A PAJZSMIRIGY MICROCARCINOMA EPIDEMIOLÓGIÁJA ÉS BIOLÓGIAI TULAJDONSÁGAI PhD értekezés Dr. Kovács Gábor László * témavezető: Dr. Szabolcs István egyetemi tanár, az MTA doktora * Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Tudományok Doktori Iskola * Közegészségügyi és egészségtudományi kutatások A jódellátottság és az endokrin rendszer kapcsolatai: epidemiológiai, diagnosztikai és klinikofarmakológiai vizsgálatok programvezető: Dr. Sótonyi Péter egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság: Dr. Rácz Károly egyetemi tamár, az MTA doktora (elnök) Dr. Lakatos Péter egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Julesz János egyetemi tanár, PhD * Bíráló bizottság: Dr. de Châtel Rudolf egyetemi tanár, az MTA doktora (elnök) Dr. Földes János egyetemi tanár, az MTA doktora (opponens) Dr. Csaba Zsolt, PhD (opponens) Dr. Nagy Endre egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Tóth Miklós, PhD * Budapest 2006
1. BEVEZETÉS... 3 1.1. A pajzsmirigy, mint a jódfelhasználás legfontosabb szerve... 3 1.2. Jódellátottság Magyarországon... 5 1.3. A pajzsmirigy daganatok biológiai tulajdonságai... 5 1.3.1. A pajzsmirigy daganatok patológiája... 5 1.3.2. A pajzsmirigy carcinoma epidemiológiája... 9 1.3.3. Környezeti faktorok, elsősorban a jód hatása a pajzsmirigy carcinoma kialakulásában... 11 1.4. A pajzsmirigy microcarcinoma... 14 1.4.1. Definíció... 14 1.4.2. A pajzsmirigy microcarcinoma epidemiológiája és jódellátottságtól való függése irodalmi adatok alapján... 15 1.4.3. A pajzsmirigy microcarcinoma biológiai tulajdonságai, prognózist befolyásoló tényezői... 18 1.5. A cyclin D1 biológiai szerepe... 20 1.5.1. A cyclin D1 tulajdonságai és élettani funkciója... 20 1.5.2. Cyclin D1 overexpresszió endokrin daganatokban... 22 1.5.3. Cyclin D1 overexpresszió pajzsmirigy microcarcinomákban... 23 2. CÉLKITŰZÉSEK... 24 2.1. A pajzsmirigy microcarcinoma epidemiológiája... 24 2.2. Autopsziás mintában észlelt pajzsmirigy microcarcinomák cyclin D1 expressziójának vizsgálata. Kérdésfeltevések:... 24 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 25 3.1. Microcarcinomák epidemiológiai vizsgálata autopsziás mintában... 25 3.2. Cyclin D1 expresszió vizsgálata pajzsmirigy daganatokban... 26 4. EREDMÉNYEK... 29 4.1. Microcarcinomák epidemiológiai vizsgálata autopsziás mintában... 29 4.2. Microcarcinomák cyclin D1 expressziójának vizsgálata... 36 5. MEGBESZÉLÉS... 41 6. KÖVETKEZTETÉSEK... 46 7. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS... 47 8. PUBLIKÁCIÓS LISTA... 56 9. ÖSSZEFOGLALÓ... 60 10. ABSTRACT... 61 2
1. BEVEZETÉS 1.1. A pajzsmirigy, mint a jódfelhasználás legfontosabb szerve A pajzsmirigy, az anyagcserefolyamatok egyik legfontosabb hormonjának, az l- thyroxinnak (tetrajód thyronin T4, trijód thyronin-t3) a termelődési helye. A hormon fontos alkotóeleme a jód. A pajzsmirigy follicularis sejtjeinek basalis membránján levő nátrium-jodid szimporter pumpa segítségével a táplálékkal bejuttatott jodid ion a keringésből a sejtekbe kerül. A pajzsmirigyszövetben normálisan 600μg jód van grammonként. A sejt belsejében a jodid-ion peroxidázok hatására oxidálódik, majd egy glikoprotein molekulához, a thyreoglobulinhoz kötődik, T3-t illetve T4-t képezve. A T3 és T4 a thyreoglobulin részeként tárolódik a kolloidban. Az agyalapi mirigy által termelt thyreoidea stimuláló hormon (TSH) hatására kolloid cseppek jutnak vissza a sejtplazmába, ahol a lizoszómákkal fuzionálva proteolízissel válnak le a glikoproteinekről. A T3 és T4 a keringésbe kerül, ahol plazmafehérjékhez kötődik (pl. thyroxinkötő globulinhoz). Élettani szempontból csak a szabad hormon bír biológiai hatással. A pajzsmirigy naponta 80-100μg hormont termel (T4:T3 aránya 20:1). Bár a keringésben mind a T3, mind a T4 jelen van; a szövetek az esetek 90%-ában a T4 dejodinálása során keletkező T3-t hasznosítják (1). A pajzsmirigyhormonok, hatásukat a sejtmagban található receptorokon (TR) fejtik ki. A sejtek cytoplasmájába a T4 diffúzióval jut be és ott 5 -dejodináz hatására T3-má alakul. A magban keletkező T3-TR komplex a sejtmagban levő DNS pajzsmirigyhormon-responziv szakaszaihoz kötődik, amely fokozza az anyagcserefolyamatokban fontos szerepet játszó fehérjék átíródását. A pajzsmirigyhormonok a Na- K-ATPáz stimulációján keresztül emelik a sejtek O 2 fogyasztását, hőtermelését (növelik az energiaforrásként szolgáló aminosavak és a glükóz felvételét). Emellett fokozzák a myocardium kontraktilitását, a beta-adrenerg receptor denzitást, a G proteinek mennyiségét a szívizomban. A pajzsmirigyhormon serkenti a bélmotilitást, a csontturnovert. A metabolikus hatások közül kiemelendő a glikogenolízist, glikoneogenezist fokozó hatás. T3 és T4 hatására a májban az LDL receptorszám-szám nő, ezáltal a koleszterin szintje csökken. A pajzsmirigyhormon fontos szerepet tölt be a kiegyensúlyozott női nemi ciklus működésében. A magzati szövetek kialakulásához és
éréséhez a thyroxin nélkülözhetetlen, de a magzati hossznövekedéshez nem szükséges. A thyroxin az agyban a myelinizációt, fehérjeszintézist és az axonális elágazódásokat segíti elő. A thyroxin hatása az idegrendszerben nem csak TR-on keresztül jelentkezik, hanem más celluláris utakon mediált hatások is szerepet játszanak az agy harmonikus fejlődésében (2). Az előbbiekben röviden összefoglalt általános anyagcsere-hatásokhoz az l-thyroxinra, és a thyroxin mólsúlyának mintegy 65%-át adó jódra feltétlenül szükség van. Mindezek ellenére a jód csak igen kis mennyiségben fordul elő szervezetünkben; a felnőtt szervezet jódtartalma mindösszesen 15-20mg. A táplálékkal felvett jód nagyobb része anorganikus jodid és kisebb része szerves kötésű jód. Az anorganikus jodid jól felszívódik a bélcsatornából; a szerves kötésű jód egy része is jodiddá alakul mielőtt felszívódna a bélből. A jód az aminosavakhoz kötve is felszívódik, de kisebb hatásfokkal. A jód főleg a vizelettel ürül, de az epével és a verítékkel is kiválasztódik. A plazma szabad, anorganikus jódkoncentrációja 6-47nmol/l, mert a felszívódó jód nagy részét a pajzsmirigy felveszi. A plazmában levő jód döntő többsége szerves kötésű jód: a T4 és T3 része (3). A WHO ajánlása alapján felnőttek napi jódszükséglete 150μg, terhesség és szoptatás alatt a napi jódszükséglet 200-250μg. A felnőttkori jódhiány leggyakoribb következménye a strúma és súlyos jódhiány esetén a hypothyreosis, az endémiás retardáció, valamint a csökkent fertilitás. Az elégtelen jódbevitel a világ legelterjedtebb hiányállapota 1990-ben mintegy másfél milliárd embert érintett, akik közül 650 milliónak lehetett strumája. A legtöbb jódhiány miatt érintett ember hegyvidéken, iparilag kevésbé fejlett területen él, de Európában is mintegy 50-100 millió embernek elégtelen a napi jódbevitele (4). A jódhiány megítélésére a legalkalmasabb eljárás a vizelet jódürítés meghatározása. 20 μg/l alatt súlyos, 20-49 μg/l között mérsékelt, 50-99μg/l között enyhe a jódhiány, 100μg/l felett nincs jódhiány. A jódhiány következtében nő a diffúz és a göbös strúma kialakulásának kockázata. Ennek hátterében részben a TSH stimuláció, részben a csökkent intrathyreoidealis jodolakton és jodolipid-tartalom valamint a jódhiány által stimulált pajzsmirigyben megemelkedő szabadgyökmennyiség által provokált szomatikus TSH-receptor és G protein mutációk állhatnak (5). 4
