Biotermék technológia - 2

Átírás

1 Biotermék technológia - 2 Msc. Biomérnök hallgatók részére Rekombináns fehérjetermékek előállítása c. alfejezet 2. Rész Előadó: Ballagi András Richter Gedeon NyRt. BME 2015.nov.-dec. ballagi@richter.hu 1

2 Tartalom A rekombináns biotechnológia területei A gyógyszeripari biotechnológia sajátosságai Gazdaszervezetek Műveletek baktériumokkal Klónozás Sejtbankok Fehérjemolekulák előállítása Refolding Példa GCSF és Peg-GCSF előállító technológia Műveletek emlős sejtekkel Klónozás Sejtbankok Tenyésztések Tenyésztési módszerek Reaktorok (labor, ipari, egyszerhasználatos) 1. Rész

3 Tartalom folyt. Monoklonális antitestek Monoklonális antitestek gyártási technológiája Véralvadási fehérjék: alvadás gátlók és alvadási faktorok VIII faktor 2. Rész Biosimiláris gyógyszerek

4 Antitestek Az ellenanyag molekulák nagy része az úgynevezett immun-globulin (Ig) fehérjecsalád tagja. Magát a folyamatot az antigén (vírus, baktérium, rákos sejt, idegen test, parazita) megjelenése határozza meg. Feladatuk, hogy specifikusan az adott antigénhez kapcsolódva olyan folyamatokat indítsanak el ami az antigén hatástalanításához vezet: vírusinaktiválás baktériumok agglutinálása megjelölés fagocitózisra Az antigén felületén a kapcsolódási rész: epitóp 4

5 Az antitestek fiziológiás szerepe Az antitestek nagyon specifikusak, minden antitest egy specifikus antigént ismer fel. Az antitestek a B limfociták felületén keletkeznek és így kerülnek a vérbe. Amikor pl. egy baktérium bekerül a sebbe, a B limfociták kieresztik az antitesteket, amelyek hatástalanítják a baktériumokat és bejuttatják őket a faló sejtekbe. A természetes antitestek poliklonálisak, mert több fajta B sejtből származnak, több epitóp ellen. 5

6 Az antitestek szerkezete Fehérje 2 nehéz lánc 2 könnyű lánc Diszulfid hidak Variábilis régió Antigén felismerő Konstans régió Effektor funkciók Osztály és alosztály 6

7 Az antitestek szerkezetének ábrázolásai 7

8 Complementarity determining regions (CDR) Az antitestek működésének ereje a CDR régióknak köszönhetően. Mindegyik CDR hurok (loop) 5-7 AA hosszú. 8

9 Antitestek A szervezet ~ féle különböző antitest előállítására képes. Ennek alapja, hogy antitest doménjei sok változatban tárolódnak a génállományban, és a kiírás során ezek random módon kombinálódhatnak. 9

10 Antitestek A könnyű lánc kétféle izoformában létezik, ezek mindkét doménje is több változatban létezik, ami további kombinációkat tesz lehetővé: Lehetséges Lehetséges Lehetséges Domének Génváltozatok kombinációk kombinációk kombinációk Könnyű lánc Nehéz lánc Vκ 40 Jκ 5 Vλ 31 Jλ 4 V H 51 D H 25 J H féle κ lánc 124 féle λ lánc 324 féle könnyű lánc 7650 féle nehéz lánc 2.5 x 10 6 féle antitest 10

11 Az antitestek glikozilálása A nehéz láncokon egy-egy N-glikozilálási hely van (Asn-297). 11

12 Poliklonállis és monoklonális antitestek keletkezése

13 A Mab-ok előállítása hibridóma technikával A monoklonális antitestek egyformák, mert egyfajta immunsejtből keletkeztek, amely immunsejtek egyetlen sejttől származnak. A kívánt monoklonális antitestet termelő sejt egyetlen, a megfelelő antitestet termelő B sejtből és egy tumor sejtből (myeloma sejt) keletkezik fúzióval. Ezeket hybridómáknak nevezzük. A monoklonális antitestek azonos antigén kötő hellyel rendelkezik, így ugyanahhoz az epitóphoz kapcsolódnak, és ugyanahhoz az antitest osztályhoz tartoznak. 13

14 Monoklonális ellenanyag előállítás menete egér/patkány beoltása antigénnel (több lépcsőben) lép vagy nyirokcsomó eltávolítása, homogenizálása lépből származó plazmasejtek + egér tumorsejtek (plazmacitóma/mielóma sejtek) fúziója Az ellenanyag termelő klónok azonosítása, izolálása A termelő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatban feldúsul 14

15 Miért hibridóma? Az antitesteket termelő plazmasejtek nem képesek osztódni, nem lehet sejttenyészetben szaporítani és termeltetni. Csak a tumorsejtek képesek korlátlanul osztódni (immortality). E két tulajdonság egyesítésével kaphatunk olyan sejtvonalat, amely: - monoklonális antitestet termel - korlátlanul szaporítható 15

16 Monoklonális ellenanyagok - egyetlen B-limfocita klón termékei - homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus) - kiszámítható hatás, kevés mellékhatás - előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben ( pharmacology-grade ) állíthatók elő - jelentős a szerepük biokémia, a molekuláris genetika, és a gyógyászat területein 16

