DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS Koleszterinhez kötődő antitestek vizsgálata - ACHA - dr. Horváth Anna Pathobiokémia program Programvezető: Prof. Dr. Mandl József Témavezető: Prof. Dr. Karádi István és Prof. Dr. Romics László Intézet: Semmelweis Egyetem III. Sz. Belgyógyászati Klinika 2002.
Tartalomjegyzék ÖSSZEFOGLALÁS... 4 1.1 Angol összefoglaló (Summary)...5 1.2 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...6 2. ELŐZMÉNYEK... 7 2.1 A KOLESZTERIN ÉS A LIPOPROTEINEK SZEREPE AZ ANYAGCSERE FOLYAMATOKBAN...7 2.1.1 A koleszterin... 7 2.1.2 A lipoprotein anyagcsere... 8 2.2 A LIPOPROTEIN ELLENES ANTITESTEK...11 2.2.1 oxldl ellenes antitestek... 11 2.2.2 Egyéb lipoprotein ellenes antitestek... 12 2.3 A LIPID ELLENES ANTITESTEK...13 2.3.1 Foszfolipidellenes antitestek... 13 2.4 ANTI-KOLESZTERIN ANTITEST...15 2.4.1 Az anti-koleszterin antitest létezésének bizonyítékai... 15 2.4.2 Az anti-koleszterin antitest funkciójának vizsgálata... 16 2.5 AZ IMMUNOLÓGIAI HOMUNCULUS ELMÉLETE...18 3. KUTATÁSI CÉLOK... 20 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 22 4.1 ANYAGOK...22 4.1.1 Reagensek:... 22 4.1.2 Kísérleti állatok... 22 4.1.3 IVIG (tisztított intravénás immunglobulin)... 22 4.1.4 HIV-törzsek... 22 4.2 VIZSGÁLT SZÉRUMOK...22 4.2.1 Normál humán szérum... 22 4.2.2 Kevert humán szérum... 22 4.2.3 Ischaemiás szívbetegektől származó szérum minták... 23 4.2.4 Stroke betegektől származó szérum minták... 23 4.2.5 Perifériás obstrukció miatt kezelt érbetegektől származó szérum minták... 23 4.2.6 Hyperlipidaemiás betegektől származó szérum minták... 23 4.2.7 HIV-pozitív betegektől származó szérum minták... 23 4.2.8 Kontrolloktól származó szérum minták... 24 4.3 MÓDSZEREK...24 4.3.1 Nyúlimmunizálás - Kísérleti protokoll... 24 4.3.2 LDL és VLDL/LDL szeparálás... 25 4.3.3 Kolmer reakció... 25 4.3.4 Rapid Plasma Reagin (RPR) teszt Portnoy reakció... 25 4.3.5 Immunkomplex titer mérése... 26 4.3.6 ACHA mérése...26 4.3.7 Ergoszterinhez, koprosztánhoz való kötődés vizsgálata... 27 4.3.8 IgG antitestek kötésének gátlása koleszterinnel fedett lemezekhez... 27 4.3.9 CD4+ sejtszám mérése... 27 4.3.10 HIV-1 RNS szint mérés a betegek plazmájában... 28 2
4.3.11 Szérum lipidértékek mérése... 28 4.3.12 Statisztikai analízis... 28 5. EREDMÉNYEK... 29 5.1 KOLESZTEROSZÓMÁVAL TÖRTÉNŐ IMMUNIZÁLÁS HATÁSA NYULAK KOLESZTERIN ETETÉSSEL KIVÁLTOTT ÉRELMESZESEDÉSÉRE...29 5.1.1 ACHA mérése...29 5.1.2 Szérum koleszterin szint a nyulakban... 29 5.1.3 Szerológiai reakciók... 30 5.1.4 Szövettani vizsgálat...31 5.2 ACHA KIMUTATÁSA EGÉSZSÉGES EMBEREKBEN ÉS TULAJDONSÁGAINAK VIZSGÁLATA...34 5.2.1 Az ACHA és az apl ellenanyagok kötésmechanizmusának összehasonlítása... 34 5.2.2 Kompetíciós és specificitás vizsgálatok:... 35 5.2.3 Az ACHA megoszlása egészséges humán populációban... 38 5.3 ACHA MÉRÉSE ATHEROSCLEROTICUS EREDETŰ ÉRBETEGSÉGEKBEN...38 5.3.1 Ischaemiás szívbetegek vizsgálata... 38 5.3.2 Stroke miatt kórházi kezelésben részesült betegek vizsgálata... 40 5.3.3 Perifériás obstruktív érbetegek ACHA titere... 40 5.3.4 Hyperlipidaemiás betegek vizsgálata... 41 5.3.5 ACHA és oxldl összehasonlító vizsgálata... 42 5.3.6 ACHA meghatározása HIV-pozitív betegekben, és a hatékony aktív antiretroviralis terápia hatása az ACHA szintekre... 43 6. MEGBESZÉLÉS... 46 KOLESZTEROSZÓMÁVAL TÖRTÉNT NYÚL IMMUNIZÁCIÓS KÍSÉRLET EREDMÉNYEINEK ÉRTÉKELÉSE...46 HUMÁN SZÉRUMOKON VÉGZETT KÍSÉRLETEK MEGTÁRGYALÁSA...47 ÉRELMESZESEDÉSBEN SZENVEDŐ BETEGEK SZÉRUMAIBAN MÉRT ACHA SZINTEK DISZKUSSZIÓJA...48 PRIMER HYPERLIPIDAEMIÁS BETEGEK ACHA TITERÉNEK ÉRTÉKELÉSE...50 HIV-FERTŐZÖTTEK SZÉRUMAIN VÉGZET VIZSGÁLATOK MEGBESZÉLÉSE...51 KÖVETKEZTETÉSEK...53 7. LEGFONTOSABB ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK... 54 IRODALOM... 55 PUBLIKÁCIÓK... 71 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ CIKKEK...71 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT EGYÉB CIKKEK...72 HIVATKOZHATÓ ELŐADÁSOK ÉS POSTEREK AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN...73.KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 77 3
Összefoglalás Kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy mi az anti-koleszterin antitest (ACHA) funkciója, specificitása, valamint azt, hogy különböző betegek szérumában milyen az előfordulása. Az irodalomban korábban már is többször leírták az antitest létezését, különböző állatokban való előfordulását, de kiterjedt humán vizsgálat kísérleteinket megelőzően nem történt. Első vizsgálatunk célja az ACHA állatokban leírt protektív hatásának megfigyelése volt nyulakon és emberi savókon. Nyulakat koleszterinből készült szuszpenzióval immunizáltunk, ACHA termelődést indukálva, majd koleszterindús diétán tartottuk az állatokat. Az immunizált nyulakban érelmeszesedésre utaló elváltozásokat nem találtunk, míg a kontroll állatokban kialakultak az arterioscleroticus plakkok. Második célkitűzésünk a humán ACHA vizsgálata volt. Elsőként írtuk le a humán ACHA specificitásának vizsgálatakor, hogy az ACHA a koleszterint direkt módon is köti, a felismeréshez egyéb szérum fehérje nem szükséges. Igazoltuk, hogy a humán ACHA is antigénként ismeri fel az alacsony denzitású lipoprotein frakciókat (LDL, VLDL). Kimutattuk, hogy az ACHA és az oxidált LDL (oxldl) elleni autoantitestek nem azonosak egymással. Egyedi szérummintákon történt vizsgálataink alapján megerősítettük, hogy minden egészséges ember vérében megtalálható a koleszterin ellenes ellenanyag. Nincs különbség a nemek között az ACHA szintjében, viszont életkori különbségek kialakulnak, a 60 év feletti populáció anti-koleszterin ellenanyag titere szignifikánsan magasabb. Elsőként mértünk különböző érbeteg csoportokban ACHA szinteket. Az ischaemiás szívbetegek és HIV-pozitív betegek szérumában az ACHA titer szignifikánsan magasabb, míg a perifériás érbetegek és a stroke miatt kezelt egyének szérumában alacsonyabb ACHA szinteket találtunk, mint a kontroll 4
