozott hajlam is jellemzővé válik. A fertőzés a CLL leggyakoribb szövődménye és haláloka egyben 6. A betegséget autoimmun jelenségek leggyakrabban autoimmun haemolitikus anaemia (AIHA) és autoimmun thrombocytopenia kísérhetik, melyek oka nem teljesen tisztázott 7. A betegek kb. 5-10 %-ában a CLL magasabb malignitású lymphomába transzformálódik ez a fejezet második részében bővebb kifejtésre kerül. Előrehaladottabb stádiumban a tumor a parenchymás szerveket is infiltrálhatja jelentős mértékű organomegáliát okozva. A CLL-ben szenvedő betegekben nagyobb valószínűséggel alakul ki másodlagos daganat, leggyakrabban bőr-, tüdő-, vastagbél- vagy méhnyakrák 4. A laboratóriumi eltérések közül a CLL vezető tünete a perifériás vérben folyamatosan fennálló abszolút lymphocytosis (5-500 G/l) és a csontvelő megemelkedett lymphocyta aránya (> 30 %). A CLL-ben nagyon gyakran észlelhetünk szérum fehérje eltéréseket. Az esetek kb. 50 %-ában antitesthiányos szindróma alakul ki a B-sejt defektus következtében. Monoklonális immunglobulinok is megjelenhetnek, leggyakoribb az IgM felszaporodása 4, 5. Differenciáldiagnosztikai szempontból a CLL-t minden perifériás lymphocytaszaporulattal és nyirokcsomó megnagyobbodással járó betegségtől el kell különíteni, így leggyakrabban a reaktív lymphocytosistól, köpenysejtes lymphomától, hajas sejtes leukaemiától, lymphoplasmocytás lymphomától és a T-sejtes NHL-től 4. 8, 1.1.2 A CLL stádiumbeosztása A klinikai stádiumbeosztás fontos a prognózis és a kezelés megítélése szempontjából. A két leggyakrabban használt stádiumbeosztás a Rai, amely elsősorban a haematológiai változásokon alapul, valamint a Binet, amely inkább a betegség kiterjedését veszi figyelembe (1. táblázat) 9. 8

1. táblázat. A CLL klinikai stádiumbeosztása Rai osztályozás és stádium Leírás 0. stádium a vérben >10.000/µl abszolút lymphocytosis és 30 % lymphocyta a csontvelőben I. stádium 0. stádium és megnagyobbodott nyirokcsomók II. stádium I. stádium és máj- és/vagy lépmegnagyobbodás III. stádium II. stádium és anaemia (Hb <110 g/l) IV. stádium III. stádium és thrombocytopenia (Plt <100.000/µl) Binet Stádium A a vérben >10.000/µl abszolút lymphocytosis és 30 % lymphocyta a csontvelőben Hb 100 g/l, Plt >100.000/µl, 2 érintett regió # Stádium B Stádium A-hoz hasonló, de 3-5 érintett régió # Stádium C Stádium A- és B-hez hasonló, de Hb <100 g/l vagy Plt <100.000/µl # : figyelembe vett régiók: cervicalis, axillaris, inguinalis, hepatikus, splenikus, lymphatikus Rövidítések: Hb, haemoglobin; Plt, platelet (thrombocyta) 1.1.3 A CLL kezelése A betegek egy része (Binet szerinti A stádiumú és a tünetmentes B stádiumú betegek) nem igényel kezelést, csak rendszeres megfigyelést. A kezelésre szoruló betegek (a tünetes Binet szerinti B és minden C stádiumú beteg) kemo- vagy polikemoterápiában részesülnek, amit olykor szteroiddal kombinálnak. Alkilálószerek, purin analógok és újabban monoklonális antitestek képezik a kemoterápia alapját 10. Szteroid kezelés indikációját képezi továbbá az immunhaemolytikus anaemia és thrombocytopenia jelentkezése. Ezekben az esetekben, ha a szteroid kezelés hatástalan, splenectomia segíthet. Radioterápia alkalmazható lokálisan alacsony dózisban a megnagyobbodott nyirokcsomók, máj illetve lép okozta tünetek enyhítésére. Amennyiben a CLL kezelésében a hagyományos kemoterápia nem hoz eredményt, autológ illetve fiatalabb betegeknél allogén őssejt transzplantáció is felmerül 5. A betegek többsége a fertőzések, az anaemia és a thrombocytopenia miatt szupportív terápiát igényel 6. 9

1.1.4 A CLL morfológiája A perifériás vérkenetben nagyszámú kis lymphocyta látható keskeny citoplazmával és kerek maggal. A sejtek kromatinja kompakt és rögös, nukleolusz nem azonosítható. A kenetekben gyakran láthatók Gumprecht rögök, amik a mechanikailag károsodott lymphocyták maradványai (1. ábra). A prolymphocyták száma rendszerint 2 %-nál kevesebb. Atípusos CLL esetében előfordul, hogy a keringő tumorsejtek nagyobbak, a sejtmagjuk hasadt vagy behúzódásokkal rendelkezik és a citoplazma bővebb 4. A B 1. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia (CLL), perifériás vérkenet (May Grünwald Giemsa, MGG). A: abszolút lymphocytosis és Gumprecht-rögök (mechanikusan károsodott lymphocyták) (400x). B: a CLL sejtek citoplazmája keskeny; magja kompakt, kerek és heterokromatinizált 4 (2000x). A csontvelő aspirációs technikával nyert keneteiben vagy a csontbiopsziás minták lenyomati készítményeiben a lymphocyták morfológiája megfelel a perifériás vérkenetben látottaknak (2. ábra). A CLL-es sejtek mieloperoxidáz negatívak. A csontvelői infiltráció mintázata a betegség korai szakában elsősorban noduláris vagy interstitialis. Előrehaladott betegségnél az infiltráció diffúz, a tumoros sejtproliferáció fokozatosan kiszorítja a velőűrökből a normális haemopoesist és a zsírsejteket 4. 10

2. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia (CLL), csontvelőkenet (MGG, 1000x). A csontvelő aspirációs mintában a CLL sejtek vannak túlnyomó többségben 4. A nyirokcsomó szövettani képére jellemző, hogy follicularis alapszerkezete eltűnik és állományát diffúzan infiltrálják a kis CLL lymphocyták. A CLL proliferáló sejtjei ún. pseudofolliculusokat képeznek, amelyek lazább magszerkezetű sejtekből álló világosabb festődésű területek (3. ábra) 4. 3. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia (CLL) nyirokcsomó hisztológiája (hematoxilin-eozin, HE, 40x). A nyirokcsomó állományát diffúzan infiltrálják a CLL sejtek, a normális follicularis szerkezet felbomlik 4. 11

