GÉNMUTÁCIÓK. Génmutációk: egy gént érintő változások. pontmutációk: egy bázist érintő változás. bázisanalógokkal

Átírás

1 GÉNMUTÁCIÓK Kromoszóma mutációk: nagyobb kromoszóma szakaszokat érintenek, így több gént, mikroszkóppal is láthatók. Deléciók, inverziók, duplikációk, transzlokációk. Génmutációk: egy gént érintő változások pontmutációk: egy bázist érintő változás báziscsere spontán vagy kémiai bázisanalógokkal mutagénekkel, tranzíció, transzverzió, Mi cserélődik mire? missense, nonsense, neutrális, silent - a kodon jelentésének változása fenotípus változást csak az első kettő okoz, csak ilyen izolálható. A két utóbbi csak szekvenálással (PCR, RAPD) vehető észre. DNS polimorfizmusok. kondícionális (letális) mutáció ts (temperature sensitive), ami ált. missense mutáció lehetnek egyéb környezeti tényezők is kondíciók (táptalaj) frameshift mutáció leolvasási keret eltolódást okoz, a replikáció során 1 bázis kiesése vagy betoldódása révén (deléció/inszerció) deléció, inszerció, inverzió,

2 Az UNIVERZÁLIS kódszótár START AUG Met (M) STOP UAA, UGA, UAG Met (M) és Trp (W) (UGG) egy kodon a legtöbb aminosavra 2-6 kodon Leu (L), Arg (R), Ser (S) 6 kodon összefügg az előfordulás gyakoriságával (kodonhasználat és G+C tartalom) Az első két bázis általában elég az aminosav meghatározásához XYU, XYC, XYA, XYG lásd trns antikodon, lőtyögő pozíció Minden bázis változhat, de sok a silent vagy neutrális mutáció. Ezekben az esetekben nincs fenotípusos következménye a mutációnak, tehát nem is vesszük észre (polimorfizmusok). A genetikai kód redundáns, sokszor 6 kodon is ugyanazt az aminosavat jelenti. Ekkor a harmadik, lötyögő pozíció szabadon változhat! FORRÓ PONT: a változás gyakrabban okoz fenotípusos változást (fontos aminosav, kevés alternatív kodon) vagy tényleg gyakoribb mutációs hely lásd 5meC T

3 wt vad típusú missense GGA AGA Gly Arg nonsense GGA TGA

4 wt frameshift

5 Reverzió vagy back mutáció pontmutáció esetében az eredeti szekvencia áll helyre egy újabb mutációs esemény következtében (tranzíció, transzverzió, frameshift, de pl. trinukleotid ismétlődés esetében is lehetséges. deléció NEM revertálhat Szupresszor mutáció Egy mutáció hatását elnyomja egy második mutáció (a vad fenotípus áll helyre) Génen belüli, de génen kívüli szupresszor mutáció is lehetséges. Génen belüli: lásd a következő oldalon a frameshif mutációk példáján. Génen kívüli -lásd az ábrát A/B fehérjék enzimatikusan aktív dimert alkotnak A gén mutációja a allélt és a fehérét eredményez a/b nem illik egymáshoz B gén mutációja b allélt és b fehérjét eredményez a/b enzimtikusan ismét aktív dimer lehet 8-5

6 wt vad típusú frameshift +1 frameshift +1/

7 Loss of function (funkcióvesztéses) mutáció Általában a legtöbb mutáció hatása ilyen. Pl. laci represszorgén sok mutációja funkcióképtelen fehérje nincs represszió Gain of function (funkciónyeréses) mutáció laci represszorgén speciális mutációja (IS allél) megváltozott funkció mindig represszió van, nem ismeri fel az inducer molekulát. Az IS dominánsm I+ és I- felett is és a mutáns allél jelenlétében nem történik indukció inducer (IPTG) jelenlétében sem. Enzim szubsztrát specifitás megváltozása is lehet példa a funkciónyerésre: az A és B vércsoportok esetében egy pontmutáció következtében az N-acetil galaktóz amin (A vércsoport) helyett galaktóz specifikus (B vércsoport) lesz a glükoziltranszferáz enzim. (A 0 vércsoport esetében egy másmilyen pontmutáció miatt funkcióképtelen a kódolt enzim ez szintén példa a funkció vesztéses mutációra.)

