A HLA antigének és biológiai jelentőségük.

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "A HLA antigének és biológiai jelentőségük."

Dávid Bodnár
9 évvel ezelőtt
Látták:

1 A HLA antigének és biológiai jelentőségük. Dr. Kozma László OVSZ Debreceni Regionális Vértranszfúziós Központ

2 A HLA ANTIGÉNEK centromer HLA 6. kromoszóma DP DQ DR B C A MHC II MHC III MHC I B C A

3 A HLA antigének öröklődése a/b c/d a/c a/c a/d b/d Példaként egy tetszőleges haplotípus: HLA-A2, B12, Cw4, DR15, DQ2

4 Nómenklatúra és szuperantigének Szerológiai specifitás: (génlókusz + allél) HLA-A 1 HLA-B 7 HLA-Cw 3 DNS alapú tipizálás: HLA-DRB1*0104 HLA-DRB3*0203 HLA-DQB1*0304 (DQ7) Szuperantigének: HLA-Bw 4, 6 HLA-DR 51, 52, 53

5 Az egyes HLA lokuszokon található allélek száma Lokusz Allélek DNS szinten Szerológiai megfelelő HLA-A HLA-B HLA-C 74 9 HLA-DRB HLA-DQB HLA-DPB1 84 (-)

megfelelő HLA-A 119 40 HLA-B 245 88 HLA-C 74

6 HLA I. osztálybeli keresztreagáló csoportok (CREG) A1 CREG (1 C) A 1,3,9,10,11,28,19 A2 CREG (2C) A 2,9,28 B5 CREG (5C) B 5,15,17,18,35,70 B7 CREG (7C) B 7,13,27,22,40,41,42,47,48 B8 CREG (8C) B 8,18,15,16 B12 CREG (12C) B 12,21,13,40,41

7 MHC II. osztály antigénjeinek meghatározása kevert limfocita kultúrával (MLR) A vizsgálandó limfocitákat keverik homozigóta irradiált és/vagy mitomycin-c-vel kezelt leukocitákkal. 4-6 napos kultúrában az idegen II. osztály antigént felismerik a T sejtek. Bekövetkezik a transzformáció (DNS szintézis és megnagyobbodás: blastogenezis) és proliferáció (mitogenezis). Mérik a radioaktív timidin inkorporációját (tricium-jelzett: 3 H). Citotoxikus T limfociták képződése: mismatch az I. és II. osztály antigénjeire. A citotoxikus hatás csak az I. osztályra korlátozott.

mitomycin-c-vel kezelt leukocitákkal. 4-6 napos kultúrában az idegen II. osztály antigént felismerik a T sejtek.

8 Veseátültetés és allograft rejekció Graft túlélés: egy éves 92-95%, 3-5 éves 70-90% A szervdonorok 1/3-a élő, 2/3-a cadaver (érrendszeri és daganatos betegségek, diabetes kizárva) Host-versus-graft reakció: túlélés xeno-allo-izo-autograft sorrendben. Számolni kell a minor histocompatibilitási antigénekkel, immun-memóriával a szekunder válasz kapcsán. Komplikációk: akut és krónikus rejekció, gyógyszer toxicitás (nefrotoxikus cyclosporin), fertőzések, vesefunkcióval összefüggő problémák, tumor incidencia nő (lymphoma, laphámcc.)

Számolni kell a minor histocompatibilitási antigénekkel, immun-memóriával a szekunder válasz kapcsán.

9 A rejekció típusai Hiperakut rejekció: magas titerű preformált HLA I. osztály antitestek jelenlétében, percek alatt előáll. Gyorsult (szekunder) rejekció: a második graft az elsővel részben azonos antigéneket hordoz. Szenzitizált T ly jelenlétében 2-5 nap alatt kialakul. Akut rejekció: elsődleges T sejt aktiváció révén 1-3 hét múlva lép fel. Krónikus rejekció: tisztázatlan okok miatt (antitestek, immunkomplexek, sejtes reakciók) hónapokkal, évekkel később jelentkezik.

