Az IGHV mutációanalízis jelentősége krónikus lymphocytás leukémiában

Az IGHV mutációanalízis jelentősége krónikus lymphocytás leukémiában Fésüs Viktória 1, *, Eyupoglu Ediz 1, *, Kiss Richárd 1, Ádám Emma 2, Kozma András 2, Mátrai Zoltán 2, Bödör Csaba 1,@ 1 Magyar Tudományos Akadémia Semmelweis Egyetem Lendület Molekuláris Onkohematológia Kutatócsoport, Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest 2 Dél-pesti Centrumkórház Országos Hematológiai és Infektológiai Intézet, Hematológiai és Őssejt-transzplantációs Osztály, Budapest Bevezetés: Az elmúlt években megjelent új célzott terápiás szereknek köszönhetően nagy áttörés történt a krónikus limfocitás leukémia kezelésében, különösen a magas rizikójú betegcsoportban. Az optimális kezelés megválasztásának elősegítése céljából egyre több biomarker kerül be a nemzetközi ajánlásokba, melyek rutinszerű vizsgálata értékes prognosztikus vagy prediktív információt szolgáltat. Jelenleg a legmegbízhatóbb paraméterek közé sorolják a szérum β-2-mikroglobulin szintet, a TP53-státuszt és az immunglobulin-nehézlánc gén (IGHV) mutációs státuszt. Célkitűzés: Jelen tanulmány célja az IGHV mutációs státusz eloszlásának vizsgálata, továbbá, az IGHV-státusz prognosztikai és prediktív szerepének, valamint hazai rutinszerű vizsgálatának ismertetése volt. Anyag és Módszer: Az IGHV mutációanalízist Sanger-szekvenálással végeztük el 173 krónikus lymphocytás leukémiában szenvedő beteg esetében a legújabb nemzetközi ajánlásoknak megfelelően. A kapott eredményeket online plat formok segítségével értékeltük. Eredmények: A betegek 54%-ában nem mutált, 40%-ában mutált és 6%-ában borderline IGHV-t azonosítottunk. A mutált IGHV génnel rendelkező betegcsoport teljes túlélésben és az első kezelésig eltelt időben egyaránt szignifikánsan kedvezőbb (p < 0,0001) kimenetellel bírt a nem mutált csoporttal összehasonlítva. Következtetések: Az IGHV mutációs státusz megbízható prognosztikus biomarker, melynek rutinszerű vizsgálata a nemzetközi ajánlásokban is kötelező elemként szerepel már. A mutációanalízis elvégzésével magas rizikójú betegek azonosíthatók, akik számára a közeljövőben ígéretes választás lehet majd az újonnan megjelent célzott terápiák egyike. Kulcsszavak: krónikus limfocitás leukémia, IGHV gén, célzott terápia IGHV mutation analysis in chronic lymphocytic leukemia Introduction: The recently emerged targeted therapies allowed us to reach new perspectives in the treatment of chronic lymphocytic leukemia, including high-risk patients. To facilitate the selection of the optimal treatment strategy, more biomarkers are included in the newest international guidelines. Assessment of these biomarkers provides precious prognostic and predictive information and allows us to better identify the high-risk CLL patients. At the moment, the serum β-2-microglobulin levels, the TP53 status, and the immunoglobulin heavy chain gene (IGHV) mutation status represents the most reliable prognostic and predictive biomarkers in CLL. Aim: To determine the distribution of IGHV mutation status in a Hungarian patient cohort. Moreover, we aimed to review the prognostic and predictive role and the routine diagnostical approach of the IGHV mutation status assessment. Methods: We applied Sanger sequencing in 173 patients suffering from CLL to determine the IGHV mutation status following the newest international recommendations. To evaluate the results, the standard online platforms were used. Results: We detected unmutated IGHV in 54% of the patients, mutated IGHV in 40% of the cases, with borderline IGHV identified in 6% of all patients. The IGHV mutated subgroup was characterized by significantly longer overall survival and significantly longer time to first treatment when compared to the IGHV unmutated group (p < 0.0001). @ Levelezési cím: Dr. Bödör Csaba, Semmelweis Egyetem, I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, 1085 Budapest, Üllői út 26., E-mail: bodor.csaba1@med.semmelweis-univ.hu, Tel.: 0036-1-215-7300/54462 * Ezek a szerzők első szerzőként egyenlő mértékben járultak hozzá az anyag összeállításához. DOI: 10.1556/2068.2018.51.1.4 Akadémiai Kiadó, Budapest 22