8 A stay-green mutáció A stay-green mutáció a klorofill degradációt szabályozó pozitív regulátor fehérje génjét (PsSRG) rontja el. Az érett borsóban nem bomlik le a klorofill, ezért zöld marad. Ha a regulátorgén legalább egy működőképes kópiája jelen van (domináns), akkor a klorofill lebomlik és a borsó színe sárga lesz

9 starch branching enzyme, SBE1 A ráncos borsó recesszív mutációt hordoz, homozigóta formában, a keményítő elágaztató enzim (starch branching enzyme, SBE1) génjében. A borsószem magasabb szacharóz tartalma miatt több vizet vesz fel, ami az éréskor, vízvesztés miatt ráncosodást okoz Amilóz amilopektin SBE1 8-9

10 Le lókusz, GA4 gén, gibberellin-3-hidroxiláz Le le allélnál Ala Thr helyettesítés az aktív centrum közelében! csökkent enz. aktivitás

11 A MUTÁCIÓK KÉMIÁJA Fluktuációs teszt (1943.) Salvador Luria és Max Delbrück az "adaptációs" hipotézist vetették alá kísérletes próbának. A hipotézis szerint a fágrezisztencia vagy bármilyen mutáció megjelenésének oka a fág illetve más, a mutáció kiváltásáért felelős környezeti tényező megjelenése. (Tehát a környezeti hatás OK és nem csak szelekciós tényező). E. coli és T1 fág rendszeren vizsgálták a fágrezisztencia kialakulásának okát -> adaptációs vagy sponán mutáció? Adaptáció, ha a fág jelenléte befolyásolja a mutáció kialakulásának gyakoriságát, ha minden konstans, a rezisztensek száma nem "fluktuál". Sok független folyadékkultúrában a T1 fágrezisztensek számolása nagy variáció (10-100x-os különbségek) a rezisztensek számában kémcsövenként. Egy kultúra nincs variáció, csak a kísérletes szórás

12 Spontán mutációk: Tautomer átalakulások a replikáció közben. A tautomer átalakulás azt jelenti, hogy a guanin és timin esetében keto enol adenin és citozin esetében amino imino átalakulás történhet nagyon rövid ideig. 0,01 % arányban, (1/ rész) 1 óra alatt 0,36 sec. Megváltozik a töltéseloszlás. A::C és G::T bázispárok tranzíciós mutáció

13 A spontán frameshift mutációk Szintén replikációs hibából, ismétlődő vagy monoton szekvenciák másolásakor keletkezhetnek több bázist is érintő frameshift mutációk. A növekvő szál szintézisénél "csúszás" (slipped mispairing) következhet be Streisinger feltételezése szerint (Streisinger- modell). A deléció vagy addíció keletkezése attól függ, hogy az elcsúszás melyik szálon történik. Spontán léziók : depurináció G vagy A leválása a cukor-gerincról, apurin helyek kialakulása deamináció C U ennek következtében GC AT tranzíció alakul ki. Az 5meC (metilcitozin) esetén a deamináció direkt TIMIN (5meU) keletkezéséhez vezet, amit a repair rendszer - szemben az uracillal (az uracil DNS glikoziláz, lásd később ) - nem ismer fel. Ezért metilált citozin tartalmú helyek mutációs forró pontok lehetnek

14 Indukált mutációk, mutagének A véletlenül vagy célzottan létrehozott nem természetes külső környezeti hatások, mint az ultraibolya sugárzás, röntgensugárzás, károsító vegyületek okozzák az indukált mutációkat. Ezek létrejöttének mechanizmusa a spontán mutációk keletkezésével azonos is lehet (lásd oxidatív károsodás, UV hatás), de a mutáció gyakorisága a mutagén hatás fokozottabb jelenléte miatt nagyobb. A genetikai kísérletek végzéséhez szükséges mutánspark előállításánál bevett módszer a mutagének alkalmazása (lásd Müller és a röntgensugárzás alkalmazása). Bázisanalógok Az 5-bromouracil (5BU) timin analóg, amelynek ionizált formája gyakoribb. Az ionizált forma nem az adeninnel, hanem a guaninnal képes bázispárosodásra. A 2aminopurin (2AP) adenin analóg, aminek protonált formája a 2AP:C párosodásra képes, így okozva tranzíciót. Alkiláló szerek: Hatékony mutagénnek bizonyultak a különböző alkiláló szerek, mint az etil csoport donor etil-metán szulfonát (EMS) vagy a metil donor nitrozoguanidin (NG)

15 Az interkaláló szerek - mint az acridin orange - frameshift mutációt okoznak. Ultraibolya sugárzás (UV) A ciklobután gyűrű két szomszédos timin és szénatomja közötti kötés létrejöttével alakul ki UV fény hatására. DNS, UV elnyelése 260 nm körül van. A gerjesztés hatására egymás melletti két pirimidin kapcsolódhat össze timin dimer Ezen kívül lehet T-C, C-C között is kötés, amiben más szénatomok is részt vehetnek