17 Hibridóma szelekció, a HAT Trick A fúzió után többféle sejt van jelen: fuzionálatlan plazmasejtek fuzionálatlan tumorsejtek hibridómák ezek közül kell izolálni a hibridómákat. A szelekció azon alapul, hogy a tumorsejtekbe még a fúzió előtt két anyagcsere markert építenek be (két enzim hiánya) HAT médiumon (hipoxantin, aminopterin, timidin) csak a fúzionált sejtek képesek szaporodni. 17

18 Hibridóma szelekció, a HAT Trick 18

19 Hibridóma szelekció, a HAT Trick DNS szintézis gátlás = sejthalál PRPP: phosphoribosylpyrophosphate, HGPRT: Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, TK: timidine kinase 19

20 Hibridóma szelekció, a HAT Trick Kerülő út: hypoxantin és timidin adagolással = szaporodás PRPP: phosphoribosylpyrophosphate, HGPRT: Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, TK: timidine kinase 20

21 Hibridóma szelekció, a HAT Trick HGPRT és TK hiányos mutánsok hiába kapnak segítséget = sejthalál Túlélés a mieloma sejtek számára csak a B sejttől kapott HGPRT és TK enzimekkel lehetséges PRPP: phosphoribosylpyrophosphate, HGPRT: Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, TK: timidine kinase 21

22 Poliklonálok és monoklonálok összehasonlítása Poliklonálok Monoklonálok Előállítás Sokfajta B sejt Egyetlen B sejt Kötödés Antitest osztály Antigén kötő hely Az immunizálásban használt összes antigén minden v. majdnem minden epitópjához Különböző osztályok (izotípusok) keveréke Különböző antigén kötő helyekkel rendelkeznek Egyetlen antigén egyetlen epitópjához Mind ugyanabba az antitest osztályba tartozik Minden antitest ugyanazzal az antigén kötő hellyel rendelkezik 22

23 A monoklonális antitestek felhasználása Az antitestek több célra is felhasználhatók: 1. Nem terápiás antitestek: Biokémiai kutatások Immun-analitikai eljárások Feldolgozási műveletekben (pl. affinkromatográfia) 2. Humán (in vivo) felhasználású antitestek: Diagnosztikában (pl. Prostascint) Terápiában (elsősorban tumorok ellen) 23

24 A terápiás monoklonális antitestek hatásmechanizmusai 1.A: 1 B: A Célmolekulák blokkolása Receptorhoz kötődve megakadályozza az aktiválást Az aktiváló molekulához csatlakozva akadályozza meg az aktiválást A Mab jelző molekula. Az apoptózist és a sejtosztódást befolyásoló mediátorok kapcsolása az effektor csoportokhoz Csupasz Mab 2. A varázslatos lövedék (Magic Bullet) célra Konjugált Mab specifikus komponensek kapcsolása az effektor csoportokhoz. Toxinok, radioaktív anyagok, enzimek. 24

25 Monoklonális antitestek a tumor terápiában 1. Közvetlen Mab hatás pl: receptor blokkolás 2. Immun konjugátumok pl: Antitest irányított enzim prodrug terápia, v. Antitest függő, sejt mediált citotoxicitás 3. Több lépéses célzás 25

26 Antitest gyógyszer konjugátumok (2. csoport tagjai) Monoklonális antitestek biológiailag aktív gyógyszerekkel kapcsolva kapcsoló (linker) molekulákon keresztül. Csökkentik a mellékhatásokat és széles terápiás ablakot biztosít Pl. Doxorubicin, Duanomycin, Chlorambucil stb. lehet a kapcsolt molekula. 26

27 Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) (2. csoport) Az antitesthez enzimet kötnek, mely a később sziszté- másan bevitt, ártalmatlan prodrug vegyületet lokálisan alakítja a citotoxikus, hatékony metabolittá 27

28 Immuno-liposzómák (2. csoport) Az immuno-liposzómak antitest és liposzóma összekapcsolását jelenti. A liposzómák képesek gyógyszerek vagy terápiás nukleotidszármazékok szállítására, így a szerek célzottan hatnak a tumorsejtekre. Ez a technológia még gyerekcipőben jár, de már sikeresen alkalmazták in vivo körülmenyek között tumorsejt növekedés gátlásra. Agytumor és a mellrák kezelésére már használják. 28

29 Paul Erlich álma a Magic Bullet-ről megvalósult. A monoklonális antitestek jelenleg a legfontosabb, legígéretesebb és leggyorsabban fejlődő területe a rák elleni küzdelemnek. 29

30 Érvek a Mab-ok használatával kapcsolatban Ellene Szájon át nem adható Magas szükséges dózis Immunogenicitás Gyenge behatolás szilárd tumorokba Lehetséges keresztreakciók más szövetekkel COG Lehetséges vírus fertőzés Nehézségek a nagyléptékű termelésben Mellete Biztonságosság Magas szelektivitás Erős hatás A lehetséges célmolekulák széles választéka Egyéb gyógyszer hiánya, vagy meglévő gyógyszer gyenge hatása 30

31 A Mab-ok fejlődése 100% egér 60-70% humán 90-95% humán 100% humán Rágcsáló eredetű Mab humán felhasználását korlátozó tényezők Rövid féléletidő a vérben A rágcsáló IgG sajátként való felismerése (elismerése) korlátozott HAMA v. HACA válasz (de van HAHA válasz is!) Alacsony fokú hatásosság 31