Conclusion: Our data demonstrated that IGHV mutation status is a reliable prognostic biomarker supported by the fact that its assessment is now recommended in the newest international guidelines. More high-risk patients can be identified using mutation analysis, for whom the recently emerged targeted therapies may represent a promising therapy of choice in the near future. Keywords: chronic lymphocytic leukemia, IGHV gene, targeted therapy (Beérkezett: 2018. április 1.; elfogadva: 2018. április 10.) Rövidítések Bcl-2 = B-cell lymphoma-2; BCR = (B-cell receptor) B-sejtreceptor; BR = bendamustin, rituximab; BTK = (Bruton s tyrosine kinase) Bruton-féle tirozinkináz; CDR3 = complementarity determining region 3; CLL = (chronic lymphoid leukemia) krónikus lymphocytás leukémia; ERIC = European Research Initiative on CLL; FCR = fludarabin, cyclophosphamid, rituximab; IGHV = (immunoglobulin heavy chain variable region) immunglobulin-nehézlánc variábilis régió; IPI = (International Prognostic Index) nemzetközi prognosztikai index; KI = (kinase inhibitor) kinázgátló; M-CLL = (mutated-cll) mutált CLL; NGS = (next generation sequencing) új-generációs szekvenálás; NOTCH1 = notch homolog 1, translocation-associated (Drosophila); OS = (overall survival) teljes túlélés; PFS = (progression-free survival) progressziómentes túlélés; PI3K = foszfatidilinozitol-3-kináz; SF3B1 = Splicing Factor 3b Subunit 1; SHM = (somatic hypermutation) szomatikus hipermutációk; TP53 = tumor protein p53; TTFT = (time to first treatment) az első kezelésig eltelt idő; U-CLL = (unmutated CLL) mutálatlan CLL; WHO = (World Health Organisation) Egészségügyi Világszervezet A krónikus lymphocytás leukémia (CLL) a leggyakoribb felnőttkori leukémia, egy lymphoproliferatív megbetegedés, melyben klonális, érett B-lymphocyták szaporodnak ( 5.000/μL) fel a perifériás vérben (WHO) [1]. A kórképet heterogén klinikai lefolyás jellemzi, melynek hátterében jelentős genetikai heterogenitás, valamint a CLL-ben jellegzetes terápia indukálta klonális evolúció áll [2]. Az esetek egyharmadát képező agresszív lefolyást mutató, TP53 mutációt és/vagy 17p deléciót hordozó CLL-es betegcsoportban rövid első kezelésig eltelt idő (TTFT), rövid progressziómentes túlélés (PFS) és gyakori relapszus jellemző; mindez rendkívül rövid (3-4 év) teljes túléléshez (OS) vezet [3, 4]. Az újonnan megjelent célzott terápiák (BTK-, Bcl-2- és PI3K inhibitorok) ebben a betegcsoportban is eredményesnek bizonyultak, miáltal lehetőség nyílt a magas rizikójú csoport hatékony kezelésére is [5 7]. Elérhető, hatékony terápiás alternatívák birtokában mára kiemelt jelentőségűvé vált a magas rizikójú betegek korai és maradéktalan azonosítása, melyben egyre nagyobb szerepet kapnak a molekuláris genetikai vizsgálatok, különösen a TP53-státusz és a sokáig feledésbe merült immun globulin-nehézlánc gén mutációs státusz (IGHV) vizsgálata [8]. A szerzők célja, hogy saját eredményeik bemutatása mellett ismertessék az IGHV-státusz prognosztikai és prediktív szerepét CLL-ben, annak helyét a mindennapi betegellátásban, továbbá, hogy ismertessék az IGHV-státusz vizsgálatának ajánlott idejét és módját a hazai klinikai gyakorlatban. Az immunglobulin-nehézlánc variábilis régiója (IGHV) A B-lymphocyták érésének korai lépéseként a csontvelőben a B-sejt receptort (BCR) kódoló régióban DNS-szintű génátrendeződés megy végbe, melynek során először a nehézláncgének valamelyik, véletlenszerűen kiválasztott diverzitás ( diversity, D) és kapcsoló ( joining, J) génszakaszai rendeződnek át, majd a nehézlánc egyik variábilis régiója ( variability, V) hozzárendeződik a létrejött D-J szakaszhoz, kialakítva a funkcionális V-D-J génát rende ződést, ami a sejtfelszíni BCR és a szekretált immunglobulin molekulák kódolásáért és specificitásáért felelős [9]. A B-sejt differenciálódás későbbi szakaszában az immun globulin nehézlánc variábilis régiójában (IGHV) antigén stimulus hatására szomatikus hipermutáció (SHM) jön létre a nyirokcsomó centrum germinatívumában, ezzel egy rendkívül specifikus BCR-t eredményezve [10]. A CLL-es sejteken klonális eredetüknél fogva ugyanazon egyedi BCR expresszálódik, mely a szomatikus hipermutáció