Chondroitini natrii sulfas Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-1 01/2009:2064 CHONDROITINI NATRII SULFAS Nátrium-kondroitin-szulfát R = SO 3 Na és R = H vagy R = H és R = SO 3 Na H 2 O(C 14 H 19 NNa 2 O 14 S) x DEFINÍCIÓ Természetes kopolimer, amelynek fő építőelemeit két diszacharidszármazék a [4)-(β-D-glükopiranoziluronsav)-(1 3)-[2-(acetilamino)-2-dezoxi-β-Dgalaktopiranozil-4-[hidrogén-szulfát)]-(1 ] és a [4)-(β-D-glükopiranoziluronsav)- (1 3)-[2-(acetilamino)-2-dezoxi-β-D-galaktopiranozil-6-[hidrogén-szulfát)]-(1 ] nátriumsói alkotják. Az anyag teljes hidrolízise során D-galaktózamin, D- glükuronsav, ecetsav és kénsav szabadul fel. Az anyag kinyerésére szárazföldi és tengeri állatok porcszöveteit egyaránt felhasználják. A 4-szulfát- és a 6-szulfátcsoportok aránya a kinyerésre felhasznált állatfajtól függően eltérő. Tartalom: 95 105% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, nedvszívó por. Oldékonyság: vízben bőségesen oldódik; acetonban és etanolban (96%) gyakorlatilag nem oldódik.
Chondroitini natrii sulfas Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-2 ELŐÁLLÍTÁS A nátrium-kondroitin-szulfát kinyerésére használt állatoknak meg kell felelniük az illetékes hatóságok által az emberi fogyasztásra alkalmas állatok egészsége tekintetében támasztott követelményeknek. A nátrium-kondroitin-szulfát előállításának körülményeit úgy kell kialakítani, hogy a bakteriális és a vírusos szennyeződés kockázata a lehető legkisebb legyen. AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Mintakészítés: R kálium-bromid pasztillák. Összehasonlítás: szárazföldi eredetű kondroitin-szulfát-nátriumhoz CRS nátrium-kondroitin-szulfátot, tengeri eredetű kondroitin-szulfát-nátriumhoz CRS nátrium-kondroitin-szulfátot (tengeri eredetű) használunk. B. Az S1 oldattal (lásd Vizsgálatok) elvégezve a nátriumion b) pont szerinti azonossági reakcióját (2.3.1) az előírt változás észlelhető. C. A Rokon vegyületek vizsgálat során nyert elektroferogramokat értékeljük. Értékelés: a vizsgálati oldat elektroferogramján látható fősáv helye egyezzék meg az a) összehasonlító oldat elektroferogramján megjelenő fősávéval. VIZSGÁLATOK S1 oldat. 2,500 g anyagot 50,0 ml R szén-dioxid-mentes vízben oldunk. S2 oldat. Az S1 oldat 1,0 ml-ét R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. ph (2.2.3): 5,5 7,5. Az S1 oldatot vizsgáljuk. Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): szárazföldi eredetű anyag esetében 20 és 30 között; tengeri eredetű anyag esetében 12 és 19 között. Az S1 oldatot vizsgáljuk és az eredményt a szárított anyagra vonatkoztatjuk. Belső viszkozitás: 0,01 0,15 m 3 /kg.