csoportban. HIV pozitív betegekben HAART hatására jelentősen csökken az ACHA szint. A disszertációban kifejtett eredmények alapján indokolt az a hipotézis, hogy a nyulakban megtalálható protektív hatás az emberekben is létezhet, viszont a magas ACHA szint nem véd az ischaemiás szívbetegség kifejlődésétől. Minden emberben keringő, a koleszterin 3 -hidroxil csoportjához kötődő, természetes autoantitestet írtunk le. Méréseink alapján felvetettük, hogy az emberi szervezetben keletkező ACHA az immunológiai homunculus része, melynek igazolására további kísérleteket tervezünk. 1.1 Summary In animal experiments the protective role of anti-cholesterol antibodies (ACHA) has been demonstrated. ACHA is a natural antibody against 3B-OH group of cholesterol. Despite the fact that ACHA are present in the serum of all healthy humans, no data on the occurrence of these antibodies in human vascular diseases is available. In our experiments we proved with a new antigen that the protective effects of immunization against arteriosclerosis in rabbits is the consequence of development of ACHA. ACHA binding to solid phase cholesterol may occur without contribution of serum cofactor. Human ACHA interact with cholesterol present in low-density lipoprotein fractions (LDL and VLDL). We showed that ACHA and anti-oxldl antibodies differ from each other. We measured ACHA levels in patients with various vascular diseases of atherosclerotic origin. ACHA levels were significantly lower in patients with peripheral atherosclerosis and cerebrovascular diseases than in healthy controls. ACHA levels were significantly higher in patients with coronary heart disease and in patients with hyperlipidemia than in healthy controls. ACHA levels are higher in HIV positive patients than in controls, HAART induced a marked drop of ACHA concentration. From our results the hypothesis of ACHA are protective antibodies may be true, but the high ACHA level does not protect us from atherosclerotic diseases. 5
1.2 Rövidítések jegyzéke ACHA: Anti Cholesterol Antibody PDGF: Platelet Derived Growth Factor AU: Arbitrary Unit PGI2: Prosztaglandin I-2 BSA: Bovine Serum Albumin RNS: Ribonukleinsav CABG: Coronary Artery Bypass Graft RPR: Rapid Plasma Reagin test CHD: Coronary Heart Disease SLE: Systhemas Lupus Erythemathodes CMV: Cytomegalovírus TIA: Transitorial Ischaemic Aattack CoA: Coenzim A TNP-: 2,4,6-trinitrophenil - CS: Cholesterosoma, Koleszteroszóma TxA2: Tromboxan A2 EDTA: Etilén-diamin-tetra-acetát VLDL: Very Low Density Lipoprotein EKG: Elektrokardiogramm PDCF: Platlet Deriveried Chemotacitc Factor ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay FITC-: Flourescein Isothiocyanate- HAART: Highly Active Anti-Retroviral Therapy HBV: Hepatitis B Vírus HCV: Hepatitis C Vírus HDL: High Density Lipoprotein HIV: Human Immunodeficiency Virus HRPO: Horse Radish Peroxidase IDL: Intermediate Density Lipoprotein IgA: Immunglobulin A IgG: Immunglobulin G IgM: Immunglobulin M ISZB: Ischaemiás szívbetegség IVIG: Intravénás immunglobulin LDL: Low Density Lipoprotein Lp(a): Lipoprotein (a) MHC: Major Histocompatibility Complex NGF: Nerve Growth Factor OPD: Orto-phenylene Diamine PBS: Phosphat Buffer Solution 6
2. Előzmények 2.1 A koleszterin és a lipoproteinek szerepe az anyagcsere folyamatokban 2.1.1 A koleszterin A koleszterin a szervezet egyik Janus-arcú molekulája, amely minden eukarióta állati sejtben megtalálható, és életfontosságú funkciók ellátásához nélkülözhetetlen (pl.: emésztés, szaporodás, jelátvitel stb). Ugyanakkor, ha a normálisnál nagyobb mennyiségben fordul elő a vérben, korunk egyik leggyakoribb betegségének, az érelmeszesedésnek, és ennek következtében súlyos betegségek (pl.: szívinfarktus, agyvérzés) kialakulásának lehet indító tényezője. A szervezetben alig található szabad koleszterin, mert kötésbe viszik az erre specifikus enzimek; az előforduló koleszterin 70%-a koleszterin-észterként van jelen. 1 A koleszterin olyan szteránvázas vegyület, mely a növények és gombák kivételével minden eukarióta sejtmembrán felépítésében fontos szerepet játszik. A koleszterinről sokáig azt tartották, hogy a membrán fluiditását szabályozza, oly módon, hogy csökkenti annak passzív permeabilitását, és növeli a lipid kettős-réteg mechanikai tartását. Ma már tudjuk, hogy a koleszterinnek ennél sokkal összetettebb a funkciója. Részt vesz a lipid raftok (membrán mikrodomének) felépítésében, és funkciójukban is kulcsfontosságú. 108 A sejtmembrán lipid raftjai olyan receptorszervező struktúrák a membránban, melyek koleszterinben és szfingolipidekben (szfingomielinben, glikoszfingolipidekben) gazdagok. A koleszterin a szfingolipiddel főként hidrogénkötéssel kapcsolódik: a koleszterin 3- beta-oh és a szfingolipid amid csoportja vesz részt a kötés kialakításában. A lipid raftok feladata a membrán fehérjék szegregálása és koncentrálása. Ezek a dinamikus struktúrák fontosak a lipidek és a fehérjék sejtfelszíni eloszlásának szabályozásában, szerepet játszanak a jelátviteli folyamatokban, és a sejtfelszín polaritásának létrehozásában. Ezekhez a feladatokhoz nélkülözhetetlen, 7
hogy a koleszterin megoszlása ne csak a sejten belül, hanem a membránok között, sőt, az adott membránon belül is szigorú szabályozás alatt álljon. A koleszterin mennyiségének megváltozásával ugyanis a membrán raftokban stabilizált receptorok funkciója akár ellentétesre is változhat. 108 A lipid raftok jelátviteli és regulációs platformot képeznek, integritásukat a koleszterin biztosítja. 71 Ezzel a felismeréssel egyértelművé vált, hogy a membránban található koleszterin nemcsak a sejtmembrán felépítéséhez szükséges, hanem sejtszinten is elengedhetetlen szabályozó funkciót lát el. Koleszterinből szintetizálódnak a különböző szteroid hormonok, amelyek fontosak a normális metabolizmus, a só- és vízháztartás és a nemi működés szabályozásában egyaránt. A koleszterinnek fontos szerepe van a fertőzések elleni védekezésekben. Kötődni képes a streptolyzin-o-hoz és más bakteriális toxinokhoz. A baktériumokban (pl.: Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa) termelt koleszterin-észteráz az endogén észterázhoz hasonlóan szabad koleszterin képzésével gyorsítja a toxinok semlegesítését. 123 A koleszterin kiinduló anyaga az epesavak szintézisének is, amelyek a lipidek emésztéséhez szükségesek, valamint védelmet biztosítanak egyes enterális fertőzések ellen. 2.1.2 A lipoprotein anyagcsere A lipidek a vérben lipoprotein partikulumok formájában keringenek, melyek tömegüket, átmérőjüket, fajsúlyukat és összetételüket tekintve jelentősen különböznek egymástól (1. táblázat). A lipoproteinek lipidek és fehérjék viszonylag állandó arányú makromolekuláris komplexei, melyek a vízoldhatatlan lipidek oldatban tartását, érpályán belüli szállítását és a sejtek lipid-ellátását biztosítják. A plazma lipoproteinjeit ultracentrifugával több különböző sűrűségű osztályra választhatjuk szét (a sűrűség annál nagyobb, minél nagyobb a részecske relatív fehérjetartalma). A lipoproteinek fehérje összetevői, az apoproteinek a szállító 8