1.1.5 A CLL immunfenotípusa A daganatos sejtek CD19, CD20, CD5, és CD23 sejtfelszíni B-sejt markereket hordoznak. Az esetek többségében sejtfelszíni monoklonális Ig könnyű lánc (gyakrabban kappa) expresszió is kimutatható. A CLL-es sejtek zéta-asszociált protein-70-t (ZAP-70) is expresszálnak különböző mértékben. A CLL-re jellegzetes immunfenotípus meghatározása áramláscitometriai mérésekkel (4. ábra) és immunhisztokémiai módszerekkel történik 4, 5. A B C D 4. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia, áramláscitometria, perifériás vér. A : a CD45/SSC diagramon a reaktív lymphocyták és a leukaemiás sejtek (piros) elkülönülnek a granulocytáktól és monocytáktól (fekete). A további vizsgálatok (B-D) a piros színnel ábrázolt sejtpopuláción történtek. B : A leukaemiás sejtek lambda-könnyűlánc monoklonális reakciót mutatnak, az expresszió intenzitása alacsony (jobb alsó kvadráns). C : A leukaemiás sejtek CD5 és CD23 pozitívak (jobb felső kvadráns). D : A leukaemiás sejtek CD5 és CD19 pozitívak (jobb felső kvadráns) 4. 12

1.1.6 A CLL genotípusa A CLL genetikai szerveződését tekintve heterogén betegségcsoport 4. Fluoreszcens in-situ hibridizációs (FISH) vizsgálattal a CLL-es esetek kb. 80 %-ában mutatható ki valamilyen genetikai eltérés 11. A CLL-es betegekben a leggyakoribb kromoszóma eltérések közé tartozik a 12-es triszómia, és a 13q14, 17p és 11q22-23 deléciók 12, 13. A CLL genetikai jellegzetességei közé tartozik továbbá a tumorsejtek által expresszált immunglobulin nehéz lánc (IgH) gén variábilis régiójának (V H ) (egyben IgVH gén) mutációs státusza, mely lehet mutálatlan, vagy szomatikus mutációkat hordozhat 14, 15. 1.1.7 A CLL prognózisa, prognosztikai faktorok A betegség prognózisának megítélésére a klinikai stádiumbeosztások és a citogenetikai eltérések használhatók. A CLL indolens lymphoma/leukaemia, a betegek átlagos túlélése 10 év körül van. A diagnózis időpontjában Rai szerinti 0-II. stádiumú betegek kezelés nélkül 5-25 évig is élhetnek. A III-IV. stádiumú betegek a diagnózistól számított 3-4 éven belül nagy valószínűséggel meghalnak. A csontvelő-elégtelenségbe torkolló kórkép is rendszerint rövid túléléssel társul. Jelen terápiás lehetőségeink közül végleges gyógyulást csak az egyébként ritkán alkalmazható és magas halálozási aránnyal járó allogén csontvelő transzplantáció eredményezhet 9. A citogenetikai eltérések kimutatása is segítséget nyújt a betegség lefolyásának megítélésében. Kedvező a CLL klinikai viselkedése azokban az esetekben, ahol az IgH gén variábilis régiójában szomatikus mutációk halmozódtak fel. Amennyiben az IgVH gén mutálatlan, a betegség rossz prognózisú csoportba sorolandó 14-16. Az IgVH gén mutációs státuszának vizsgálata szekvenálással történik, ami nem terjedt el a rutin diagnosztikában. Az IgVH mutációs státusszal szoros összefüggést mutató és könnyebben hozzáférhető marker, a ZAP-70 expresszió vizsgálata a rutin diagnosztika részét képezi. Ha a ZAP-70 expresszió a sejtek kevesebb mint 20 %-ában észlelhető áramlás cytometriai vizsgálattal, akkor a CLL jó prognózisúnak számít, ha pedig az aktivitás a sejtek több mint 20 %-ában detektálható, a betegség klinikai lefolyása kedvezőtlen 17-19. A kromoszómaeltérést nem hordozó és a 13q14 kromoszómarégió delécióját hordozó betegeknek általában jobb prognózisú a betegségük és a túlélési idejük hosszabb 13. A 17p deléciót hordozó betegek a kezelésre kevésbé reagálnak összehasonlítva a 11q deléciót vagy a 12-es triszómiát hordozó betegekkel 13. 13

A 11q22-23 kromoszómarégió deléciójával járó esetek prognózisa rossz 2, 12, 13. A 12-es kromoszóma triszómiája és a 6q21 kromoszómarégió deléciója is kedvezőtlen kimenetellel hozható összefüggésbe 4. A prognosztikus citogenetikai eltérések kimutatása leggyakrabban FISH vizsgálattal történik 4. 1.1.8 A CLL sejteredete A CLL eredete a mai napig sem teljesen ismert. A sejteredet pontos tisztázása fontos lenne a CLL-es betegekben kifejlődő immunregulációs zavarok pontos megértéséhez és a felborult immunműködés helyreállítási lehetőségeinek tisztázásához 20. A daganatos lymphocyták felszaporodása valószínűleg a csontvelőben kezdődik, és innen terjed rá a nyirokcsomókra és a lépre 9. A CLL-nek két altípusát különböztetjük meg az IgVH gén mutációs státusza alapján: mutált (M) és nem mutált (NM) CLL-es esetek. Az M és NM CLL-es sejtek eredetének azonos vagy különböző volta is még kutatás tárgyát képezi 14, 15. A mutált CLL-es esetekben az IgVH gén a normális szomatikus hipermutációs (SHM) folyamattal egyező jellegzetességeket mutat 21, 22, így feltehetően ezek a sejtek bejutottak a centrum germinatívumba (CG) és ott antigén stimulus érte őket. A nem mutált eseteknél ugyanakkor nem egyértelmű, hogy a sejtek esetleg éretlen B-sejtekből származnának. Érdekes, hogy az NM esetek IgVH génjei közül gyakori az IgVH 1-69 overexpressziója 15, 21-23, ami úgy függhet össze a betegséggel, hogy pl. egy speciális antigén vagy antigén-szerű elem is részt vesz ezen alcsoport genezisében. A sejteredetek különbözőségére utal továbbá az is, hogy az NM esetek gyakran expresszálnak erősen polireaktív antitesteket, míg az M esetekben ez ritka 24. Az M és NM CLL sejteredetének azonosságára utal az a tény, miszerint az IgVH gén mutációs státuszától függetlenül minden CLL-es sejt azonos sejtfelszíni fenotípust mutat, ami az antigén stimuluson átesett, aktivált B-sejtek fenotípusához hasonlít 25. Ugyanezt támasztják alá a génexpressziós vizsgálatok eredményei, melyek szerint az M és NM CLL-es sejtek nagymértékben hasonlítanak egymásra 26 és a memória B-sejtekre is 19. Ezek alapján a CLL sejtek a memória B-sejtekből is származhatnak. Ez a feltételezés a CLL sejtek posztgerminális eredetére utalna, de az NM CLL sejtek éppen azért, mert az IgVH génjük nem mutált nem valószínű, hogy bejutottak volna a CG-be 19. Más elképzelés szerint a CLL sejtek prekurzorai a marginális zóna B-sejtjeiből is származhatnak, ugyanis a sejtek funkcionális és fenotípusos tulajdonságai nagyon 14

