MUTÁCIÓ és REPAIR. Ha nincs mutáció, nincs evolúció. Mutációk a kívánatosnál nagyobb számban keletkeznek, így szükség van javító mechanizmusokra.

Átírás

1 MUTÁCIÓ és REPAIR A Az ivarsejtek kialakulásánál a magas mutációs ráta életképtelenné teszi az utódokat. A testi sejtekben előforduló sok mutáció elpusztítja az egyedet (rákos sejtek gyakori kialakulása). DE T A G Ha nincs mutáció, nincs evolúció. Replikációs pontatlanság Kémiai reakciók Mobilis genetikai elemek C G T Mutációk a kívánatosnál nagyobb számban keletkeznek, így szükség van javító mechanizmusokra. A Szintén replikációs hiba az elcsúszás Ismétlődő régióknál: di-, tri, tetranuleotid repeat A genom folyamatosan változik (kódoló és szabályozó elemek) A sérülések megakaszthatják a replikációs és transzkripciós folyamatokat. Inkorrekt bázispárosodás egy hosszabb szakaszon- Pl. két vagy három bázissal (egy ismétlődő egységgel) hosszabb az egyik szál. CA gyakori humán és más emlős genomban: mikroszatellit DNS Replikációs hibák és javításuk Pontmutáció, szubsztitúció (tranzíció, transzverzió) gyakorisággal oka: tautomer átalakulás Kódoló régióban is lehet ismétlődés: CAG (Gln, Q), CGG (Arg, R) trinukleotid repeat expanzió poly Glu fehérjerész Huntington kór (lásd korábban) CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG Más betegség oka is lehet pl. muszkuláris disztrófia 5-1

2 A DNS polimeráz és a proofreading repair Különösen nagy precizitás figyelhető meg a DNS replikációnál. 1 hiba / 1010 bázis (humán genom 3x109 bp). A DNS polimerizáció mechanizmusa ennél jóval több tévedést enged meg. A különbség a javító mechanizmusoknak köszönhető. A tautomer átalakulás miatt kb. 105 bázisonként keletkezik replikációkor hiba. Az inkorrekt bázispárosodást a replikációt végző polimeráz (pol III, E. coli) azonnal érzékeli (nem tud a térviszonyok miatt újabb bázist beépíteni) és 3 5 exonukleáz aktivitásának segítségével a nem komplementer bázist eltávolítja. Ez a proofreading repear, a másolt szöveg azonnali korrekciója. A javításnak köszönhetően már csak egy hiba esik minden 107 beépített bázisra. További korrekcióra a többi javító rendszer segítségével kerül sor. Mi a különbcég? dctp és CTP kötődése Az E. coli pol III alfa, epszilon és théta alegységek közül az epszilon alegységhez kötődik a proofreading aktivitás (mutd). Az epszilon funkcióképtelensége esetén van polimeráz aktivitás, de nincs proofreading hibajavítás. Igy a szintetizált DNS-szál több hibát tartalmaz. A mutd mutáns allélt hordozó baktériumtörzsből kiindulva mindenféle mutáció izolálása könnyebb. Az epszilon alegységet kódoló mutáns allélt ezért - más, javító funkciót kódoló mutáns allélhoz hasonlóan - mutátor génnek nevezzük, innen a mut rövidítés (lásd még GO repair). A DNS-polimerázok hibajavító aktivitása (exonucl. 3 5 ) 5-2

3 Specializált DNS polimerázok A DNS-polimerázok minden élőlényben nagy számban fordulnak elő és különböző feladatokra specializáltak: 3R! replikáció, repair, rekombináció E. coli legalább 5 féle Pol I primer eltávolítás és több féle repair (rövid szakaszok szintézise) Pol III kromoszóma replikáció eukarióták 15 féle DNS-polimeráz Pol (α) alfa/primáz primer szint. Pol (δ) delta - replikáció, NER, BER Pol (ε) epszilon replikáció, NER, BER pl. Pol (θ) théta dinb homológ, humán gén hdinb1 5-3