funkció mellett receptorkötő, receptoraktiváló, receptorgátló és enzimatikus tevékenységet is kifejtenek. 1 A lipoproteinek általában gömbszerű részecskék, melyeknek belső (középső) részén az apoláris lipidek (koleszterin-észter, trigliceridek) helyezkednek el bizonyos fehérjékkel, míg a gömbszerű magot membránszerű, kettős rétegű burok veszi körül, amely döntően foszfolipidekből és koleszterinből, valamint felszíni apoproteinekből áll. A koleszterin szükségletnek egy része a tápanyagokkal jut a szervezetünkbe, ennek az exogén koleszterinnek, vegyes táplálkozás mellett, csak 35-45%-a (ép bélhám esetén maximum 1000 mg) szívódik fel 42, mely a felszívódás után a májba kerül, ahonnan egy része a VLDL (very low density lipoprotein) részecskéiben visszakerül a keringésbe. 43 A szükséges koleszterin más része endogén úton szintetizálódik a tápanyagok lebontása során keletkező acetil-koenzim A-ból, döntő részben a májban és a vékonybél falában. A képződött koleszterin vagy ún. chylomicronként, vagy VLDL-ként kerül a keringésbe. A VLDL maradék molekulák receptor-mediált úton kerülnek vissza a májba, és eddig még pontosan nem tisztázott mechanizmussal LDL-lé alakulnak. Az LDL a szervezet fő koleszterin-észter donorjának tekinthető. Szükség esetén minden sejtmaggal rendelkező állati sejt képes koleszterint szintetizálni, azonban a sejtek jórészt LDL felvételével jutnak a koleszterin szükségletükhöz. A sejtfelszíni LDL-receptorhoz az LDL az apoprotein B-100 meghatározott részével kötődik és a komplex internalizálódik. Ezt követően az LDL a lizoszómákban alkotórészeire bontódik le. A felszabaduló szabad koleszterin a sejt koleszterin raktárát növeli, mely befolyásolja az LDL-receptort kódoló génszakasz transzkripcióját, és ezáltal csökkenti az expresszálódott LDL-receptorok számát. A koleszterin lebontása döntően a májban történik, ahol epesavak képződnek belőle. A bélcsatornába kiválasztott epesavak és koleszterin mintegy 90-95%-a a terminális ileumból reabszorbeálódik (enterohepatikus recirkuláció), a többi a 9
bélbaktériumok hatására történő átalakulás után a széklettel kiürül. A koleszterin lebontása szempontjából elhanyagolható az a koleszterin mennyiség, amiből a szteroidhormonok képződnek, vagy az, ami a bőrön keresztül kiválasztódik. 1 LIPOPROTEIN CHYLOMICRON VLDL (VERY LOW DENSITY LIPOPROTEIN) IDL (INTERMEDIATE DENSITY LIPOPROTEIN) LDL (LOW DENSITY LIPOPROTEIN) Sűrűség (g/ml) Triglycerid tartalom (%) Apoproteinek <0,95 86 apob-48, apoc-i,-ii,-iii, apoe 0,96-1,006 52 apob-100, apoc-i, -II, -III, apoe 1,006-1,019 23 apob-100, -48, apoc-i, -II, -III, apoe 1,019-1,063 10 apob-100 HDL (HIGH DENSITY LIPOPROTEIN) 1,063-1,21 4 apoa-i, -II, apoc-i,c-iii, apod, apoe LP(A) 1,051-1,082 - apo-b100, apo(a) 1. táblázat: A lipoproteinek sűrűség és összetétel szerinti csoportosítása. 1 10
2.2 A lipoprotein ellenes antitestek Az eddig ismert irodalmi adatok alapján a lipoprotein anyagcsere és az immunfolyamatok kapcsolata igen sokrétű. Emberben patológiás autoantitesteket írtak le, ez hívta föl először a figyelmet a zsíranyagcsere és az immunháztartás kapcsolatára. Az első emberi lipoprotein-ellenes antitesteket Beaumontnak sikerült izolálnia hyperlipoproteinaemiához társult myelomás betegből. 13 Az eddig leírt lipoprotein ellenes antitestek közös ismertetője, hogy az aktivitás az imunglobulinok F ab fragmentumához kötött, azonban támadáspontjuk különböző, és a kapcsolódásuk igen specifikus. 2.2.1 oxldl ellenes antitestek A natív LDL legfontosabb összetevői: körübelül 700 foszfolipid 600 koleszterin, 1 apob 100, valamint a belsejében található 185 triglicerid, 1600 darab koleszterinészter molekula. 113 Mind a lipid, mind az apoprotein rész oxidálódhat. Egyre több kísérletes eredmény támasztja alá, hogy az LDL oxidációjának fontos szerepe van az érelmeszesedés kialakulásában, mind állatokban (nyúl, egér), mind emberben. 88,111,112,125 Az oxldl egyike az immunválaszt provokáló antigéneknek. 113 Különböző epitópokat írtak le az oxldl lipid, apoprotein, fehérje és a fehérjék glükózaminoglikán részein, nyulakban, egerekben és emberen. 81,85,87,88,91,100 OxLDL ellenes antitestek megtalálhatók a szérumban és az atherosclerotikus plakkokban részben immunkomplexek részeként. 88,103,124 Több tanulmányban emelkedett oxldl ellenes autoantitest szinteket írtak le ischaemiás szívbetegségben, diabetes mellitusban, perifériás érelmeszesedésben, hypertóniaban szenvedő és preeclampsiás betegeken. 14,16,66,82,95,103,119 Az irodalmi adatok azonban ellentmondásosak. Paiker familiáris hiperkoleszterinemiás betegek vizsgálata során arra az eredményre jutott, hogy ox-ldl ellenes antitest nem jelzi előre az érelmeszesedés súlyosságát. 84 1-es típusú diabetesesekben Orchard munkacsoportja 82 a kontroll csoporthoz képest emelkedett oxldl-ab titert mért, míg Mironová és munkatársai 74 azonos értékűnek mérték a beteg és az egészséges 11
egyénekből álló csoportok antitest szintjét. Fukumoto egészséges humán populáción végzett mérések alapján felveti, hogy az oxldl kiváltotta immunválasz védő funkcióval bírhat az érelmeszesedés korai stádiumában. 34 Hiperkoleszterinemiás betegcsoporton férfiakban Hulthe és szerzőtársai alacsony IgG-típusú oxldl ellenes antitest szintet mértek. 52 George munkacsoportja szerint az anti-oxldl antitestek megléte hyperlipidaemiával asszociálható. 38 A kutatások arra engednek következtetni, hogy az oxldl kiváltotta immunválasz eleinte előnyös hatású, azaz védi az endotélsejteket a káros hatásoktól, csökkenti az érelemeszesedés progresszióját; később a folyamat előrehaladtával a védőhatás már nem elégséges és a megemelkedett antitestszint kórjelző. 2.2.2 Egyéb lipoprotein ellenes antitestek Baudet által 1978-ban leírt IgA, mely mind emberi, mind állati tisztított VLDL-lel, LDL-lel, HDL-lel, ill. chylomicronnal reagál, kötőhelye a gluphosphorylcholin. 10 Myelómás betegből izoláltak olyan IgG-t, mely csak emberi VLDL, LDL és HDL molekulával reagál. 12 Kilgore és munkatársai szintén hyperlipidémiával társult myelomás betegek szérumából olyan IgA kappa immunoglobint izoláltak, mely VLDL-lel és LDL-lel reagált, de HDL-lel nem. A kötőhelyet a lipoproteinek B és E apoproteinjén találták meg. 57 Gallango humán HDL Va-nak nevezett el egy eddig nem ismert immunglobulin csoportot, ami a HDL ellen termelődött, IgA-típusú autoantitest. 35 Nem csak myelomában ismertek lipoprotein-ellenes antitestek. Nephrosis syndromában 11, SLE-ben már az 1970-es évektől leírtak lipoprotein ellenes antitesteket. Smith aktív stádiumban lévő systemás lupus erythematosusos betegekről számolt be, akik szérumában lipoproteineket és IgG-t tartalmazó immunkomplexek voltak, melyek a betegség remisszióba kerülésével eltűntek a szérumból. 109 Liposarcomához társult hyperlipoproteinaemia esetei is ismertek, mind emberben, mind állatban. 99 12
