MRM alapú módszerek alkalmazása testfolyadékokból történő biomarker vizsgálatokhoz

Átírás

1 MRM alapú módszerek alkalmazása testfolyadékokból történő biomarker vizsgálatokhoz Dr. Csősz Éva Proteomika és Lipidomika Szolgáltató Laboratórium Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem

2 Biomarkerek miért, hogyan, honnan? Olyan molekulák, amelyek a betegségek diagnosztikájában,a betegség lefolyásának nyomonkövetésében és terápiájában,a toxikus hatások kimutatásában használhatók Biomarker fehérjék jelenlétük/mennyiségük bír jelző szereppel Enzimek jelenlét vagy aktivitás a fontos? Legjobb prediktorok, amelyek a hiba/kóros állapot helyéről származnak = biopszia Invazív Sokszor speciálisan képzett szakember szükséges Nem lehet szűrésre használni

3 Folyékony biopszia liquid biopsy Szájüregi laphámrák OSCC Helyettesítheti-e a nyál a biopsziát? Nem invazív Folyamatosan termelődik Nincs szükség speciálisan képzett szakemberre a gyűjtéshez Felhasználható lenne szűrésre, a magas kockázatú csoportok azonosítására

4 Folyékony biopszia liquid biopsy Szérum/plazma Vizelet Óriási az igény a nem Nyál invazív módon gyűjthető Könny biológiai minták iránt Verejték Hüvelyváladék Intersticiális váladék Agy-gerincvelői folyadék... Point-of care típusú tesztek kifejlesztése Mintamennyiség Mintagyűjtés módja

5 Tömegspektrometria Több ezer fehérje kimutatása és kvantitálása biológiai mintákból Elegendő a viszonylag kis mintamennyiség Tömegspektrometria Proteomika Nem invazív módon gyűjthető testfolyadékok vizsgálata

6 Biomarker felfedezés folyamata Csősz és mtsai. J Proteomics 2017

7 Célzott proteomikai megközelítés alkalmazása potenciális biomarkerek vizsgálatára Leggyakrabban használt módszer az SRM/MRM (Selected/Multiple Reaction Monitoring) szelektált/többszörös reakció monitorozáson alapuló tömegspektrometriás módszer Specifikus Szelektív Szenzitív Multiplex

8 Célzott MRM-alapú tömegspektrometriás analízis Q1 m/z Q3 m/z m/z m/z Ionforrás Q1 Ütközési cella Q3 Detektor MRM átmenetek Q1 m/z Q3 m/z pár Intenzitás Komplex minta Q1 m/z Q3 m/z pár Q1 m/z Q3 m/z Idő (min)

9 Célzott MRM-alapú tömegspektrometriás analízis Q1/Q3 pár Q1/Q3 pár Q1/Q3 pár Q1/Q3 pár Q1/Q3 pár SIL (heavy), referencia peptid Endogén peptid Stabil izotóppal jelzett (SIL) szintetikus referencia peptidek használata belső standardként Görbe alatti terület AUC relatív vagy abszolút kvantitálás

10 Beta defenzin 2 lineáris dinamikus tartománya Könny Sejtkultúra felülúszó R2=1 Log AUC Log AUC R2=0.951 Peptid mennyiség (fmol) Peptid mennyiség (fmol) Kalló és mtsai. RCMM 2015.

11 Hogyan tervezzünk MRM átmeneteket? Q3 m/z Q1 m/z SRM atlas ( CPTAC Assay Portal ( In silico emésztés MMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVE GGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCD SGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECC AVCPQPPTAPTRPPNGQGPQGPKGDPG PPGIPGRNGDPGIPGQPGSPGSPGPPGI CESCPTGPQNYSPQYDSYDVKSGVAVG GLAGYPGPAGPPG Uniprot szekvencia Blastp keresés GEDGK GAAGIK GFDGR GAPGEK LDAIK LLSSR MRM átmenetek tervezése GAPGEK Fehérjére jellemző szekvencia Peptidek Q1 (m/z) Q3 (m/z) MRM átmenetek

12 Nézőpont kérdése: előny vagy hátrány?

13 A mátrix hatása az MRM alapú kvantitálásra nyál könny víz

14 A magyar lakosságra jellemző OSCC-specifikus nyálbiomarkerek proteomikai vizsgálata Csősz és mtsai. PLOS One, 2017.

15 OSCC specifikus biomarkerek vizsgálata OSCC a szájüregi daganatok leggyakoribb formája A hatodik leggyakoribb daganat 5 éves túlélési ráta alacsony Nagyon fontos jól használható diagnosztikus biomarkerek azonosítása

16 OSCC specifikus biomarkerek vizsgálata Profilin IL-1 alfa Tioredoxin IL-1 beta S100A9 IL-6 Kataláz IL-8 CD44 TNF-alfa CD59 VEGF Galektin 3 kötő fehérje Citokeratin Cyfra 21-1 fragmense Célzott tömegspektrometriás módszer tervezése Luminex xmap technológián alapuló multiplex kit