4 Specializált DNS polimerázok, csere replikációkor Eukariótákban a primer szintézist a DNS polimeráz α/primáz végzi (hatékonyság vagy processzivitás nt). Ezek után a sokkal hatékonyabban működő (nagy processzivitású, nt) delta (δ) és epszilon (ε) polimeráz veszi át a szintézist. Ezek processzivitását nagy mértékben fokozza a DNS körül gyűrűt alkotó PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) komplex. A PCNA nemcsak a szintézis hatékonyságát növeli, de számos repair fehérjével kerülhet kölcsönhatásba, ezzel változtatva az egész komplex funkcióját. PCNA: három alegység alkot egy kört a DNA körül (sliding DNA clamps). E. colitól az emberig megtalálható. Külön polimerázok specializálódtak bizonyos javító funkciókra E. colitól az emberig. A PCNA szerveződése a DNS körül 5-4

5 Mismatch repair system Mismatch = inkorrekt bázispárosodás Két, három nagyságrenddel tovább növelheti a másolás pontosságát, azaz minden századik vagy ezredik replikációs hiba marad csak meg. Probléma: i) a mismatch átmeneti, a következő replikációkor eltűnik ii) melyik a rosszul beépített bázis, melyik az új szál? muts, mutl, muth E. coli: MutS az ellenőr dimer, a hibánál konformáció változás, MutL ezt a komplexet ismeri fel, aktiválja a MutH nukleázt. Ez a mismatch közelében egy foszfodiészter kötést elhasít (nick), mindig az újjonnan szintetizált, a hibát hordozó szálon. Az új szál felismerhető egy ideig a Dam rendszer működése miatt. Bevágás után egy specifikus helikáz, az UvrD gyűri le az egyes szálat a mismatch felé, és különböző exonukleázok degradálják. A keletkezett egyes szálú részt a DNS polimeráz III (Pol III) foltozza be (+ ligáz). 5-5

6 Dam metiláz (DNA adenine methylase) specifikusan metilálja a 5'-GATC3 szekvenciát (GmATC) 44 = 256 bázispáronként fordul elő átlagosan. Replikáció során hemimetilált helyek keletkeznek, ahol az új szálon a szekvencia még néhány percig nincs metilálva. A MutH endonukleáz a hemimetilált helyekhez kapcsolódik, de nem aktív. Csak a MutS/MutL komplex jelenlétében hasítja a nem metilált szálat. Attól függően, hogy a bevágástól merre van a hiba, különböző exonukleázok végzik el a rossz szál lebontását. 5 irányban a 3 5 exonukleáz aktivitásssal rendelkező exonukleáz I, 3 irányban az 5 3 exonukleáz aktivitással rendelkező exonukleáz VII vagy a RecJ fehérje végzi a lebontást 5-6

7 Klónozás és Dam rendszer A Dam rendszer ismerete a klónozásnál is fontos! Azok a restrikciós enzimek, melyek felismerési helyében benne van a GATC, a metilált szekvenciát lehet, hogy nem hasítják. Ilyen a gyakran alkalmazott MboI A ClaI hasítóhelye részben tartalmazza a GATC szekvenciát (atcgat), ezért csak akkor nem hasít az enzim, ha a felismerési hely után közvetlenül egy C következik a 3 végen. nnn ATC GAT C nnn Azzal szembesülhetünk, hogy vannak a DNSen ClaI hasítóhelyek, de az enzim nem mindegyiket vágja. Ilyenkor Dam- törzsbe transzformálják a plazmidot és ebből tisztítják. 5-7