32 A Mab-okkal kapcsolatos Nobel-díjak 32

33 Humán és humanized Mab-ok létrehozásának módszerei 33

34 Monoklonális antitestek elnevezésének rendszere Előtag cél forrás utótag varies -o(s)- bone -u- human -mab -vi(r)- viral -o- mouse -ba(c)- bacterial -a- rat -li(m)- immune -e- hamster -le(s)- infectious lesions -i- primate -ci(r)- cardiovascular -xi- chimeric -mu(l)- musculoskeletal -zu- humanized -ki(n)- interleukin as target -axo- rat/murine hybrid -co(l)- -me(l)- -ma(r)- -go(t)- -go(v)- -pr(o)- -tu(m)- -neu(r)- -tox(a)- -fu(ng)- colonic tumor melanoma mammary tumor testicular tumor ovarian tumor prostate tumor miscellaneous tumor nervous system toxin as target fungal Abciximab megakadályozza a vörös vértestek aggregátumainak kialakulását. A szó felbontható: ab- + -ci(r)- + -xi- + -mab. Amiből látható, hogy egy olyan kiméráról van szó, amely érrendszeri kezelést tesz lehetővé. 34

35 Monoklonális antitestek nevezéktana Az előtag nem hordoz semmiféle imformációt, csak egyedinek kell lennie, általaban utalás a gyógyszer nevére A második tag utalás a gyógyszer célpontjára (pl -ci(r)- keringési rendszerre ható) A következő tag a forrásról, illetve az antitest típusáról nyújt információt Végül pedig a -mab utótag következik = monoclonal antibody) Ellenőrző kérdés: Melyik gyógyszerről lehet szó, és mit lehet tudni róla? tras- + -tu(m)- + -zu- + -mab.??? 35

36 FDA által jóváhagyott Mab-ok 36

37 Mab-ok a jövőben 37

38 Érdekes alternatívák: Mab fragmentumok Kis antitest fragmentumok (Fv vagy Fab) szintén alkalmasak citokinek blokkolására Előnyük: jobban behatolnak a szövetekbe Antitest fragmentumok összekapcsolása dimerekké v. tetramerekké. Előnyük: megnövekedett hatás Mesterséges Diabodies (bispecifikus Mabok) Két különböző antigén specifitású antitest kapcsolása (egyik a célfehérjét, a másik az effektort kapcsolja) Összekapcsol effektor sejteket

39 Érdekes alternatívák: Nanobody A Nanobaody kb. 110 aminosavból álló polipeptid lánc egy nehézláncú variábilis doménnel Raymond Hamers fedezte fel teve vérben. A könnyű lánc hiányzik, de ugyanaz az antigén kötődés, mint a normál Mabnál. A szerkezet ellenállóvá teszi hővel és alacsony ph-val szemben. => Fejlesztések nanobody orális készítmények irányába. Bélbetegségek, pl. malacok E.coli okozta hasmenése ellen már van. Egyéb fertőzések, bélrák ellen fejlesztés. 39

40 A Mab-okkal kapcsolatos mellékhatások Allergén reakciók, pl. viszketés Influenza szerű szimptómák: levertség, láz, izomfájdalom, rossz közérzet Hasmenés Hányinger Kiütések Súlyos esetben anafilaxiás sokk 40

41 Tartalom folyt. Monoklonális antitestek Monoklonális antitestek gyártási technológiája Véralvadási fehérjék: alvadás gátlók és alvadási faktorok VIII faktor 2. Rész Biosimiláris gyógyszerek

42 A termék minőségi tulajdonságai (Quality Attributes) Identity Process related impurities Amino acid sequence Disulfide-bridges (SH-bonds) Higher order structure Thiols Cell substrate-derived impurities HCDNA HCP Cell culture derived impurities (media components) Insulin Pluronic F-68 Antifoam agent Downstream-derived impurities Protein A Purification buffer components Viral purity Excipients Endotoxins, microbial purity 42

43 A termék minőségi tulajdonságai (Quality Attributes) Product related impurities and variants Charge heterogeneity C-terminal Lys-heterogeneity N-terminal Glutamine Deamidation (and pe formation) Oxidation Glycosylation Galactosylation Afucosylation Sialylation High mannose content Non-glycosylated heavy chain α-gal epitope Aggregation Glycation Fragmentation 43

44 A termék minőségi tulajdonságai (Quality Attributes) Biological activity Characterization and physical tests of the RGB-03 solution CD20 binding assay Binding to relevant Fcγ receptors (CD16a, CD32a, CD64) Binding to FcRn Binding to complement (C1q) ADCC CDC Cytokine release assay Induction of apoptosis Colour Clarity/opalescence Osmolality ph Concentration, drug content 44

45 A fejlesztési folyamat Aminosav szekvencia (meghatározva, vagy irodalmi), Analitikai arzenál kialakítása A könnyű és nehéz lánc optimálása számításokkal (Genart) A könnyű és nehéz lánc DNS-ének szintézise és ideigl. plazmidba helyezése A klónozó plazmid konstrukciója és transzfekciója CHO sejtekbe elektroporációval Minipoolok és később egyedi klónok kiválasztása a növekedési képesség, a termelési képesség és a molekula minőség alapján (HTS módszerek előnyös alkalmazása) A termelő klón és egy követő klón kiválasztása) RCB létrehozása Upstream technológia fejlesztés és optimalizálás Downstream fejlesztés és optimalizálás Analitikai módszerek továbbfejlesztése, MCB, WCB létrehozása Léptéknövelés és termelési próbák, dokumentációk elkészítése, Preklinikai és F1 anyagok elkészítése, Technológiai transzfer a termelő helyre

