Pathologiai Diagnosztika Molekuláris pathologia. Semmelweis Egyetem,

Átírás

1 Pathologiai Diagnosztika Molekuláris pathologia Semmelweis Egyetem, II. Pathologia Intézet MOLEKULÁRIS PATHOLÓGIA LABORATÓRIUM Dr. Kiss András 2013 október 29.

2 Pathologiai diagnosis Klinikai Laboratórium Orvosi Mikrobiológia Pathologia - Anatomical pathology (+ clinical pathology) - Molekuláris pathologia Cytologia Histologia Immunohisztokémia Flow Cytometria Molekuláris pathologia MORPHOLOGIA

3 Vizsgálati anyagok Műtéti preparátum Biopsia szövethenger/darab Sejtek CYTOLÓGIA Folyadékok Emberi test

4 A pathológus munkája Szövettani minták elemzése, diagnosis, vélemény Cytológiai vizsgálat sejtek morphológiája Speciális vizsgálatok végzése: dg. pontosítása Kórboncolás elvégzése, értékelése Oktatás Tanácsadás (szóban is!!!)

5 Rutin eljárás szövettani vizsgálat során 1. Makroszkópos vizsgálat indítás 2. Kivágott szövetdarabok fixálása Szövettani asszisztens 3. Lemetszés 4. Festés 5. Vizsgálat

6 Mit indítunk?

7 Festési eljárások RUTIN: haematoxylin-eosin PAS (perjódsav-schiff) Alciánkék + PAS Giemsa Papanicolau

8 Speciális festések Nissl Masson Kristályibolya Best Grimelius Gomori Schmorl Gram Ziehl-Neelsen Orcein Gallyas Van Gieson Romeis Mallory Grocott Tri-króm Congo Resorcin-fuchsin Kossa Ezüstözés

9 Endoscopia

10 Gyomorbiopsia 2 mm

11 Alciánkék-PAS

12 Helicobacter pylori Giemsa

13 Warthin-Starry festés

14 Amyloidosis Congo Congo: POLARIZÁLT fényben

15 Metastasis

16 Metszetek: 2 Dimenzióban!! Biológiai struktúrák: 3 Dimenzióban!!

17 Invazív carcinoma -cervix

18

19 Specimen-mammográfia - mikrokalcifikáció

20 GENETIKA, CYTOGENETIKA PATHOLOGIA MICROBIOLÓGIA MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA CYTOLOGIA LABORDIAGNOSZTIKA

21 MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA ALAPJAI Molekuláris biológia = Molekuláris Pathologia MULTIDISZCIPLINÁRIS tud. terület Az anyag kezelése, a diagnózis kiadása és értelmezése konzultációt igényelhet!!

22 Ideális DIAGNOSZTIKA HEALTHY & BENIGN DISEASE CUTOFF CANCER Ng/mL % Specificity 100% Sensitivity

23 A realitás HEALTHY & BENIGN DISEASE CUTOFF Malignancy % FALS NEG. 70% FALS POS. ELENGEDTÜK Tumor tovább progrediál TOVÁBB VIZSGÁLJUK VÉGÜL KIZÁRJUK

24 ÁLTALÁNOS MEGJEGYZÉSEK - SPECIFICITÁS, SZENZITIVITÁS - Mire való a pathologia (beleértve a molekuláris pathologiát)? Kérdések? Mit mond a morfológia / genetikai infromáció? Fejlődési rendellensség? Örökölhető? Gyulladás? Akut vagy krónikus? Daganat? Tumor like lesion, benignus, malignus? Therápia / Prognosis / Predikció!

25 SPECIFICITÁS, SZENZITIVITÁS nagyságrendileg jobb

26

27 FAP

28 NEOPLASIA Traverso G, Shuber A, Olsson L, Levin B, Johnson C, Hamilton SR, Boynton K, Kinzler KW, Vogelstein B.: Detection of proximal colorectal cancers through analysis of faecal DNA. Lancet 2002 Feb 2;359(9304):403-4

29 Positive Predictive Value ( PPV) : It is the probability that a patient with a positive test result actually has ancer. PPV, unlike NPV,markedly influenced by the prevelance of disease in the population tested. Negative Predictive Value (NPV) : It is the probability that a patient with a negative test result does not have cancer.

