Albumini humani solutio Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.6-1 ALBUMINI HUMANI SOLUTIO Humán albumin oldat 01/2010:0255 DEFINICIÓ A humán albumin oldat olyan vizes fehérje oldat, melyet a Humán plazma frakcionálás céljára (0853) cikkely előírásainak megfelelő plazmából nyernek. ELŐÁLLÍTÁS Az albumin elválasztása ellenőrzött körülmények között történik, különös tekintettel a ph-ra, az ionerősségre és a hőmérsékletre annak érdekében, hogy a végtermék összes fehérje tartalmának legalább 95%-a albumin legyen. A humán albumint 150 250 g/l összes fehérje-tartalmú koncentrált oldatként vagy 35 50 g/l összes fehérje-tartalmú izotóniás oldatként készítik. A hőmérsékleti hatások kivédésére, megfelelő koncentrációban, megfelelő stabilizáló anyagok adhatók a készítményhez, például nátrium-kaprilát (nátrium-oktanoát), N-acetil-triptofán vagy a kettő keveréke. Mikrobiológiai tartósítószer az előállítás egyik szakaszában sem alkalmazható. Az oldatot baktériumszűrőn bocsátják át, steril tartályokba aszeptikusan letöltik, amelyeket azután a szennyeződés elkerülése céljából lezárnak. Az oldatot a végső tartályban 60 ± 1,0 C-ra melegítik, és legalább 10 órán keresztül ezen a hőmérsékleten tartják. A tartályokat ezután legalább 14 napig 30 32 C-on, vagy legalább négy hétig 20 25 C-on inkubálják, végül vizuálisan vizsgálják mikrobiológiai szennyeződésre. SAJÁTSÁGOK Tiszta, enyhén viszkózus folyadék; csaknem színtelen, sárga, borostyánszínű vagy zöld. AZONOSÍTÁS Megfelelő immunelektroforézis technikával vizsgáljuk. Normál humán szérumfehérjék elleni antiszérumot használva összehasonlítjuk a normál humán szérumot és a vizsgálandó készítményt, amelyeket 10 g/l fehérjetöménységűre
Albumini humani solutio Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.6-2 hígítottunk. A vizsgálandó készítmény fő összetevője feleljen meg a normál humán szérum fő összetevőjének. A készítményben kis mennyiségben más plazmafehérjék is jelen lehetnek. VIZSGÁLATOK ph (2.2.3): 6,7 7,3. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy 10 g/l fehérjetöménységű oldatot nyerjünk. Összes fehérje. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy 2 ml oldat kb. 15 mg fehérjét tartalmazzon. Az oldat 2,0 ml-éhez kerek aljú centrifugacsőben R nátrium-molibdenát 75 g/l töménységű oldatának 2 ml-ét, valamint 1 térfogatrész R nitrogénmentes tömény kénsav és 30 térfogatrész R víz elegyének 2 ml-ét adjuk. Az elegyet összerázzuk, 5 percig centrifugáljuk, a felülúszó folyadékot leöntjük, és a nyílásával lefelé fordított csövet szűrőpapírra állítjuk, hogy az felszívja a nedvességet. A csapadék nitrogéntartalmát kénsavas roncsolásos módszerrel (2.5.9) meghatározzuk, és az eredményt 6,25-dal szorozva kiszámítjuk a fehérjetartalmat. A készítménynek a címkén megjelölt fehérjemennyiség 95 105%-át kell tartalmaznia. Fehérjeösszetétel. Zónaelektroforézis (2.2.31). Hordozó közegként megfelelő cellulóz-acetát, vagy agaróz gél csíkokat, elektrolitoldatként R1 barbitál tompítóoldatot (ph 8,6) használunk. Amennyiben cellulóz-acetát a hordozó közeg, az alábbi módszer alkalmazható. Agaróz gél használata esetén, és mivel ezek rendes esetben egy automatizált rendszer részei, az alábbiakban leírtak helyett a gyártó utasításai az irányadóak. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy az oldat fehérjekoncentrációja 20 g/l legyen. Összehasonlító oldat. BRP elektroforézisre szánt humán albumint R nátriumklorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy 20 g/l fehérjekoncentrációjú oldatot nyerjünk. 10 mm széles sávban 2,5 μl, vagy keskenyebb csíkot használva milliméterenként 0,25 μl vizsgálati oldatot viszünk fel a csíkra. Egy másik csíkra ugyanilyen módon ugyanekkora térfogatú összehasonlító oldatot viszünk fel. Megfelelő nagyságú elektromos térerőt alkalmazunk, úgy, hogy a leggyorsabb sáv legalább 30 mm-t vándoroljon. Ezután 5 percen keresztül R amidofekete-10b oldattal, majd 10 térfogatrész R tömény ecetsav és 90 térfogatrész R metanol elegyével kezeljük a csíkokat, amíg a háttér éppen el nem színtelenedik. A csíkokat ezután 19 térfogatrész R tömény ecetsav és 81 térfogatrész R metanol elegyével átlátszóvá tesszük, majd 600 nm-en
Albumini humani solutio Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.6-3 megmérjük a sávok abszorbanciáját, olyan műszerrel, mely a méréstartományon belül lineáris választ ad. Csíkonként 3 mérés átlagából számítjuk az eredményt. Rendszeralkalamasság: az összehasonlító készítmény cellulóz-acetáton, vagy agaróz gélen felvett elektroferogramján a fősávban található fehérjék aránya az összehasonlító készítmény kísérőiratában megjelölt határok közé esik. Értékelés: a vizsgálati oldat cellulóz-acetáton, vagy agaróz gélen felvett elektroferogramján a fehérjék legfeljebb 5%-ának lehet a fő sávétól eltérő mozgékonysága. Molekulaméret eloszlás. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával olyan töménységűre hígítjuk, mely a használt kromatográfiás rendszerben alkalmazható. 4 12 g/l töménység és 50 600 μg injektált fehérje általában megfelelő. Oszlop: méretei: l = 0,6 m, = 7,5 mm, vagy l = 0,3 m, = 7,8 mm, állófázis: 10 000 500 000 relatív molekulatömegű globuláris fehérjék frakcionálására alkalmas R kromatográfiás célra szánt hidrofil szilikagél. Mozgófázis: 4,873 g R vízmentes dinátrium-hidrogén-foszfátot, 1,741 g R nátrium-dihidrogén-foszfát-monohidrátot, 11,688 g R nátrium-kloridot és 50 mg R nátrium-azidot 1 liter R vízben oldunk. Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc Detektálás:spektrofotométerrel, 280 nm-en. A polimerek és aggregátumok csúcsa a kromatogram azon részén helyezkedik el, mely a kizárásos térfogatot képviseli. A stabilizáló anyaghoz tartozó csúcsot nem vesszük figyelembe. A polimerekhez és aggregátumokhoz tartozó csúcs a kromatogram teljes területének legfeljebb 10%-a lehet (ez kb. 5% polimernek és aggregátumnak felel meg). Hem. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy 10 g/l fehérjetartalmú oldatot kapjunk. Az oldat 403 nm-en mért abszorbanciája (2.2.25) legfeljebb 0,15 lehet. Kompenzáló folyadékként R vizet használunk. Prekallikrein aktivátor (2.6.15): legfeljebb 35 NE/ml. Alumínium. legfeljebb 2,0 10 2 μg/l. Atomabszorpciós spektrometria (2.2.23, I. vagy II. módszer). Atomizáló egységként grafitkemencét használunk.