hasonlítanak a CLL sejtekéhez (pl.: polireaktivitás) 23. Ez utóbbi elképzelés alapján az M CLL sejtek a szomatikus mutációkat T-sejt független antigén válasz során halmozzák fel a CG-n kívül, a marginális zónában 27. Egy újabb elképzelés szerint a CLL immunszabályozó B-sejt eredetű tumor 28. Ezek a sejtek hasonlítanak a szabályozó T-sejtekre (T reg ), amiket eddig még csak egerekben sikerült kimutatni, és hatásukat tekintve az IL-10 termelésén keresztül a T-helper 1 választ gátolják 29. Ezt a hipotézist támogatja a CD25 és CD26 expressziója a CLL és a T reg -sejtek felszínén. Az elképzelés talán segít fetárni azokat az ismeretlen mechanizmusokat, amik a CLL-ben jellemző immunszabályozási zavarokat okozzák. Bár a CLL sejteredetére vonatkozó tanulmányok eredményei sokrétűek, a legújabb kutatások alapján összesítve elmondható, hogy a CLL-sejtek valószínűleg antigén stimuluson átesett érett B-sejtekből alakulnak ki. 1.2 A krónikus lymphocytás leukaemia transzformációja Richter és prolymphocytás transzformáció A CLL egyik szövődménye, amikor a betegség magas malignitású non-hodgkin lymphomába alakul át. Szövettanilag leggyakrabban diffúz nagy B-sejtes lymphoma (DLBL) (Richter szindróma, Richter transzformáció, RT) és prolymphocytás leukaemia (prolymphocytás transzformáció, PLT) 1, ritkábban Hodgkin-lymphoma és akut lymphoblastos leukaemia 30, 31 is előfordul a transzformált CLL-ek között. Ezek az agressziv lymphomák leggyakrabban nyirokcsomóban fejlődnek ki és onnan disszeminálnak más szervekbe. Ritkán csontvelőben is kialakulhatnak, vagy esetleg extranodális szövetben 32. A transzformált esetekre a szövettani típustól függetlenül jellemző az agresszív lefolyás és a rossz prognózis 8. A transzformáció okát és a transzformációban szerepet játszó molekuláris mechanizmusokat jelenleg kevéssé ismerjük. A továbbiakban a munkám szempontjából fontosabb RT-ről és PLT-ről értekezem részletesebben. 15

1.2.1 A Richter transzformáció A Richter szindrómát először 1928-ban Maurice N. Richter írta le. A tanulmányában jellemzett CLL-ben szenvedő férfibetegnél gyorsan zajló, fatális kimenetelű generalizált lymphadenopathia és masszív organomegália volt megfigyelhető 33. A szövettani vizsgálat a CLL-re jellemző kis sejtek mellett nagy, polimorf endotheloid tumorsejtek jelenlétét igazolta, melyek széles, bazofil citoplazmával, jól körülhatárolt maggal és több prominens nukleolusszal rendelkeztek 33. Ez a szövettani kép a B-sejtes NHL-ek jelenlegi WHO osztályozása szerint a DLBL centroblasztos variánsának felel meg 1. A CLL DLBL-be történő átalakulása a betegek mintegy 5-10 %-ában következik be 8. Az RT-t klinikailag gyors állapotromlás jellemzi, az általános klinikai tünetek közül magas láz, súlyvesztés és/vagy éjszakai izzadás fordul elő leggyakrabban. Jellemző, hogy a nyirokcsomók hirtelen nagymértékben és disszemináltan megnagyobbodnak 34, 35. A betegek további klinikai tüneteit okozhatja a lép- ill. májmegnagyobbodás, és a transzformáció által érintett egyéb régiók elváltozásai. Az RT extranodális megjelenését leírták már mellhártyában 36, bőrben 37, 38, gyomorbélrendszerben 39, központi idegrendszerben 40-42, tüdőben 43, szemben 44, herében 45, vesében 32 és orrüregben 46. Nyirokcsomó érintettség esetén a szövettani vizsgálat során homogén, kis lymphocytás CLL-es területeket változó mértékben infiltráló centroblasztos (CB) vagy immunoblasztos (IB) sejtszaporulat látható 1, 4. A CLL-es kissejtes komponens kiszorulásával a folyamat DLBL képét mutatja. A transzformált DLBL sejtek nagyok, kerek vagy enyhén szabálytalan alakúak, valamint mérsékelten széles citoplazmával, laza magszerkezettel, a magban nagy, centrálisan elhelyezkedő erősen bazofil magvacskával (IB), vagy több, a maghártya mentén elhelyezkedő nukleolusszal (CB) rendelkeznek (5. ábra). 16