8 Az eukarióta sejtekben szintén működik mismatch repair. A MutS megfelelője az MSH fehérje (MutS homologs v. hmuts), a MutL megfelelője az MLH (MutL homologs v. hmutl). Bizonyos rákféleségekre hajlamosít a MSH2 és az MLH gének mutációja. Több MSH gént illetve fehérjét is azonosítottak. Van, amelyik kis inszercióra/delécióra specifikus, ami replikációs csúszás (slippage) következtében jön létre, di- illetve trinukleotid ismétlődéseknél. Érdekes módon az eukariótákból, de a legtöbb baktériumból is, hiányzik a Dam metiláz és a MutH (a kettő együtt egy specifikus restrikciós-modifikációs rendszer). Az új szál felismerését az Okazaki fragmentek (nick!) teszik lehetővé. Tehát addig működik a rendszer, amíg a ligálás be nem következik. In vitro a humán MSH fehérje a nick tartalmú szálon képes a hibajavítást elkezdeni (ez a követő szálnál működik!). A vezető szálon nincsenek Okazaki fragmentek, nincs nick! A MSH fehérje kapcsolódhat a replikáció során a DNS körül gyűrűt alkotó PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) komplexhez, amely a DNS polimeráz delta hatékony működését segíti. DNS károsodáskor a PCNA fehérjék ubiquitinálódnak és részt vesznek a repair folyamatokban. 5-8

9 DNS károsodás A mutációkat külső környezeti tényezők is okozhatják: UV és röntgen sugárzás, különböző oxidatív vegyületek, alkiláló szerek, vagy lehet spontán degradáció is. Többféle direkt javítás is létezik (direct repair), amely azonnal helyreállítja az eredeti állapotot. A fotoreaktivációs repair UV hatására pirimidin dimer (timin, citozin dimer, ciklobután gyűrű) keletkezik két egymás melletti pirimidin között. Ez a szerkezet a replikációt megállítja. Minden élőlény csoportban (emlősökben csak NER) találtak fotoliáz enzimeket, amelyek flavoproteinek. 2 db fénygyűjtő kofaktoruk van (FADH2 /MTHF). Kék fény szükséges a működésükhöz. A fotoliázok homológjai a kriptokróm fehérjék, amelyek a cirkadián ritmus szabályozásában vesznek részt növényekben és állatokban (emberben) is. (Békapeték UV-B érzékenysége, fotoliáz aktivitása és a populációk gyérülése között összefüggést találtak.) flavin adenine dinucleotide (FAD) methylene tetrahydrofolate (MTHF) 5-9

10 Direkt javítás Alkiltranszferázok Az O-6 pozícióban alkil csoportot tartalmazó guanin keletkezésekor (pl. nitrozoguanidin vagy EMS alkalmazása esetén) az alkiltranszferázok képesek a csoport direkt eltávolítására. Az E.coli metiltranszferáz az O6-metilguaninról a metilcsoportot egyik cisztein aminosavának -SH csoportjára helyezi át. S-metilcisztein keletkezik és így ismét guanin lesz a károsodás helyén. A reakció az enzimet (metil akceptor protein) maradandóan károsítja, ezért nagyon költséges a sejtnek ez a javítási mód. Ha a direkt javítás nem lehetséges A hibás rész eltávolítása BÁZIS EXCÍZIÓS REPAIR (BER) A sérült bázist távolítja el a cukor-foszfát gerincről. Ezt a feladatot a DNS glükoziláz enzimek végzik, hidrolizálva a glükozidos kötést a bázis és a cukor komponensek között. Különböző specifikus glükozilázok találhatók a sejtben. A kis árok mentén végigcsúszva keresik a hibát. Humán sejtmagban nyolc különböző specifitású enzimet azonosítottak. Hogyan ismerik fel a hibás bázist, hiszen a sérült bázis rejtve van a kettős hélix belsejében? Az uracil DNS glükoziláz a citozin deamináció révén keletkezett uracilt távolítja el. (Ezért jó, hogy a DNS-ben timin van és nem uracil, és ezért rossz, ha a C metilált!) HA METILÁLT (5mC), akkor TIMIN keletkezik, NINCS HIBA FELISMERÉS MUTÁCIÓS FORRÓ PONT! 5-10