Az immunglobulin-lipoprotein komplexek szerepet játszanak a hyperlipoproteinaemiákat kísérő xanthoma képződésben. Az anti-pg, IgA antitest hatására a fibroblasztok nem képesek az LDL internalizálására. A komplexben levő koleszterin nem képes az intracelluláris koleszterin szintézis gátlására, így a de novo képződő koleszterin felhalmozódik a sejtben. 13,41 Romics és Kalabay a fent felsorolt tényekből kiindulva a hyperlipoproteinaemiák hátterében autoimmun etiológiát feltételeztek. Az általuk vizsgált 23 beteg szérumaiban nem találtak kóros immunglobulin szaporulatot, ezért felvetették, hogy az autoimmun primer hyperlipoproteinaemia nem tartozik a gyakori fajták közé. 99 2.3 A lipid ellenes antitestek Landsteiner haptén-teóriájának előtérbe kerülésével (amely szerint apró, nem fehérje természetű molekulák önmagukban nem indukálnak antitest termelést) 61, sajnálatos módon háttérbe szorult a lipidek ellen képződő antitestek kutatása. A lipid-ellenes antitestek vizsgálata metodikai nehézségekkel járt, ezért az ELISA technika kifejlesztéséig csak indirekt reakciókkal tudták igazolni az antitestek létezését. 101,104 A foszfolipid-ellenes antitest, 65 a lecitin-ellenes antitest 27 és a koleszterinnel kötésbe lépő immunglobulin 104 után ismerté váltak a szteránvázas nemi hormonok ellen képződő 7,17, D-vitamin elleni 63 és a lipida elleni antitiestek 49 is. Az immunológiai homunculus elmélete alapján akár az is feltételezhető, hogy a szervezetünkben természetesen előforduló mindenféle lipid ellen képesek a B- lymphocyták immunglobulint termelni. 21 2.3.1 Foszfolipidellenes antitestek A lipid ellenes antitestek közül a legtöbbet vizsgált antitest az anticardiolipin (=antifoszfolipid) antitest. Szinte minden SLE-s betegekben megtalálható foszfolipid ellenes (apl) antitest, mely a kardiolipinhez kötődik, ionkromatográfiás tisztítás során elveszti a kötőképességét; sem ELISA lemezhez, sem kromatográfás 13
oszlophoz nem létesít kötést az apl antitest, hacsak BSA-t vagy normál humán szérumot nem adunk újra az immunglobulinokhoz. A mindkét oldatban megtalálható fehérje a β-2-glikoprotein-i (β2-gpi), mely kofaktorként segíti az antitestek kötődését az antigénjükhöz. 72 Az apl antitestek kötődését más fehérjék is segíthetik, ezért megkülönböztethetők kofaktor dependenciájuk alapján (β2-gpi, protein S, prothrombin). 53 Vannak kofaktort nem igénylő apl antitestek, például syphilisben a betegekben apl antitest komplexképződése nem függ a szérum β-2- glikoprotein-i szintjétől. 59,70 14
2.4 Anti-koleszterin antitest 2.4.1 Az anti-koleszterin antitest létezésének bizonyítékai Sachs és Klopstochs 1925-ben figyelte meg a koleszterin immunizáló hatását, és indirekt módon bizonyították a koleszterin ellen képződő antitestek létét. 101 Karl Landsteiner 1930-ban kapott Nobel-díja újra előtérbe helyezte az 1919-ben kidolgozott a haptén teóriát 61, melyre hivatkozva az immunológusok nagy része elvetette a lipidekhez kötődő antitestek létezését. A hetvenes években Sato 104 vizsgálta a koleszterinnel immunizált állatok szérumának megváltozott immunaktivitását és újra felvetette a koleszterin ellen képződő antitest létét. 1980-as évek végén Swartz megfigyelte, hogy a koleszterindús liposzómák a klasszikus útvonalon aktiválják a komplement-rendszert. 114 Ebből indirekt módon következtettek a koleszterin ellen képződő antitestre, majd direkt módon, ELISA teszttel igazolták a létezését. Alving és munkacsoportjának nemcsak állatokban, de egészséges felnőttekben is sikerült kimutatni az antitestet, valamint leírták, hogy az ACHA-nak IgM, IgG, IgA és IgE izotípusa egyaránt létezik. 4 Horváth István vezetésével 1994-ben vizsgáltunk előszőr (lues szempontjából álpozitív) betegek ACHA szintjét. [VI.] Homogén beteg populáción csak krónikus Chagas betegségben szenvedők szérumában mértek, és ott szignifikánsan magasabbnak találták az ACHA titerét a kontroll csoporthoz képest. 8 Addadi munkacsoportja 1996-ban egér lépébe ültetett koleszterin kristályok ellen termelődött monoclonalis koleszterin ellenes antitestek hatását vizsgálta. Kísérleteik szerint a koleszterin kristályok ellen termeltetett antitest különbözik Dijkstra és munkatársai által vizsgált monoklonális egér anti-koleszterin antitesttől, mert ez nem kötődik a koleszterin kristályokhoz, míg az általuk termeltetett viszont a monolayer koleszterin felszínt nem ismeri fel. 54,92 15
Az egérben termeltetett monoklonális ACHA specificitásának vizsgálata azt mutatta, hogy az ACHA a koleszterin -hidroxil csoportját ismeri fel epitópként, minden olyan vegyülethez kötődik, amelyben ez a csoport nem fedett. 28,92 A lipidek és lipoproteinek ellen képződő antitestek léte ma már általánosan elfogadott. Mégis az anti-koleszterin antitest (ACHA) létezését ellenzők legtöbbször felteszik a kérdést: a szervezetben általánosan előforduló molekula ellen miért termelne ellenanyagot az immunrendszer? Minden ember szervezetében megtalálható a saját antigénekkel is reagáló jól szabályozott rendszer melynek része az immunológiai homunculus rendszere-, amely alacsony affinitással reagál a konzervatív elemekkel, míg nagyon gyors eliminációs hatású a patogén kórokozókkal szemben. 21 A szervezetünkben megtalálható koleszterin is konzervatív, eukariótákban mindenütt előforduló molekula, ugyan baktériumokban sokkal ritkább, (anaerob baktériumokban egyáltalán nincs, aerobokban pedig lényegesen kevesebb, mint az állati eukarióta membránokban). 2.4.2 Az anti-koleszterin antitest funkciójának vizsgálata Az ACHA funkcióját eddig elsősorban állatkísérletekben vizsgálták. Amerikai 3 vizsgálatok igazolták, hogy azokban a nyulakban, melyekben ACHAképződést indukáltak intravénás immunizálással, koleszterin etetés ellenére jelentősen csökkent, vagy nem is alakult ki érelmeszesedés, míg a kontroll, nem immunizált állatokban jelentős mértékű volt az aortosclerosis. Saját vizsgálataink során [I.],[IX.] reprodukálni tudtuk ezen eredményeket. Az immunizáláshoz új típusú immunizáló anyagot fejlesztettünk ki (koleszteroszóma), mely abban tér el az eddig alkalmazott antigénektől, hogy csak koleszterinből áll. 50 Az egérben termeltetett monoklonális ACHA specificitásának vizsgálata azt mutatta, hogy humán lipoproteinek közül az ACHA nem kötődik a HDL-hez, viszont az LDL, VLDL és IDL lipoproteinekkel antigén-antitest komplexet hoz létre. 28 16