Gyorsult (szekunder) rejekció: a második graft az elsővel részben azonos antigéneket hordoz.

10 Examples of selected immunosuppressive agents AGENT Corticosteroids, prednisone Cyclosporin, FK-506 Rapamycin Azathioprine, 6-MP Methotrexate Cyclophosphamide, melphalan POSSIBLE ACTION Anti-inflammatory, alter T cell and PMN traffic Inhibiting IL-2 synthesis Blocking IL-2-R signal Purine metabolism Folate metabolism Alkylation of DNA, RNA and proteins

melphalan POSSIBLE ACTION Anti-inflammatory, alter T cell and PMN traffic Inhibiting

11 A graft túlélési idejének növelése Donor szelekció: egypetéjű ikrek, HLA azonosság, egyezés a D/DR lókuszon, ABO kompatibilitás! Recipiens előkezelése: fertőzésmentes és nem lehet magas vérnyomása. 1-5x ml teljes vér transzfúziója a donortól ajánlott. Immunszuppresszív terápia: az antigén által kiváltott T sejt proliferációt gátolják (cyclosporin A, FK-506 tacrolimus, rapamycin

Recipiens előkezelése: fertőzésmentes és nem lehet magas vérnyomása.

12 A csontvelő transzplantáció megközelítése I. Autológ csontvelő: probléma a tárolás, hűtés. nincs GVHL II. Rokon donorok: monozigóta ikrek HLA identikus testvérek egy antigén különbséggel rendelkező szülő. III. Nem rokon donorok.

13 Bone Marrow Donor Worldwide 41 ország 56 donor regiszter 21 ország 38 köldökvér regiszter Összesen több mint 10 millió regisztrált donor ill. köldökvér egység Magyar Csontvelődonor Regiszter 5000 regisztrált csontvelő donor

több mint 10 millió regisztrált donor ill.

14 HLA and disease associations DISEASE ALLÉL PATIENTS% CONTROL% RR Ankylosing Spondylitis B ,4 Reiter s syndrome B ,0 Acute anterior Uveitis B ,4 Psoriasis vulg. Cw ,3 DR ,4 Dermatitis herpetiformis Celiac disease DR ,8 IDDM DR 3/ ,9

Acute anterior Uveitis B 27 52 9 10,4 Psoriasis vulg.

15 MÓDSZEREINK I HLA-A,-B,-C antigének meghatározása szerológiailag Terasaki-féle limfocitotoxicitási mikroteszt

16 A DNS alapú HLA tipizálás módszerei Restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) Szekvencia specifikus oligonukleotid (SSO) hibridizáció Módosított SSO: ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay) HLA PCR-SSP (sequence-specific primer) tipizálás HLA SBT (sequence-based typing) módszer DNS mikrochipek alkalmazása

ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay) HLA PCR-SSP (sequence-specific

17 A HLA tipizálás PCR-SSP módszerének elve A sikeres amplifikáció előfeltétele a tökéletes egyezés a primer-templát hibridben a primer 3 végén TAGTCAGTTCAATCGGGAG Teljes egyezés ATCAGTCAAGTTAG van termék TAGTCAGTTCAATCGGGAG 3 mismatch - ATCAGTCAAGTTA nincs termék C

primer 3 végén TAGTCAGTTCAATCGGGAG Teljes egyezés ATCAGTCAAGTTAG

18 A HLA PCR-SSP módszer kivitelezése DNS izolálás Generation Capture Column kittel Specifikus amplifikáció PCR reakcióban Kiértékelés

19 DNS IZOLÁLÁS GENERATION CAPTURE COLUMN KITTEL 300 µl perifériás vérből 5-10 µg DNS

20 ESZKÖZEINK HLA-DR antigének meghatározása genetikailag PCR készülék HLA-DRB SSP Kit DNS Purifikációs oldat

21 POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR) I HLA DRB-SSP Kit PCR minta - HLA specifikus primer párok PCR: Ha a hozzáadott szekvencia a keresett allélnak megfelelő, a génszakaszok amplifikálódnak.