11 BER repair Az uracil DNS glükoziláz a citozin deamináció révén keletkezett uracilt távolítja el. 5-11

12 BER repair 5 deoxiribóz-foszfát (drp) uracil DNS glükoziláz AP hely, a lánc folytonos! AP endonkleáz 3 OH vég és 5 deoxiribóz-foszfát (drp) Pol (δ) delta vagy Pol (ε) epszilon 2-10 bázis szintézis drp-régi szál legyűrődik flap 1 endonukleáz (FEN1, humán, Rad27 élesztő) eltávolítja DNS ligáz - van egy rövidebb út is (Pol β) 1 nt épül be, és a drp-t az enzim liáz doménje kivágja. (és további megoldások is) 5-12

13 A GO repair MutM MutT MutY A 8-oxodG hidrolízisét még a trifoszát beépülése előtt a MutT fehérje végzi el: (GO)-P-P-P -> MutT -> GO-P + PP Ha beépülés után történik az oxidáció, akkor specifikus oxog DNS glükozilázok távolítják el a hibát. AP endonukleáz DNS poli ligáz G:C GO::C A GO:C bázispárnál a MutM glükoziláz távolítja el az oxog-t. G:C GO::C replikáció GO::A Ha a replikáció előtt nem vágódik ki az oxog, akkor viszonylag gyakran oxog:a bázispár keletkezik. Egy specifikus glükoziláz (MutY) felismeri ezt a párt és az adenin bázist távolítja el! Fail-safe hiba mentes glükoziláz. Az oxog (piros) eltávolításakor az oxog glükoziláz (MutM) kihajtja a hibás bázist a kettős spirálból. 5-13

14 NUKLEOTID EXCÍZIÓS REPAIR (NER) A BER rendszerrel ellentétben nem specifikus szerkezeteket, hanem a kettős hélixben lévő torzulást ismeri fel., és egy hosszabb részen kivágja a hibás szálat. Egyes szálú rész jön létre, ahol DNS szintézissel áll helyre a kétszálú szekvencia. E. coli tól az emberig fontos hibajavító rendszer. Az E. coli nukleotid excíziós repair négy gén kódolja: uvra, uvrb, uvrc, uvrd Az UvrAB komplex ellenőrzi a DNS szerkezetét. Ha torziót észlel, az UvrB marad a hibás részen és elválasztja a két szálat. Ehhez a struktúrához kötődik az UvrC fehérje. Ez egy endonukleáz, ami a hibás szálat bázis hosszan kimetszi (két helyen vágja el a cukor-foszfát gerincet). Az UvrD egy DNS helikáz, ami eltávolítja a hibát tartalmzó részt. A DNS polimeráz I (Pol I) szintetizálja meg a hiányzó részt és a ligáz alakítja ki a gap helyén a hiányzó kovalens kötést. A humán xeroderma pigmentosum örökletes betegség a NER rendszer hibájából ered. A rendszer jóval komplexebb, mint prokariótáknál. A hibás repair rendszerrel rendelkező betegekből származó sejtvonalak fúziójával (szomatikus sejt hibridizáció és komplementációs vizsgálat) derítették ki a rendszerben részt vevő gének (fehérjék) számát. E módszerrel hét független gént tudtak kimutatni (A-G). A betegség után XP a fehérjék elnevezése: XPC a torzió felismerője XPA és XPD a javító buborék kialakítói A bevágásban az XPF és XPG fehérjék vesznek részt. A kivágott egyes szálú DNS nukleotid. 5-14

15 Transzkripcióval kapcsolt javítás Az átírást végző RNS polimeráz szintén felismeri a károsodott részt, ha az a templát szálon van (pl. timin dimer). A feltartóztatott RNS polimeráz helyét az excíziós repair (NER) fehérjék foglalják el. Igy az RNS polimeráz a hiba érzékelő fehérjék közé is tartozik. Eukariótáknál a fő hiba érzékelő transzkripciós faktor a TFIIH, amely az iniciációs buborék kialakításában vesz részt. A komplex része az XPA helikáz és az XPD. A TFIIH az excíziós repair rendszer része is. 5-15

16 A duplaszálú törést javító rekombinációs repair Az excíziós repair a folytonos szál információját felhasználva javít. De mi van, ha mindkét szálon van törés? Ilyenkor működik a DSB rekombinációs repair, amely a testvérkromatidáról másolja át az információt. Leírása a homológ rekombinációnál szerepel. Posztreplikációs rekombinációs repair néven is ismert, mert csak a replikáció után biztosított a működése. 5-16

