2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-1 01/2007:20422 2.4.22. ZSÍRSAVÖSSZETÉTEL GÁZKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA Az idegen olajok vizsgálatát gázkromatográfiásan végezzük (2.2.28), és ehhez a vizsgálandó olajban található zsírsavakat metil-észterekké alakítjuk. A MÓDSZER E módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, ciklopropil- vagy ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei találhatók, sem olyanokra, amelyek nagy arányban tartalmaznak nyolc szénatomnál rövidebb láncú zsírsavakat és olyanokra sem, amelyeknek savszáma nagyobb, mint 2,0. Vizsgálati oldat. Amennyiben a cikkely előírja, metilezés előtt megszárítjuk a vizsgálandó olajat. Ezután 1,0 g olajat visszafolyóhűtővel és gázbevezető csővel ellátott, 25 ml-es csiszolatos gömblombikba mérünk. 10 ml R vízmentes metanolt és R kálium-hidroxid R metanolos, 60 g/l töménységű oldatából 0,2 ml-t elegyítünk hozzá. Felszereljük a visszafolyóhűtőt, az elegyen mintegy 50 ml/perc sebességgel R nitrogént áramoltatunk, az oldatot összerázzuk, és forrásig melegítjük. Az oldat feltisztulásától számítva (ami kb. 10 percet vesz igénybe), a melegítést további 5 percig folytatjuk. Ezután az oldatot folyó vízzel lehűtjük, majd választótölcsérbe visszük. A lombikot 5 ml R heptánnal átmossuk és ezt a mosófolyadékot is a választótölcsérbe öntjük. A választótölcsérben lévő oldatot R nátrium-klorid 200 g/l töménységű oldatának 10 ml-ével erőteljesen összerázzuk. A fázisok elkülönülése után a szerves fázist R vízmentes nátrium-szulfátot tartalmazó edénykébe visszük át, és állás után megszűrjük. Összehasonlító oldat (a). Ezen fejezetnek egyik az egyedi cikkely által előírt táblázata alapján 0,50 g kalibráló keveréket készítünk. (Amennyiben a cikkely nem ír elő speciális oldatot, a 2.4.22.-1. táblázat szerinti összetételt alkalmazzuk.) A keveréket R heptánnal 50,0 ml-re oldjuk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml a) összehasonlító oldatot R heptánnal 10,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). 0,50 g zsírsav-metilészter keveréket készítünk, melynek összetétele megfelel a vizsgálandó anyag cikkelyében feltüntetett zsírsav-
2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-2 összetételnek. Az elegyet R heptánnal 50,0 ml-re oldjuk. A kereskedelemben kapható zsírsav-metilészter elegyek is felhasználhatók. Oszlop: anyaga: kvarcüveg, üveg vagy kvarc; méretei: l = 10 30 m, Ø = 0,2 0,8 mm; állófázis: R makrogol 20 000 (filmvastagság 0,1 0,5 μm) vagy egyéb, megfelelő állófázis. Vivőgáz: R gázkromatográfiás célra szánt hélium vagy R gázkromatográfiás célra szánt hidrogén. Áramlási sebesség: 1,3 ml/perc (ha az oszlop belső átmérője 0,32 mm). Mintaáram-elosztási arány: 1:100 vagy kisebb, az adott oszlop belső átmérőjéhez igazodva; pl. ha az oszlop belső átmérője 0,32 mm, akkor 1:50. Hőmérséklet: oszlop: izoterm körülmények között 160 200 C; ezen belül az oszlop hosszához és típusához kell igazodni; ha például az oszlop hossza 30 m, bevonata pedig R makrogol 20 000, akkor a hőmérséklet 200 C; ha lineáris hőmérséklet-programozásra van szükség, akkor a 30 m-es oszlop hőmérsékletét percenként 3 C-kal 170 C-ról 230 C-ra emeljük; injektor: 250 C; detektor: 250 C. Detektálás: lángionizáció. Injektálás: 1 μl. Érzékenység: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs magassága érje el a regisztráló teljes skálaszélességének 50 70 %-át. Rendszeralkalmasság, ha a 2.4.22.-1. vagy a 2.4.22.-3. táblázat kalibráló elegyét használjuk:
2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-3 csúcsfelbontás: legalább 1,8, a metil-oleát és a metil-sztearát között az a) összehasonlító oldat kromatogramján; jel/zaj viszony: legalább 5, a metil-mirisztát csúcsra számolva a b) összehasonlító oldat kromatogramján; elméleti tányérszám: legalább 30 000, a metil-sztearát csúcsra számolva az a) összehasonlító oldat kromatogramján. Rendszeralkalmasság, ha a 2.4.22.-2. táblázat kalibráló elegyét használjuk: csúcsfelbontás: legalább 4,0, a metil-kaprilát és a metil-dekanoát között az a) összehasonlító oldat kromatogramján; jel/zaj viszony: legalább 5, a metil-kaproát csúcsra számolva a b) összehasonlító oldat kromatogramján; elméleti tányérszám: legalább 15 000, a metil-dekanoát csúcsra számolva az a) összehasonlító oldat kromatogramján. A KROMATOGRAMOK ÉRTÉKELÉSE A vizsgálati körülményeket úgy kell megválasztani, hogy ne keletkezhessenek elfedett csúcsok (egymástól kevéssé eltérő retenciós idejű összetevők, például linolénsav és arachinsav egyidejű jelenléte esetén). Kvalitatív értékelés. A csúcsokat a c) összehasonlító oldat kromatogramja alapján azonosítjuk (akár izoterm vizsgálati körülményeket, akár lineáris hőmérsékleti programozást alkalmaztunk). Izoterm kromatografálás esetében a csúcsokat úgy is azonosíthatjuk, hogy az a) összehasonlító oldat kromatogramja, valamint a 2.4.22.-1., a 2.4.22.-2, ill. a 2.4.22.-3. táblázat adatatai alapján kalibrációs görbéket szerkesztünk. 2.4.22.-1. táblázat Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.)
2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-4 A keveréket alkotó kalibráló anyagok Összetétel (% m/m) R metil-laurát 5 R metil-mirisztát 5 R metil-palmitát 10 R metil-sztearát 20 R metil-arachinát 40 R metil-oleát 20 2.4.22.-2. táblázat Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.) A keveréket alkotó kalibráló anyagok Összetétel (% m/m) R metil-kaproát 10 R metil-kaprilát 10 R metil-dekanoát 20 R metil-laurát 20 R metil-mirisztát 40 2.4.22.-3. táblázat Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.) A keveréket alkotó kalibráló anyagok Összetétel (% m/m) R metil-mirisztát 5 R metil-palmitát 10 R metil-sztearát 15 R metil-arachinát 20 R metil-oleát 20 R metil-ejkozenoát 10
2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-5 R metil-behenát 10 R metil-lignocerát 10 Az a) összehasonlító oldat kromatogramján lemérjük valamennyi csúcs redukált retenciós idejét (t R ). A redukált retenciós idő nem az injektálás időpontjától, hanem az oldószer-csúcstól mért retenciós idő. Felvesszük a kalibrációs görbét: log( t R ) = f (szénlánchossz-egyenérték) Telítetlen savak log t R értékei e görbének olyan pontjain helyezkednek el, amelyek nem egész számú szénlánchossz-egyenértéknek felelnek meg; a szénlánchosszegyenérték annak az elméleti telített szénláncnak a hossza, amelynek t R értéke megegyezne az azonosítandó zsírsavéval. Például, a linolsav t R értéke egy elméletileg 18,8 szénatomszámú, telített zsírsavéval egyezik meg. A vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő csúcsokat a kalibrációs görbe és a redukált retenciós idők felhasználásával azonosítjuk. A szénlánchosszegyenértékeket a 2.4.22-4. táblázat foglalja össze. 2.4.22.-4. táblázat. Szénlánchossz-egyenértékek. (Ezen értékek, melyeket kalibrációs görbe alapján kell kiszámolni, példaként szerepelnek, és R makrogol 20 000-rel bevont oszlopra vonatkoznak.) Zsírsav Kapronsav Kaprilsav Kaprinsav Laurinsav Mirisztinsav Palmitinsav Palmitoleinsav Margarinsav Sztearinsav Olajsav Linolsav Gamma-linolénsav Alfa-linolénsav Arachinsav Ejkozénsav Arachidonsav Behensav Erukasav 12-Oxosztearinsav Szénlánchossz-egyenérték 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 16,3 17,0 18,0 18,3 18,8 19,0 19,2 20,0 20,2 21,2 22,0 22,2 22,7