Az ACHA állatokban jelentkező védő funkciója magyarázható azzal, hogy az ACHA szerepet játszhat az LDL keringésből való eltávolításában, opszonizálja az LDL-t, így a makrofágok Fc-receptoraikon keresztül felvehetik azt. Ezzel a koleszterin eltávolításának egy új, eddig ismeretlen útját feltételezik az LDLreceptor és scavanger-receptor út mellett. 5 A legújabb vizsgálatok szerint a koleszterin ellenes antitestek kötődnek a sejtmembrán mikrodoménjeihez, valamint befolyásolják a koleszterin transzportját is. 60 Az ACHA keletkezésének háttere ma még nem tisztázott. Az egyik feltételezett folyamat szerint az érfalon képződő plakkokban található koleszterin molekulák a védő endothelsejt-réteg sérülése után felszínre kerülve, antitesttermelést indukálhatnak. 5,83 Ez elképzelés összhangban áll a klónszelekció elméletével. Az immunológiai homunculus elmélet szerint születéstől fogva termelődnek az antitestek, szérumban mért szintjüknek a megváltozása mögött genetikai háttér vagy az immunológiai reguláció felborulása feltételezhető. 17
2.5 Az immunológiai homunculus elmélete Az immunrendszer elsődleges feladata megvédeni a többsejtű élőlényeket a patogénekkel szemben. Ebben a folyamatban a legfontosabb a saját és a nem saját struktúrák elkülönítése, amiben a korábbi elfogadott elméletek szerint a klonális szelekciónak van döntő szerepe. 39 A toleranciáról és az autoimmunitásról kialakult nézetek sokat változtak az idők során. Ma már ismert azonban, hogy az immunrendszer működésének természetes eleme az önfelismerés. A jól szabályzott autoreaktivitás nem veszélyezteti sem a szervezet épségét, sem az immunhomeosztázist, és biztosítja az immunológiai toleranciát. 32 Rövid ideig tartó autoimmun válasz egészséges szervezetben is létrejöhet, de a fertőzés lezajlásával többnyire spontán lecsökken a normális szintere. Ennek hátterében az állhat, hogy normális körülmények között kimutathatók a szervezetben autoreaktív T- és B-sejtek, valamint autoantitestek, amelyek kóros következmények nélkül reagálnak saját struktúrákkal. Ilyen értelemben fiziológiás autoimmunitásról is beszélhetünk. 39 Az immunológiai homunculust az immunológusok is csak az utóbbi időben fogadták el. Cohen szerint az autoimmunitás nem rendellenesség, hanem szerves része az ép immunrendszernek. 21 A saját antigének és a hozzájuk kötődő antitestek köre, amelyeket a természetes autoreaktív T- és B-sejtek felismernek, nem véletlenszerű, hanem jól körülhatárolható. Az antigéneket felismerő természetes ellenanyagok valószínűleg a B-1-sejtek termékei. Cohen felveti, hogy a klonális szelekció paradigmáját egy kognitív paradigmával kell felváltani, amely szerint egy információkat gyűjtő és feldolgozó rendszer akkor a legeredményesebb, ha a tárgy belső reprezentációjával rendelkezik. Az immunrendszer általa feltételezett stratégiája az idegrendszeréhez hasonlítható, amely ugyancsak belső képekre épül. Az immunrendszer centrális része egy immunológiai homunculus, amely limitált számú saját struktúra belső képmását tartalmazza. Ez magyarázza egyebek között azt is, hogy miért öröklődnek az ezeket felismerő receptorokat kódoló gének 18
változatlan formában. Az immunológiai homunculust olyan T- és B-sejtek építik fel, melyek a korlátozott számú domináns saját antigénnel reagálni tudnak, és ezeknek szabályozó funkciójuk is van. A homunculus a természetes, szabályozott autoimmunitás megfelelője: befolyásolja az antigén-prezentáló sejtek funkcióit, a klonális aktiváció specificitását és a szabályozó folyamatok működését. Az anyától kapott természetes autoantitestek is segítenek kialakítani a csecsemő saját immunológiai homunculusát. 106 Az immunrendszer nemcsak a kórokozók elpusztításában, hanem a szervezet integritásának megőrzésében is fontos. Az autoimmun T-sejtek szerepet játszhatnak a károsodott szövetek gyógyításában is, meg tudják védeni a központi idegrendszert az axonok degenerációjától, elősegítik a sebek gyógyulását. A fenti folyamatok hátterében a T-sejtek NGF (nerve growth factor) és citokin termelése áll. Az autoimmunitás tehát nemcsak káros, ahogy az autoimmun betegségek alapján eddig feltételeztük, hanem hasznos is lehet. 90 Kutatási eredmények megerősítik az immunreguláció szerepét az érelmeszesedés megelőzésében. 3,34,52,[I.],[III.],[IV.] Ezen védőmechanizmusok felborulása jelentős rizikótényező lehet az atherosclerosis progressziójában. 14,38,81,84,116,[III.] Coutinho ötvözte Cohen elméletét és a klasszikus fertőzések megelőzésére szolgáló immunrendszer képét. 23 Szerinte az immunrendszer, az idegrendszer analógiájára, felosztható centrális és perifériás részre. A centrális rész megfelelne az immunológiai homunculus-nak, míg a perifériás rész védene a fertőzésektől. Úgy gondoljuk, hogy az immunológiai homunculus elmélete a kapott eredményeink magyarázatában segítségünkre lehet. 19
3. KUTATÁSI CÉLOK Már az ötvenes években felvetődött, hogy az érelmeszesedés ellen immunizációval lehet védekezni. A gondolat első kísérletes bizonyítékát 1959-ben Gerő Sándor professzor adta. 40 Meszes érfalból készített antigénnel immunizált kakasokat és nyulakat, melyekben ezután nem alakult ki érelmeszesedés, míg a kontroll csoportot atherosclerotikus erek jellemezték. A kísérletet sokáig nem sikerült reprodukálni. 1967-ben Dallocchio végzett eredményes prevenciós kísérleteket. 25 Az 1990-es években újra fellendült az érelmeszesedés megelőzésének kutatása, azóta is több helyen folynak bíztató állatkísérletek az érelmeszesedés prevenciójára. 6,9,77,86,114,126 Alving és munkacsoportja 1996-ban koleszterin-dús liposzómákkal jelentősen csökkentette az atherosclerosis kialakulását koleszterin-dús diéta mellett. 3 Mivel az eddigi antigének keverékek voltak, munkacsoportunk célja tiszta koleszterinből előállított antigén 50 hatásosságának vizsgálata volt. [I.] Humán ACHA tulajdonságait eddig nem tanulmányozták, ezért célkitűzéseink között szerepelt az ACHA specificitásának vizsgálata. [III.] Nem voltak adatok arra, hogy az ACHA részben vagy egészében azonos-e a többi antilipid antitesttel, ezért felvettettük azt a kérdést, hogy szintje korrelál-e az oxldl ellenes antitesttel [V.], és megvizsgáltuk, hogy az anti-foszfolipid antitesthez hasonlóan az ACHA is kofaktort igényel e a koleszterinhez való kötődéséhez [III.],[VII.]? Állatkísérletes adatok alapján felvetődött, hogy koleszterin tartalmú részecskékkel kellene immunizálni az érelmeszesedés ellen 18,117, de atherosclerotikus eredetű betegcsoportokon nem mértek ACHA-szintet. Ezért megvizsgáltuk ischaemiás szívbetegek, perifériás érbetegek, stroke betegek, hyperlipidaemiás betegcsoport ACHA szintjét. [III.][V.] 20