jelenléte és annak mértéke ( mutated IGHV: IGHV-M) vagy hiánya ( unmutated IGHV: IGHV-U) függ vényében két rendkívül eltérő klinikai lefolyással bíró beteg csoportot definiál (M-CLL és U-CLL) a kezdeti klinikai tanulmányok óta [11]. A szomatikus hipermutáción átesett IGHV-M sejtek differenciáltabbak, magasabb affinitásúak, utóbbi következtében kevesebb interakcióba lépnek a tumoros mikrokörnyezetben expresszált (auto) antigénekkel [12]. Így az M-CLL-es sejtklónban a BCRjelátvitel a csökkent ligandfüggő aktiváció miatt kevésbé aktív, melynek következménye többek között az alacsonyabb proliferációs ráta [12] (1. ábra). Ezzel szemben az IGHV-U polireaktív, magas proliferációs rátával ren delkezik, ezzel egy agresszívebb viselkedést kölcsönözve a CLL-es sejtnek, ami klinikailag jelentősen rövidebb TTFT-vel, PFS-sel és OS-sel jár [12]. 23

1. ábra Az IGHV mutációs státusz két formája. Az IGHV szomatikus hipermutációs státusza két teljesen különböző biológiai viselkedésű és klinikai lefolyású CLL-t eredményez. (A) Szomatikus hipermutáció megléte esetén (IGHV-M) a CLL-es sejtek differenciáltabbak, specifikusabb immunglobulint (Ig) expresszálnak ennél fogva autoantigénekkel kevésbé reagálnak. (B) A szomatikus hipermutáción át nem esett CLL-es sejtek (IGHV-U) kevésbé differenciáltak, sejtfelszínükön aspecifikus, polireaktív Ig-t expresszálnak, mely agresszív klinikai lefolyással társul. Rövidítések: IGHV: immunglobulin-nehézlánc variá bilis régió; VH: heavy chain variable gene; DH: heavy chain diversity gene; JH: heavy chain joining gene; CDR: complementarity determining region; FR: framework A betegek közel 60:40 arányban hordoznak mutált, illetve nem mutált IGHV-t, az IGHV-U gyakorisága azonban a progresszív, relabáló, transzformálódó esetekben jelentősen magasabb, amit néhány esetben egy új, nem mutált IGHV-t expresszáló CLL-es sejtklón megjelenése, szelekciója is eredményezhet [13]. Köszönhetően az IGHV-státusz nagy klinikai tanulmányokban történő vizsgálatának, a nagy mennyiségű összegyűlt adat arra a tényre világított rá, hogy bizonyos IGHV gének (IGHV1-69, IGHV3-7, IGHV3-21) a vártnál gyakrabban fordulnak elő, és ezen gének a betegek közel harmadának BCR-ét alkotják [14]. Ezek az úgynevezett sztereotíp ( kvázi identikus ) immunglobulinok, melyeket a nehézlánc komplementaritást meghatározó régiójának ( complementarity determining region 3, CDR3) specifikus szekvencia motívumai alapján alcsoportokba (ún. subsetekbe) sorolhatunk [14]. Az egy sztereotíp BCR alcsoportba tartozó BCR-ek identikus antigénkötőhellyel rendelkeznek, antigénstimuláció hatására hasonló módon aktiválják a BCR-jelátvitelt [14]. Az alcsoportok ( subsetek ) azonosításának kiemelt klinikai jelentősége abban rejlik, hogy az egy alcsoportba tartozó CLL-es betegek sok esetben az IGHV mutációs státusztól függetlenül, hasonló klinikummal rendelkeznek, így sok esetben a subset meghatározása a kórlefolyás és a terápiás válasz előrejelzésében is segítséget nyújthat. Jelen ismeretünk szerint a subset#1 (IGHV1/5/7), a subset#2 (IGHV3-21) és a subset#8 (IGHV4-39) agresszív lefolyással (TTFT 1,5-1,9 év), míg a subset#4 (IGHV4-34) indolens lefolyással (TTFT 11 év) jár [14]. Az IGHV-státusz terápiás vonatkozásai 1999-ben több tanulmány is leírta az IGHV génben létrejött szomatikus hipermutáció kiemelt prognosztikai jelentőségét CLL-ben, melyet azóta több, nagyszámú betegcsoporton végzett prospektív klinikai tanulmány is megerősített [11, 15, 16]. Az első nagy részletes tanulmányban egy texasi munkacsoport 300 CLL-es beteg elsővonalbeli FCR kezelését vizsgálta, 6 év után 51%-os, 12,8 év után 30,9%-os PFS-t demonstrálva [17, 18]. A PFS 12,8 év után az IGHV-M csoportban 79,8%, az IGHV-U csoportban csupán 8,7% volt [18]. A CLL8 vizsgálat értékelésekor Rossi és mtsai hasonló eredményeket írtak le; az IGHV-M, magas rizikójú citogenetikai eltérések (11q-, 17p-) nélküli csoportjában egy platót elérő, 4 év után 71%- os PFS-sel, valamint az azonos korú és nemű populációéval megegyező túléléssel [19]. Ezen tanulmányok azt sugallják, hogy kezelési indikáció fennállása esetén a TP53 defektust (del(17p) és/vagy TP53 mutációk) nem hordozó, IGHV-M