16 MUTÁCIÓ és REPAIR A Az ivarsejtek kialakulásánál a magas mutációs ráta életképtelenné teszi az utódokat. A testi sejtekben előforduló sok mutáció elpusztítja az egyedet (rákos sejtek gyakori kialakulása). DE T A G Ha nincs mutáció, nincs evolúció. Replikációs pontatlanság Kémiai reakciók Mobilis genetikai elemek C G T Mutációk a kívánatosnál nagyobb számban keletkeznek, így szükség van javító mechanizmusokra. A Szintén replikációs hiba az elcsúszás Ismétlődő régióknál: di-, tri, tetranuleotid repeat A genom folyamatosan változik (kódoló és szabályozó elemek) A sérülések megakaszthatják a replikációs és transzkripciós folyamatokat. Inkorrekt bázispárosodás egy hosszabb szakaszon- Pl. két vagy három bázissal (egy ismétlődő egységgel) hosszabb az egyik szál. CA gyakori humán és más emlős genomban: mikroszatellit DNS Replikációs hibák és javításuk Pontmutáció, szubsztitúció (tranzíció, transzverzió) gyakorisággal oka: tautomer átalakulás Kódoló régióban is lehet ismétlődés: CAG (Gln, Q), CGG (Arg, R) trinukleotid repeat expanzió poly Gln fehérjerész Huntington kór (lásd korábban) CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG Más betegség oka is lehet pl. muszkuláris disztrófia

17 A DNS polimeráz és a proofreading repair Különösen nagy precizitás figyelhető meg a DNS replikációnál. 1 hiba / 1010 bázis (humán genom 3x109 bp). A DNS polimerizáció mechanizmusa ennél jóval több tévedést enged meg. A különbség a javító mechanizmusoknak köszönhető. A tautomer átalakulás miatt kb. 105 bázisonként keletkezik replikációkor hiba. Az inkorrekt bázispárosodást a replikációt végző polimeráz (pol III, E. coli) azonnal érzékeli (nem tud a térviszonyok miatt újabb bázist beépíteni) és 3 5 exonukleáz aktivitásának segítségével a nem komplementer bázist eltávolítja. A DNS-polimerázok hibajavító aktivitása (exonucl. 3 5 ) Ez a proofreading repear, a másolt szöveg azonnali korrekciója. A javításnak köszönhetően már csak egy hiba esik minden 10 7 beépített bázisra. További korrekcióra a többi javító rendszer segítségével kerülhet sor

18 Három fő hibajavító mechanizmus: -Direkt javítás -Bázis kivágás -Hibát tartalmazó szakasz eltávolítása

19 Mismatch repair system Mismatch = inkorrekt bázispárosodás Két, három nagyságrenddel tovább növelheti a másolás pontosságát, azaz minden századik vagy ezredik replikációs hiba marad csak meg. Probléma: i) a mismatch átmeneti, a következő replikációkor eltűnik ii) melyik a rosszul beépített bázis, melyik az új szál? muts, mutl, muth E. coli: MutS az ellenőr dimer, a hibánál konformáció változás, MutL ezt a komplexet ismeri fel, aktiválja a MutH nukleázt. Ez a mismatch közelében egy foszfodiészter kötést elhasít (nick), mindig az újjonnan szintetizált, a hibát hordozó szálon. Az új szál felismerhető egy ideig a Dam rendszer működése miatt

20 Dam metiláz (DNA adenine methylase) specifikusan metilálja a 5'-GATC3 szekvenciát (GmATC) 44 = 256 bázispáronként fordul elő átlagosan. Replikáció során hemimetilált helyek keletkeznek, ahol az új szálon a szekvencia még néhány percig nincs metilálva

21 Az eukarióta sejtekben szintén működik mismatch repair. A MutS megfelelője az MSH fehérje (MutS homologs v. hmuts), a MutL megfelelője az MLH (MutL homologs v. hmutl). Bizonyos rákféleségekre hajlamosít a MSH2 és az MLH gének mutációja. Több MSH gént illetve fehérjét is azonosítottak. Van, amelyik kis inszercióra/delécióra specifikus, ami replikációs csúszás (slippage) következtében jön létre, di- illetve trinukleotid ismétlődéseknél. Érdekes módon az eukariótákból, de a legtöbb baktériumból is, hiányzik a Dam metiláz és a MutH (a kettő együtt egy specifikus restrikciós-modifikációs rendszer). Az új szál felismerését az Okazaki fragmentek (nick!) teszik lehetővé

22 DNS károsodás A mutációkat külső környezeti tényezők is okozhatják: UV és röntgen sugárzás, különböző oxidatív vegyületek, alkiláló szerek, vagy lehet spontán degradáció is. Többféle direkt javítás is létezik (direct repair), amely azonnal helyreállítja az eredeti állapotot. A fotoreaktivációs repair UV hatására pirimidin dimer (timin, citozin dimer, ciklobután gyűrű) keletkezik két egymás melletti pirimidin között. Ez a szerkezet a replikációt megállítja. Minden élőlény csoportban (emlősökben csak NER) találtak fotoliáz enzimeket. Kék fény szükséges a működésükhöz. (Békapeték UV-B érzékenysége, fotoliáz aktivitása és a populációk gyérülése között összefüggést találtak.)