1.2. Jódellátottság Magyarországon Magyaroszág 4/5-e az ivóvíz jodidtartalma alapján enyhén-mérsékelten jódhiányos területnek számít. Az Alföld középső része, Jász-Nagykun-Szolnok és Békés megye, jódban gazdag területnek minősül, ugyanis a lakosság az ivóvízellátását nagyrészt az artézi kutakból kapja, amelyek jodidtartalma igen magas. Munkacsoportunk 1996-1997- ben az ápolási otthonokban lakó idős emberek jódürítését és az ehhez kapcsolódó pajzsmirigy diszfunkciókat vizsgálta. Budapesten és környékén lévő otthonokban 119 idős embert (medián életkor 81 év) vizsgálva az átlagos jódkiválasztás 72μg/g kreatinin volt. A középső alföldi régióban 92 ember (medián életkor 78 év) került vizsgálatra, ahol az átlagos jódürítés 513μg/g kreatinin volt. Az alacsony jódürítésű területen a golyva előfordulása 39.4%-os, míg a magas jódürítésű területen 12,2%-os volt (p<0.001). A vizsgált két csoport mellett a Csallóköz jódhiányos területén jódozott sóval végzett golyvaprofilaxisban részesülő idősek között is készült felmérés. Itt 135 ember (medián életkor 81 év) került vizsgálatra, az átlagos jódürítés 100μg/g kreatinin volt. Ebben a csoportban a golyva előfordulási aránya 16,4%-os volt, jól mutatva a jódozott só kedvező hatását a golyva megelőzésében. (6). A vizsgálatban mért jódürítés alapján meghatározott csoportok fontos szerepet kaptak későbbi epidemiológiai kutatásunk megtervezésénél. 1.3. A pajzsmirigy daganatok biológiai tulajdonságai 1.3.1. A pajzsmirigy daganatok patológiája A pajzsmirigy leggyakoribb benignus daganatai a follicularis adenomák, amelyek többnyire tokkal körülvett, solitaer elváltozások, de lehetnek tok nélküli, illetve multiplex eltérések is. Működés szempontjából megkülönböztetnek funkcionáló és nem funkcionáló elváltozásokat. A follicularis adenomáknak jellemző microscopicus tulajdonságai vannak: a sejtek jól differenciált folliculusokat formálnak, amelyek a normális folliculusokhoz hasonlíthatnak és lehetnek trabecularis megjelenésűek is. Néha -különösen a nagyobb elváltozások- tartalmazhatnak bevérzést, oedemát, fibrosist. A follicularis jóindulatú daganatokban hiányzik a tok- és az érbetörés, amely a különbséget adja a benignus és malignus follicularis elváltozások között. (7). A follicularis adenoma bizonyos esetekben rosszindulatú daganattá progrediálhat. Egy 5
experimentális vizsgálat során patkányban follicularis adenomát észleltek, amelyet nem távolítottak el. Folyamatosan figyelték a daganat változását, és az idő előrehaladtával először kevert, jó és rosszindulatú komponenseket tartalmazó elváltozások, majd végül csak malignus tulajdonságokat tartalmazó sejtek voltak megfigyelhetőek a daganatban. (8). Emberben a follicularis adenoma follicularis carcinoma átalakulására csak indirekt bizonyítékok állnak fenn, ennek gyakorisága feltehetőleg alacsony (7). A pajzsmirigy rosszindulatú daganatainak 90%-a follicularis sejtekből, azaz a thyreocytákból indul ki. A rosszindulatú pajzsmirigy daganatok mintegy 70-80%-át a papillaris carcinoma adja. A daganat gyakran infiltrativ módon növekszik, multicentrikus és gyakran ad nyirokcsomó áttétet. A hisztológiai kritériumok: tetőcserépszerűen egymásra vetülő tejüvegszerű sejtmagok, kávébab alakú barázdák ( groove -ok), úgynevezett maginklúziók és az esetek több, mint a felében elmeszesedett psammomatestek (9,10). (1. ábra) B A 1. ábra 47 éves nőbetegből származó papillaris pajzsmirigy carcinoma szövettani képe. Jól látható a daganat papillaris szerkezete, továbbá a tejüvegszerű, tetőcserépszerűen egymás mellé torlódó sejtmagvak képe. Haematoxylin-eosin festés, 100X nagyítás. A: magbarázdák (groove); B: maginklúzió 6
A rosszindulatú pajzsmirigy daganatok 20%-át a follicularis carcinoma adja. A follicularis carcinoma a benignus adenomához szövettani szempontból nagyon hasonló; a malignitás megítélésében az érinvázió és a daganat-tok beszűrődése ad támpontot. A follicularis daganat egyik altípusa a Hürtle sejtes carcinoma, ami az előbbiekben említett follicularis típustól az enzimatikus, biokémiai és elektronmikroszkópos tulajdonságok tekintetében tér el. A parafollicularis sejtekből származik a primer pajzsmirigy daganatok 3-5%-a, a medullaris carcinoma (más néven C-sejtes carcinoma). A daganat 80%-ban sporadikus, 20%-ban a multiplex endokrin neoplasia 2A-2B klinikai tünetegyüttesének részjelenségeként manifesztálódik. A pajzsmirigyrákok 5-10 %-át az anaplasticus (differenciálatlan) carcinomák adják, amelyek többnyire a korábbi differenciált formákból alakulnak ki, de ritkán de novo is keletkezhetnek. A felsoroltakon túl lehet lymphoma, teratoma, pajzsmirigy carcinosarcoma, illetve metastasis is a mirigyállományon belül (9,10). A pajzsmirigyben előforduló egyéb lehetséges dagatok ismertetése nem tartozik az értekezés tárgykörébe; a legfrissebb 2004-es WHO klasszifikáció a http://www.iarc.fr/who-bluebooks/bbwebsite/bb7.html oldalon érhető el. A follicularis sejtekből kiinduló daganatok génmutációi fontos szerepet játszanak a különböző szövettani típusú carcinomák kialakulásában, illetve az egymásból történő átalakulásban. Az eddig legtöbbet vizsgált géneltérés a RET/PTC rearrangement, illetve ennek többféle altípusa. A RET/PTC rearrangement-ek egy olasz tanulmány alapján a papillaris daganatok 55%-ában fordulnak elő; többnyire a sugárzás indukálta daganatokban; szignifikánsan nagyobb számban a csernobili katasztrófát követően radioaktív sugárzásnak kitett gyermekek körében. Ugyanezen populációban a benignus göbökben is nagy arányban (52,4%) fordult elő a rearrangement; ami azt feltételezi, hogy a jól differenciált elváltozások kialakulásában fontos szerepet tölt be ez a genetikai eltérés (11). További részletek a RET/PTC rearrangementről az 1.4.3. fejezetben olvashatóak. Az intracellularis signal utakban fontos szerepet betöltő RAS aktiváló pontmutációi (12, 13, 59, 61. codonon) benignus és malignus daganatokban (túlnyomórészt follicularis carcinomákban) egyaránt előfordulhatnak, jódhiányos területen némileg gyakrabban (12). 7