csoportban az FCR tűnik a legígéretesebb kezelésnek, ezen esetekben ugyanis tartós CR, sőt néhány tanulmány szerint akár gyógyulás is elérhető [20, 21]. A nem mutált IGHV-vel rendelkező betegcsoportban az újonnan megjelent célzott terápiák (ibrutinib, acalabrutinib, venetoclax) különösen szép eredményeket értek el. Az elsővonalbeli ibrutinibkezelés IGHV-U csoportban megfigyelt hatékonysága, PFS-re gyakorolt pozitív hatása felülmúlja bármely korábbi terápiás protokollét (FCR, BR, G-Clb, R-Clb) [22 24], aminek hátterében a BCR jelátvitel fokozott aktivitása áll ebben a betegcsoportban. Kiemelt jelentőségű, hogy relabáló, refrakter CLL-ben az 24

1. táblázat Klinikai és biológiai paraméterek megoszlása a vizsgált betegcsoportban Paraméter Betegszám (n = 173) % Átlagéletkor mintavételkor 65,5 Nem férfi 112 65 nő 61 35 Klinikai stádium Binet A 93 54 Binet B 37 21 Binet C 43 25 TP53-státusz (del(17p) és/vagy TP53 mutáció) TP53 defektus 47 27 vad típusú TP53 126 73 Kezelés igényelt 136 79 nem igényelt 37 21 ibrutinib a beteg IGHV-státuszától és rizikójától függetlenül megőrzi hatékonyságát, továbbá ebben a betegcsoportban szintén hosszabb PFS-t biztosít egyéb protokolloknál [25, 26]. Összességében elmondható, hogy kezelési indikáció fennállásakor, a kezelés megkezdése előtt az IGHV mutációs státusz vizsgálata ajánlott, mindezt a Nemzetközi CLL-Munkacsoport (iwcll) 2018-ban megjelent ajánlása is egyértelműen megfogalmazza [20]. Anyag és módszer Az IGHV-státusz meghatározását 173 hazai CLL-es beteg rutin diagnosztikai vizsgálatra érkező DNS-mintáján végeztük el. A CLL diagnózisa a Semmelweis Egyetem I. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetében, illetve a Dél-Pesti Centrumkórház Hematológiai és Őssejttranszplantációs Osztályán, 1994 2017 között, az Egészségügyi Világszervezet (World Health Organization, WHO) Kritériumai szerint történt. Százhetvenhárom beteg (112 férfi, 61 nő) genomiális DNS-mintáját vizsgáltuk meg; a mintavétel 37 esetben kezelés megkezdése előtt, 136 esetben korábbi kezelést követően történt. A vizsgált betegcsoport átlagéletkora mintavételkor 65.5 év volt, a további klinikai és biológiai paraméterek megoszlása az 1. táblázatban látható. A Dél-Pesti Centrumkórház citogenetikai laboratóriumának köszönhetően rendelkezésre álltak korábbi fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) végzett vizsgálatok eredményei a 12-es triszómiát, a 13q14 deléciót, a 11q22-q23 deléciót és a 17p13 deléciót illetően. A DNS kivonása a mononukleáris sejtfrakció ficoll-lal történő szeparációját követően High Pure PCR template purification kit (Roche) segítségével történt, a gyártó utasításainak megfelelően. Az Európai LeukemiaNet CLL munkacsoportja ( European Research Initiative on CLL : ERIC) által 2017-ben közölt ajánlás alapján a szomatikus A B Produk v IGHV-átrendez dés Gén: IGHV3-21 Homológia: 100% Subset: CLL#2 Státusz: nem mutált Prognózis: kedvez len 2. ábra Az IGHV-státusz vizsgálata. (A) A vizsgálat az ERIC ajánlás alapján az egész átrendeződött IGHV-IGHD-IGHJ génszekvencia szekvenálását lehetővé tévő 5 leader (az ábrán 1, és 2) és az IGHJ génre irányuló 3 consensus primerek (az ábrán R jelzéssel) alkalmazásával történik. (B) Az eredmény kiértékelése in silico, online platformok segítségével történik. Rövidítések: IGHV: immunglobulin-nehézlánc variábilis régió; L: leader; C: heavy chain constant region gene; VH: heavy chain variable gene; D: heavy chain diversity gene; J: heavy chain joining gene; FR: framework 25

A B IGHV-státusz eloszlása (n = 173) Subsetek gyakorisága (n = 173) 40% 6% 54% IGHV-M IGHV-U IGHV-B 2% 2% 2% 1% 1% 1% ismeretlen CLL#1 CLL#2 CLL#3 CLL#4 91% CLL#6 CLL#59 3. ábra Az IGHV-státusz megoszlása a vizsgált betegcsoportban (n =173). (A) A betegek 54%-a nem mutált (IGHV-U), 40%-a mutált (IGHV-M), 6%-a borderline (IGHV-B) státusszal rendelkezett. (B) Összesen a betegek 9%-át lehetett valamelyik ismert CLL-es sztereotíp BCR alcsoportba sorolni. Rövidítések: IGHV: immunglobulin-nehézlánc variábilis régió; IGHV-U: nem mutált IGHV; IGHV-M: mutált IGHV; IGHV-B: borderline IGHV hipermutációs státusz vizsgálatát genomiális DNS mintákon, az átrendeződött