Előkísérleteink során IVIG és HIVIG ACHA szintjének összehasonlítására nyílt lehetőségünk. Mivel korábban Chagas-betegségben igen emelkedett ACHA szintet találtak 8, és HIVIG-ben is sokszorosa az ACHA szint az IVIG-ének, felvetődik, hogy az infekció emelheti az ACHA szintet. HIV-pozitív betegekben idővel jelentős lipid-eltérések alakulnak ki (csökken a szérum koleszterin, nő a szérum triglicerid szint). Ezért szisztematikus vizsgálatokat végeztünk HIV-pozitív betegeken. HAART (Highly active antiretroviral therapy) befolyásolja a szérum lipid-értékeket, ezért megmértük a HAART hatását is. [IV.] 21
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1 ANYAGOK 4.1.1 Reagensek: 5 -cholesten-3 -ol (koleszterin), 5 -cholestane (koprosztán), és 5,7,22- cholestatrien-24 -methyl-3 -ol (ergoszterin) Sigma (St.Luise, MO), kazein (Reanal, Budapest), torma-peroxidázzal jelzett anti-humán IgG (DAKO, Glostrup) és o-fenilén-diamin (OPD) (Sigma, St. Luise, USA), IVIG (Sandoglobulin 50mg/ml). 4.1.2 Kísérleti állatok Tizenkét darab New Zealand White-nyúl (Kisállat Tenyésztő Központ, Gödöllő, Magyarország). 19 hetes hím nyulak, 2,5 kg-os súly. 4.1.3 IVIG (tisztított intravénás immunglobulin) Sandoglobulin 50mg/ml (Péter Späth ajándéka, Svájc) 4.1.4 HIV-törzsek T-sejt tropikus, H9 sejtekben tenyésztett HIV-1 IIIB törzs. Makrofág tropikus HIV-1 Ba-L makrofágokban tenyésztett törzs. A HIV-1 vírus meghatározása reverz transzkriptáz assay-vel történt. 4.2 Vizsgált szérumok 4.2.1 Normál humán szérum Egészséges önkéntesek véréből centrifugálással nyert szérum (NHS). 4.2.2 Kevert humán szérum LDL, LDL/VLDL preparátumok készítéséhez frissen vett vérből kevert humán szérumot használtunk. 22
4.2.3 Ischaemiás szívbetegektől származó szérum minták 341 beteg (259 férfi / 82 nő, 35-78 évesek) átlagéletkor: 58 év. Mindegyik betegnél mellkasi fájdalommal együtt típusos EKG elváltozást észleltek, melynek háttérben coronarographiával igazolható szignifikáns stenosis állt. A betegeknél nyílt szívműtét során aorto-coronaria by-pass graft beültetés történt. A betegektől az operációt követő hatodik hónapban vettek vért. 91 betegnél az operációt követő egy év múlva újból történt vérvétel. 4.2.4 Stroke betegektől származó szérum minták 146 cerebrovasculáris történésen átesett beteg (70 férfi és 76 nő, 40-92 évesek, átlagéletkor: 69 év). A betegek közül 20-at TIA, 111-et ischaemiás stroke, 15-öt vérzéses stroke diagnózissal gondoztak. A kórházi kezelés megkezdésekor történt a vérvétel. 4.2.5 Perifériás obstrukció miatt kezelt érbetegektől származó szérum minták 86 beteg (58 férfi és 28 nő, 39-78 évesek, átlagéletkor: 58 év) súlyos femoropoplitealis atherosclerotikus érszűkülettel. Angioplastika után (atherectomiát követő műér beültetés) mindegyik beteg reoperáción esett át ismételt érelzáródás miatt. Az első műtét után 5 évvel történt a vérvétel. 4.2.6 Hyperlipidaemiás betegektől származó szérum minták 37 primer kevert típusú hiperlipidaemiás beteg (22 férfi és 15 nő, (átlagéletkor: 47 ±10 év)) lásd 6. táblázat. A betegektől a lipidcsökkentő kezelés, valamint szigorú diéta elindítása előtt vettek vért. 34 esetben állt rendelkezésünkre a klinikai anamnézis is. Ezen betegek között nem volt cukorbeteg, vagy nephrosis syndroma miatt lipidanyagcsere felborulásban szenvedő egyén. Kettő betegnél találtunk adatot ISZB-re (egyik esetben angina pectoris, másikban AMI 2 évvel korábban). Egy beteg esett át stroke-on. 4.2.7 HIV-pozitív betegektől származó szérum minták 46 HIV-poziítv beteg (37 férfi és 9 nő, átlagéletkor: 46 év, CD4+ T szám 25-658 (medián: 320) sejt/ l) szérumában határoztuk meg az ACHA szintet, 23
mindegyik beteg HAART (highly active antiretroviral therapy) kezelésben részesült. 41 betegnél 7-71 hónapon át (medián 26 hónap) követéses vizsgálatot végeztünk. A HAART során súlyos lipodistrophia 5 betegnél alakult ki. 4.2.8 Kontrolloktól származó szérum minták 284 kontroll szérum mintát mértünk meg a kísérletek során. Beteg kontroll: 27 fő, akik myocardialis infarktuson estek át, de nem történt sem by-pass műtét, sem coronarographia. A vérvétel az acut történést követő első és harmadik hónapban történt. Egészséges véradók: Önkéntes véradók, normál koleszterin és triglicerid paraméterekkel. (n=135, 70 férfi, 65 nő, 19-68 év közöttiek, átlagéletkor: 49 év), valamint gerontológiai szűrésen megjelent egészséges emberek (n=83, 30 férfi, 53 nő, 59-84 évesek, átlagéletkor:70 év). A (hyperlipidaemiás vagy hiperlipidemiás) betegekhez választott kontroll csoport 39 egészséges véradóból állt (23 férfi és 16 nő, 46 ±8 év) lásd 7.táblázat. Mindegyik kontroll szérumot HIV-1, HIV-2, CMV, HBV és HCV antitestekre szűrtük. 4.3 MÓDSZEREK 4.3.1 Nyúlimmunizálás - Kísérleti protokoll Két csoportba 6-6 nyulat választottunk, egyiket Immunizált-csoport -nak neveztük el ezeket később koleszteroszómával (CS) immunizáltuk, a másik a kontroll-csoport. Az immunizált csoportba tartozó nyulakat 5 mg CS-val immunizáltuk kilenc alkalommal az alábbiak szerint: Az első, második és harmadik héten hetente két alkalommal oltottuk az állatokat, az oltások között minimum három nap szünetet tartottunk. A negyedik, ötödik és hatodik héten hetente egyszer injektáltuk az antigént. Az immunizálás 6 hétig tartott. A kontroll-csoportban lévő állatokat a fent leírt protokoll szerint a szuszpendáló oldattal kezeltük (ebben az esetben vechiculumnak fiziologiás konyhasó oldatot használtuk). 24