Chondroitini natrii sulfas Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-3 Vizsgálati oldat (a). Lemérünk 5,000 g (m 0p ) vizsgálandó anyagot és R nátriumklorid 11,7 g/l-es, szobahőmérsékletű oldatából kb. 80 ml-t adunk hozzá. Az oldódás elősegítésére a keveréket 30 percen át szobahőmérsékleten rázatjuk. A kapott oldatot R nátrium-klorid 11,7 g/l-es oldatával 100,0 ml-re hígítjuk, majd 0,45 m-es membránszűrőn megszűrjük. A szüredék első 10 ml-es részletét elöntjük. Az a) vizsgálati oldat koncentrációja csak tájékoztató jellegű, és az oldat viszkozitásának kezdeti megállapítása után a koncentrációt be kell állítani. Vizsgálati oldat (b). Az a) vizsgálati oldat 15,0 ml-éhez R nátrium-klorid 11,7 g/les oldatából 5,00 ml-t elegyítünk. Vizsgálati oldat (c). Az a) vizsgálati oldat 10,0 ml-éhez R nátrium-klorid 11,7 g/les oldatából 10,0 ml-t elegyítünk. Vizsgálati oldat (d). Az a) vizsgálati oldat 5,0 ml-éhez R nátrium-klorid 11,7 g/l-es oldatából 15,0 ml-t elegyítünk. 25,00±0,03 C-on meghatározzuk az R nátrium-klorid 11,7 g/l-es oldatának átfolyási idejét (t 0 ), valamint a négy vizsgálati oldat átfolyási idejét (t 1, t 2, t 3 és t 4 ) (2.2.9). Megfelelő kapilláris viszkozimétert használunk, melynek kapillárisvégződése tölcsér alakú, és jellemzői a következők: műszerállandó kb. 0,005 mm 2 /s 2, kinematikai viszkozitás-tartomány 1 5 mm 2 /s, az R kapilláris belső átmérője 0,53 mm, a C gömb térfogata 5,6 ml, az N cső belső átmérője 2,8-3,2 mm. Valamennyi meghatározást egyazon viszkoziméterrel végezzük, és valamennyi átfolyási időt három párhuzamos mérés alapján állapítjuk meg. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha az eredmények legfeljebb 0,35%-kal térnek el a középértéktől, és ha a t 1 átfolyási idő 1,6 t 0 és 1,8 t 0 közé esik. Ha ez a követelmény nem teljesül, módosítjuk az a) vizsgálati oldat koncentrációját, és az eljárást megismételjük. A relatív viszkozitások kiszámítása. Mivel a kondroitin-szulfát-oldatok sűrűsége és az oldószer sűrűsége csaknem azonos, az η ri relatív viszkozitásokat (η r1, η r2, η r3 és η r4 ) a megfelelő oldatok t i átfolyási idejének (t 1, t 2, t 3 és t 4 ) és az oldószer t 0 átfolyási idejének hányadosából számolhatjuk ki, de figyelembe kell venni a kapillárisra jellemző kinetikus energia korrekciós faktort (B = 30 800 s 3 ), mégpedig a következőképpen: A koncentrációk kiszámítása B ti 2 ti B t0 t 2 0
Chondroitini natrii sulfas Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-4 A nátrium-kondroitin-szulfát kg/m 3 -ben kifejezett koncentrációját (c 1 ) az a) vizsgálati oldatban a következő összefüggés alapján számoljuk ki: ahol x 100 h m0 p 20, 100 100 x = a tartalmi meghatározás alapján kapott nátrium-kondroitin-szulfát-tartalom, százalékban, h = szárítási veszteség, százalékban. A nátrium-kondroitin-szulfát kg/m 3 -ben kifejezett koncentrációját (c 2 ) a b) vizsgálati oldatban a következő összefüggés alapján számoljuk ki: 0,75 c 1 A nátrium-kondroitin-szulfát kg/m 3 -ben kifejezett koncentrációját (c 3 ) a c) vizsgálati oldatban a következő összefüggés alapján számoljuk ki: 0,50 c 1 A nátrium-kondroitin-szulfát kg/m 3 -ben kifejezett koncentrációját (c 4 ) a d) vizsgálati oldatban a következő összefüggés alapján számoljuk ki: A belső viszkozitás kiszámítása 0,25 c 1 A vizsgálati oldatok η si fajlagos viszkozitását (η s1, η s2, η s3 és η s4 ) a relatív viszkozitásokból (η r1, η r2, η r3 és η r4 ) számoljuk ki a következő kifejezés alapján: η ri 1 A belső viszkozitást [η] a következőképpen definiáljuk: s lim c 0 c és lineáris regressziós analízissel, a legkisebb négyzetek alapján számoljuk ki:
Chondroitini natrii sulfas Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-5 ahol si i c c i k H + [ ], c i = a vizsgálandó anyag koncentrációja kg/m 3 -ben kifejezve, k H = Huggins-állandó. Rokon vegyületek. Elektroforézis (2.2.31). A-tompítóoldat (0,1 M bárium-acetát oldat, ph 5). 25,54 g R bárium-acetátot 900 ml R vízben oldunk. Az oldat ph-ját R tömény ecetsavval 5,0-re állítjuk be, majd térfogatát R vízzel 1000,0 ml-re egészítjük ki. B-tompítóoldat (1 M bárium-acetát oldat, ph 5). 255,43 g R bárium-acetátot 900 ml R vízben oldunk. Az oldat ph-ját R tömény ecetsavval 5,0-re állítjuk be, majd térfogatát R vízzel 1000,0 ml-re egészítjük ki. Festőoldat. 1,0 g R toluidinkéket és 2,0 g R nátrium-kloridot 1000 ml 0,01 M sósavban oldunk. Az oldatot megszűrjük. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból R vízzel 30 mg/ml-es oldatot készítünk. Összehasonlító oldat (a). CRS nátrium-kondroitin-szulfátból R vízzel 30 mg/ml-es oldatot készítünk. Összehasonlító oldat (b). Az a) összehasonlító oldat 2,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). R víz és b) összehasonlító oldat azonos térfogatarányú elegye. Vizsgálat. Az elektroforézis hordozón a lemezt 10 C-ra hűtjük. Előzetes egyensúlybeállítás céljából az agarózgélt 1 percre az A-tompítóoldatba merítjük. A folyadékfelesleget óvatos dekantálással távolítjuk el. A gélt mintegy 5 percig szárítjuk. Az elektroforézis készülék mindkét tartályába 400 ml B-tompítóoldatot töltünk. Az agarózgél mélyedéseibe valamennyi oldatból 1 1 l-t viszünk fel. R glicerin 50 %V/V-os oldatából néhány ml-t pipettázunk a készülék lehűtött lemezére, majd a gélt a kerámia lemez közepére helyezzük. Az agarózgél pozitív és negatív oldalára egy-egy B-tompítóoldattal telített kanócot illesztünk. Biztosítjuk az elektroforézishez használt tompítóoldat és az agarózgél közti jó vezetést. Az elektroforézis kivitelezésének körülményei: 75 ma/gél, amely egy kb. 12 10 cmes gélen 100-150 V (legfeljebb 300-400 V) feszültség hatására alakul ki. Az elektroforézist 12 percen át folytatjuk. Ezután a gélt 2 percre R vízmentes etanolból (10 térfogatrész) és A-tompítóoldatból (90 térfogatrész) készült elegybe helyezzük,
Chondroitini natrii sulfas Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-6 és az elektroforézist 20 percen át folytatjuk. A gélt 2 percre R vízmentes etanolból (30 térfogatrész) és A-tompítóoldatból (70 térfogatrész) készült elegybe helyezzük, és az elektroforézist 20 percen át folytatjuk. A festőoldatban 10 percig festjük a gélt. A festék kimosására 15 percen át csapvízet folyatunk a gélre, majd 10-15 percen át R vízzel mossuk, hogy a c) összehasonlító oldat elektroferogramján a sáv láthatóvá váljék. A gélt hagyjuk megszáradni. Rendszeralkalmasság: a c) összehasonlító oldat elektroferogramján egy sáv látható; a b) összehasonlító oldat elektroferogramján a sáv határozottan látható és helye megegyezik az a) összehasonlító oldat elektroferogramján megjelenő sáv helyével. Értékelés: a vizsgálati oldat elektroferogramján nem jelenhet meg olyan szekunder sáv, amely intenzívebb, mint a b) összehasonlító oldat elektroferogramján látható sáv (2%). Fehérje (2.5.33, 2. módszer): legfeljebb 3,0%. (szárított anyagra). Vizsgálati oldat. 1,0 ml S1 oldatot 0,1 M nátrium-hidroxid oldattal 50,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldatok. Pontosan mért, kb. 0,100 g R szarvasmarha albumint 0,1 M nátrium-hidroxid oldattal 50,0 ml-re oldunk. A hígításokhoz is 0,1 M nátriumhidroxid oldatot használunk. Klorid (2.4.4): legfeljebb 0,5%. 1 ml S2 oldatot R vízzel 15 ml-re hígítunk. Nem használunk hígított salétromsavat. Az összehasonlító oldatot 5 ml R klorid mértékoldattal (5 ppm Cl) és 10 ml R vízzel készítjük. Nehézfémek (2.4.8/C): legfeljebb 20 ppm. 1,0 g anyagot vizsgálunk. Az összehasonlító oldatot 2 ml R ólom mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 12,0%. Az anyag 1,000 g-ját 4 órán át szárítószekrényben 100 105 C-on szárítjuk. Mikrobiológiai szennyezés. TAMC: elfogadási követelmény 10 3 CFU/g (2.6.12). TYMC: elfogadási követelmény 10 2 CFU/g (2.6.12).