A B 5. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia (CLL), diffúz nagy B-sejtes (Richter) transzformáció. A : A csontvelő aspirációs mintában nagy, centroblasztokra és immunoblasztokra emlékeztető sejtek láthatók (csontvelőkenet, MGG, 1000x) B : a kis CLL-es lymphocyták keverednek a diffúz nagy B-sejtes lymphoma sejtjeivel (nyirokcsomó, HE, 200x) 4. Az RT immunfenotípusára vonatkozó szegényes irodalmi adatok arra utalnak, hogy bizonyos esetekben az RT megőrzi a megelőző CLL immunfenotípusát (IgM +, IgD +/-, CD5 +, CD19 +, CD23 + ) 47, 48, más esetekben viszont az RT immunhisztokémiai megjelenése eltér a CLL-től (CD5 -, IgD -, Ki-67 + ) 49-51. A DLBL nem mindig az eredeti CLL-es tumorklónból alakul ki, de novo is kifejlődhet, ilyenkor kompozit lymphomáról beszélünk. Különféle tanulmányok alapján feltételezhető, hogy az RT az esetek 50-60 %-ában valódi klonális evolúció során fejlődik ki a megelőző CLL-ből 36, 52, 53 és 40-50 % -ban alakul ki de novo. A CLL és az agresszív lymphoma klonális kapcsolatának igazolása az IgH gén harmadik komplementaritást determináló régiójának (CDR3) polimeráz láncreakciós (PCR) vizsgálatával (esetenként a szekvenciák analízisével) történik. A CDR3 régió tartalmazza a B-sejtekben átrendeződő variábilis (V H ), diverzitás (D) és joining (J H ) génszakaszok egyedi, sejtre jellemző kombinációját 54, 55, mely végigkíséri az adott B-sejt fejlődésének folyamatát 56. A CDR3 régió PCR-amplifikációja a V H és J H génekre specifikus primerpárokkal érhető el 57. A megegyező hosszúságú termékek a lymphomák közös klonális eredetére utalnak, míg a különböző hosszúságúak kizárják a klonális kapcsolatot 49, 58. A PCR termékek szekvencia analízisével akkor igazolt a CLL és RT közötti klonális kapcsolat, ha a szekvenciák bázissorrendje azonos. A CLL-es esetek 50-60%-ában a B-sejtek az IgVH régióban szomatikus mutációkat hordoznak, 40-50%-uk nem tartalmaz mutációkat 59. Kutatócsoportunk erre vonatkozó tanulmánya szerint valódi klonális evolúció csak a szomatikus mutációkat nem hordozó CLL-es eseteknél valósul meg 60. 17

A klonális evolúciót újabb kromoszóma vagy genetikai abnormalitások, vagy vírusinfekciók válthatják ki 61. RT-ben többféle kromoszóma és genetikai eltérést leírtak már, amelyek mind szerepet játszhatnak a lymphoma progresszióban (2. táblázat). A heterogén genetikai eltérések jelenléte arra utal, hogy a CLL sejtek a sejtciklus szabályozásának zavara miatt újabb és újabb genetikai hibákat halmoznak fel, általános genetikai instabilitás alakul ki bennük, és a szelektív növekedési előnyhöz jutó sejtek végül kialakítják az RT-re jellemző agresszív lymphoma képét 62-64. 2. táblázat. RT-ben leírt genetikai abnormitások és összefüggésük a transzformációval genetikai elváltozás 12-es triszómia 11q deléció t(11;14) transzlokáció mikroszatellita instabilitás P53 mutáció p16ink4a mutáció P21 mutáció P27 expresszió elvesztése Rb deléció c-myc kópiaszám emelkedés a-myb expresszió csökkenés összefüggés a transzformációval bizonyos tanulmányok szerint néhány CLL-es betegben ez lehet az első eltérés a transzformáció során 65, 66, de valószínűleg nincs direkt szerepe a transzformációban gyakran a 23-as régiót érinti, ami olyan génekben gazdag, amelyek kiesése transzformációt okozhat (pl: NCAM) 67 az IgH promoter szabályozása alá kerül a BCL-1 gén, így a ciklin D1 overexpresszálódik és a sejtciklus felgyorsul 68 jelenléte bizonyított RT-ben, oka valószínűleg a mismatch repair rendszer károsodása 69 új malignus klón kialakulásával hozható összefüggésbe, 68, 70 a transzformációval kevésbé ezen tumor szupresszor géneknek a kiesése, illetve funkciójuk megváltozása a sejtciklus szabályozásban a DNS repair mechanizmusokban és/vagy a sejtdifferenciálódásban okoz kárt, elősegítve ezzel további genetikai eltérések felhalmozódását a sejtekben és a transzformációt 71-73 Rövidítések: BCL-1, B-cell leukaemia/lymphoma 1 gén; CLL, krónikus lymphocytás leukaemia; IgH, immunglobulin nehézlánc gén; NCAM, nerve cell adhesion molecule; p53, p16ink4a, p21, p27, tumor szupresszor gének; Rb, retinoblastoma gén; RT, Richter transzformáció 18

A citogenetikai vizsgálatok eredményei megerősítették azt a feltételezést, miszerint a CLL-ben detektálható komplex kariotípus-eltérések nagyobb valószínűséggel vezetnek RT-hez, mint a kromoszomális eltérések hiánya, vagy a 12. triszómia 66, önmagában 74. Összességében elmondható, hogy az RT-ben leírt genetikai elváltozások egyike sem tehető elsődlegesen felelőssé a CLL transzformációjáért 8. Az RT-k egy kis részében Epstein-Barr vírus fertőzést is leírtak 53, 75. Az Epstein-Barr vírus többféle módon okozhat lymphoma progressziót, de szerepe a transzformációban még nem bizonyított 8. Az RT kezelése egyelőre nem megoldott, jelenleg az egyébként NHL-ben és akut lymphoblastos leukaemiában használt cytotoxikus szereket alkalmazzák 35, amire a betegeknek csak kb. 50 %-a reagál 4. Az RT prognózisa kifejezetten rossz, a betegek átlagos túlélése 5 hónap 4. 1.2.2 A prolymphocytás transzformáció A CLL lefolyása során kb. 15-30 %-ban következik be PLT 4. A PLT klinikai tünetei hasonlóak az RT tüneteihez, a beteg állapotának romlása jelzi a transzformációt. A fáradtság, súlyvesztés és éjszakai izzadás mellett jellemző a lépmegnagyobbodás és a magas fehérvérsejtszám. Nyirokcsomó megnagyobbodás ritkán fordul elő 76. A PLT-nél a perifériás vérben, a csontvelőben vagy a nyirokszövetekben a prolymphocyták aránya a tumoros sejtpopuláción belül meghaladja a 30 %-ot 4, 76. A PLT sejtek a CLL sejteknél nagyobbak, citoplazmájuk bővebb, kerek maggal és prominens nukleolusszal rendelkeznek 4 (6. ábra). 19

A B 6. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia, prolymphocytás transzformáció. A: a perifériás vérkenetben felszaporodtak a nagyobb, bővebb citoplazmával és prominens nukleolusszal rendelkező prolymphocyták a leukaemiás sejtek mellett. A kenetben Gumprecht-rögök is megfigyelhetők (perifériás vérkenet, MGG, 200x). B: a csontbiopsziás mintában az infiltráló prolymphocyták világos, laza magkromatinnal és prominens nukleoluszokkal rendelkeznek (csontbiopszia HE, 200x) 4. A PLT-s betegek agresszívebb terápiát igényelnek; ezeknél az eseteknél is mint az RT-nél NHL-ben és akut lymphoblastos leukaemiában alkalmazott cytotoxikus szerekkel történik a kezelés. Ritkán őssejt transzplantáció is szóba kerül 35. A PLT jelentősen csökkenti a betegek túlélését. 20