A TRK a RET-hez hasonlóan tyrozin-kináz aktivitással rendelkezik, és már hosszú ideje ismert a rearrangment típusú átalakulása papillaris daganatokban (13). A TRK-T1 fúziós proteint expresszáló trangenikus egerek 54%-ánál rövid időn belül pajzsmirigy abnormalitások, elsősorban follicularis hyperplasia és papillaris carcinoma alakulhat ki; 7 hónapos korban azonban mindegyik transgenikus egérnél manifesztálódik a daganat (14). Ugyancsak régóta ismert, hogy a p53 tumorszuppresszor gén pontmutációja jelentős arányban (akár 70%-ban) kimutatható anaplasticus carcinomákban (15). Egy amerikai tanulmányban anapalsticus carcinomák genetikai tulajdonságait vizsgálták. A BRAF gén 599. kodonra specifikus mutáns allél PCR reakcióval 8-ból 5 anaplasticus ráknál észleltek pozitivitást, ebből 4-nél papillaris rákokra jellemző komponens is kimutatható volt. A RAS onkogén 1 és 2 exon 12, 13, 61 codon pontmutációit direkt szekvenálással vizsgálták. A 8 anaplasticus karcinómából csak egy esetben volt pontmutáció kimutatható. A RET/PTC rearrangement következtében létrejövő fúziós protein immunhisztokémiai festése egyik anaplasticus rákban sem volt pozitív, ami ismételten alátámasztja azt, hogy a RET/PTC rearrangement többnyire csak a jól differenciált daganatok fontos genetikai eltérése. A mutáns p53 tumorszuppresszor protein immunhisztokémiailag a 8 anaplasticus rákból 5-nél volt kimutatható, mégpedig azoknál, amelyek a BRAF gén mutációját is hordozták. Ebből az a következtetés volt levonható, hogy a papillaris komponenst hordozó anaplasticus daganatok feltehetőleg BRAF mutációt hordozó papillaris carcinomákból alakulhattak ki (16). A különböző szövettani típusú pajzsmirigy daganatok egymásba történő átalakulásában szerepet játszó gének a 2. ábrán olvashatóak. 8
ADENOMA HYPERFUNKCIÓS GÖB RAS RAS THYROCYTA FOLLICULARIS CARCINOMA RAS?, TRK PAPILLARIS CARCINOMA (RET/PTC -) P53, BRAF ANAPLASTICUS CARCINOMA P53, BRAF PAPILLARIS CARCINOMA (RET/PTC +) 2. ábra mutatja a daganatok kialakulásának feltételezett útját, illetve a már több vizsgálattal bizonyított genetikai eltérések lehetséges szerepét. 1.3.2. A pajzsmirigy carcinoma epidemiológiája A pajzsmirigy carcinoma incidenciája 1,2-2,6/100000 férfiakban és 2,0-3,8/100000 nőkben (17). A mortalitási arány 0,2-1,2/100000 férfiakban és 0,4-2,8/100000 nőkben. A legtöbb országban a morbiditási adatokhoz hasonlóan a mortalitási arány is kétszer nagyobb nőkben, mint férfiakban. A pajzsmirigyrák okozta mortalitás az általános daganatos halálozás kevesebb, mint 1 százalékáért felelős (18,19). Az egyes országok között a pajzsmirigyrák prevalenciájában jelentős különbségek vannak. Mintegy kétszer nagyobb az incidencia Izlandon és Hawaii-on, összehasonlítva az észak-európai országokkal, Kanadával, az Egyesült Államokkal és Izraellel. Az ok egyenlőre nem ismert, de egy lehetséges magyarázat lehet, hogy az előbbi két szigeten szakszerűbb, illetve könnyebben megvalósítható a daganatok regisztrálása. Ahogy az előbbiekben említésre került, a legnagyobb incidencia Hawaii-on észlelhető, elsősorban a kínai férfiak és a filippino nők között; továbbá Hawaii-on az incidencia minden etnikai csoportban magasabb, mint az adott etnikai csoport földrajzi származási helyén (20). Kolonel és munkatársai egy másik, Hawaii-on végzett vizsgálatban a 9
pajzsmirigyrák kockázatának 60%-os emelkedését észlelték a legtöbb jódot fogyasztók körében; ugyanakkor a kontrollcsoporthoz képest a különbség nem volt szignifikáns (21). Az Egyesült Államokban a pajzsmirigy carcinoma sokkal gyakoribb az európai rasszhoz tartozó férfiak és nők között, mint az afro-amerikaiak és latin-amerikaiak között. Az Egyesült Államokban élő japánok és kínaiak között kétszer nagyobb a pajzsmirigyrák előfordulása, mint a származási országukban. A különbségekért feltehetőleg különböző környezeti faktorok, étkezési szokások tehetők felelőssé (22). A pajzsmirigy carcinoma ritka 16 év alatti gyermekekben, ahol az incidencia 0,02-0,3/100000. A daganat csak kivételesen fordul elő 10 éves kor előtt. Felnőttekben az incidencia az életkorral előrehaladva nő. Nőkben az incidencia 16-40 év között folyamatosan emelkedik, amit egy plató szakasz követ, majd az incidencia férfiak és nők között 75-79 év között kiegyenlítődik. A medián életkor a daganat kialakulásakor a legtöbb tanulmányban 45 és 50 év között van. A pajzsmirigyrák-incidencia női/férfi aránya pubertás előtt és menopauzát követően 1, a többi esetben 2-4 között változik. Mindez felveti a nemi hormonok esetleges szerepét a daganat kialakulásában, ugyanakkor a számos epidemiológiai vizsgálat ellenére, a pajzsmirigy rák nőkben mért magasabb incidenciájának oka továbbra is ismeretlen (7). Egy vizsgálat alapján a papillaris carcinoma kockázata idősebb, de még fogamzóképes életkorban csökken, a follicularis carcinomáé azonban emelkedik (23). Más vizsgálatban azonban nem észleltek összefüggést az incidencia és a reproduktív kor vagy az irreguláris nemi ciklus között (18,24). Néhány vizsgálat a szülések számának emelkedésével arányosan az incidencia mérsékelt növekedését mutatta. 35 éves kor alatt a radioaktív sugárzás indukálta daganat kockázata a terhességek számával arányosan növekszik (23,24). Az ösztrogént és progeszteront kombináltan tartalmazó orális fogamzásgátlók, valamint a menopauza kezelésére adott ösztrogént tartalmazó készítmények használata egy klinikai vizsgálatban nem növelte a pajzsmirigy carcinoma kockázatát (24). A pajzsmirigy göbök ugyan gyermekekben és fiatal felnőttekben ritkák, de ezek között a malignus elváltozások aránya nagyobb (25). Bizonyos vizsgálatok azt mutatják, hogy gyakran diagnosztizálnak strúmát malignus pajzsmirigy daganat felfedezése előtt (18,26). Ez az összefüggés egy lehetséges etiopatogenetikai kapcsolatot feltételez, ugyanakkor a benignus eltérések vizsgálata, nyomonkövetése elősegíti az esetleges roszindulatú daganatok felismerését is. A solitaer 10