2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-6 Ricinolsav 12-Hidroxisztearinsav Lignocerinsav Nervonsav 23,9 23,9 24,0 24,2 Kvantitatív értékelés. Általában a normalizációs eljárást alkalmazzuk, melynek során a kromatogramon megjelenő csúcsok területösszegét az oldószercsúcsok területét figyelmen kívül hagyva 100%-nak tekintjük. Egy-egy összetevő mennyiségét úgy számítjuk ki, hogy meghatározzuk az illető csúcs területének a csúcsok területösszegéhez viszonyított százalékos arányát. Azokat a csúcsokat, amelyeknek területe kisebb, mint a csúcsok területösszegének 0,05%-a, nem vesszük figyelembe. Az egyedi cikkely esetenként, például tizenkét szénatomos vagy ennél rövidebb láncú zsírsavak jelenléte esetén, átszámítási faktorokat ad meg a csúcsterületek átszámításához m/m százalékra. B MÓDSZER Ez a módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, ciklopropil- vagy ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei találhatók és olyan olajokra sem, amelyeknek savszáma nagyobb, mint 2,0. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag 0,100 g-ját csavaros kupakkal ellátott, 10 ml-es centrifugacsőbe mérjük, 1 ml R heptán és 1 ml R dimetil-karbonát segítségével oldjuk és enyhe melegítés (50 60 C) közben erőteljesen keverjük. Ezután hozzáadjuk R nátrium R vízmentes metanolos, a szükséges óvintézkedések figyelembevételével készített, még meleg, 12 g/l-es oldatának 1 ml-ét. Az elegyet kb. 5 percig erőteljesen keverjük. Ezután 3 ml R desztillált vizet adunk hozzá, és kb. 30 másodperces, erőteljesen keverés után 1500 g-vel 15 percig centrifugáljuk. A szerves fázisból 1 μl-t injektálunk. Összehasonlító oldatok és a kromatogramok értékelése. Amennyiben az egyedi cikkely nem tartalmaz speciális előírást, a továbbiakban az A módszerben előírtak szerint járunk el. Oszlop: anyaga: kvarcüveg; méretei: l = 0,30 m, Ø = 0,25 mm;
2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-7 állófázis: R makrogol 20 000 (filmvastagság 0,25 μm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hélium. Áramlási sebesség: 0,9 ml/perc. Mintaáram-elosztási arány: 1:100. Hőmérséklet: Idő (perc) Hőmérséklet ( C) Oszlop Injektor Detektor Detektálás: lángionizáció. Injektálás: 1 μl. 0 15 15 36 36 61 100 100 225 225 250 250 C MÓDSZER Ez a módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, aldehid-, keton-, ciklopropil- és ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei, továbbá konjugált, többszörösen telítetlen és acetilén-kötést tartalmazó vegyületek találhatók, mivel ezen csoportok részben vagy teljesen elbomlanak. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag 0,10 g-ját 25 ml-es Erlenmeyer-lombikban R nátrium-hidroxid R metanollal készült, 20 g/l töménységű oldatának 2 ml-ében oldjuk, és az oldatot visszafolyóhűtő alkalmazásával 30 percig forraljuk. Ezután a hűtőn keresztül 2,0 ml R metanolos bór-trifluorid oldatot juttatunk hozzá, és 30 percig forraljuk, majd ismét a hűtőn keresztül 4 ml R heptánt juttatunk hozzá, és 5 percig forraljuk. Lehűtés után 10,0 ml R telített nátrium-klorid oldattal kb. 15 másodpercig rázzuk, majd még annyi R telített nátrium-klorid oldatot adunk hozzá, hogy a felső fázis a lombik nyakába kerüljön. A felső fázis 2 ml-ét kivesszük, 3 2 ml R vízzel mossuk, és R vízmentes nátrium-szulfáttal megszárítjuk.
2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-8 Összehasonlító oldatok, kromatográfiás vizsgálat és a kromatogramok értékelése. Amennyiben az egyedi cikkely nem tartalmaz speciális előírást, a továbbiakban az A módszerben előírtak szerint járunk el.