46 Kodon optimalizáció és génszintézis A primer szerkezet pontos meghatározása után egy CRO meghatározhatja az optimális kódokat az egyes aminosavakhoz, amelyek a leggyorsabb fehérjeszintézist biztosítják. GeneOptimizer Software (Geneart),. Pl. a következő főbb megfontolásokat kell figyelembe venni: A CHO kódhasználata statisztikai alapon A G/C arány úgy legyen beállítva, hogy a m-rna féléletideje minél hosszabb legyen: a (túl magas (>80%) és túl alacsony (<30%) G/C arányok kerülendők. Az expressziót lassító szekvenciák kerülése pl. RNS másodlagos szerkezetet okozó szekvenciák Az optimális szekvencia alapján szintetikus úton készül el a könnyű és a nehéz lánc DNSe, ami plazmidba tehető. 46

47 A géneket tartalmazó vektorok szerkezete Dicisztronos vektor a CMV és a SV40 vírus gén promotere által szabályozott. és tartalmazza a hph szelekciós gént (hygromycin phosphotranspherase) Ezen kívül szoktak gének lenni az E.coliban való manipulációhoz (ori, amp), és esetleg olyan elemek, amelyek a DNS vektor kromoszómába történő stabil beültetését és a későbbi reprodukálható termelést szabályozzák (lsd. a korábbi ábrát erről. ) 47

48 A Mab glikozilációja 48

49 A Mab glikozilációja Classification of N-linked oligosaccharides. Panels A, B and C present a high-mannose, a hybrid and a complex tetra-antennary oligosaccharide, respectively. Highlighted by a box is the Man3GlcNAc2 core structure present in all N-linked glycans Panel D shows the most common glycans observed on the Fc of mabs 49

50 Glikozilációs mintázat optimálása a tápoldat összetételével 50

51 Milyen hibás termékek keletkezhetnek? ProteomeLab TM SDS-Gel Resolving Power IgG Purity and Heterogeneity Assay by CE

52 Mab termelő eljárás emlős sejttel tenyésztési sor Media Prep HEAT COOL Media Pasteurizer Vial Thaw / Inoculum Expansion 50-Liter 500-Liter 5000-Liter 20,000-Liter 52

53 Mab termelő eljárás emlős sejttel Downstream 1. From the culture Virus Inactivation rprotein A Dia: 1 meter CV: 236 L Bed: 30cm Depth Filter 75m 2 Disc-Stack Centrifuge A potenciálisan előforduló burkos vírusok eltávolítása A Mab molekulák befogása affinitás elven, a HCP, a HCDNA és más szennyezők eltávolítása, és a Mab bekoncentrálása Sejttörmelék eltávolítása Sejtek eltávolítása 53

54 Mab termelő Mab termelő eljárás emlős eljárás sejttel Downstream Downstream Cation Exchange Dia: 1.6m CV: 600L Bed: 30cm Intermediate Storage Anion Exchange Dia: 1.6m CV: 600L Bed:30cm Intermediate Storage Viral Filtration 20m 2 Savas töltésű variánsok és HCP eltávolítása Aggregátumok, vírusok, HCP és HCDNA eltávolítása További (gyakorlatilag az összes) potenciális vírusok eltávolítása 54

55 Mab termelő Mab termelő eljárás emlős eljárás sejttel Downstream Downstream I.B.I CryoPreservation System Hosszú idejű tárolás Bulk Filtration (BDS) 3m 2 A potenciálisan előforduló mikrobiális szennyezők eltávolítása, 0,2 µm szűrő (low bioburden) UF/DF Step 80m 2 Puffercsere a végleges tároló pufferre és a Mab koncentráció beállítása Intermediate Storage Hydrophobic Interaction Dia: 1.6m CV: 600L Bed: 30cm További aggregátumok és HCP eltávolítása 55

56 Kromatográfiás oszlopok léptéknövelése

57 Protein A kromatográfia - Az eluens ph-ja és a terhelés jelentősen befolyásolja a HCP mennyiségét. - A terhelés, áramlási sebesség és a frakciószedés vége jelentősen befolyásolja a kihozatalt - Az aggregátum képződést és a deamidációt egyik vizsgált paraméter sem befolyásolta - A terhelés és frakciószedés vége kritériumának kombinálásával a frakciók Mab koncentrációja 2-20 g/l között változott, ami jóval alacsonyabb, mint a vírusinaktiválás során vizsgált legnagyobb koncentráció (35g/l).

58 Protein A kromatográfia

59 Protein A kromatográfia Gyanta élettartam: Protein A kromatográfia Élettartam: legalább 250 ciklus Kismértékű kitermelés csökkenés, de a minőségi paraméterek nem változtak.

60 Vírus inaktiválás - ph beállítása 3,5-re ecetsavval perc állás szobahőmérsékleten - ph beállítása 5,0-re - szűrés

61 Vírus inaktiválás A maximális időt a kationcserés kromatográfia aggregátum eltávolító képessége határozza meg (180 perc, +3σ felső határ 3,1%). Ezt a CEX képes 1%-ra csökkenteni.

62 Vírus inaktiválás Vírus inaktiválás

63 Vírus inaktiválás Következtetés: ph 3,2 4,0 között, 60 perc alatt a logaritmikus redukciós faktor 6,6- nél nagyobb. Alacsonyabb hőmérsékleten és magasabb ph-n az inaktiválódás lassabban játszódott le. A fehérjekoncentráció alig befolyásolta az inaktiválódás sebességét. A folyamatnak nem volt hatása a termék minőségi jellemzőire.