22 Specifikus amplifikáció PCR reakcióval Előfeltétele: kielégítő mennyiségű és tisztaságú genomiális templát DNS Megjegyzés: ne használjunk sem heparint, sem szerves oldószereket

23 A specifikus amplifikáció (PCR) paraméterei Kezdeti denaturálás 94 o C, 2 perc 10 ciklus: Denaturálás 94 o C, 10 mp Annealing & extension 65 o C, 60 mp 20 ciklus: Denaturálás 94 o C, 10 mp Annealing 61 o C, 50 mp Extension 72 o C, 30 mp

24 POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR) II Festés Gélelektroforézis UV szűrő lámpa HLA-DR 16,13

25 HLA-DR genotipizálás PCR-SSP módszerrel

26 A specifikus amplifikációt befolyásoló tényezők A PCR hőmérsékleti paraméterei (annealing temperature) A genomiális templát DNS mennyisége Mg 2+ koncentráció

27 A HLA GENOTIPIZÁLÁS ELŐNYEI Szerológiai tipizálás feltételei Ép target sejtek (dye exclusion) Kielégítő mértékű felületi antigénsűrűség DNS alapú valamivel gyorsabb nagyobb részletesség (humorális-sejtes immunválasz) standardizálható nem szükséges élő limfocita

28 HLA SBT rendszer (sequencing-based typing)

29 A DNS microarray hibridizáció alkalmazása a HLA rendszer vizsgálatában Alacsony- és nagy felbontású HLA tipizálás Guo Z, Hood L, Petersdorf EW: Rev.Immunogenet Haddock SH et al. Methods Mol. Biol HLA antigének és ligandok expressziójának mérése Gutgemann A. et al.: Arch. Dermatol. Res Sturniolo T. et al.: Nat. Biotechnol

36 DNS izolálás Generation Capture Column kittel A minta tisztítása A minta elúció A DNS tartalom mérése

37 A minta tisztítása Felvisszük a 300 μl teljes vért vagy sejtszuszpenziót az oszlopra 5 percig áll. Hozzáadunk 400 μl DNS Purification oldatot 1 percig áll RT. Centrifugálás 30 mp, 4000 g. Az előző két fázis ismétlése. 200 μl DNS Elúciós oldat - inkubálás nélkül centrifugálás.

38 Minta elúció Vidd át az oszlopot tiszta csőbe. Adj hozzá 100 μl DNS elúciós puffert. Inkubáld 10 percig 99 o C-on. Centrifugáld: 30 mp, 8000 g. Tárolás: 3 hónapig 4 o C-on, hosszabb időre 20 o C-on.

39 A DNS tartalom mérése 20 μl minta + 80 μl puffer: a minta DNS cc: μg/ml A maradék kb 75 μl minta DNS tartalma: 3,75-6,75 μg A 24 PCR reakcióhoz kell kb 2,4 μg. A master mix-hez keverünk μl templát DNS oldatot.

40 Költségszámítás A Generation Capture Column kit 50 oszlopot tartalmaz. Ára Ft (Merck) Ez 459 Ft/teszt, amennyiben sikerül a DR és DQ tipizáláshoz 2 x 2,4 μg és a méréshez szükséges 0,5 μg, azaz 5,3 μg előállítása. Sejtszuszpenzió teljes vér helyett javítja a kitermelést.

41 POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR) II Festés Gélelektroforézis UV szűrő lámpa HLA-DR 16,13

Hasonló dokumentumok

A hisztokompatibilitási rendszer sejtbiológiája és genetikája. Rajczy Katalin Klinikai Immunológia Budapest,

A hisztokompatibilitási rendszer sejtbiológiája és genetikája Rajczy Katalin Klinikai Immunológia Budapest, 2018.03.12 A fő szöveti összeférhetőségi génkomplex (Major Histocompatibility Complex) MHC Szinte