IGHV-IGHD-IGHJ génszekvencia multiplex polimeráz láncreakcióval (PCR) történő amplifikációját követő direkt Sanger-szekvenálással végeztük el [27]. A multiplex PCR során az új ERIC ajánlás alapján az egész átrendeződött IGHV génszekvencia szekvenálását lehetővé tévő 5 leader és az IGHJ génre irányuló 3 consensus primereket alkalmaztuk. A kapott immunglobulin génszekvencia kiértékelése az IMGT ( International Im- MunoGeneTics information system : IMGT) által biztosított IMGT/V-QUEST (http://www.imgt.org/) online bioinformatikai algoritmus segítségével, nemzetközi referencia szekvenciával történő összehasonlítással történt (2. ábra). A nemzetközi ajánlásnak megfelelően 98% homológia esetén IGHV-U, 97 97.9% esetén borderline (IGHV-B), végül <97% esetén IGHV-M-státuszt határoztunk meg [27]. A BcR Ig sztereotípia meghatározása az ARResT/AssignSubsets (http://tools.bat.infspire.org/ arrest/assignsubsets/) online platform alkalmazásával történt. Eredmények IGHV szomatikus hipermutációs státusz Az IGHV-státusz meghatározását 173 hazai CLL-es beteg esetén végeztük el. A betegek 54%-ában (94/173) nem mutált (IGHV-U), 40%-ában (69/173) mutált (IGHV-M) és 6%-ában (10/173) borderline IGHV-t (IGHV-B) azonosítottunk (3.A ábra). Ezt követően megvizsgáltuk a legfontosabb citogenetikai eltérések előfordulását az U-CLL (n = 94) és M-CLL (n = 69) csoportokban. Míg az alacsony rizikójú 13q deléció gyakrabban fordult elő az M-CLL csoportban, mint az U-LL csoportban (64% vs. 47%), addig a magasabb rizikójú eltérések az U-CLL csoportban jelentek meg gyakrabban (11q deléció esetén 29% vs. 3%, 17p deléció esetén 21% vs. 0%) (4. ábra). Ugyanez az összefüggés fordított irányban is fennállt, a TP53 diszrupcióval (TP53 mutáció/17p deléció) rendelkező esetek 83%-a (39/47) nem mutált IGHV szekvenciával rendelkezett. 13q14 deléció 12-es triszómia 11q22-q23 deléció 17p13 deléció 7% 3% 0% M-CLL n = 69 64% U-CLL n = 94 47% 21% 30% 21% Kedvez bb Prognózis Kedvez tlen 4. ábra Az IGHV-státusz citogenetikai eltérésekhez való viszonya (n = 173). A legfontosabb citogenetikai eltérések közül a 13q deléció az M-CLL csoportban fordult elő gyakrabban, míg a 12-es triszómia, a 11q deléció és a 17p deléció az U-CLL csoportban. Rövidítések: IGHV: immunglobulin-nehézlánc variábilis régió; IGHV-U: nem mutált IGHV; IGHV-M: mutált IGHV; U-CLL: IGHV-U csoport; M-CLL: IGHV-M csoport 26

A Teljes túlélés (OS); (n = 173) B El kezelésig eltelt i (TTFT); (n = 173) Túlélés (%) 100 100 U-CLL medián: 22 n = 79 80 M-CLL medián: 98 75 p < 0,0001 60 n = 79 n = 94 50 U-CLL medián: 146 40 M-CLL medián: NR 25 p < 0,0001 20 n = 94 Nem kezelt (%) 0 0 50 100 150 200 250 300 350 Id (hónapok) IGHV-U (<98%) IGHV-M (>98%) 0 0 25 50 75 100 125 150 175 200 Id (hónapok) 5. ábra Teljes túlélés és első kezelésig eltelt idő (TTFT) az U-CLL (n = 94) és M-CLL (n = 79) csoportokban. (A) Az U-CLL csoport medián túlélése 146 hónap volt, míg az M-CLL csoport túlélése a mediánt nem érte el (NR) (p < 0,0001). (B) A medián TTFT az U-CLL csoportban 22 hónap, míg az M-CLL csoportban 98 hónap volt (p < 0,0001). Rövidítések: IGHV: U-CLL: IGHV-U csoport; M-CLL: IGHV-M csoport; NR: not reached Ismert sztereotíp BCR alcsoportok ( subsetek ) gyakorisága Végül betegeinknél meghatároztuk a hozzátartozó sztereotíp BCR subsetet is. Tizenhat beteg tartozott valamelyik kiemelt subsetbe (CLL#1: 4 beteg, CLL#2: 4 beteg, CLL#3: 4 beteg, CLL#4: 2 beteg, CLL#6: 1 beteg, CLL#59: 1 beteg), míg a fennmaradó 157 beteg esetén nem volt azonosítható ismert sztereotíp subset (3.B ábra). Az IGHV-státusz klinikai relevanciája A továbbiakban az IGHV-státusz első kezelésig eltelt időre ( time to first treatment : TTFT) és teljes túlélésre ( overall survival : OS) gyakorolt hatását vizsgáltuk. Ennél az összehasonlításnál a borderline eseteket az M-CLL csoportba soroltuk, ugyanis a homológia százaléka alapján ehhez a csoporthoz álltak közelebb. Az U-CLL csoport (n = 94) medián túlélése 146 hónap volt, míg az M-CLL csoport (n = 79) túlélése a mediánt nem érte el (p < 0,0001). A medián TTFT az U-CLL csoportban (n = 94) 22 hónap, míg az M-CLL csoportban (n = 79) 98 hónap volt (p < 0,0001) (5. ábra). A követési idő alatt