64 Kationcserés kromatográfia Cél: MaB megkötése, elválasztása a DNS-től, HCP-ktől, a leszakadt Protein A-tól és az aggregátumoktól. A glikozilációt és a deamidálódást nem befolyásolja. A víruseltávolításhoz viszont hozzájárul. 5,0 ± 0,2 ph-jú acetát pufferres oldat kerül a 20 ± 3 cm magasságú oszlopra szobahőmérsékleten. Az elúció fokozatosan növekvő koncentrációjú és ph-jú acetát pufferrel történik.

65 Kationcserés kromatográfia Kationcserés kromatográfia

66 Kationcserés kromatográfia Kationcserés kromatográfia

67 Anioncserés kromatográfia Anioncserés kromatográfia - Átfolyó üzemmódban a szennyezések (HCP, DNA, endotoxins) megkötése - Hozzájárulhat a vírusmentesítéshez - Oszlopmagasság: 20 cm - Kromatografálás előtt ph és vezetőképesség beállítás - Equilibration, loading, washing with equiblibration buffer

68 Anioncserés kromatográfia Anioncserés kromatográfia

69 A Mab termék jellemzése Tests Acceptance criteria Methods Physical tests Characters Clear or slightly opaque, colourless or yellowish solution. Visual Results R1A0161 clear, colourless solution ph 6.5 ± 0.2 In-house 6.5 Osmolality 360 ± 30 mosm/kg Ph. Eur. Identifications Chip electrophoresis (non-reducing) RP-HPLC Isoelectric focusing Peptide map The bands in the electropherogram obtained with the test solution are similar in position to the bands in the electropherogram obtained with the reference solution (±10%). Retention time of the main peak in the test solution should correspond to that of the reference solution. Isoelectric point of the test solution is similar to that of the reference solution (± 0.1 pi). Chromatogram of the test solution prepared from the digested sample should correspond to that obtained with the reference solution prepared from the digested reference material. Chip electrophoresis (non-reducing)/ In-house RP-HPLC/ In-house Capillary IEF/ In-house RP-HPLC/ In-house mosm/kg identical identical identical identical 69

70 Tests Acceptance criteria Methods Tests for purity Glycan pattern Impurities with molecular masses differing from that of the product Mab Mab charge variants and impurities Bacterial endotoxins A Mab termék jellemzése Results R1A0161 G corrected area% 55.8%* G corrected area% CE-LIF/ 29.5% G corrected area% In-house 9.7% G corrected area% 5.0% Main peak: at least 99% SEC-HPLC/ In-house 99.6% Chip Heavy chain + light chain electrophoresis at least 97% altogether (reducing)/ 99.7% In-house Main peak: at least 45% 56.1% Sum of (acidic) impurities n.m.t. 15% before the main peak: Ion-exchange 8.2% Peak pertaining to the first n.m.t. 40% HPLC/ 31.0% lysine variant: Sum of other (basic) impurities: 3.0 EU/ml In-house n.m.t. 8% 4.7% Kinetic turbidimetry (harmonized Ph. Eur./USP) <0.04 EU/ml 70

71 A Mab termék jellemzése Tests Acceptance criteria Methods Results R1A0161 Tests for purity CHO Host cell Not more than 4 ng/mg protein. protein CHO Host cell < 1000 pg / 1000 mg protein DNA impurity 10 Total aerobic microbial count (TAMC): CFU/ml 10 Microbiological Total combined yeasts/moulds count (TYMC): CFU/ml purity Absence of bile-tolerant Gram-negative bacteria (1 ml). Absence of Staphylococcus aureus (1 ml). Absence of Pseudomonas aeruginosa (1 ml). ELISA/ In-house qrt-pcr/ In-house Harmonized Ph.Eur./USP 0.9 ng / mg protein 28.5 pg / 1000 mg protein conforms 71

72 A Mab termék jellemzése Tests Acceptance criteria Methods Results R1A0161 Contents Active substance Active substance Biological activity Sialic acid 10 mg/ml ± 1 mg/ml Between 80% and 125% of the reference material (Mabthera ) N-Acetylneuraminic acid (NANA): K D : M N-Glycolylneuraminic acid (NGNA): n.m.t. 0.4 µg/mg protein n..m.t. 0.01µg/mg protein RP-HPLC/ In-house CDC assay/ In-house CD16a assay/ In-house RP-HPLC-FL/ In-house 10.4 mg/ml 103.9% M µg/mg protein µg/mg protein 72

73 Tartalom folyt. Monoklonális antitestek Monoklonális antitestek gyártási technológiája Véralvadási fehérjék: alvadás gátlók és alvadási faktorok VIII faktor 2. Rész Biosimiláris gyógyszerek

74 Véralvadási fehérjék előállítása Gyógyszerként előállított fehérjék: Alvadási oldal: Faktor VIII, Faktor IX Gátló oldal: szöveti plazminogén aktivátor (tpa), antitrombin, hirudin, urokináz (upa), (heparin, sztreptokináz) 74

75 Antihemofíliás faktor = Faktor VIll Véralvadási faktor, hiánya vérzékenységet okoz. Génje az X kromoszómán helyezkedik el a nemhez kötött recesszív öröklődés iskolapéldája ( Habsburgok). A veleszületett vérzékenységet 80%-ban a F-VIII hiánya okozza. Pótlásával (hetente 1-2x) a véralvadás normalizálható. Proteolítikus enzim, Ser proteáz. A F-IX-el, trombinnal, foszfolipiddel (PL) és Ca 2+ -nal együtt (= tenáz komplex) a F-X-et aktiválja. Önmagában nincs enzimaktivitása. A F-VIII-at proteázok aktiválják, de a vérben az egyéb proteolítikus enzimek gyorsan (~1 óra) el is bontják. Védelem: von Wille-brand faktorhoz kötődik. 75