2. A genom instabilitás szerepe a lymphomák kifejlődésében A genom (vagy genetikai) instabilitás központi szereppel bír a daganatos betegségek kialakulásában és lefolyásuk során a tumorok majdnem mindegyike genetikailag instabil. A tumorok progressziójának motorja és heterogenitásuk oka is a genom instabilitás. Az instabilitás jelzi, hogy a genom épségét fenntartó mechanizmusok a sejtben meghibásodtak. A genom instabilitás a kromoszómák és a nukleotidok szintjén nyilvánulhat meg a humán daganatokban 77. A nukleotidok szintjén kialakuló genetikai instabilitás egy vagy néhány bázispárt érint a DNS-ben. A humán daganatokban ez a típus ritkán fordul elő, de súlyos következményekkel járhat 77, 78. Főbb formái a következők: A hibajavító (mismatch-repair) gének és a tumorszupresszor gének működésének zavarával vagy inaktivációjával járó változás (pontmutáció, deléció vagy hipermetiláció) gyakran eredményez aberrációkat a genomban. DNS szekvenciát érintő változás továbbá a tandem ismétlődő DNS-szakaszok (mikroszatelliták) kópiaszámának megváltozása, amit mikroszatellita instabilitásnak nevezünk. Az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM) a genom instabilitás egy újabban leírt formája 79, melyről bővebben a 2.1 fejezetben írok. A kromoszómák szintjén kialakuló genom instabilitás a kromoszóma-szegregáció zavarain keresztül vezet szám- vagy szerkezetbeli kromoszóma eltérésekhez 77. Ide tartoznak: A kromoszómaszám eltérések kromoszóma-nyerés vagy -vesztés (aneuploiditás) nagyon gyakran fordulnak elő humán daganatokban. A kromoszóma-transzlokációk olyan kromoszómahibák, amelyeknél azonos vagy különböző kromoszómán levő, egymástól távol eső DNS-szakaszok kapcsolódnak össze. Ez a folyamat fúziós gének kialakulásával járhat. A génamplifikáció egy meghatározott génszakasz több kópiában való megjelenése, amely 0,5-10 megabázis hosszúságú járulékos örökítőanyagot jelent. 21

2.1 Az aberráns szomatikus hipermutáció A nukleotidok szintjén kialakuló genom instabilitás legújabban leírt formája az aberráns szomatikus hipermutáció. Az ASHM-et a normál B-sejt érés során lezajló szomatikus hipermutáció hibás működésének tartják 79. Az SHM a nyirokcsomók csíraközpontjaiban (centrum germinatívum, CG) zajló alapvető immunológiai folyamat, melynek során a B-lymphocyták átrendeződött immunglobulin nehézláncgénjeinek variábilis régióiban szomatikus mutációk halmozódnak fel (7. ábra). Ez a folyamat része a B-sejtek affinitás-érésének, melynek eredményeképpen az antigénnel egyre magasabb aviditással reagáló antitestek keletkeznek 80. Az SHM a fiziológiás B-sejt fejlődés során a BCL-6 gén 5 nem-kódoló régióját is érinti 81, 82, de ennek jelentősége még nem ismert. 5' V H D C µ J H 3' 5' Leader FR1 CDR1 FR2 FR3 FR4 CDR2 CDR3 3' SHM 5' 3' 5' 3' 5' 3' CDR1 CDR2 CDR3 7. ábra. Az immunglobulin nehézlánc (IgH) génátrendeződés és a szomatikus hipermutáció. A B-sejtek érésének korai stádiumában, a csontvelőben történik az IgH génátrendeződés, melynek során a variábilis, diverzitás és joining géncsaládok egy-egy tagjának összekapcsolódása zajlik. A B-sejt érés későbbi szakaszában antigén inger hatására aktiválódik a megfelelő specificitású B-sejt, melynek átrendeződött IgH génjei a nyirokcsomó csíraközpontjában szomatikus mutációk sorozatán mennek át. A folyamat eredménye intraklonális divergencia, vagyis heterogén B-sejt populáció kialakulása. A szomatikus mutációk elsősorban az antigén kötődéséért felelős régiókat (CDR) érintik az antigén-szelektált B-sejtekben. Rövidítések: C µ, konstans régió; CDR, komplementaritást meghatározó szakasz; D, diverzitás ( diversity ) géncsalád; FR, framework régió; J H, joining géncsalád; SHM, szomatikus hipermutáció; V H, variábilis géncsalád 22

Az ASHM során a hipermutációs aktivitás átterjed más, a fiziológiás célgéneken kívüli lókuszokra, például protoonkogénekre is. A vizsgált gének közül az ASHM leggyakrabban a c-myc, a PAX-5, a RhoH és a Pim1 protoonkogéneket érinti 79. Az érintett gének jellemzőit a 3. táblázatban foglaltam össze. 3. táblázat. Az ASHM által érintett gének jellegzetességei. gén Fehérje funkció c-myc PAX-5 RhoH transzkripciós faktor B-sejt specifikus transzkripciós faktor kis GTP-kötő fehérje (Ras szupercsalád) sejtnövekedés, proliferáció, differenciáció és apoptózis szabályozás B-sejt irányba való elköteleződés során szabályozás extracelluláris szignálok továbbítása összefüggés betegséggel Burkittlymphoma és más haematopoetikus daganatok kis lymphocytás lymphoma, DLBL non-hodgkin lymphomák ASHM által érintett régió P1/P2 major promotertől, illetve a P3 minor promotertől downstream található 1,5 illetve ~0,9 kb hosszúságú szakaszok 1B exon környezetében mintegy 1 kb hosszú szakasz 1B exon 3 irányban található nem kódoló régió a transzkripciót iniciáló bizonyos fehérjék régió 3 végétől 2 kb-ra Pim1 protein kináz aktivitásának DLBL található kb. 1,2 kb hosszú szabályozása szakasz Rövidítések: ASHM, aberráns szomatikus hipermutáció; DLBL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; kb, kilobázis Az ASHM által érintett régiókban detektált mutációk mintázata megegyezik az IgVH és a BCL-6 génekre jellemző SHM mintázatával 83, 84 : a mutációk nagy része egyszerű nukleotid szubsztitúció, ritka az inszerció vagy deléció előfordulása, a transzkripciót iniciáló régiótól kb. 2 kb-ig terjedő távolságban lokalizálódnak, gyakran érintik az RGYW (R=A/G; Y=C/T; W=A/T) szekvcencia-motívumot, gyakrabban érintik a G+C nukleotid párokat, mint az A+T párokat, a tranzíciók aránya valamivel gyakoribb a transzverzióknál. 23