és multiplex pajzsmirigy göbökben a malignitás aránya azonos (27). Malignus pajzsmirigy göbök gyakoribbak Graves -Basedow kóros betegek mintáiban, ugyanakkor Hashimoto thyreoiditisben ez az arány ritkább (28,29). Hashimoto thyreoiditisben ugyanakkor a pajzsmirigy lymphomája gyakrabban alakulhat ki. Sporadikusan pajzsmirigyrák előfordulása figyelhető meg veleszületett golyvás betegekben, ami felveti a tartós és egyenletes TSH stimuláció daganatkialakulást elősegítő hatását (7). Horn-Ross és munkatársai közleményében (30) a daganatkialakulást szignifikánsan elősegítő tényezőknek a következőket találták: 1. a fej és a nyaki terület besugárzása több, mint 5 évvel a diagnózis előtt (odds ratio [OR] 2,7; 95%-os confidencia intervallum [95% CI]: 1,2-6,2) 2. göbös strúma töb, mint 2 évvel a diagnózis előtt (OR 4,7; 95% CI: 3,1-7,2) 3. családi anamnézisben előforduló: a. pajzsmirigy rák (OR 6,1; 95% CI: 1,8-21,3) b. göbös strúma (OR 2,6; 95% CI: 1,7-4,2) c. hyper vagy hypothyreosis (OR: 1,5; 95%CI 1,0-2,3) 1.3.3. Környezeti faktorok, elsősorban a jód hatása a pajzsmirigy carcinoma kialakulásában A pajzsmirigy göbök prevalenciája magasabb, a göbök malignitási aránya alacsonyabb azokban az országokban, ahol jódhiány áll fenn, mint azokban az országokban, ahol a jódellátottság megfelelő. Azokon a földrajzi területeken, ahol endémiás golyva észlelhető a follicularis és az anaplasticus szövettani típusú daganatok relative gyakoribbak, mint a papillaris daganatok, összehasonlítva azokkal a területekkel, ahol megfelelő a jódfelvétel. A jódprofilaxis azonban módosíthatja a különböző szövettani típusú daganatok előfordulása közötti arányt (27,31). A jódprofilaxis bevezetését követően Argentinában a papillaris:follicularis carcinoma aránya 2,5:1-ről 6,2:1 re emelkedett. Svájcban hasonló változások voltak kimutathatóak (32,33). Dél- Lengyelországban a jódprofilaxis bevezetése előtt 1986-ban a papillaris:folliclularis carcinoma aránya 1,0 körül volt, a jódprofilaxis bevezetését követően 2001-re az az arány 5,9-ig emelkedett (34). Ez az állítás összhangban van azokkal a kutatási 11
eredményekkel, amelyek szerint a papillaris carcinoma prevalenciája az emelkedett jódellátottságú területeken magasabb (35). Az 1960-as években és később az 1990-es években végzett állatkisérletek azt mutatták, hogy az alacsony jódtartalmú diéta mellett a kisérleti állatokban túlnyomórésztfollicularis típusú daganatok alakultak ki. A daganatok kialakulását a TSH túlstimulálásával magyarázták (36). A jódellátottság és a pajzsmirigyrák kapcsolatára végzett vizsgálatok nehezen összehasonlíthatóak, különösen azért, mert a tartós jódellátottságot a vizsgálatok nagy részében nem mérték pontosan. Ez alól kivételnek számít Horn-Ross nőkön végzett, 1 évig tartó prospektív vizsgálata, ahol a tartós jódfelvételt precízen meghatározták (30). Itt többek között a lábujjköröm jódtartalma alapján határozták meg a vizsgálatot megelőző fél évben felvett jód mennyiségét. A legtöbb vizsgálatban a magas jódbevitelt a jelentős mennyiségű halfogyasztással magyarázzák. Mindezek miatt a vizsgálók különös figyelmet fordítottak a halfogyasztásra is, és különböző alcsoportokat képeztek (pl: kagylók-rákok-; tengeri halak-; édesvízi halak-; konzerv tonhal-; halsaláta/sózott hal fogyasztása). A felsoroltak közül nem szignifikánsan növelte a papillaris pajzsmirigyrák kockázatát: 1. a napi 7,5g-nál nagyobb édesvízi halfogyasztás (OR 1,1; 95% CI: 0,74-1,7) 2. a napi 0,3g-nál több 2g-nál kevesebb sózott hal fogyasztása (OR 1,3; 95% CI: 0,77-2,3) szignifikánsan növelte a papillaris pajzsmirigyrák kockázatát: 1. a napi 3,5g-nál nagyobb tonhalkonzerv-fogyasztás (OR 1,5; 95% CI: 1,0-2,1) [határérték szignifikancia] 2. a napi 2g-nál nagyobb sózott hal fogyasztása (OR 2,3; 95% CI: 1,3-4,0) A többi esetben gyakorlatilag nem volt kockázatnövekedés. A napi jódellátottság alapján számolva ugyanakkor csak a nagy kockázatú csoportban (azaz korábbi fejnyak besugárzás, korábbi göbös golyva, pajzsmirigy daganatos betegség a családi anamnézisben) volt kimutatható nem szignifikáns- növekedés a daganat kockázatában 324μg/nap feletti jódbevitel esetén (OR: 1,5; 95%CI: 0,68-3,2). A többi esetben a jelentősebb jódbevitel nem növelte a pajzsmirigyrák kialakulásának kockázatát. A vizsgálat további érdekessége volt, hogy ugyanez a jódbevitel az alacsony kockázatú csoportban közel szignifikánsan, mintegy harmadával csökkentette a pajzsmirigyrák 12
előfordulási kockázatát (OR: 0,68; 95%CI: 0,44-1,0). A vizsgálatból konklúzióként az volt levonható, hogy a megfelelő mennyiségű jódfelvétel nem kockázatnövelő, illetve inkább kockázatcsökkentő tényező a pajzsmirigyrák kialakulásában. Ebben a vizsgálatban az alacsony jódfelvételben részesülőkhöz hasonlították a többi csoportot, és azt a következtetést vonták le, hogy feltehetőleg a tartósan magas TSH stimuláció miatt- az alacsony jódellátottság, az elsősorban follicularis szövettani típusú pajzsmirigyrák kialakulásának egyik fő kockázati tényezője (30). A jód patogenetikai szerepének teóriája azokon a területeken, ahol a pajzsmirigyrák prevalenciája, továbbá a jódfelvétel magas, és a golyva nem endémiás (Hawaii és Izland) megdőlni látszik, ugyanakkor más környezeti faktorok, például a fokozott vulkanikus tevékenység miatt az ivóvízben és az élelmiszerekben megjelenő egyéb ásványi anyagok patogenezisben betöltött szerepe feltételezhető (37). Ezt támasztaná alá az az olasz vizsgálat is, ahol a pajzsmirigyrák incidenciája a jódhiányos területen kétszer akkora volt, mint megfelelő jódellátottságú régióban (27). A pajzsmirigyrák patogenezisében esetlegesen szerepet játszó anyagok közül a szelén az utóbbi időben az egyik leggyakrabban vizsgált nyomelem. Egy lengyel vizsgálatban a legalacsonyabb szelénkoncentrációt a pajzsmirigyrákos-szövetben, a legmagasabbat a Graves betegségben és a noduláris golyvás betegek pajzsmirigyében mérték. A legmagasabb szérum szelénkoncentráció az egészségeseknél volt mérhető (38). A táplálékkal felvett, többnyire növényi eredetű anyagok (az úgynevezett endokrin disruptorok), mint például a szójában található genistein befolyásolhatják a pajzsmirigyhormon szintézisét és ez különböző diszfunkciókhoz vezethet. Erre egy közel 50 éves klasszikus kisérlet illetve megfigyelés hívta fel a figyelmet, amikor a szójatejjel táplált csecsemőknél golyva alakult ki (39). A későbbi vizsgálatok igazolták, hogy a genistein a hatását az ösztrogén receptorokon fejti ki, és gátolja a pajzsmirigy peroxidáz (TPO) működését is (40). Az endokrin disruptorok regulációs hálózaton keresztül a pajzsmirigyhormon metabolizmus lépéseit, például az T4-T3 átalakulást végző 1. típusú dejodináz működését is megzavarhatják (41). Itt említeném meg röviden azt az experimentális vizsgálatot, amit Josef Köhrle professzor munkacsoportjában (Institut für Experimentelle Endokrinologie Charité, Berlin) végeztem. A malát-enzim aktivitását mértem részben malát enzim assay-jel, részben a malát enzim mrns szintjének real-time PCR-ral történő vizsgálatával különböző, természetes és szintetikus 13