30 TUMOR MARKEREK - CEA Levels higher than normal have also been found in Heavy smokers and in persons with cirrhosis, pancreatitis, Uremia, peptic ulcer, intestinal metaplasia of the stomach, as well as ulcerative colitis. The antigen has been reported in tissue of intestinal polyps: colonic inflammatory mucosa, and normal intestinal mucosa of children. The antigen is detected in about 50% of tumors of the breast, stomach, lung, and in other solid tumors.

31 CEA Posztoperatív prognosztikus indikátor Serial CEA in Monitoring Cancer therapy Assessment of the adequacy of Surgical Removal of primary tumor. If the preoperatively elevated CEA level fails to decrease to normal range of 2.5 ng / ml or less within 4 to 8 weeks postoperatively, this strongly suggests persistent disease. Patients with a persistently elevated CEA level postoperatively may indicate an incomplete surgical resection or metastatic disease.

32 Prostata RÁK Prostate rák a betegség elején ritkán okoz tüneteket. A betegek sokszor előrahaladott vagy metasztatikus prostata rákkal kerültek felismerésre. MA, a prostata rák többsége RDV eltérések vagy PSA szint emelkedése alapján kerülnek felismerésre.

33 PSA és Prostata Rák Incidencia és Cancer Incidencia (U.S ) PSA Screening 14 Incidence Mortality Source: Surveillance, Epidemiology, and End Results Program, , Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute, 2003.

34 - Mintavétel - Hibalehetőségek Minta:- aspirációs cytologia (fine needle aspiration biopsy (FNAB) - cytologiai kenet - PAP kenet -corebiopszia - sebészi rezekátum HIBALEHETŐSÉG: - Jelölés ( anyag / név / szám csere) - Az anyag reprezentatív? Pl. túl kicsi, nem jól orientált, felszínes, kifaragódott? Elég az anyag a diagnózisra? Mintavétel száma, mélysége. Makroszkópia, Protokollok?

35 WHIPPLE MŰTÉT Periampulláris Tumorok Pancreas cc Ampulláris cc Duodenális cc Distalis epeút cc Chronic pancreatitis

36 WHIPPLE SPECIMEN PANCREAS CC Tumor leírás Méret Szín Konzisztencia Cystták Helyzete az anatómiai struktúrákhoz. DTávolság a rezekciós szélektől Vezeték elzáródása Maradék pancreas állomány

37

38 ÁLTALÁNOS MEGJEGYZÉSEK malignus tumorok: Kérdések? Primer vagy secunder (metastasis)? Ha metastatis: hol a primer tu.? Terápia? Parameters a terápiához: grade és stage Ezek meghatározzák a terápiát: Rezekció + Radiotherapia + Chemotherapia (preoperatív vagy postoperatív) KOMMUNIKÁCIÓ a KLINIKUSSAL! Biztos malignus, biztos benignus: O.K. Pathologus nem tudja: MIÉRT? Sebészi rezekció: R0? Rezekciós szélek?

39 ÁLTALÁNOS MEGJEGYZÉSEK malignus tumorok: Pathologus nem tudja: MIÉRT? Nincs elég tapasztalat / tudás elméletileg lehetséges konzultáció! (pl. két szakorvos aláírása kell egy malignus diagnózis kiadásához!) Klinikai minta nem alkalmas definitív diagnózisra! Malignus tumor? Válasz : talán = NEM SEGÍTSÉG A DÖNTÉSHEZ Mennyire megbízható a lelet: Új biopszia? Control? Más technikák? KOMMUNIKÁCIÓ a KLINIKUSSAL! Kérdések? A legjobb lelet sem ér semmit, ha a klinikus nem érti meg a lényeget! SEBESSÉG és INFORMÁCIÓ ÁTADÁS a siker titka!