Az ASHM a felsorolt géneken kívül valószínűleg még más lókuszokat is érint, melynek következtében ún. genom szintű instabilitást hoz létre 79. Az ASHM többféle mechanizmus útján vezethet malignus transzformáció kialakulásához, ilyen pl. a fehérjeszerkezet megváltoztatása, gének inaktiválása és génexpresszió szabályozása. A mutációk lokalizációja az egyes génekben átfedést mutathat a különböző transzlokációkra jellemző fő kromoszóma-töréspontokkal. Az ASHM-et eddig különféle NHL-ekben írták le: a DLBL-ek mintegy 50%-ában 79 primer központi idegrendszeri DLBL-ben 85 AIDS-asszociált NHL-ekben 86 hepatitis-c vírus fertőzéssel társult NHL-ekben 87 Mediastinalis B-sejtes lymphomában 88 Több kutatócsoport is leírta, hogy az ASHM nem érinti a CLL-t 79, 85-87. A CLL magas malignitású lymphomába átalakult eseteiben, így RT-ben és PLT-ben viszont az ASHM-et korábban nem vizsgálták. 2.2 Az aktiváció-indukált citidin deamináz Az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) enzim esszenciális szerepet tölt be alapvető immunológiai folyamatokban, az SHM-ben és az izotípusváltásban ( class-switch rekombináció, CSR), amelyek a nyirokcsomó centrum germinatívumában zajlanak 89, 90. Az izotípusváltás is a B-sejt érés folyamatához tartozik, melynek során az immunglobulin osztályok típusa megváltozik: IgM- és IgD mellett IgE, IgG és IgA keletkezik. Az AID fiziológiásan a centrum germinatívum B-sejtjeiben melyek CD19 és CD38 sejtfelszíni markereket hordoznak expresszálódik. Az AID fehérje a citoplazmában lokalizálódik chaperonok segítségével mindaddig, amíg valamilyen B-sejt aktiváló stimulus hatására be nem kerül a sejtmagba. B-sejt aktiváló stimulusok lehetnek például az IL-4, CD40 ligand és lipopoliszacharidok, amelyek az NF-κB és a JAK-STAT-6 jelátviteli úton keresztül fejtik ki hatásukat 91, 92 (8. ábra). 24

CD38 CD19 AID AID NF-κB IL-4 CD40 ligand LPS JAK-STAT-6 8. ábra. Az AID fiziológiásan a centrum germinatívum B-sejtjeiben expresszálódik. Az AID fehérje a citoplazmában raktározódik, amíg valamilyen B-sejt aktiváló stimulus hatására be nem kerül a magba (piros nyíl). B-sejt aktiváló stimulusok például az IL-4, CD40 ligand és lipopoliszacharidok, amelyek az NF-κB és a JAK-STAT-6 jelátviteli úton keresztül fejtik ki hatásukat. Rövidítések: AID, aktiváció indukált citidin deamináz; CD, cluster differentiation ; IL, interleukin; JAK, Janus-kináz; LPS, lipopoliszacharid; NF-κB, nukleáris faktor-κb; STAT-6, signal transducer and activator of transcription 6. Az AID erősen mutagén enzim, hatására deaminálással a citidinből uridin képződik (9. ábra). Hatásmechanizmusa még nem teljesen tisztázott, több elképzelés is született erre vonatkozóan. Az egyik elgondolás szerint az AID az mrns editálásán keresztül fejti ki hatását 93. Valószínűbbnek tűnik ma már az az elképzelés, mely szerint az AID a transzkripció során közvetlenül az egyszálú DNS molekulán képes citidin deamináz aktivitását kifejteni, különböző, többségében még ismeretlen kofaktorok segítségével 94, 95. NH 2 O C N C H AID H C N C H O C C H N R citidin NH 2 O C C H N R uridin 9. ábra. Az AID hatására a citidinből uridin keletkezik deaminálással. Rövidítések: AID, aktiváció indukált citidin deamináz 25

A deaminálás során a DNS molekulában guanin-uracil (G-U) bázispárosodási hibák (mismatchek) keletkeznek 96, amelyek intermedierei lesznek az SHM és a CSR folyamatainak. A G-U mismatchek feloldására különféle javító folyamatok aktiválódnak, melyek a jellegüktől függően vagy kijavíthatják a hibát, vagy különböző típusú szomatikus mutációk vagy DNS törések létrejöttét eredményezik A javító folyamatok és eredményeik 101 : hiba kijavítása DNS integritásának helyreállítása (G-C bázispár) javítás nélküli replikáció C-T és G-A tranzíciók bázis-excíziós rendszer aktiválódása tranzíciók és transzverziók uracil-n-glikoziláz enzim aktiválódása, majd transzléziós replikáció tranzíciók és transzverziók uracil-n-glikoziláz enzim aktiválódása, majd apurin/apirimidin endonukleáz működése tranzíciók és transzverziók bármelyik javító folyamat (ha a hibák megfelelő pozícióban vannak) duplaszálú DNS törés 97-100. Ezek alapján érthető, hogy az AID enzim inadekvát aktivitása helytelen DNS rekombinációk kialakulásán keresztül genom instabilitást hozhat létre, mely különféle B-sejtes lymphomák kialakulásához vezethet. Nagy valószínűség szerint az inadekvát AID aktivitás tehető felelőssé az ASHM kialakulásáért is, melynek során különböző protoonkogénekben szomatikus mutációk halmozódnak fel 102 (10. ábra). 26

IgM, IgD SHM AID IgG, IgA, IgE IgVH-régió B-lymphocyta ASHM nyirokcsomó csíraközpont c-myc, Pax-5, RhoH és Pim1 protoonkogének B-sejtes daganatok 10. ábra. Az AID alapvető fontosságú enzim az izotípusváltás és az SHM folyamatában, melyek a B-sejt érés során valósulnak meg a nyirokcsomó csíraközpontjában. Az AID inadekvát működése (piros nyíl) ASHM-hez vezet, melynek következtében B-sejtes lymphomák fejlődhetnek ki. Rövidítések: AID, aktiváció-indukált citidin deamináz; ASHM, aberráns szomatikus hipermutáció; Ig, immunglobulin; IgVH, immunglobulin nehézlánc gén variábilis régió; SHM, szomatikus hipermutáció. 27