17 Citokin szintek változása TNF alfa, IL6 potenciális biomarkerként használható a magyar lakosság szűrésére

18 Potenciális biomarker fehérjék szintjének vizsgálata OSCC-ben szenvedő betegek és illesztett kontrollok nyálmintáiban Profilin Irodalmi adatok alapján biomarkerként Tioredoxin azonosították OSCC esetében S100A9 Kataláz Tömegspektrometriás CD44 módszertervezés és CD59 optimalizálás Galektin 3 kötő fehérje Citokeratin Cyfra 21-1 fragmens 15 beteg, 15 korban illesztett és 15 fiatal kontroll nyálminta analízise

19 Potenciális OSCC specifikus nyálfehérjék vizsgálata Illesztett kontroll Fiatal kontroll OSCC Illesztett kontroll OSCC Fiatal kontroll OSCC Kontroll Tioredoxin és S100A9 használható potenciális biomarkerként

20 Melyik a jobb potenciális biomarker vagy biomarker kombináció? Tömegspektrometriás analízis Tioredoxin és S100A9 potenciális biomarkerként használható Citokin szintek vizsgálata (Luminex analízis) TNF alfa, IL6 potenciális biomarkerként használható a magyar lakosság szűrésére ROC (Reciver Opreator Characteristic) statisztika

21 A potenciális biomarkerek elemzése ROC statisztika segítségével TNF-α Sens: 82.1% Spec: 100% Szenzitivitás S100A9 Szenzitivitás Szenzitivitás AUC: Sens: 81.8% Spec: 76.2% 1-Specificitás AUC: Sens: 82.1% Spec: 100.0% Sens: 75.0% Spec: 80.0% 1-Specificitás AUC: IL-6 éstnf-α 1-Specificitás 1-Specificitás Thioredoxin S100A9 ésthioredoxin AUC: Sens: 63.6% Spec: 81.0% 1-Specificitás Szenzitivitás AUC: Szenzitivitás Szenzitivitás IL-6 AUC: Sens: 86.4% Spec: 66.7% 1-Specificitás Csősz és mtsai. PLOS One, 2017.

22 Az egyes országokban vizsgált potenciális OSCCspecifikus nyál biomarkerek Ország Kína Horvátország Magyarország India Irán Izrael Olaszország Japán Szerbia Taiwan Vizsgált fehérjék CA-50, CEA, S100A7, S100A8, S100A9 bfgf, IL-6 CATA, CD44, CD59, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, K1C19, M2BP, PROF, S100A9, TNF-α, TXN, VEGF CA125, LDH IL-1α, IL-6, IL-8, TNF-α ALB, CA125, CA19.9, CEA, CYD1, Cyfra 21.1, EGF, IgG, IGF1, Ki-67, LDH, MMP-2, MMP-9, MSP, OGG1, p-src, siga, SCCA, TPA STAT, SUR HNP-1, IL-6, IL-1β, IL-8, OSTP IL-1β, IL-8, M2BP ALB, AMY, ANXA2, APOA, APOA2, APOA-IV, B3AT, C4BPA, CBG, CD109, CHIT1, CO6, CO9, DHB4, EGF, FSCN, FABP, GSTM1, HEXA, HPRT, HEP2, H2A1A, HYEP, ICAM3, IGHA2, IGHV, ITIH2, ITIH4, KBRS1, KNG1, KV119, KV403, LV102, PCP, RETN, RL7, S100A8, TRFE, T132A, TBA1C, VTNC, ZN497, ZN501 Egyesült P53ab Királyság Amerikai ACT, bfgf, CATA*, CD44, CD59, END1, H1, IL-1, IL-1α, IL-1β, IL-6, ILEgyesült Államok 8, INVO, K1C19, M2BP, MOES, MYO, PROF, RAB7, S100A12, S100A7, S100A9, S100P, TNF-α, VEGF Csősz és mtsai. PLOS One, 2017.

23 Potenciális biomarker az OSCC szűrésére Magyarországon IL-6 * * p=0.018 * p=0.015 S100A9 (ng/ml) Thioredoxin (ng/ml) p=0.029 * p=0.006 IL-6 (pg/ml) * p=0.019 Csősz és mtsai. PLOS One, 2017.

24 Könnybiomarkerek vizsgálata Alzheimer kórban Kalló és mtsai. PLOS One, 2017.

25 A könny, mint védelmi vonal Folyamatosan termelődik Fő szerepe a nedvesítés Lipid réteg 0,1 m Véd a patogénekkel Vizes réteg 8 m szemben Non-invazív módon gyűjthető Mucin réteg 0,8 m mucin epitél sejtek

26 Alzheimer kór v Primer neurodegeneratív betegség v Legfőbb kockázati tényezője az életkor v Etiopatogenezise ismeretlen hipotézisek: 3-as típusú diabetes (lokális agyi inzulinrezisztencia) gyulladásos betegség v Jellegzetes neuropatológiai elváltozások az agyban: amyloid plakkok neurofibrillaris kötegek neuronpusztulás

27 Alzheimer kór szemet érintő komplikációk Amiloid plakkok lerakódása a szemben Retina morfológiájának változása Retina érhálózatának megváltozása Alzheimer-kóros Csökkent vizuális teljesítmény Kontroll (Goldstein et. al. 2003) Hipotézis: A szem mikrokörnyezet megváltozása hatással lehet a szekretált könnyfehérjékre is Omikai Budapest, Fórum 2016 Sciex szeminárium, 2017.