Albumini humani solutio Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.6-4 Az oldatok elkészítéséhez műanyag tartályokat, és ahol csak lehetséges, műanyag eszközöket használunk. Használat előtt az üvegeszközöket (vagy egyéb eszközöket) salétromsavval (200 g/l HNO 3 ) mossuk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt használjuk, amelyet szükség esetén hígítunk. Összehasonlító oldatok. Legalább három összehasonlító oldatot készítünk pl. úgy, hogy R alumínium mértékoldatot (10 ppm Al) R oktoxinol 10 1 g/l töménységű oldatával hígítunk olyan koncentrációtartományban, amelybe a vizsgálandó készítmény alumínium-koncentrációja várhatóan beleesik. Monitoroldat. A vizsgálati oldathoz R alumínium mértékoldatot (10 ppm Al) vagy egyéb alkalmas bizonylatolt referenciaanyagot adunk olyan mennyiségben, hogy az oldat alumínium-koncentrációját 20 μg/l-rel növeljük. Üres oldat. R oktoxinol 10 1 g/l töménységű oldata. Hullámhossz: 309,3 nm vagy más alkalmas hullámhossz. Résszélesség: 0,5 nm. Grafitcső: pirolitikusan bevont, beépített platformmal. Háttérkorrektor: kikapcsolva. Atomizáló egység: grafitkemence; a leolvasások között kiizzítjuk. A 0255.-1 táblázatban példaként megadott működési beállítások egy adott készülék esetében megfelelőnek bizonyultak. Az optimális körülmények létrehozása érdekében a beállítások módosíthatók. Injektálás: a következő oldatokból 3 3 alkalommal injektálunk: üres oldat, összehasonlító oldat, vizsgálati oldat, monitoroldat. 0255.-1. táblázat. Példaként megadott, megfelelőnek talált működési beállítások. Lépés Végső hőmérséklet ( C) Hőmérséklet beállási idő (s) Hőmérséklet tartási idő (s) Gáz 1 120 10 80 argon 2 200 5 20 argon 3 650 5 10 argon 4 1300 5 10 argon 5 1300 1 10 nincs 6 2500 0,7 4 nincs 7 2600 0,5 3 argon 8 20 12,9 3 nincs Rendszeralkalmasság:
Albumini humani solutio Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.6-5 a monitoroldathoz adott alumínium visszanyerése 80 120%. Az összehasonlító oldat segítségével kapott eredményekből kalibrációs egyenest készítünk, és a kalibrációs egyenes felhasználásával meghatározzuk a vizsgálandó készítmény alumínium-tartalmát. Kálium: legfeljebb 0,05 mmol K, 1 gramm fehérjére számítva. Atomemissziós spektrometria (2.2.22, I. módszer). Hullámhossz: 766,5 nm. Nátrium: legfeljebb 1,60 10 2 mmol Na/liter; a deklarált Na-tartalom 95 105%-a. Atomemissziós spektrometria (2.2.22, I. módszer) Hullámhossz: 589 nm. Sterilitás (2.6.1). A készítmény feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. Pirogének (2.6.8) vagy Bakteriláis endotoxinok (2.6.14). A készítmény feleljen meg a pirogén vizsgálat követelményeinek, vagy lehetőleg, amennyiben indokolt és engedélyezett, egy olyan validált in vitro vizsgálatnak, mint például a bakteriális endotoxin vizsgálat. Pirogén vizsgálathoz a 35 50 g/l-es fehérjetartalmú oldat esetén a nyulaknak testtömeg kilogrammonként 10 ml-t, 150 250 g/l-es fehérjetartalmú oldat esetén pedig testtömeg kilogrammonként 5 ml-t fecskendezünk be a vizsgálandó készítményből. Amennyiben a bakteriális endotoxin vizsgálatot alkalmazzuk, a vizsgálandó készítmény 50 g/l-es fehérjetartalmú oldatotok esetén legfeljebb 0,5 NE/ml endotoxint, 50 200 g/l fehérjetartalmú oldatok esetén legfeljebb 1,3 NE/ml endotoxint, 200 250 g/l fehérjetartalmú oldatok esetében pedig legfeljebb 1,7 NE/ml endotoxint tartalmazhat. ELTARTÁS Fénytől védve. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: a készítmény nevét, a készítmény térfogatát, a fehérjetartalmat, g/l-ben kifejezve,
Albumini humani solutio Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.6-6 a nátriumtartalmat, mmol/l-ben kifejezve, hogy a terméket nem szabad felhasználni, ha az zavaros, vagy ha üledék képződött benne, minden adalékanyag (pl. stabilizáló anyag) nevét és koncentrációját.