76 A Faktor-VIll szerkezete Eredetileg egyetlen hatalmas glikoprotein láncként szintetizálódik (300 kda, 2332 aminosav), amely háromféle doménből áll össze: Érése során két proteolítikus hasítás révén a B domén jelentős része leválik, és két eltérő alegységből álló heterodimer keletkezik: A 1 -A 2 -B nehéz lánc, 92 kda és A 3 -C 1 -C 2 könnyű lánc, 73 kda A vérben ez az inaktív (zimogén) forma kering a von Willebrandt faktorhoz kötött állapotban. 76

77 A véralvadási faktorok homológ szerkezete 77

78 A Faktor-VIll aktiválása A F-VIII aktiválását Arg mellett hasító Ser proteázok végzik, amelyek kiszabadítják az A doméneket (hasítás: Arg372, Arg740 Arg1689). Három fragmensből álló komplex jön létre, amit kétértékű fémion (pl. Mg 2+ ) tart össze. A B doménnek nincs további szerepe. 78

79 A Faktor-VIll módosításai 1. Az A2 és A3 fragmens közti laza kapcsolatot egy diszulfid híd beépítésével (Cys664 - Cys1826) erősítették meg. Az aktív molekula élettartama jelentősen növekedett. 2. Az emlős sejtekben kifejezett F-VIII lassan termelődik (túl nagy mrns instabil, chaperon igény, ER Golgi transzport). Méret csökkentés: a B-domén kihagyása. Az aktivitást nem befolyásolta, de a hiányzó glikozilek miatt még lassabban érlelődött. Megoldás: a hosszú B lánc helyett egy rövid összekötő szakaszt építettek be, rajta egy N-glikozilálási hellyel (Asn) szörös növekedés. 79

80 A Faktor-VIll gyártása Transzformált CHO sejtekkel (szuszpenziós, szérummentes tápoldat, inzulin van benne, de az is rekombináns, ~60 jól definiált komponens). 500 l reaktor, folytonos fermentáció, hígítási sebesség ~1 /nap Affinkromatográfia (pl. szelektív kötődése a vw faktorhoz affinkromatográfiás tisztítást tesz lehetővé, de lehet a TN8.2 szintetikus peptiddel is.) Vírus inaktiválás (szolvent-detergens módszerrel) Formulázás HSA, vagy egyéb állati fehérje nélkül. Az állati fehérje mentesség megszünteti a vírus-, vagy prion átvitel veszélyét. Nyomnyi hörcsög-fehérjét azért tartalmaz. 80

81 A Faktor VIll affinkromatográfiás izolálása A F-VIII szelektív kötődése a vw faktorhoz affinkromatográfiás tisztítást tesz lehetővé: 81

82 A rekombináns Faktor-VIll fejlesztése 82

83 Rekombináns faktor VIII-at termelő fermentorok 83

84 Tartalom folyt. Monoklonális antitestek Monoklonális antitestek gyártási technológiája Véralvadási fehérjék: alvadás gátlók és alvadási faktorok VIII faktor 2. Rész Biosimiláris gyógyszerek

85 Az egészségügyi költségvetések növekvő terhei Egészségügyi kiadások vásárlóerő paritáson normalizálva három angol nyelvű ország esetében Egészségügyi biztosítók kifizetéseinek és a tagok befizetéseinek növekedése az infláció és az alkalmazottak fizetésének tükrében az USAban. Data from the Kaiser HRET Survay of Employer-Sponsored Health. 85

86 A gyógyszerek piacának növekedése Cumulative Annual Growth Rate 86

87 Originális biotech blockbusterek 87

88 A rák előfordulása a társadalomban és jövőbeni kilátások Néhány adat: A rák előfordulása a társadalomban 10x akkora 65 éves kor után, mint 65 éves kor alatti populációban. A demográfiai folyamatok miatt (a társadalmak öregedése) 2010-re a rák a legtöbb országban a fő halálokká vált és 2032 közötti 20 évben 14 mill.-ról 25 mill. ra nő (80% növekedés) az évi új esetek száma (WHO adat). Adat / egyén 88

89 Autoimmun betegségek előfordulása a társadalomban 1715 Autoimmun betegség / lakos 89

90 Kismolekulás és biotechnológiai gyógyszeres kezelések összehasonlítása költségek szempontjából Due to the high cost of infliximab, the mean total drug cost was higher in the infliximab than the conventional treatment group 4710; Ann Rheum Dis doi: /annrheumdis Delta: > USD Delta: > EUR 90

91 A növekvő költségek a páciensek kezelésekhez való hozzáférését veszélyeztetik 91

92 Bioszimiláris gyógyszerek mik azok a bioszimilárisok? 2012-ben az EMA megadta a bioszimiláris definicióját egy eljárási útmutatóban (procedural guide): A hasonló biológiai orvosi készítmény, ismert nevén bioszimiláris, egy gyógyszer, amely hasonló egy már engedélyezett biológiai készítményhez, a referencia gyógyszerkészítményhez. A bioszimiláris gyógyszer hatóanyaga már ismert mint biológiailag aktív hatóanyag, és hasonló a referencia gyógyszerkészítmény hatóanyagához. Elvárt dolog, hogy a bioszimiláris gyógyszerkészítmény és a referencia gyógyszerkészítmény hatásossága és biztonsága azonos és általában ugyanolyan állapot kezelésére szolgáljon. 92