endokrin disruptorokal kezelt patkányok májában. (A malát enzim a pajzsmirigy hormon hatás egyik jól ismert, és kisérleti munkában gyakran használt végpontja (42)). Az endokrin disruptorok közül a 4-nonylphenol (műanyagok és szintetikus lakkok alkotórésze), és az octyl-methoxycinnamate (naptejek, testápolók alkotórésze) stimulálta a malát enzim működését. A szójatartalmú diéta csökkentette a malátenzim aktivitását és a T4 szintjét is. A 4-nonylphenol ugyanakkor emelte a T4 szintjét. A munkacsoport többi tagja által végzett vizsgálatok igazolták, hogy minden alkalmazott endokrin disruptor csökkentette az 5 dejodináz aktivitását, különösen a nőstény patkányokban. Konklúzióként azt mondhattuk, hogy az endokrin disruptorok megzavarhatják a pajzsmirigyhormon szabályozását, de a pontos mechanizmus nagyon bonyolult és részletes felderítése még tisztázásra vár. A kisérletsorozat leírása közlemény formájában a Toxicology folyóiratban 2004-ben megjelent (43). Az előbbiekből következően tehát nem kizárt, hogy pajzsmirigyhormon-szintézis szabályozásának endokrin disruptorok általi megzavarása (pl. a TSH szint befolyásolása által) akár a karcinogenezis bizonyos lépéseit is stimulálhatja. Az előbbiekben leírtak alapján a környezeti faktorok, közöttük a jód szerepének tisztázása a pajzsmirigy daganatok kialakulásában a biológiai kutatások egyik fontos területe. 1.4. A pajzsmirigy microcarcinoma 1.4.1. Definíció Mikrocarcinomának nevezzük azokat a pajzsmirigy daganatokat, amelyek a szövettani tulajdonságokat tekintve eleget tesznek az 1.3.1. fejezetben leírt kritériumoknak, legnagyobb átmérőjük nem haladja meg az 1 cm-t (44). Az ultrahang vizsgálatok bevezetése előtt az 1 cm-nél kisebb tumorok rejtve maradtak, legtöbbször csak akkor kerültek felfedezésre, amikor a beteg valamilyen más pajzsmirigy-betegség miatt műtétre került. Ezeket az elváltozásokat occult daganatoknak nevezték, azonban helyesebb ezen elváltozásokat microcarcinomáknak nevezni. Néhány szerző látens carcinoma névvel illeti ezeket a tumorokat (45). 14
1.4.2. A pajzsmirigy microcarcinoma epidemiológiája és jódellátottságtól való függése irodalmi adatok alapján A pajzsmirigy microcarcinomái a rendelkezésre álló autopsziás szűrővizsgálatok eredménye alapján 4,5-35,6%-os gyakorisággal fordulnak elő, ami a klinikai tüneteket adó pajzsmirigy carcinomák incidenciájánál 100-1000-szer nagyobb. A microcarcinomák valós előfordulási arányát a válogatás nélküli autopsziás mintákból lehet a legjobban megbecsülni, ugyanis a műtéti anyagból származó microcarcinomák leggyakrabban göbös vagy diffúz strumákból származnak, így a strumát okozó környezeti faktorok a microcarcinomák előfordulását is befolyásolhatják. Az 1974 és 2001 közötti szakirodalmi közlemények alapján elvégzett metaanalízis fontos információkat adott a jódellátottságot illetően: jódhiányos területen 6.21%-os-, jódban gazdag területen 16,48%-os prevalencia volt látható (1a. táblázat). 15
1a. táblázat. Autopsziás mintákban észlelt microcarcinomák prevalenciájának metaanalízise a jódellátottságtól függően. metodika földrajzi régió microcarcinoma / autopsziás minta szerző év jódellátottság prevalencia Balázs Gy (46) 1974 - g Debrecen, 9/200 4.5% Magyarorszá Sampson RJ et 1974 - g Minnesota,USA 9/157 5.7% al (47) + g Hiroshima- 196/1096 17.9% Nagasaki, Japán Fukunaga FH 1975 - t Cali-Medellin, 34/607 5.6% et al.(48) Kolumbia + t Hawaii, japán 60/248 24.2% populáció - t Ontario, Kanada 6/100 6.0% - t Gliwice, Lengyelország 10/110 9.1% + t Sendai, Japán 29/102 28.4% Sobrinho- 1979 - g Oporto, 40/600 6.6% Simoes et al. (49) Portugália Bondeson et 1981 + g Malmö, 43/500 8.6% al.(50) Svédország Harach R.et al. 1985 + g Finnország 36/101 35.6% (51) Lang Wet al. 1987 - g Hannover, 63/1020 6.2% (52) Németország Ottino A et al. (53) 1989 + t La Plata, Argentína 11/100 11.0% Yamamoto Y et al. (54) Neuhold N et al. (55) 1990 + g Tokushima, Japán 2001 - t Bécs, Horn, Ausztria 46/408 11.3% 10/118 8.5% jódellátottság: + : jódban gazdag; - jódban szegény; metodika: g: csak a gyanús pajzsmirigy szelet került beágyazásra és festésre; t: teljes pajzsmirigy beágyazásra és festésre került A microcarcinomák prevalenciáinak összehasonlítását nehezíti, hogy a legtöbb vizsgálatot gazdag jódellátottságú területen, japán, azaz ázsiai populációban, a jódhiányos területen végzett szűrővizsgálatokat a kaukázusi rasszhoz tartozókon végezték. A kutatási metodikák sem voltak egységesek: a vizsgálatok egy részében 16
(Balázs és mtsai, Sampson és mtsai, Sobrinho-Simoes és mtsai, Bondeson és mtsai, Harach és mtsai, Lang és mtsai, Yamamoto és mtsai [46,47,49,50,51,52,54]) a formalinban fixált pajzsmirigyeket 2-3mm-es szeletekre vágták, majd csak a lupéval körülírt malignus elváltozásra gyanúsnak vélt szeleteket ágyazták be paraffinba és haematoxylin-eozin festés után ezeket mikroszkóppal vizsgálták. A jódellátottságot nem figyelembe véve ezzel a technikával 10,20%-os microcarcinoma prevalencia volt észlelhető. A vizsgálatok másik csoportjában (Fukunaga és mtsai, Ottino és mtsai, Neuhold és mtsai [48,53,55]) az összes szeletet beágyazták, így praktikusan a teljes pajzsmirigyet megvizsgálták mikroszkóppal is; ezzel a metodikával 13,19%-os prevalencia volt kimutatható. A hasonló metodikát alkalmazó csoportok eredményeit összevetve a következő eredményt kaptuk (1b táblázat): 1b táblázat. Microcarcinomák összesített prevalenciájának összehasonlítása azonos metodikák alapján, különböző jódellátottságú területek között metodika jódhiányos területen jódgazdag területen szignifikancia (χ 2 teszttel) teljes pajzsmirigy feldolgozásra került 60/935 (6,4%) 146/858 (17,0%) p<0,0001 csak a gyanús pajzsmirigyszeletek kerültek beágyazásra 121/1977 (6,1%) 321/2105 (15,2%) p<0,0001 A két metodika közti különbség meghatározása azonos jódellátottságú területen (χ 2 teszttel) p=0,75 p=0,22 Az adatokat összefoglalva több következtetés is levonható: 1. A metaanalízis adatok alapján, a jódban gazdag területen az autopsziás mintákban mért microcarcinoma prevalencia, szignifikánsan magasabb, mint jódhiányos területen; ez a különbség a metodikától független. 2. Azonos jódellátottságú területen a különböző metodikákkal mért microcarcinoma prevalenca nem különbözik szignifikánsan egymástól; azaz a teljes pajzsmirigy szövettani feldolgozása lényegesen nem emeli a felismerésre került microcarcinomák számát. 17