a betegek 79%-a (136/173) igényelt kezelést. Várakozásainknak megfelelően a kezelést igénylő páciensek többsége (65%) IGHV-U-t hordozott. Az M-CLL csoportban csupán a betegek 50%-át (39/79), míg az U-CLL csoportban a betegek 94%-át (88/94) kellett kezelni. Kemo-vagy kemoimmunoterápiát minden kezelt beteg, míg harmad- vagy sokadvonalbeli Btk-gátló kezelést (ibrutinib) 9 beteg (7 IGHV-U és 2 IGHV-B) kapott. Megbeszélés Az elmúlt években a klinikai tanulmányok ismét megerősítették az IGHV mutációs státusz prognosztikai és prediktív értékét CLL-ben, továbbá rávilágítottak a V-D-J átrendeződés részletesebb vizsgálatának, azon belül is a subsetek meghatározásának klinikai jelentőségére is. Míg a hazai CLL-es betegcsoportban a subsetek előfordulási aránya megegyezik az irodalomban leírtakkal, addig érdekes módon a nem mutált IGHV-t hordozó betegek aránya a vártnál némileg magasabbnak (54%) bizonyult tanulmányunkban. Utóbbi azzal magyarázható, hogy az általunk vizsgált betegcsoportban nagyobb volt a magas rizikójú, kedvezőtlenebb prognózissal bíró betegek aránya, valamint a betegek háromnegyede igényelt kezelést. A betegség rizikóbecslésére CLL-ben régóta ismert és használt a Döhner-féle citogenetikai prognosztikus modell, mely a betegeket a különböző kromoszóma-aberrációk alapján sorolja eltérő prognosztikus csoportokba (legjobb prognózissal a 13q14 deléció jár, majd egyre rövidebb túléléssel jár a normális kariotípus, a 12-es triszómia, a 11q22-q23 deléció, s végül a 17p13 deléció) [3]. Ezen modell hiányossága, hogy a jó prognózisú csoportba kerülő betegek egy részében a vártnál agresszívabb lefolyás jelentkezik, így intenzív kutatások irányultak további biomarkerek azonosítására, melyben az új-generációs szekvenálás (NGS) hozott nagy előrelépést. Habár az NGS elterjedésével a magas rizikójú, kemoimmunoterápiára rosszul- vagy nem reagáló betegcsoport egyre pontosabb azonosítására nyílik lehetőségünk, az újonnan azonosított klinikai jelentőséggel bíró genetikai eltérések (például SF3B1 vagy NOTCH1 mutációk) mellett a TP53-státusz (TP53 mutációk és 17p deléciók), valamint az IGHV mutációs státusz továbbra is a két legerősebb prognosztikus, illetve prediktív biomarker maradt [20]. Fontos kiemelni, hogy ezen biomarkerek megléte nem jelent kezelési indikációt, vizsgálatuk a klinikai paraméterek alapján fennálló kezelési indikáció esetében indokolt [20]. Ami a kezelési stratégia megválasztását illeti, habár U-CLL-ben nagyon bíztatóak a kezdeti eredmények az új gyógyszerek alkalmazásával, a viszonylag rövid követési idő miatt ezen célzott terápiák pontos elhelyezése a kezelési algoritmusokban az IGHV mutációs státusz fényében még várat magára. 27

2. táblázat A CLL-IPI prognosztikus rendszer elemei és értékelése Prognosztikus marker Rossz prognózisú faktor Pontérték Életkor >65 év 1 Klinikai stádium Rai I IV, Binet B-C 1 β-2-mikroglobulin szint >3.5 mg/l 2 IGHV mutációs státusz nem mutált (>98% homológia a csíravonalival) 2 TP53-státusz del(17p) és/vagy TP53 mutáció 4 Összpontszám Rizikó 5 éves OS (%) 0 1 alacsony rizikó 93 2 3 közepes rizikó 79 4 6 magas rizikó 63 7 10 nagyon magas rizikó 23 Rövidítések: IPI: International Prognostic Index; IGHV: immunglobulin-nehézlánc variábilis régió; OS: overall survival A legújabb integrált prognosztikus rendszer a CLL-IPI, mely a genetikai, biokémiai és klinikai paraméterek kombinációjával nagyban elősegíti a CLL-es betegek prognosztikai besorolását és személyre szabott kezelését a klinikai gyakorlatban [8]. A CLL-IPI vizsgálatok során a 27 vizsgált paraméterből 5 bizonyult független prognosztikus markernek a teljes túlélés szempontjából, melyek a TP53-státusz (vad típusú TP53 versus 17p-/TP53 mutációk/ mindkét eltérés), az IGHV-státusz (mutált versus nem mutált), szérum β-2-mikroglobulin koncentráció ( 3.5mg/L versus >3.5mg/L), klinikai stádium (Binet A/ Rai 0 versus Binet B-C/Rai I IV) és az életkor ( 65 versus >65 év). Ezen paraméterek együttes figyelembevételével mind a Rai, mind a Binet rendszernél megbízhatóbb prognosztikai információkhoz jutunk, az öt éves OS szempontjából, négy egymástól szignifikánsan elkülönülő (p < 0,001) rizikó cso porttal (alacsony