23 Direkt javítás Alkiltranszferázok Az O-6 pozícióban alkil csoportot tartalmazó guanin keletkezésekor (pl. nitrozoguanidin vagy EMS alkalmazása esetén) az alkiltranszferázok képesek a csoport direkt eltávolítására. Ha a direkt javítás nem lehetséges A hibás rész eltávolítása BÁZIS EXCÍZIÓS REPAIR (BER) A sérült bázist távolítja el a cukor-foszfát gerincről. Ezt a feladatot a DNS glükoziláz enzimek végzik, hidrolizálva a glükozidos kötést a bázis és a cukor komponensek között. Különböző specifikus glükozilázok találhatók a sejtben. A kis árok mentén végigcsúszva keresik a hibát. Humán sejtmagban nyolc különböző specifitású enzimet azonosítottak. Az uracil DNS glükoziláz a citozin deamináció révén keletkezett uracilt távolítja el. (Ezért jó, hogy a DNS-ben timin van és nem uracil, és ezért rossz, ha a C metilált!) HA METILÁLT (5mC), akkor TIMIN keletkezik, NINCS HIBA FELISMERÉS MUTÁCIÓS FORRÓ PONT!

24 BER repair Az uracil DNS glükoziláz a citozin deamináció révén keletkezett uracilt távolítja el

25 NUKLEOTID EXCÍZIÓS REPAIR (NER) A BER rendszerrel ellentétben nem specifikus szerkezeteket, hanem a kettős hélixben lévő torzulást ismeri fel., és egy hosszabb részen kivágja a hibás szálat. Egyes szálú rész jön létre, ahol DNS szintézissel áll helyre a kétszálú szekvencia. E. coli tól az emberig fontos hibajavító rendszer. Az E. coli nukleotid excíziós repair négy gén kódolja: uvra, uvrb, uvrc, uvrd Az UvrAB komplex ellenőrzi a DNS szerkezetét. Ha torziót észlel, az UvrB marad a hibás részen és elválasztja a két szálat. Ehhez a struktúrához kötődik az UvrC fehérje. Ez egy endonukleáz, ami a hibás szálat bázis hosszan kimetszi (két helyen vágja el a cukor-foszfát gerincet). Az UvrD egy DNS helikáz, ami eltávolítja a hibát tartalmzó részt. A DNS polimeráz I (Pol I) szintetizálja meg a hiányzó részt és a ligáz alakítja ki a gap helyén a hiányzó kovalens kötést. A humán xeroderma pigmentosum örökletes betegség a NER rendszer hibájából ered. A rendszer jóval komplexebb, mint prokariótáknál. XP fehérjék A kivágott egyes szálú DNS nukleotid

26 A duplaszálú törést javító rekombinációs repair Az excíziós repair a folytonos szál információját felhasználva javít. De mi van, ha mindkét szálon van törés? Ilyenkor működik a DSB rekombinációs repair, amely a testvérkromatidáról másolja át az információt. Leírása a homológ rekombinációnál szerepel. Posztreplikációs rekombinációs repair néven is ismert, mert csak a replikáció után biztosított a működése. (Lásd a folyamatot rekombinációnál.) részletesebben a DSB 8-26

27 SOS repair vagy translesion synthesis (TLS) A replikáció során egy másik javító mechanizmus is életbe léphet. Ez az SOS repair vagy translesion synthesis (TLS), ami a hibás DNS-templát szál hibahalmozó (error prone) másolását engedi meg. Speciális DNS polimerázok, az Y-family polimerázok végzik ezt a feladatot. Van olyan Y-családba tartozó humán polimeráz, amely AA bázisokat épít a timin dimerrel szemben. Tehát nem mindig hiba halmozó a rendszer. Az UV-induced mutagenesis vagy umu géneket E. coliban fedezték fel, amikor UV-kezelt sejtekben vizsgálták a bejuttatott lambda DNS hibáinak javítását. Kiderült, hogy a kezelt E. coli sejtekben indukálódik egy olyan replikációs mechanizmus, ami sok hibával másol