Fokozott AID expressziót különböző típusú lymphomákban leírtak (4. táblázat) 103-106. Az egyes munkacsoportok az AID expressziót különböző mértékűnek találták CLL-ben 91, 104, 107-109. Albesiano és mtsai 107 határhigításos módszerrel bebizonyították, hogy a CLL-es tumorsejt populációban az AID expresszió heterogén és csak a sejtek egy kis része expresszál AID-et. Ugyanakkor a CLL magas malignitású lymphomába transzformálódott eseteinél (RT, PLT) az AID expressziójára vonatkozó adat az irodalomban nem található. 4. táblázat. Az AID expresszió mértéke különféle lymphomákban lymphoma eredete centrum germinativum nem centrum germinativum AID expresszió DLBL GCB-altípus DLBL ABC-altípus Burkitt-lymphoma extranodalis marginális zóna magas follicularis lymphoma lymphoma (MALT) mediastinalis B-sejtes lymphoma CLL myeloma multiplex alacsony MALT lymphoma köpenysejtes lymphoma Rövidítések: ABC, aktivált B-sejtes; AID, aktiváció-indukált citidin deamináz; CLL, krónikus lymphocytás leukaemia; DLBL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; GCB, centrum germinatívum B-sejtes; MALT, mucosa asszociált lymphoid szövet Összesítve elmondható, hogy az AID inadekvát aktivitása összefügghet az ASHM-mel, amely különféle B-sejtes lymphomák patogenezisében vesz részt. Az AID és az ASHM szerepét korábban nem vizsgálták a CLL Richter és prolymphocytás transzformációjában. 28

IV. CÉLKITŰZÉSEK Az aktiváció-indukált citidin deamináz mrns expressziójának vizsgálata krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformált eseteiben. Az aberráns szomatikus hipermutáció vizsgálata a c-myc, Pax-5 és RhoH protoonkogénekben a krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformált eseteiben. Az IgVH gének mutációs státuszának feltérképezése és azok összevetése a c-myc, Pax-5 és RhoH protoonkogének mutációs státuszával a krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformált eseteiben. 29

V. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 1. Beteganyagok Tanulmányunkban 29 krónikus lymphocytás leukaemiás beteg perifériás vér (PV) mintáját vagy frissen fagyasztott nyirokcsomó biopsziás mintáját használtuk. Valamennyi minta diagnózisát az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben állították fel a World Health Organization (WHO) lymphoid szövetek daganatos megbetegedéseinek klasszifikációjára vonatkozó kritériumainak megfelelően, hisztopatológiai és immunfenotípus vizsgálatok alapján (3). A CLL-es betegek közül 8 eset a betegség klinikai lefolyása alatt nem transzformálódott (1-8. esetek). 13 esetben Richter transzformáció (9-21. esetek), míg 8 esetben prolymphocytás transzformáció (22-29. esetek) fejlődött ki. Az RT-s betegek közül 7 esetben (9-15. esetek) a CLL-es és a DLBL-es minta is elérhető volt a vizsgálatokra. Ezekben az esetekben a CLL és a hozzátartozó DLBL minták egyforma IgVH génátrendeződést mutattak, igazolva ezzel a tumor minták azonos klonális eredetét. A vizsgált mintákban a malignus sejtek aránya több mint 90 % volt. A betegek klinikai adatait (nem, kor, mintavétel ideje, klinikai stádium, lymphocyta szám, thrombocyta szám és hemoglobin szint) az 5. táblázat foglalja össze. 30

5. táblázat. A betegek klinikai adatai Eset szám Minta Nem Kor Mintavétel ideje (év, hó) Stádium (Binet) Lymphocyta (G/l) Thrombocyta (G/l) Hemoglobin (g/l) 1 CLL nő 70 2003 10 A 25,07 125 131 2 CLL ffi 89 2004 06 A 14,63 138 104 3 CLL ffi 79 2004 03 C 14,03 121 65 4 CLL nő 72 2004 03 A 21,17 214 142 5 CLL nő 82 2004 02 C 39,67 32 85 6 CLL ffi 60 2003 11 B 13,68 586 113 7 CLL ffi 53 2004 03 A 22,77 218 135 8 CLL nő 77 2003 09 A 8,06 228 138 9 CLL ffi 60 2004 09 B 2,25 122 134 RT 60 2004 03 B 1,33 153 137 10 CLL ffi 61 2002 10 A 7,57 571 131 RT 63 2004 11 B 56,32 216 123 11 CLL ffi 64 2002 02 B 14,94 178 115 RT 64 2002 02 B 22,01 230 123 12 CLL ffi 62 2003 02 B 36,33 320 139 RT 62 2003 02 B 7,84 286 130 13 CLL ffi 52 2003 10 C 4,48 67 129 RT 52 2003 06 C 2,84 38 125 14 CLL ffi 41 2003 10 C 442,70 45 55 RT 40 2002 02 B 1,65 115 114 15 CLL nő 73 2005 03 B 19,88 170 119 RT 73 2005 02 B 26,98 341 128 16 RT ffi 63 2003 02 C 80,22 0,6 77 17 RT ffi 51 2004 02 B 18,40 176 118 18 RT nő 53 2004 01 C 5,50 36 101 19 RT ffi 71 1996 11 C 8,36 113 98 20 RT ffi 68 1998 05 B 11,45 303 126 21 RT nő 55 2004 03 B 3,77 285 109 22 PLT nő 69 1998 12 B 6,32 241 128 23 PLT ffi 75 1998 01 A 27,53 189 134 24 PLT ffi 66 2002 03 A 2,15 148 127 25 PLT nő 49 2004 08 B 346,00 263 126 26 PLT ffi 83 2004 09 B 1,72 144 134 27 PLT nő 76 2004 06 B 6,89 200 149 28 PLT ffi 60 2002 02 A 2,62 158 135 29 PLT ffi 74 2004 08 B 38,14 170 130 Rövidítések: CLL, krónikus lymphocytás leukemia; NA, nem amplifikált; ffi, férfi; PLT, prolymphocytás transzformáció; RT, Richter transzformáció 31

2. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mrns expressziójának vizsgálata kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval Összesen 12 CLL-es (1-12. esetek), 13 RT-s (9-21. esetek) és 8 PLT-s minta (22-29. esetek) AID mrns expresszióját analizáltuk kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval (real-time PCR, qrt-pcr). Négy esetben (9-12. esetek) a CLL-es és a hozzátartozó RT-s minta is elérhető volt a vizsgálatra. A vizsgálathoz kontrollként 8 egészséges önkéntes PV-ének mononukleáris sejtjeit és 2 humán reaktív nyirokcsomó CG B-sejtjeit használtuk. Az mrns expressziós vizsgálat munkamenetét a 11. ábra foglalja össze. RNS izolálás RT qrt-pcr 11. ábra. Az mrns expresszió analíziséhez először a kontroll és a tumor szövetekből RNS-t izoláltunk klasszikus módszerrel, majd ebből reverz transzkripcióval cdns-t szintetizáltunk. A cdns mintákkal elvégeztük a valós-idejű PCR reakciót, majd a ΔΔC T módszer segítségével meghatároztuk a relatív expressziós szinteket. Rövidítések: RT, reverz transzkripció; qrt-pcr, kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakció 2.1 Lézer mikrodisszekció A Leica lézer mikrodisszekciós rendszer (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) segítségével 2 humán reaktív nyirokcsomóból centrum germinatívum sejteket izoláltunk, a gyártó utasításai alapján. A munka során minden eszközt RNA later (Qiagen, USA) reagenssel kezeltünk, hogy megakadályozzuk az RNS degradációját. A frissen fagyasztott nyirokcsomó mintákból metszeteket készítettünk mikrodisszekcióra alkalmas tárgylemezre. A tárgylemezeket toluidin-kék festékkel megfestettük, majd a centrum germinatívumokból sejteket vágtunk ki. Az izolált sejteket Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) reagensbe gyűjtöttük. 32

2.2 RNS izolálás Totál RNS izolálást végeztünk Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) reagens alkalmazásával a 8 egészséges PV mononukleáris sejtjeiből, a 2 reaktív nyirokcsomó CG B-sejtjeiből valamint a 12 CLL-es (1-12. esetek), 13 RT-s (9-21. esetek) és 8 PLT-s (22-29. esetek) mintából a gyártó utasításainak megfelelően. A PV-ek esetében első lépés volt a mononukláris sejtkomponens szeparálása sűrűség gradiens centrifugálással. Steril üvegkémcsőben 2ml szobahőmérsékletű Histopaque (Sigma, St. Louis, USA) reagensre rárétegeztünk 2 ml EDTA-val alvadásgátolt teljes vért, majd 30 percig centrifugálást végeztünk 400 g-vel, szobahőmérsékleten. A centrifugálás során elkülönült mononukleáris sejteket tartalmazó fázist leszívtuk és egy másik steril üvegkémcsőbe pipettáztuk, ahol a sejteket 5 ml DEPC (dietil-pirokarbonát) PBS-ben (phosphate-buffered saline) reszuszpendáltuk. Az ezt követő 10 perces, szobahőmérsékleten 250 g-vel végzett centrifugálás után a felülúszót leöntöttük, és a kémcső alján maradt tisztított mononukleáris frakcióhoz 1 ml Trizol reagenst adtunk. A fagyasztott nyirokcsomó mintákból először mikrotómmal 15 darab 30 μm vastag metszetet készítettünk, és a szövetmetszeteket egy steril eppendorf csőben 1 ml Trizol reagensben homogenizáltuk. Miután a kémcsövekben a vér és a nyirokcsomó mintákból nyert homogenizátumban a sejtek teljesen feloldódtak (a csövek tartalma viszkózussá vált) hozzámértünk 200 μl kloroformot. Vortexelés és 3 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után 15 percig 4 o C-on 10 000 g-vel centrifugáltuk a csöveket, majd a felső vizes fázist egy új steril eppendorf csőbe szívtuk át és hozzámértünk 0.5 ml izopropanolt. 10 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után 10 percig 4 o C-on 10 000 g-vel centrifugálást végeztünk, majd a felülúszó leöntése után 1 ml 75 %-os etanolt mértünk a csövekbe és a csövek falát megpöcögtettük, hogy az RNS üledék leváljon a cső faláról. Egy újabb 10 perces, 4 o C-on 10 000 g-vel végzett centrifugálás után a felülúszó leszívását követően az RNS precipitátumot tartalmazó csövet jégbe állítva hagytuk megszáradni. Az RNS precipitátumot 30-50 μl DEPC-kezelt vízben feloldottuk és 37 o C-os vízfürdőben 15 percig inkubáltuk. Az RNS koncentrációját spektrofotométer (Gene Quant II, Cambridge, UK) segítségével 260 nm hullámhosszon megmértük. Az RNS mintákat -70 C-on tároltuk a további felhasználásig. 33

2.3 Reverz transzkripció Az RNS minták cdns-sé történő kvantitatív átírását, vagyis a reverz transzkripciót a High Capacity cdna Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével végeztük. A reverz transzkripciós reakció a MiniCycler TM (MJ Research Inc., USA) készülékben zajlott, hőprofilja: 10 perces 25 o C-on történő inkubációt követő 37 o C-on zajló 120 perces szintézis. A reakció során 2.5 μg RNS átírása történt 100 μl végtérfogatban. A reakció összetétele a 6. táblázatban látható. A megszintetizálódott cdns mintákat -20 o C-on tároltuk a további felhasználásig. 6. táblázat. A reverz transzkripciós reakció összetétele összetevők mennyiség/cső Reverse Transcription Buffer (10x) 10 μl dntps (25x) 4 μl Random Primers (10x) 10 μl MultiScribe Reverse Transcriptase (50U/ μl) 5 μl RNS templát 2.5 μg Nukleáz mentes víz 100 μl-ig 2.4 Kvantitatív RT-PCR és az AID mrns expressziós szintek meghatározása A 12 CLL-es, a 13 RT-s, a 8 PLT-s valamint a kontroll minták kvantitatív RT-PCR reakcióit az ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) valós-idejű PCR készülék segítségével végeztük el. Az AID mrns amplifikációjához a TaqMan alapú Assays-on-Demand (Applied Biosystems) génexpressziós rendszert használtunk. A kitben az AID gén amplifikálni kívánt szakaszára specifikus TaqMan próba mellett olyan AID-re specifikus primerpár található, amely a vad típusú gén és több splice-variáns amplifikációjára is alkalmas. Az AID értékek normalizálásához belső kontrollként a glyceralaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) háztartási gén amplifikációját is elvégeztük előre kifejlesztett (pre-developed) TaqMan Control Reagent (Applied Biosystems) rendszer 34