93 Bioszimiláris gyógyszerek mik azok a bioszimilárisok? (folyt.) Az összehasonlítás az originális és a bioszimiláris molekula között egy átfogó program eredménye, amelyben fontos tulajdonságok hasonlósága kerül bizonyításra, mint fiziko-kémiai paraméterek, bioaktivitás, PK, PD, hatásosság, biztonság. Ugyanakkor az ilyen molekulák hatalmas mérete és élő szervezetekben történő előállítása miatt nem lehet követelmény a teljes kémiai és szerkezeti azonosság, mint a szintetikus molekulák esetében. Éppen ezért nem nevezhetjük őket biogenerikus -nak, mert megtévesztő lenne. 93

94 Bioszimiláris gyógyszerek összehasonlítás kis molekulás termékekkel Termék jellemzői Kis molekula, Általában stabil, Egyszerű bevitel Generikus Bioszimiláris Nagy összetett molekula, Stabilitás csak speciális szabályok mellett, Általában injekciós bevitel Termelés Kémiai szintézis Élő organizmusokkal készül, Speciális termelő üzemben, Érzékeny a techn. változtatásokra, Magas COG Fejlesztés Kevés klinikai vizsgálat, Jelentős K+F költség, (gyakran F1, PK/PD vizsgálat) Kiterjedt klin. vizsg., F1, F3 Szabályozás Marketing Rövidített törzskönyvezés Európában és USA-ban Korlátozott részletezés az orvosok felé, Gyógyszerész által eldönthető helyettesíthetőség, Nagy árcsökkenés az originálishoz képest. Törzskönyvezési eljárás Európában megvan, Hiányzik az USA-ban A részletek megadása fontos az orvosok felé, Speciális elosztó lánc kell, Általában klinikai alkalmazás, Az ár az originális ár 50-70%-a

95 A bioszimilárisok egy külön szektort képeznek a gyógyszeriparon belül

96 Mit nyerünk a bioszimilárisokkal? Jelenleg a páciensek több ezer $- t fizetnek havonta az MS, a vérszegénység, vagy neutropénia kezelésére Hozzáférés nő Originátor gyógyszergyárak monopol helyzetben vannak Versenyhelyzet nő Várható spórolás 20 év alatt 378 milliárd $ Árcsökkentő, pénzügyi hatás 2009 és 2019 között 21 biotechnológiai blockbuster patentja jár le 50 Mrd $ éves forgalmi értéket képviselve. A legtöbb ilyen készítményt az onkológia, a gyulladásos betegségek és az érrendszeri betegségek területén alkalmazzák.

97 Bioszimiláris gyógyszerek vita az elnevezésről A fehérjemolekulák összetettsége és változékonysága miatt, nem valószínű, hogy a legtöbb fehérje esetében a bioszimiláris gyártója bizonyítani tudja, hogy a terméke azonos (identical) egy már engedélyezett termékkel.

98 Bioszimiláris gyógyszerek: Piacot befolyásoló körülmények Piac-segítő körülmények - Páciensek számának bővülése POZ. - E.ü. kiadások csökkentésének kényszere -További molekulák szabadalmának lejárata - Bővülő tudományos-technikai ismeretek Piac-fékező körülmények - Időigényes törzskönyvezési eljárások NEG. lassítják a piacra kerülést - Elégtelen tudás a termelő eljárásról befolyásolja a hosszú távú termékminőséget - Bizonytalan, vonakodó kezelőorvosi hozzáállás a bioszimilárisokhoz

99 Bioszimiláris gyógyszerek: Termelőket befolyásoló körülmények - A cégek hozzáférnek a modern termelő technológiákhoz. POZ. alacsonyabb COG stabilabb technológia alacsonyabb ingatlan beruházási költségek - Az originátorok technológia-változtatási lehetőségei korlátozottak - A jövőbeni versenykörülmények bizonytalanok, NEG. - A világ egészségügyi hatóságainak és klinikusainak korlátozott tapasztalatai vannak a bioszimiláris termékekről, - A bioszimilárisok törzskönyvezésének szabályozása az USA-ban nem áll rendelkezésre, - Nagyon komplikált a gyógyszeripar szabadalmi helyzete, - A cégeknek korlátozott tudása és tapasztalata van a bioszimilárisok piaci bevezetéséről,

100 Bioszimiláris gyógyszerek: Mit jelentenek ezek egy gyógyszergyárnak? - A tudományos háttér kritikus a piacra kerülésben, - A fejlesztési és termelési stratégiáknak flexibiliseknek kell lenniük: - A termelő eljárást és az épületet úgy kell megtervezni, hogy könnyen lépték növelhető legyen mindkét irányba - Képesség a törzskönyvezés utáni technikai változtatásokra kompetitív előnyt jelent. (Ehhez QbD, PAT és megalapozott Design Space kell.) - A bioszimilárisok fejlesztése 7-8 évig is eltart és M EUR kerülhet, (szemben a generikusok 2-3 év hosszú és 1,6 2,4 M EUR költségű fejlesztésével.