Az oltási periódus alatt az állatok nyúltápot és vizet kaptak. A hetedik héttől mindkét csoport táplálékát kiegészítettük naponta 2 g koleszterint tartalmazó 10 ml-nyi folyadékkal, melyet további 18 héten át adtunk per os. 4.3.2 LDL és VLDL/LDL szeparálás Friss vérvételből származó, 1 órán belül lecentrifugált, kevert, humán szérumhoz 0,1 mm EDTA-t, és 0,1% Na-azidot adtunk, KBr-dal a denzitást 1.063- ra állítottuk. A mintát ultracentrifugáltuk 48000 rpm-mel 24 órán át, majd a VLDL/LDL-frakciót szeparáltuk, melynek protein koncentrációját Lowry-teszttel mértük. Az LDL és a VLDL/LDL frakciók elválasztásához: KBr-dal 1.006-ra állítottuk a denzitást, majd 100.000 x g-vel ultracentrifugáltuk 24 órán át; a szeparált LDL-t desztillált vízzel szemben dializáltuk és a kimerítéses vizsgálatokhoz frissen használtuk fel. 4.3.3 Kolmer reakció Natív vér lecentrifugálása után, a leszívott savót 30 percig 56 o C-on inaktiváltuk. A savókat 1:5 arányban veronál pufferrel higítottuk 0,5 ml térfogatra, három párhuzamost használva. Az első csöhöz 0,5 ml veronál puffert, másodikhoz kardiolipin antigént, harmadikhoz Reiter-protein antigént adtunk. Komplementnek tengerimalacok frissen liofilizált vérszérumát használtuk 1:20-as higításból 0,6 ml mértünk minden csőbe. Összerázás után 24 órán át 4 o C-on inkubáltuk a mintákat, majd 37 o C-on 20 percig, majd minden csőhöz 0,4 ml hemolizinnel szenzibilizált birka vörösvérsejt oldatot adtunk, és vízfürdőben további 20 percig inkubáltuk. Antikomplementernek (AC) tekintettük, ha a vörösvérsejtek a kontroll csőben sem hemolizáltak. 4.3.4 Rapid Plasma Reagin (RPR) teszt Portnoy reakció Vizsgálandó savót és a negatív kontroll savót higítatlanul használtuk, míg a pozitív savóból felező higítási sort készítettünk 4 lépésben. Mandula-lemez mélyedéseibe 50 µl szérummintát cseppentettünk, majd mindegyikhez 25 µl RPR antigénszuszpenziót adtunk. 4 percig 2 kör/sec sebességgel ráztuk szobahőn. 25
Negatívnak tekintettük a mintákat, ha a szuszpenzió a rázás után a mikroszkópos leolvasással (100x nagyítással) is homogén maradt. 4.3.5 Immunkomplex titer mérése Az antikomplementer szérumhoz felező higítási sort készítünk, 0,5 ml mennyiségben. Mindegyik mintához titerére állított komplementet mérunk 0,5 ml mennyiségben. Összerázás után 24 órán át 4 o C-on inkubáltuk a mintákat, majd 37 o C-on 20 percig, majd minden csőhöz 0,4 ml hemolizinnel szenzibilizált birka vörösvérsejt oldatot adtunk, és vízfürdőben további 20 percig inkubáltuk. A titerértéket az 50% higítás reciprokával adjuk meg. 4.3.6 ACHA mérése Az ELISA-lemezeket etanolban oldott koleszterinnel (5 l koleszterin /well (lyuk) 100 l abszolút etanolban oldva) fedtük, a koleszterin fixálása 4 o C-on történt 24 órán át tartó beszárítással. Miután PBS-sel mostuk és kazeinnel (0,1% kazeines PBS-ben) blokkoltuk a lemezt, rámértük a szérumokat 1:800-as hígításban (PBS 0,1% kazeines oldatában hígítva). Az anti-koleszterin antitestek kötésének detektálása torma-peroxidázzal jelzett anti-humán IgG-vel (Dako, Glostrup) és o- fenilén-diaminnal (OPD) (Sigma, St. Luise, USA) valamint H 2 O 2 - szubsztráttal történt. Az optikai denzitást 490 nm-en mértük (a referencia 620 nm). Standardként tisztított immunglobulin (IVIG, Sandoglobulin 50mg/ml) 1:100-tól induló felező hígítási sorát használtuk. Az eredményeket a standard görbéből számolt AU (arbitrary unit)/ml értékben adtuk meg. Minden két vagy három párhuzamos mintaértékhez egy háttér-mérés tartozott, a háttér OD értékeket levontuk a párhuzamosok átlagából. A legtöményebb hígítás (1:100) ACHA szintjét 1000 AU/ml-nek vettük. Nyulak szérumában mért ACHA mérés a fenti leírástól eltér a konjugátumban (torma-peroxidázzal jelzett, anti-nyúl IgGAM (Humán, Gödöllő, Magyarország)), valamint a mérés kiértékelésében. A színreakcióra annyi időt hagytunk, míg 26
szemellenőrzés mellett a kontroll higítási soron jól kivehető elszíneződést kaptunk, de a háttér még nem jelzett színreakciót. 492 nm-en mért OD párhuzamos értékek átlagából a háttér levonása nélkül 0,500 fölötti értéket pozitívnak tekintettünk, a határeseten lévő méréseket 0,5±0,05 megismételtük. 4.3.7 Ergoszterinhez, koprosztánhoz való kötődés vizsgálata A specificitás vizsgálatokhoz az ELISA lemezeket koleszterin mellett ergoszterinnel és koprosztánnal fedtük 5 l/ 100 l koncentrációban, a beszárítás 4 o C-on történt 24 órán át. A többi lépés megegyezett a fent leírtakkal (4.3.6.). 4.3.8 IgG antitestek kötésének gátlása koleszterinnel fedett lemezekhez Az inhibíció VLDL/LDL és LDL preparátummal az alábbiak szerint történt: Az intravénás immunglobulin készítményt (IVIG (1mg/ml)) 60 percen keresztül inkubáltuk 37 o C-on a különböző koncentrációjú VLDL/LDL(0,25-1mg/ml) ill. LDL (0,5-4mg/ml). preparátummal és kontrollként 0,1% kazeinnel. Az IgG kötődését a koleszterinnel fedett lemezhez az elegyek különböző hígításaiban (0.03-0.25 mg/ml ill. 0.03-1.0 mg/ml) mértük 490 nm-en (600 nm-es referencia mellett). IgG antitestek kötődésének gátlását HIV-1 preparátumokkal szintén elvégeztük az alábbiak szerint: a különböző HIV pozitív szérummintáknak 1:80 hígításaihoz 10 6, 10 5 és 10 4 RT cpm/ml HIV-1 BA-L vagy HIV-1 IIIB preparátumokat vagy puffert mértünk. Szobahőmérsékleten 60 perces inkubálási idő után mértük be a mintákat ELISA lemezre, az ACHA mérése a fent leírtak szerint (4.3.6.) történt. 4.3.9 CD4+ sejtszám mérése T sejtek vizsgálatát flow cytometriás módszerrel vizsgáltuk (FACScan) IMK Lymphocyte kit (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) felhasználásával. 27
4.3.10 HIV-1 RNS szint mérés a betegek plazmájában HIV-1 RNS szint mérése a betegek plazmájában NASBA (Organon Teknika, Turnhout, Belgium) teszttel történt. 4.3.11 Szérum lipidértékek mérése Szérum összkoleszterin szint mérése enzimatikus kolorimetrikus módszerrel történt ENZACHOL-F és ENZGlycid-GPO reagensekkel (Diagnosticum, Hungary). Quantitativ triglycerid mérést Hoffmann-LaRoche (Switzerland) tesztjével végeztük. 4.3.12 Statisztikai analízis Megvizsgáltuk a mintákban az antitest eloszlását. Mivel az eloszlás nem normális eloszlású volt, ezért a statisztikai analízis során az anti-koleszterin antitest szint különbözőségét a beteg és a kontroll csoport között a nem parametrikus Mann-Whitney teszttel határoztuk meg, a terápia során a beteg csoportban a változást Wilcoxon próbával ellenőriztük. Az ACHA szintek és a lipid paraméterek között Spearman korrelációt számoltunk. Kruskal-Wallis teszttel hasonlítottuk össze az azonos csoportban különböző időpontokban levett szérum minták ACHA értékeit. Az eredmények megadásánál a p<0.05 szignifikancia szintet választottuk. 28