rizikójú 93,3%, közepes rizikójú 79,3%, magas rizikójú 63,3%, nagyon magas rizikójú 23,3%) [8]. (2. táblázat). Érdekes, hogy a CLL-IPI rendszerből kimaradnak a Döhner-féle citogenetikai alapú prognosztikus rendszer jól ismert kromoszóma-eltérései (11q- és 13-deléció, 12-es triszómia), ugyanakkor nagy súllyal bekerült a TP53, illetve az IGHV mutációs státusz. Éppen ezért az IGHV-státusz a Nemzetközi CLL-Munkacsoport legújabb ajánlásában is helyet kapott, mint a kezelési indikáció fennállása esetén elvégzendő vizsgálat, mely szintén ezen biomarker kiemelt klinikai jelentőségét erősíti meg [20]. Az IGHV mutációs státusz meghatározásának gyakorlati vonatkozásaival kapcsolatban kiemelendő, hogy a vizsgálat eredménye önmagában nem jelent kezelési indikációt; a vizsgálat elvégzése kezelési indikáció fennállásakor szükséges. Mivel egy stabil biomarkerről van szó, amely a betegség lefolyása során nem változik, a vizsgálatot nem szükséges ismételni az egyes kezelések előtt vagy között, eredménye informatív a betegség várható lefolyásával kapcsolatban. Az IGHV vizsgálat mikéntjéről a fentebb ismertetett ERIC ajánlás rendelkezik [27]. Fontos gyakorlati szempont, hogy a molekuláris diagnosztikai leleten a mutációs státusz eredményén túl szükséges az átrendeződött gén pontos leírása, valamint a legközelebbi csíravonalbeli génnel való homológia mértékének százalékos megadása is. Továbbá, fontos az alcsoport (ún. subset ) megadása is, amennyiben az adott beteg IGHV szekvenciája besorolható valamely alcsoportba, mivel bizonyos alcsoportok a mutációs státuszt kvázi felülírva, jellemző klinikai kimenetellel bírnak. Bár az esetek döntő részében az IGHVstátusz könnyen meghatározható, a mindennapi gya korlatban számolni kell azzal, hogy az esetek mintegy 5 8%-ában ún. borderline eredménnyel zárul a vizsgálat, amikor nem vonható le egyértelmű következtetés a prog nózissal kapcsolatban. Továbbá, az esetek 1 2%- ában előfordulhat, hogy a mutációs státusz nem határozható meg, amiért döntően a nem-produktív vagy kettős génátrendeződések megjelenése a felelős. A vizsgálat kivite lezéséhez egy cső EDTA alvadásgátolt perifériás vérminta szükséges. Az IGHV vizsgálathoz az ERIC lehetőséget biztosít egy európai akkreditáció megszerzésére, aminek során az európai referencia laboratóriumból kapott minták IGHV-státuszát kell helyesen meghatározni, a szükséges klinikai interpretációval egyetemben. Laboratóriumunk 2018 elején sikeresen vett részt az ERIC által szervezett akkreditációs vizsgálaton. Összefoglalva elmondható, hogy az IGHV mutációs státusz egy egyszerűen vizsgálható, stabil, megbízható prognosztikus marker CLL-ben, melynek vizsgálata rutinszerűen elérhető a Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet ERIC akkreditációval rendelkező molekuláris diagnosztikai laboratóriumában. Nyilatkozatok: A cikk nem jelent meg más folyóiratban és nem áll publikáció alatt. A szerzők a szerzői útmutatót elolvasták. Anyagi támogatás: A közlemény az MTA Lendület programjának (LP95021), a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal NVKP_16-1-2016-0004 pályázata, valamint az Emberi Erőforrások Minisztériuma ÚNKP-17-2- 28

I-SE-32 kódszámú Új Nemzetiségi Kiválóság Programjának támogatásával készült. Szerzői munkamegosztás: Valamennyi szerző (FV, EE, KR, AE, KA, MZ, BCs) részt vett a közlemény megírásában, valamint az előzetes irodalmi adatok feldolgozásában. Érdekeltségek: A szerzőknek nincsenek érdekeltségeik. Irodalom [1] Harris NL, Swerdlow S, Campo E, et al. The World Health Organization (WHO) classification of lymphoid neoplasms: What s new? Ann Oncol. 2008; 19: 119 119. [2] Braggio E, Kay NE, VanWier S, et al. Longitudinal genome-wide analysis of patients with chronic lymphocytic leukemia reveals complex evolution of clonal architecture at disease progression and at the time of relapse. Leukemia. 2012; 26: 1698 1701. [3] Dohner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2000; 343: 1910 1916. [4] Rossi D, Rasi S, Spina V, et al. Integrated mutational and cytogenetic analysis identifies new prognostic subgroups in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2013; 121: 1403 1412. [5] Stilgenbauer S, Eichhorst B, Schetelig J, et al. Venetoclax in relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with 17p deletion: a multicentre, open-label, phase 2 study. Lancet Oncol. 