28 Könnyfehérjék SDS-PAGE analízise AD1 AD2 AD Kontroll MW 2 120kDa 85kDa 50kDa 35kDa 25kDa 20kDa Relatív intenzitás (CNTxmm2) Kontroll 1 * NAD Kontroll AD * 3000 * 2000 * * 1000 * * 2 3 * * * * Sáv A sávok intenzitása szignifikánsan lecsökkent az Alzheimer kóros betegektől származó mintákban a kontroll csoporthoz képest

29 LC-MS/MS alapú fehérje azonosítása Sáv Azonosított fehérje UniProt ID Laktoferrin P Laktoferrin P Laktoferrin P02788 fehérjék a kémiai barrier 5 Laktoferrin Szérum albumin Ig α-lánc C régió P02788 P02768 P01876 részei, ezáltal szerepet 6 Laktoferrin Ig α-lánc C régió P02788 P01876 játszanak a szervezet 7 Zn α2 glikoprotein Keratin 1 Lakritin P25311 P04264 Q9GZZ8 védelmében 8 Keratin 1 Keratin 10 P04264 P Ig λ-lánc C régiók P0CG05/P0CG06 10 Ig λ-lánc C régiók Ig κ-lánc C régió Zimogén granulum fehérje 16 homológ B Prolin gazdag fehérje 4 P0CG05/P0CG06 P01834 Q96DA0 Q16378 patomechanizmusában szerepet 11 Lipokalin-1 Prolaktin indukált fehérje P31025 P12273 játszhat a szem kémiai 12 Lizozim-C Lipofilin A Prolaktin indukált fehérje Lipofilin C Cisztatin-S P61626 O75556 P12273 O95968 P Lizozim-C P61626 A csökkent mennyiségű Az Alzheimer kór barrierének megváltozása

30 A kémiai barriert alkotó fehérjék MRM alapú vizsgálata Zn α2 glikoprotein Prolaktin indukált fehérje Lizozim-C Lipofilin A Lipokalin-1 Laktoferrin Ig λ lánc Galektin 3-kötő fehérje Lakritin Dermcidin Az Alzheimer kór összefüggésben állhat a könnymirigyek csökkent működésével, a kémiai barrier megváltozik, az epitélsejtek által termelt dermcidin szintje megemelkedik Omikai Budapest, Fórum 2016 Sciex szeminárium, 2017.

31 Alzheimer kórra specifikus potenciális biomarkerek azonosítása Fehérjék Szenzitivitás (%) Specificitás(%) PV+ (%) PV- (%) AUC Pontosság 95% CI LCN LTF LYZ PIP LACRT DCD LCN1+DCD LYZ+LACRT LCN1+DCD+ LACRT LCN1+DCD+LTF LCN1+DCD+LYZ LCN1+LTF+LYZ LYZ+LACRT+ DCD LYZ+LACRT+ LCN PIP+LACRT+DCD DCD+LCN1+LTF+PIP LCN1+DCD+LYZ+LACRT A lipokalin-1, dermcidin, lizozim-c és laktirin kombinációja jól használható biomarkernek tűnik Omikai Budapest, Fórum 2016 Sciex szeminárium, 2017.

32 Összefoglalás Sikeresen kifejlesztettünk és alkalmaztunk MRM alapú tömegspektrometriás módszereket nyál- és könny fehérjék célzott vizsgálatára Az MRM alapú módszerek szenzitivitása és multiplex jellege jól használható a testfolyadékokból történő biomarker kutatásokban Eredményesen azonosítottunk potenciális biomarkereket szájüregi laphámrák és Alzheimer kór esetén Megfelelően kivitelezve az MRM-alapú vizsgálatok elengedhetetlen részét képezik a biomarker kutatásoknak

33 Köszönetnyilvánítás Biomarker kutatócsoport Proteomika és Lipidomika Szolgáltató Laboratórium Prof. Tőzsér József Hartman Zsolt Dr. Csősz Éva Sólyom Kamilla Dr. Kalló Gergő Szabó Emese Darainé Julika Márkus Bernadett Dr. Matúz Krisztina Kovács Fruzsina Székely Tímea Dr. Csutak Adrienne Deák Eszter Prof. Márton Ildikó Prof. Kiss Csongor Dr. Tar Ildikó Dr. Szabó Adrienn Dr. Emri Miklós Bába Orsolya Bertók Nikolett Varga Anita Tarsoly Zsófia PD Dr. Tóth Noémi Sinka László NKFIH PD Bolyai János Kutatási Ösztöndíj