5. EREDMÉNYEK 5.1 Koleszteroszómával történő immunizálás hatása nyulak koleszterin etetéssel kiváltott érelmeszesedésére 5.1.1 ACHA mérése Az immunizált csoportban és a kontroll csoportban is 6-6 nyulat vizsgáltunk. Háromszor vettünk vért a kísérlet során: első alkalommal a kísérlet megkezdéskor előszőr immunizálás előtt, másodszor a hatodik hét végén, harmadszor a kísérlet befejezésekor a 24-ik héten. A kísérlet kezdetekor egyik csoportban sem volt detektálható koleszterin ellenes antitest. A hatodik hét végén, az immunizált csoportba tartozó állatok mindegyikénél detektálható volt az ACHA, míg a kontroll csoportban egyik állatban sem. A 24. héten az immunizált csoport állatai megőrizték a koleszterin ellenes immunitásukat, míg a kontroll csoportban továbbra sem mértünk ACHA szintet (2. táblázat). Immunizált-csoport Kontroll-csoport 1.hét - - - - - - - - - - - - 6.hét + + + + + + - - - - - - 24.hét + + + + + * - - - - - - 2. táblázat: ACHA detektálása ELISA metodikával nyulak szérumában a kísérlet 1., 6., 24. hetében. (* egy állatot veszítettünk a kísérlet 7. hetében) 5.1.2 Szérum koleszterin szint a nyulakban A kísérlet kezdetekor és a 24. hét végén megmértük a nyulak szérum koleszterin szintjét mindkét csoportban (3. táblázat). A két csoport között 29
kezdetben nem volt szignifikáns különbség, míg a kísérlet végén az immunizált csoportban lényegesen kisebb mértékben emelkedett a koleszterin szint az etetés hatására (Mann-Whitney teszttel szignifikáns (p<0,0001) különbséget kaptunk). 3. táblázat: Szérum koleszterin szintek a kísérlet első és 24. hetében. 5.1.3 Szerológiai reakciók A 24. héten levett vérmintákból RPR (rapid plasma reagin test), Kolmer reakciót és immunkomplex titert mértünk (4. táblázat). Az RPR mindkét csoport állatainak szérumában negatív eredményt adott. A Kolmer reakcióban antikomplementernek (AC) mutatkozott mindegyik szérumminta. Az immunkomplex titerekben mutatkozott némi eltérés, de a különbség nem bizonyult szignifikánsnak. Immunizált csoport Kontroll csoport Mann- Whitney teszt 1.hét 1,1 0,2 mmol/l 1,3 0,3 mmol/l n.s. 24.hét 6,0 0,8 mmol/l 14,43 1,3 mmol/l p<0,0001 Immunizáltcsoport Kontrollcsoport Mann-Whitney teszt RPR Negatív Negatív - KOLMER AC AC - IMMUNKOMPLEX TITER 29 3 34 8 n.s. 4. táblázat: Szerológiai reakciók a nyúl immunizációs kísérlet 24. hetében. 30
5.1.4 Szövettani vizsgálat Az állatokat a 24. héten elvéreztettük, majd mindkét csoportból a nyulak aortáját szövettanilag feldolgoztuk. Egyrészt az aorta teljes hosszában megszámoltuk az atherosclerotikus plakkokat és az érfal felületéhez viszonyítva százalékot számoltunk, másrészt szövettani kép készült az érfalról (lásd: 1. és 2. ábra). Az immunizált csoportból származó minták érfalán plakkot sehol sem észleltünk (0%), míg a kontroll csoport érfelszíne súlyos atherosclerotikus érelválrozásokat mutatott zsíros csíkoktól a meszes plakkos elváltozásig 85±7%- ban. A többi szervben (vese, máj, szív, mellékvese) pathológiai elváltozást nem észleltünk. 31
1. ábra: Koleszterinnel etetett (kontroll) nyúl aortájából készített szövettani metszett hematoxilin eosinnal festve 400 nagyítás. 32
2. ábra: Koleszterin diétán tartott, koleszteroszómával immunizált nyúl aortájából készült szövettani metszet hematoxilin eosinnal festve elválasztó vonal feletti 400x- es, alsó kép 160 x-es nagyítású átnézeti fotó. 33
5.2 ACHA kimutatása egészséges emberekben és tulajdonságainak vizsgálata 5.2.1 Az ACHA és az apl ellenanyagok kötésmechanizmusának összehasonlítása Cardiolipin, azaz foszfolipid-ellenes (apl) antitestek tulajdonságait, SLE-ben betöltött szerepét számos kutatócsoport vizsgálja világszerte. Kísérleteik eredményeként biztosan állíthatjuk, hogy több alcsoportja létezik az apl antitestnek, antigén-antitest kötődés létrejöttét számos kofaktor segíti (pl.: béta-2- glikoprotein-1). Kofaktor nélkül is képes kötést létrehozni az apl antitest (negatívan töltött antikardiolipinnel és foszfatidilszerinnel), ezen antitestek termelődését infekció provokálja, és nem autoimmun betegség. 53,59,70,72 0.75 NHS IVIG OD 490nm 0.50 0.25 0.00 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 IgG (mg/dl) 3. ábra: Koleszterinnel fedett lemezen mért antitest kötődés kimutatása ELISA technikával, tisztított intravénás immunglobulinból(ivig) és kevert normál humán szérumból (NHS) 490 nm hullámhosszon. Ahhoz, hogy meggyőződjünk róla, hogy a koleszterin-ellenes ellenanyag az apl ellenanyaghoz hasonlóan a magát a koleszterint, vagy a lipid szérumfehérjével alkotott komplexét ismeri-e fel; a koleszterinnel fedett lemezeket különböző 34
koncentrációjú tisztított intravénás immunglobulin készítménnyel (IVIG) inkubáltuk. A lemezen ugyanakkor egészséges önkéntes véradók szérumának ACHA tartalmát is megmértük azonos immunglobulin-g koncentrációjúnak higítva, mint az IVIG-et. A koleszterinnel fedett lemezeket a tisztított humán immunglobulin készítmény (IVIG) különböző koncentrációjú oldataival inkubálva dózisfüggő kötődést tapasztaltunk (lásd 3. ábra). Ez az eredmény alátámasztja azt az elképzelést, amely szerint az ACHA a koleszterint direkt módon köti, egyéb szérumfehérje nem szükséges a felismeréshez. 7 mg/dl-nél kisebb koncentrációban erősebb színreakciót kaptunk az NHS esetében, ezért feltételezzük, hogy nem zárható ki egyéb szérumfehérjék (kofaktorok) szerepe sem. 5.2.2 Kompetíciós és specificitás vizsgálatok: Dijkstra 1996-ban írta le, hogy a szérum lipoprotein frakciói közül az egérben termelt monoklonális IgM-típusú koleszterin ellenes ellenanyag ELISA-ban reagál a VLDL, IDL-, és az LDL frakciókkal, de nem reagál a high-density lipoproteinnel. 28 Kíváncsiak voltunk, hogy a humán mintákban előforduló IgG típusú ellenanyag is hasonló reaktivitással rendelkezik-e a különböző lipoprotein frakciókkal. Ennek vizsgálatára LDL-t és VLDL-t szeparáltunk humán szérumból. Kérdésünkre, hogy gátolható-e az ACHA kötődése a szilárd fázisú koleszterinhez humán lipid frakciókkal, az alábbi eredmények adnak választ. Az LDL dózisfüggően gátolta a humán ACHA kötődését a szilárd fázisú koleszterinhez (lásd: 4.A ábra). Ugyanezt a kísérletet végeztük el a különböző koncentrációjú (0.25-8 mg/ml) VLDL/LDL preparátummal is (lásd: 4.B ábra). A magasabb koncentrációk teljes mértékben gátolták a kötődést, míg az alacsonyabb koncentrációknál is kifejezett gátlást tapasztaltunk. Tehát az ACHA kötődése gátolható a szilárd fázisú koleszterinhez humán lipid frakciókkal: VLDL/LDL és LDL preparátummal. Ez a kísérleti eredmény arra utal, hogy az egér monoklonális koleszterin ellenes ellenanyaghoz hasonlóan a 35