Mindezek alapján ugyan úgy tűnik, hogy a jódellátottságnak a pajzsmirigy microcarcinomák előfordulását befolyásoló hatása nem kérdéses, ugyanakkor ennek nagy biztonsággal történő igazolására lehetőleg egy földrajzi régióban, etnográfiailag egységes populációban kell az autopsziás szűrővizsgálatot elvégezni úgy, hogy az egyes szubpopulációk csak a jódfelvételben különbözzenek egymástól. Ilyen vizsgálatot eddig nem végeztek. Magyarországon, az alföldi artézi kutak magas jódtartalma illetve a budapesti ivóvíz relatív jódszegénysége miatt, viszonylag kis távolságra egymástól, etnográfiailag közel homogén populációban vizsgálható a pajzsmirigy microcarcinoma előfordulása, ahol az egyes alcsoportok között a környezeti faktorok közül csak az ivóvizek átlagos jódtartalmában van különbség (ld. 1.2. fejezet). Más tényezőkkel azért nem kell számolni, mert Magyarországon nincs kötelező jódprofilaxis; a tej, a kenyér vagy a takarmány kötelező jódozása sem került bevezetésre. A háztartásokban elérhető jódozott konyhasó használata sajnos még nem általános, vizsgálatunk szempontjából a hatása nem jelentős. 1.4.3. A pajzsmirigy microcarcinoma biológiai tulajdonságai, prognózist befolyásoló tényezői Az incidentálisan felfedezésre került pajzsmirigy microcarcinomák diagnosztikájáról és kezelési stratégiáiról az Orvosképzés 2001. évi 3. számában közöltem összefoglalót, így ennek részletezésétől eltekintek (56). Egy 1993-2001 között végzett japán követéses vizsgálat eredményei alapján alkothatunk képet a microcarcinomák prognózisáról. Ebben a vizsgálatban 732 betegnél ultrahang vezérelt aspirációs cytológiai vizsgálattal igazolták az 1cm-nél nem nagyobb papillaris daganat jelenlétét. 162 beteg került az obszerválandó csoportba. Itt a követési idő alatt 70%-nál vagy nem változott vagy csökkent a daganat mérete. 10,2%-ban a daganat mérete több, mint 10mm-rel nőtt. Nyaki nyirokcsomó metastasis alakult ki a betegek 1,2%-ánál. 570 betegnél sebészi beavatkozás mellett döntöttek; ehhez a csoporthoz hozzátettek még 56 beteget az obszervációs csoportból. Az így létrejött 626 fős csoportban 594 esetben történt nyaki nyirokcsomó blokkdisszekció, és ebből metastasis volt igazolható 50,5%-ban, multifokális tumort észleltek 52,8%-ban. 2,7%- ban volt észlelhető a daganat kiújulása a műtét után 5 éven belül, és 5,0%-ban 8 éven 18
belül. A kutatócsoport arra következtetésre jutott, hogy papillaris microcarcinománál - még multifokalitás esetén is- a daganat csekély progresszióhajlama miatt obszerváció a választható kezelési stratégia (57). A prognózist, illetve a mortalitást meghatározó legfontosabb faktorokról a Mayo Klinika klinikai pajzsmirigyrákra vonatkozó adatbázisa alapján lehet nyilatkozni. Csökkenő fontossági sorrendben leginkább a következő faktorokat befolyásolják a prognózist: - hisztológiailag grade>2 (Broder féle klasszifikáció a sejtmag és citoplazma atypia valamint a mitotikusan osztódó magok alapján), - távoli metastasis, pajzsmirigyen kívüli terjedés, - a daganat mérete > 4 cm, - > 50 éves életkor, - férfi nem. A daganat mérete tehát egy fontos prognosztikai faktor, ami microcarcinoma esetén a definícióból adódóan- kedvező kimenetelt feltételez. Bizonyos vélekedések szerint a nyirokcsomó metastasis az agresszív viselkedésű, rossz prognózisú daganatok esetén fordul elő. (58). A prognózist -a kezelési stratégiákon túl- számos molekuláris genetikai eltérés is befolyásolhatja. A klinikai papillaris pajzsmirigy daganatokban előforduló egyik legismertebb eltérés a RET protoonkogén úgynevezett rearrangementje. A RET egy membrán receptor tirozinkinázt kódol és a pajzsmirigy parafollicularis C sejtjeiben erőteljesen expresszálódik. A RET-ben bekövetkező pontmutációk a sporadikus medullaris carcinoma, illetve az öröklött familiaris medullaris carcinoma, a multiplex endokrin neoplasia 2A és 2B típusaiban jelentkeznek (59). A RET aktiváló rearrangement mutációiból eddig 10 került felismerésre; ezek a papillaris pajzsmirigy carcinomák 2-80%-ban fordulnak elő (60). Egy vizsgálatban a papillaris microcarcinomákban a RET/PTC rearrangement 1,2,3 77%-ban fordult elő, ugyanakkor a klinikai tüneteket adó papillaris carcinomákban ez az arány csak 47% volt (p<0,005). Feltételezhető, hogy a RET/PTC rearrangement a daganat kialakulás egyik első lépése. A RET/PTC rearrangement magas incidenciája a microcarcinomákban alacsony proliferációs index-szel jár együtt. Ezzel ellentétben a nagyobb elváltozások és az agresszívabb daganatok a rearrangement 19
elvesztésével járnak. Érdekes megfigyelés, hogy a multifokális microcarcinomák csak mintegy 38%-ban észlelhető ugyanaz a RET/PTC rearrangement típus az egyes gócokban, ezért az feltételezhető, hogy a többgócú daganatok többnyire nem ugyanabból a klónból származnak, hanem de novo keletkeznek (61-63). Khoo és munkatársai vizsgálták a metastasist adó incidentálisan felfedezett microcarcinomák cyclin D1 protein expresszióját. A cyclin D1 overexpresszió korrelált a microcarcinomák metastatizáló képességével (64). A cyclin D1 szerepét és az említett vizsgálatot az 1.5.2. és az 1.5.3. fejezetekben részletezem. Eddig csak az incidentálisan felfedezett microcarcinomákon (azaz strúmaműtét során a rutin hisztopatológiai eljárások alatt talált), vagy tüneteket adó kis méretű pajzsmirigy daganatokban történt a molekuláris-genetikai tulajdonságok vizsgálata. Autopsziás mintákon végzett ilyen jellegű vizsgálatok a szakirodalomból nem ismertek, jóllehet ezeken a mintákon lehet talán a legtisztábban, egyéb hatásoktól mentesen vizsgálni a microcarcinomák kialakulását és biológai tulajdonságait. Ugyancsak nem vizsgálták eddig a jódnak a pajzsmirigy microcarcinomák keletkezésére kifejtett esetleges hatását egy földrajzi régióban, etnográfiailag közel homogén populációban. 1.5. A cyclin D1 biológiai szerepe 1.5.1. A cyclin D1 tulajdonságai és élettani funkciója A normális emberi sejtciklus számos, jól meghatározható lépésből áll. Az S fázisban a DNS replikáció zajlik, az M fázisban a sejt osztódása, a mitózis megy végbe. Az egyes fázisok közötti összekötő lépcsőt a G1 és G2 (gap) fázis adja. A fiziológiás sejtciklus egyik legfontosabb ellenőrzési pontja a G1 fázisban van. A G1 fázisban van a START pont, amikor eldől, hogy a sejt belép-e egy újabb sejtciklusba vagy sem. A korai G1 fázisban a D típusú cyclinek, míg a késői G1 fázisban az E típusú cyclinek játszanak szerepet a folyamatok koordinálásában. A cyclin D1 protein egy holoenzim regulációs alegysége, feladata a retinoblastoma (Rb) tumorszuppresszor fehérje foszforilálása és egyben inaktiválása. A cyclin D1 legfontosabb heterodimer partnerei a cyclin dependens kináz-4 és -6 (CDK4/6). A Rb tumorszuppresszor fehérje szerepe elsődlegesen az, hogy a G1/S fázis határán meggátolja a sejtciklus továbbhaladását, így 20