2016; 17: 768 778. [6] Sharman JP, Coutre SE, Furman RR, et al. Second interim analysis of a phase 3 study of idelalisib (ZYDELIG (R)) plus rituximab (R) for relapsed Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): Efficacy analysis in patient subpopulations with del(17p) and other adverse prognostic factors. Blood 2014; 124: 330. [7] Brown JR, Hillmen P, O Brien S, et al. Extended follow-up and impact of high-risk prognostic factors from the phase 3 RESONA- TETM study in patients with previously treated CLL/SLL. Leukemia. 2018; 32: 83 91. [8] International CLLIPIwg An international prognostic index for patients with chronic lymphocytic leukaemia (CLL-IPI): a metaanalysis of individual patient data. Lancet Oncol. 2016; 17: 779 790. [9] Collins AM, Sewell WA, Edwards MR. Immunoglobulin gene rearrangement, repertoire diversity, and the allergic response. Pharmacol Ther. 2003; 100: 157 170. [10] Fabbri G, Dalla-Favera R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nat Rev Cancer. 2016; 16: 145 162. [11] Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1999; 94: 1848 1854. [12] Zenz T, Mertens D, Kuppers R, et al. From pathogenesis to treatment of chronic lymphocytic leukaemia. Nat Rev Cancer. 2010; 10: 37 50. [13] Rose-Zerilli MJ, Gibson J, Wang J, et al. Longitudinal copy number, whole exome and targeted deep sequencing of good risk IGHV-mutated CLL patients with progressive disease. Leukemia. 2016; 30: 1301 1310. [14] Stamatopoulos K, Agathangelidis A, Rosenquist R, et al. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2017; 31: 282 291. [15] Damle RN, Wasil T, Fais F, et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1999; 94: 1840 1847. [16] Naylor M, Capra JD. Mutational status of Ig V(H) genes provides clinically valuable information in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1999; 94: 1837 1839. [17] Tam CS, O Brien S, Wierda W, et al. Long-term results of the fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab regimen as initial therapy of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2008; 112: 975 980. [18] Thompson PA, Tam CS, O Brien SM, et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2016; 127: 303 309. [19] Rossi D, Terzi-di-Bergamo L, De Paoli L, et al. Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2015; 126: 1921 1924. [20] Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2018; doi: 10.1182/blood-2017-09-806398. [21] Chai-Adisaksopha C, Brown JR. FCR achieves long-term durable remissions in patients with IGHV-mutated CLL. Blood. 2017; 130: 2278 2282. [22] Goede V, Fischer K, Busch R, et al. Obinutuzumab plus chlorambucil in patients with CLL and coexisting conditions. N Engl J Med. 2014; 370: 1101 1110. [23] Barr P, Robak T, Owen CJ, et al. Updated Efficacy and Safety from the Phase 3 Resonate-2 Study: Ibrutinib As First-Line Treatment Option in Patients 65 Years and Older with Chronic Lymphocytic Leukemia/Small Lymphocytic Leukemia. Blood. 2016; 128: 234 234. [24] Kipps TJ, Hillmen P, Demirkan F, et al. 11q Deletion (del11q) Is Not a Prognostic Factor for Adverse Outcomes for Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia/Small Lymphocytic Lymphoma (CLL/SLL) Treated with Ibrutinib: Pooled Data from 3 Randomized Phase 3 Studies. Blood. 2016; 128: 2042 2042. [25] Brown JR, Hillmen P, O Brien S, et al. Extended follow-up and impact of high-risk prognostic factors from the phase 3 RESO- NATE study in patients with previously treated CLL/SLL. Leukemia. 2018; 32: 83 91. [26] Chanan-Khan A, Cramer P, Demirkan F, et al. Ibrutinib combined with bendamustine and rituximab compared with placebo, bendamustine, and rituximab for previously treated chronic lymphocytic leukaemia or small lymphocytic lymphoma (HELIOS): a randomised, double-blind, phase 3 study. Lancet Oncol. 2016; 17: 200 211. [27] Rosenquist R, Ghia P, Hadzidimitriou A, et al. Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations. Leukemia. 2017; 31: 1477 1481. 29