17 SOS repair vagy translesion synthesis (TLS) A replikáció során egy másik javító mechanizmus is életbe léphet. Ez az SOS repair vagy translesion synthesis (TLS), ami a hibás DNS-templát szál hibahalmozó (error prone) másolását engedi meg. Speciális DNS polimerázok, az Y-family polimerázok végzik ezt a feladatot. E. coli esetén a DNS polimeráz III komplex (Pol III és PCNA gyűrű) szétesik, és helyét az UmuD és UmuC fehérjék alkotta Pol V vagy a Pol IV foglalja el. Ez a komplex például a timin dimer templáton vagy az abázikus helyeken is, hibásan másolva ugyan, de keresztüljut. A hibás helyet elhagyva ismét összeáll a pol III kompex. Van olyan Y-családba tartozó humán polimeráz, amely AA bázisokat épít a timin dimerrel szemben. Tehát nem mindig hiba halmozó a rendszer. Az UV-induced mutagenesis vagy umu géneket E. coliban fedezték fel, amikor UV-kezelt sejtekben vizsgálták a bejuttatott lambda DNS hibáinak javítását. Kiderült, hogy a kezelt E. coli sejtekben indukálódik egy olyan replikációs mechanizmus, ami sok hibával másol. Lásd az SOS válasz, az umudc operon és az Y-family polimerázok. 5-17

18 A DNS polimerázok homológiák alapján 7 családba oszthatók: A, B, C, D, X, Y, RT Az Y-családba tartozó DNS-polimerázok megtalálhatók mindenütt az élővilágban. Normál templáton alacsony pontossággal végzik a szintézist, de hibákat tartalmazó DNStempláton is képesek működni, ellentétben más polimerázokkal. Az SOS válasz Normál körülmények között ezek a gének nem expresszálódnak. E. coli esetén maga a DNS-károsodás a jel. In vitro a RecA aktiváció egyszálú DNS-t (ssdns) és ATP-t igényel. Valószínű, hogy a sejtben is a megnövekvő egyszálú DNS szakaszok hatására aktiválódik a RecA fehérje. Érdekes módon, ekkor a LexA fehérje, amely egy transzkripciós represszor, proteolitikus hasítása történik meg, amit nem a RecA végez, bár proteáz aktivitással is rendelkezik. A LexA saját magát inaktiválja a RecA hatására. A LexA repressziója alatt áll az umudc operon és számos más repair gén is. Az UmuD fehérje még inaktív, hasításáért, aktiválásáért (UmuD ) a RecA fehérje a felelős. Az aktív polimerázt az UmuD 2/UmuC komplex alkotja (DNS pol V.) Az SOS-válasz olyan géneket aktivál, melyek promóterében megtalálható az SOS-box (LexA kötőhely). A károsodás hatására néhány percen belül felhalmozódik a RecA fehérje, inaktiválódik a LexA és átíródnak az SOS operonok (pl umudc). A károsodás megszünése után ugyanilyen gyorsan represszálódnak az SOS gének, mivel a reca és a lexa génnek is represszora a LexA fehérje. Nincs jel nincs LexA hasítás represszió 5-18

19 Az SOS válasz például UV fény hatására aktiválható. A reca mutáns E. coli törzsek így számos funkcióban hibásak, nemcsak a homológ rekombinációban, hanem a javító funkciók indukciójában is központi szerepe van a RecA fehérjének. Y-family DNS polimerázok törzsfái Egy-egy színes körcikk a hasonló eredetű javító enzimek rokonsági viszonyait mutatja. Például a DinB fehérje (narancs színű rész) E. colitól (Ec DinB, = DNS pol IV.) az emberig (Hs DINB1) megtalálható Hs: H. sapiens, Mm: M. musculus, Dm: D. melanogaster, Ce: C. elegans, At: A. thaliana, Sc: S. cerevisiae, Eco: E. coli,... stb. 5-19

20