a sejt osztódása megáll. A cyclin dependens kinázok hatására a Rb fehérje foszforilálódik (egyben inaktiválódik), a sejtciklus a következő S fázisba lép. A foszforilált Rb fehérjét alacsony molekulasúlyú fehérjecsaládba tartozó enzimfehérjék (cyclin dependens kináz inhibitorok, [CDKI]) gátolják, azaz a foszforilált Rb fehérje defoszforilálódik és ismét képes betölteni ezen az ellenőrzőponton a sejtciklust gátló szerepét (3. ábra). (65,66) G0 fázis START G1 fázis Cyclin D1 (CDK4/6) M fázis Rb fehérje (P) Rb fehérje CDK inhibitorok (P) Rb fehérje sejtciklus gátlása G2 fázis S fázis 3. ábra. A sejtciklus a cyclin D1 és a Rb fehérje kapcsolata. Az ábra részletes magyarázata a szövegben olvasható. A nyugalomban levő sejtekben a cyclin D1 szintje alacsony. A sejtmagban jelentkező cyclin D1 szint emelkedés azt jelenti, hogy a sejt átlép a G1 fázisból az S fázisba. A cyclin D1 egy 35kDa méretű protein, génje a 11. kromoszóma q13 lokuszán helyezkedik el. A fehérjét 5 exon kódolja és a protein jelentős homológiát mutat más cyclinekkel. A fehérje amino-terminális vége egy leucin-x-cisztein-x-glutamát mintázatot mutat, ahol az X különféle aminosavat jelez; ez a terület felelős a Rb proteinhez történő kötődésért (ez a rész számos virális onkogénnel mutat hasonlóságot). A cyclin D1 meglehetősen instabil fehérje, fél-életideje kevesebb, mint 20 perc. 21
A cyclin D1 overexpressziója számos daganatban kimutatható, így az emlő-, nyelőcső-, máj-, fej/nyaki régió különféle laphám daganataiban és melanoma malignumban is (65). 1.5.2. Cyclin D1 overexpresszió endokrin daganatokban Az egyik legismertebb cyclin D1-gyel kapcsolatos elváltozás a mellékpajzsmirigy adenomáiban mutatható ki. Itt a parathormont (PTH) kódoló PTH gén promoter régiója a 11. kromoszómán pericentromer inverzió miatt a cyclin D1 gén promotere mellé kerül. A cyclin D1 overexpresszió az egyik leggyakoribb, típusos eltérés mellékpajzsmirigy adenomákban, az esetek mintegy 18%-ban észlelhető (67). PTH gén Cyclin D1 promoter 3 PTH promoter 5 Cyclin D1 gén 11q13 5 +3 4. ábra. A parathormon (PTH) gén promoter régiójának és a cyclin D1 gén promoter régiójának pericentromer inverziója mellékpajzsmirigy adenomákban. A cyclin D1 gén promotere 3 pozícióban kapcsolódik a PTH gén reguláló régiójához (65). Hypophysis adenomákban és mellékvese daganatok keletkezésében a cyclin D1 fontos szerepet játszik. (65). Az ovarialis és testicularis daganatokban kimutatható a cyclin D1 (és cyclin D2) overexpressziója (68). Számos vizsgálat foglalkozik a cyclin D1 overexpresszió és a pajzsmirigy papillaris carcinoma kapcsolatával. Bizonyos vizsgálatok a cyclin D1-et -más sejtciklusszabályozó fehérjékhez hasonlóan- a pajzsmirigy daganat független, prognosztikai paraméterének tartják (69). Egy immunhisztokémiai vizsgálatban a jól differenciált pajzsmirigyrákokban 39/122 esetben volt cyclin D1 pozitivitás, míg follicularis adenomákban csak 1/33 esetben (p<0,05) (70). Egy másik vizsgálatban a papillaris daganatokban 28/40 esetben, az anaplasticus daganatokban 28/32 esetben volt cyclin D1 22
overexpresszió kimutatható (71). Egy dél-koreai vizsgálatban 79,2%-os volt a cyclin D1 pozitivitás papillaris carcinomában (72). Khoo és munkatársai a cyclin D1 mellett a p27 tumor szuppresszor gén expresszióját is vizsgálták. A p27gén által kódolt fehérje egy cyclin dependens kináz (CDK) inhibitor, gátolja a cyclin D1/CDK komplex működését a G0 és G1 fázisban; ami így meggátolja a Rb fehérje inaktiválódását, azaz meggátolja a G1/S fázis átmenetét. A normális follicularis sejtek erős p27 immunhisztokémiai pozitivitást mutatnak, míg az expresszió csökkent hyperplasticus és neoplasticus pajzsmirigy göbökben. A vizsgálatban azt az eredményt kapták, hogy a daganatok 63,2% expresszálta a cyclin D1-t, az egyes alcsoportok közül szignifikánsan nagyobb arányban azok, amelyeknél nyirokcsomó metastasis is jelentkezett; ugyanakkor a p27 gén expressziójának szignifikánsan alacsonyabb szintje volt észlelhető a metastatizáló pajzsmirigy carcinomákban. A szerzők a vizsgálatok eredményéből azt a következtetést vonták le, hogy a p27 gén expressziójának csökkenése, valamint a cyclin D1 overexpressziója együttesen a papillaris carcinoma nyirokcsomóáttét-képzésének független prediktív faktora (73). 1.5.3. Cyclin D1 overexpresszió pajzsmirigy microcarcinomákban Khoo és munkacsoportjának közleményében 22, pajzsmirigy műtét kapcsán incidentálisan felfedezett metasztatizáló papillaris microcarcinoma közül 20 esetben (90,9%) volt immunhisztokémiailag erős intenzitású cyclin D1 pozitivitás kimutatható. Az incidentálisan felfedezésre került, nem metasztatizáló 34 microcarcinoma közül mindössze 3 daganat (8,8%) mutatott pozitivitást. A különbség szignifikáns volt (p<0,001) (64). A cyclin D1 expressziót autopsziás mintákból származó pajzsmirigy microcarcinomákon még nem vizsgálták, ami pedig feltételezésünk szerint a carcinogenezis első lépéseiről adna információt, illetve a daganatképződés egyedi útját mutatná egy egyébként gyakorlatilag intakt (nem strúmás, klinikailag nem hyper- vagy hypothyreotikus) pajzsmirigyben. 23
2. CÉLKITŰZÉSEK 2.1. A pajzsmirigy microcarcinoma epidemiológiája Vizsgálatunk első részében autopsziás mintákból szűrővizsgálatot végeztünk a microcarcinomák prevalenciájának megismerésére. A vizsgálatokból a következő kérdésekre kerestük a választ: - Mekkora a pajzsmirigy microcarcinoma prevalenciája a magyar populációban? - Hogyan befolyásolja a jódellátottság a pajzsmirigy microcarcinomák prevalenciáját egy földrajzi régióban, közel homogén etnográfiai populációban elő embereken. - Hogyan függ a microcarcinomák megjelenése a kortól és a nemtől? - Milyen a szövettani megoszlás a microcarcinomák között? - Befolyásolja-e a strúma megjelenése a microcarcinomák számát? 2.2. Autopsziás mintában észlelt pajzsmirigy microcarcinomák cyclin D1 expressziójának vizsgálata. Kérdésfeltevések: - Milyen a cyclin D1 expresszió aránya autopsziás mintákból származó microcarcinomákban? - Klinikai tüneteket adó daganatokkal összehasonlítva levonható-e valamilyen következtetés a cyclin D1 pozitivitás és a daganat progressziója, illetve a microcarcinomák biológiai tulajdonságára vonatkozólag? 24