101 Bioszimiláris gyógyszerek: Kicserélhetőség (Interchangebility) Európában: A bioszimilárisok különleges kémiai és biológiai tulajdonságaik miatt nem automatikusan cserélhetők ki (interchangebility) egymással és az originátorral. A kicserélhetőség elemzése nem része az EMA által végzett tudományos elemzésnek. Vagyis egy EMA által megadott forgalomba hozatali engedély (MA) nem jelent kicserélhetőséget vagy automatikus helyettesíthetőséget. Az USA-ban: Az FDA-nek viszont joga van kinevezni (designate) az adott bioszimilárist kicserélhetőnek (interchangable), ami azt jelenti, hogy a gyógyszerész kiadhat bioszimilárist az originátor helyett anélkül, hogy az orvost értesítenie kellene. (The Biologics Price Competition and Innovation Act)

102 Kicserélhetőség (Interchangebility) folyt. Interchangeability An application (or a supplement to an application) submitted under this subsection may include information demonstrating that the biological product meets the standards described in paragraph (4). (A)the biological product (i)is biosimilar to the reference product; and (ii)can be expected to produce the same clinical result as the reference product in any given patient;

103 A bioszimilárisok fejlesztésének lépései Proving biosimilarity with comparability to reference product at all stages Design specification Validation Clinical Trials PK/PD Preclinical Biological characterization Physicochemical characterization Process development Leading biosimilars companies have developed the technology to achieve an excellent match Differences are not inherently more relevant than after m anufacturing changes Analytics Target range Drug product development Purification process development Reference product Quality can not be tested into a product, it has to be built in by design ; International Guideline ICH Q8 Bioprocess development Recombinant cell line development

104 A bioszimilárisok fejlesztésének lépései Végső koncentrációk (hatóanyag, adalékanyagok), állásidők, stabilitásvizsgálatok, SOP-k, GMP dok. Kromatográfiás lépések, sebességek, ciklusok száma, mosások száma, erőssége, állásidők, stabilitásvizsgálatok DoE. SOP-k, GMP dok. Inokulum sor optimálás, fermentáció fejl. (ph, ToC, idők, média komp., stb. - DoE), léptéknövelés legalább preklinikai anyag gyártáshoz. Sejtelválasztás optimálás, centrifugálás, szűrések. SOP-k, GMP dok. Analitika, (fizikokémiai, bioassay) Gén kiválasztás, szekvencia megállapítás, génbevitel, elsődleges és másodlagos szelekció, RCB, MCB, WCB készítése, Genetikai stabilitás tesztelése ( gen.) Biosafety tesztelése (vírusmentes, prionmentes, stb.)

105 A bioszimilaritás bizonyítása A hasonlóság bizonyítása a technológiai fejlesztés során (CMC chemical-manufactuing-contol) - A termelés során jelentkező szennyezések és bomlástermékek meghatározása (process related impurities & degradation products) - A referencia termék sarzsonkénti változásainak ismerete (batch-tobatch variability) - A molekulaszerkezet és a minőséget befolyásoló tulajdonságok összehasonlítása (Critical Quality Attributes) - Az esetleges kismértékű eltérések hatásának ismerete a hatásosságra és a biztonságra (efficacy & safety) - Annak bizonyítása, hogy szisztematikus fejlesztés történt a hasonlósági követelmények teljesítésére (pl. ferm. idők és tápoldatkomponensek a megfelelő cukormintázat érdekében.)

106 A bioszimilaritás bizonyítása (folyt.) - Biológiai aktivitás in-vitro tesztekben (bioassay, kötési tesztek) - Pre-klinika és toxikológia: állati és in-vitro tesztek - PK, PD: hasonlóság (hatásosság és biztonság hasonlósága) - Klinika: : hasonlóság Terápiás azonosság (hatásosság és biztonság hasonlósága) Statisztikai analízis Immunogenicitás 106

107 Lehetséges variációk egy molekulán belül

108 Az originátorok támadása 108

109 A bioszimiláris gyártók ellentámadása, az originátorok változtatásainak felhasználásával 109

110 Mab technológia léptéknövelhetősége

111 Összefoglaló megállapítások 1. Szerkezeti bonyolultság miatt nincs generikus lehetőség, A fejlesztés nehéz és fejlett tudományos és technológiai felkészültséget kíván A fejlesztés idő és forrásigényesebb, mint a generikusoknál, Mivel az azonosság nem megállapítható, hasonlóságot kell definiálni, a törzskönyvező hatóság felé, Ennek szabályozásában az EU vezető szereppel bír, de továbbra is elég bizonytalan a későbbi megítélése a jelölt molekulának, Azok a cégek lesznek sikeresek, akik ezeket a bizonytalanságokat jól tudják kezelni tudományosan, technikailag, és kereskedelmileg, Fiziko-kémiai hasonlóság, biztonságossági hasonlóság, és terápiás ekvivalencia kell a referencia termékhez viszonyítva, Fázis I. és III. vizsgálatok kellenek, 111

112 Összefoglaló megállapítások 2. Időtáv: NBE és bioszimiláris között (4-6 év), Költsége: NBE és bioszimiláris között (200M-800M EUR), Árkülönbség a piacon: NBE és generikus között (10%-50%), Nem szabad hatékonyabbnak lennie => ha hatékonyabb akkor stand alone fejlesztés szerint kell eljárni, és eltérő piaci magatartás is szükséges Minél több, az originátortól származó sarzs kimerítő jellemzése elengedhetetlen a bioszimilaritás bizonyításához. A piacra lépés után is kell folytatni a technológia fejlesztést, a minél jobb és olcsóbb előállítás érdekében, de figyelembe kell venni a változtatásokkal járó technikai és hatósági kockázatokat, A klinikai vizsgálatok komplikáltak és változatos eredményt szolgáltathatnak A piacra lépés után alapos piackövetésre van szükség 112

113 Köszönöm a figyelmet! 113