Chondroitini natrii sulfas Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-7 Staphylococcus aureus nem lehet jelen (2.6.13). Pseudomonas aeruginosa nem lehet jelen (2.6.13). Escherichia coli nem lehet jelen (2.6.13). Salmonella nem lehet jelen (2.6.13). Epeálló Gram-negatív baktériumok nem lehetnek jelen (2.6.13). VIZSGÁLATOK Vizsgálati oldat (a). A vizsgálandó anyag 0,100 g-ját (m 1 ) R vízzel 100,0 ml-re oldjuk. Vizsgálati oldat (b). Az a) vizsgálati oldat 5,0 ml-ét R vízzel 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). A Szárítási veszteség vizsgálat előírása szerint szárított CRS nátrium-kondroitin-szulfát 0,100 g-ját (m 0 ) R vízzel 100,0 ml-re oldjuk. Összehasonlító oldat (b). Az a) összehasonlító oldat 5,0 ml-ét R vízzel 50,0 ml-re hígítjuk. Titráló oldat (a). Pontosan mért, 4,000 g R cetilpiridinium-klorid-monohidrátot R vízzel 1000 ml-re oldunk. Titráló oldat (b). Pontosan mért, 1,000 g R cetilpiridinium-klorid-monohidrátot R vízzel 1000 ml-re oldunk. Vizuális vagy fotometriás titrálást végzünk a következők szerint: Vizuális titrálás. 40,0 ml a) összehasonlító oldatot és 40,0 ml a) vizsgálati oldatot titrálunk az a) titráló oldattal. A oldat zavarossá válik. A végpontban a folyadék feltisztul, miközben a szuszpenzióban csaknem fehér csapadék keletkezik. A csapadék észrevehetőbb, ha a titrálás megkezdése előtt R metilénkék 1%-os oldatából 0,1 ml-t teszünk az oldathoz. A csapadékrészecskék kék háttér előtt jobban észlelhetők. Fotometriás titrálás. 50,0 ml b) összehasonlító oldatot és 50,0 ml b) vizsgálati oldatot titrálunk a b) titráló oldattal. A végpont megállapításához megfelelő automata titráló berendezést használunk, olyan fotoelektróddal ellátva, amely a látható tartományban lehetővé teszi a megfelelő hullámhosszon történő mérést (nincs kritikus hullámhossz). A százalékos nátrium-kondroitin-szulfát-tartalmat a következő összefüggés alapján számoljuk ki:
Chondroitini natrii sulfas Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-8 ahol v m v 0 m 1 100 Z 100 h 1 0, v 0 = az adott összehasonlító oldat titrálására fogyott, megfelelő titráló oldat térfogata, milliliterben, v 1 = h az adott vizsgálati oldat titrálására fogyott, megfelelő titráló oldat térfogata, milliliterben, = a vizsgálandó anyag szárítási vesztesége, százalékban, Z = a CRS nátrium-kondroitin-szulfát százalékos H 2 O(C 14 H 19 NNa 2 O 14 S) x - tartalma. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban fénytől védve. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni az anyag eredetét (tengeri vagy szárazföldi).