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Microcarcinomák epidemiológiai vizsgálata autopsziás mintában Vizsgálatunk első része a pajzsmirigy microcarcinomák prevalenciájának meghatározására szolgáló szűrővizsgálat volt. A pajzsmirigy mintákat négy kórházból gyűjtött válogatás nélküli autopsziákból nyertük. Két város (Szolnok és Karcag) Jász- Nagykun-Szolnok megyében található, aminek jelentős része jódban gazdag (JG) területnek minősül. A másik két kórház budapesti (Szent János Kórház, Országos Gyógyintézeti Központ), ezen kórházak ellátási területei relative jódszegény (JSZ) régiónak számítanak. A minták gyűjtéséhez a szükséges etikai engedély (Országos Gyógyintézeti Központ, Regionális Etikai Bizottság) rendelkezésre állt. Munkacsoportunk korábban már vizsgálta ezen régiókban, ápolási otthonokban élő idősek átlagos jódürítését. A vizsgálat részletezése az 1.2. alfejezetben olvasható (6). A JG és JSZ alcsoportok meghatározásánál tehát ezen eredményeket vettük figyelembe, ugyanis az elhunytak egyedi utólagos vizelet jód ürítésének meghatározása nem volt kivitelezhető. Az irodalmi adatok metaanalízise alapján különbség volt feltételezhető a microcarcinomák prevalenciájában a jódellátottság alapján. Mint az az 1a és 1b. táblázatokban, valamint az 1.4.2. fejezetben olvasható a JG területen 16,48%-os, míg a JSZ területen 6,21%-os microcarcinoma prevalencia volt feltételezhető. Ezek alapján 148-148 autopszia gyűjtésével kalkuláltunk mindkét régióban a statisztikailag szignifikáns (p<0,05) és 80%-os statisztikai power eléréséhez. Az esetlegesen kisebb microcarcinoma prevalencia lehetőségével számolva előzetesen legalább 220-220 minta gyűjtését terveztük. Összesen 222 pajzsmirigy került eltávolításra a JSZ területen. Ez 109 férfi (átlagéletkor 72,4 év, medián életkor 76 év, minimum 36 év és maximum 91 év) és 113 nő (átlagéletkor 71,7 év, medián életkor 74 év, minimum 33 év és maximum 94 év) mintáját jelenti. JG területen összesen 221 pajzsmirigy került eltávolításra. Ez 132 férfi (átlagéletkor 66,0 év, medián életkor 68 év, minimum 26 év és maximum 95 év) és 89 nő 25
(átlagéletkor 67,2 év, medián életkor 68 év, minimum 21 év és maximum 89 év) mintájából állt. Az esetek egyikénél sem volt ismert pajzsmirigybetegség. Minden esetben eltávolításra került a teljes pajzsmirigy, majd az eltávolítást követően 10%-os pufferolt formalinban fixálást végeztünk. A fixálást követően feljegyeztük a pajzsmirigy méretét, a nem-tumoros pajzsmirigy göböket, majd Bondeson metodikáját (50) követve 1-2mm-es szeleteket készítettünk. A látható körülírt göbös elváltozások feljegyzésre kerültek. Bondeson metodikáját némileg módosítva minden egyes szelet mindkét oldalát sztereomikroszkóppal 20x-os nagyítás mellett megvizsgáltuk. Minden egyes, sztereomikroszkóppal látható, göbös elváltozásra gyanús szeletet félretettünk további hisztopatológiai vizsgálat céljából. Ezeket a szeleteket paraffinba ágyaztuk, majd a rutin hisztopatológiai metodikákkal előkészített anyagokból 3-4μm vastagságú metszeteket készítettünk, amiket haematoxylin-eozinnal festettünk. Legalább nyolc szövettani metszet készült azokból a pajzsmirigyekből is, amelyekben sztereomikroszkóppal elváltozás nem volt észlelhető. Az összes így nyert metszetet ugyanaz a két személy vizsgálta párhuzamosan (Dr Gonda Gábor és magam) az Országos Gógyintézeti Központ Patológai Osztályán. A paraffin blokkok száma 8 és 38 között változott, átlagosan 21,2 blokk készült a pajzsmirigyekből. A microcarcinoma szövettani meghatározása az 1.3.1. fejezetben leírt kritériumok alapján történt. Ellenőrizendő az alkalmazott metodikánk érzékenységét 20 olyan esetben, ahol elváltozásra gyanús képlet nem volt észlelhető, a sztereomikroszkópos előszűrés után az összes szeletet paraffinba ágyaztuk, majd haematoxylin-eozinnal megfestettük. Egy esetben sem találtunk azonban többlet microcarcinomát. χ 2 tesztet alkalmaztunk a jódfelvétel-, kor- és nemfüggő microcarcinoma prevalencia, továbbá a strúma és a göbök számának összehasonlítására; Student s t tesztet használtunk az alcsoportokban mért pajzsmirigy tömegek összehasonlítására. Ehhez a GraphPad PRISM 3.02 számítógép programot alkalmaztuk. 3.2. Cyclin D1 expresszió vizsgálata pajzsmirigy daganatokban Vizsgálatunk második részében a pajzsmirigy microcarcinomák cyclin D1 expresszióját vizsgáltuk. Ehhez a 443 autopsziás mintában észlelt 21 microcarcinomát használtuk. A 21 microcarcinoma közül az egyik mérete 15mm volt, ezért ezt a méretre vonatkozó definíció szerint az immunhisztokémiai vizsgálat során nem microcarcinomának, hanem 26
occult carcinomának neveztük. A microcarcinomás csoportból 8 minta volt alkalmas további immunhisztokémiai vizsgálatra (3 férfi 40-57 év között, 5 nő 57-78 év között), illetve az előbbiekben említett 15mm átmérőjű occultnak nevezett carcinomán is elvégeztük az immunhisztokémiai vizsgálatot. A többi észlelt microcarcinoma mérete illetve technikai okok miatt nem volt alkalmas további vizsgálatra. A cyclin D1 expresszióját 15 klinikai tüneteket adó papillaris carcinoma szövettani blokkján is elvégeztük (3 férfi 12 nő). A medián életkor a microcarcinoma csoportban 53 év, a klinikai rák csoportjában 59 év volt. Formalinban fixált, paraffinba ágyazott blokkokból készített 3μm vastag metszeteket készítettünk. A metszeteket 3-aminopropylethoxysilane borítású tárgylemezekre (SuperFrost Plus, Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig, Németország) vittük fel, majd száradni hagytuk egy éjszakán keresztül 65 C-on. Xylénnel deparaffinizáltuk a metszetet, majd ezt követően rehidráltuk leszálló alkoholsorral az immunfestés előtt. A metszeteket 0,3%-os hydrogén-peroxidázzal, metanolban 30 percig kezeltük, ezáltal gátolva a szövet endogén peroxidáz aktivitását. Hő indukált antigén feltárást végeztünk kuktában (Tefal Clipso) 0,5M, ph 10,0 Tris bázisban 2 percig teljes nyomás alatt, a szakirodalmi leírásoknak megfelelően (74-76). Nyúl monoklonális cyclin D1 antitestet 1:100 higításban (clone SP4; Lab Vision Co. Westinghouse, CA, USA) használtunk, primer antitestként. 90 perces, szobahőn végzett inkubációt követően EnVision+-t (DakoCytomation Carpinteria, CA, USA) használtuk, mint másodlagos antitestet a gyártó előírásának megfelelően (77,78). Peroxidáz reakciót DAB (diaminobenzidin) Substrate-Chromogen System-mel (DakoCytomation) a gyártói utasításoknak megfelelően végeztük, majd ezt követően 2 perces haematoxylin háttérfestés történt. Az immunfestést a Bay Zoltán Alapítvány Molekuláris Patológiai Laboratóriumában, Szegeden végeztük, Dr Krenács László és Stelkovics Éva vezetésével. Az immunfestést Khoo közleményéhez hasonlóan (73) értékeltük. A cyclin D1 pozitivitás méretékét (magfestődést) a következőképpen osztályoztuk: grade 0= a dagantszövetben nincs pozitív sejt; grade 1 = fokális festődés, kevesebb, mint a tumorsejtek 10%-a festődik (gyakorlatban ez 1-2 magfestődést jelentett látóterenként); grade 2= nagyfokú festődés a sejtek 10-50%-ban, grade 3= diffúz magfestődés a daganatsejtek több, mint 50%-ában. 27