40 90 s: IMMUNOCHEMISTRY WAS CONSIDERED USEFUL OTHER TECHNIQUES WERE NOT IMPORTANT 2000 s: IMMUNOCHEMISTRY WAS ESSENTIAL FLOW CYTOMETRY WAS USEFUL OTHER TECHNIQUES WERE NOT IMPORTANT RECENT YEARS: IMMUNOCYTOCHEMISTRY TUMOR MARKERS FLOW CYTOMETRY PCR FISH IN SITU HYBRIDIZATION CYTOGENETICS TISSUE MICROARRAYS Almost every dpt. Clin. laboratories Path. Centers Path. Centers Path Centers Path Centers Spec. centers

41 INTER-PERSONAL SKILLS TRIPLE A: AVAILABILITY, AMICABILITY, ABILITY (AFFABILITY) EMOTIONAL INTELLIGENCE, INTEGRITY MOTIVATION, SELF STARTERS PROACTIVELY ENGAGE CLINICIANS NEED TO UNDERSTAND CLINICIANS PROBLEMS NEED TO KNOW HOW TO DO CONSULTATIONS BECOME INVOLVED

42 SEBÉSZI PATHOLOGIA FAGYASZTÁS MAKROSZKÓPIA CYTOLÓGIA GYN CYTOLÓGIA FNAB MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS ISO MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA ELVÁRÁSOK IMMUNOHISZTOKÉMIA MINDEN TECHNIKÁT KELL TUDNI INTERPRETÁLNI!

43 Módszerek - Immunhisztokémia - Deparaffinálás - Antigén feltárás / mikrohullám előkezelés - Blokkoló szérum - Primér antitest Szubsztrát Színreakció Peroxidáz - Secunder antitest - Avidin - Biotin - komplex - Peroxidáz reakció / DAB / - Háttérfestés / haematoxylin / Avidin Biotin Secunder AB Anti-egér Anti-nyúl Primér antitest egér nyúl Blokkoló fehérjék Antigén:

44 Melan A

45 Cytokeratin ellenes antitesttel pozitiv reakció 100x

46 Immunfluorescens vizsgálat IgM ellenes antitesttel

47 PATHOLOGIA TÜDŐRÁK Kissejtes (SCLC)? Nem-kissejtes (NSCLC) Subtyping of undifferentiated non-small cell carcinomas in bronchial biopsy specimens. Loo PS, Thomas SC, Nicolson MC, Fyfe MN, Kerr KM. J Thorac Oncol Apr;5(4): A reevaluation of the clinical significance of histological subtyping of non--small-cell lung carcinoma: diagnostic algorithms in the era of personalized treatments. Rossi G, Pelosi G, Graziano P, Barbareschi M, Papotti M. Int J Surg Pathol Jun;17(3): Review.

48 PATHOLOGIAI DIAGNOSZTIKA PRIMER TÜDŐRÁK NE markerek + TTF-1 + p63 HMWCKs (CK 5/6) CD56 + SCLC / LCCNEC Neuro-endokr. markerek - NSCLC, n.o.s. SQC EGYÉB ADC TTF-1 + p63 CK7 + HMWKCKs - rosszul diff. carcinoma átmeneti fenotípus TTF-1 - P63 - TTF-1 - p63 + CK7 -/+ CK 5/6 + HMWKCKs + S100A7 + A reevaluation of clinical significance of histological subtyping of non-small cell lung carcinoma: diagnostic algorithms in the era of personalized treatments. Rossi G, Pelosi G, Graziano P, Barbareschi M, Papotti M. Int J Surg Pathol Jun;17(3): Review

49 CITOLÓGIAI MINTAVÉTEL hazai gyakorlat Bronchoszkópos ( + transthroracalis) szövettani mintavétel 1 Bronchoszkópos citológiai mintavétel 4 Hátránya: - mintavételi hibák - fixálási hibák - kevesebb pontos diagnózis

50 Sebészi Rezekátum Makrodisszekció..

51 Transbronchialis biopszia T/N<1:8 T/N <1:2

52 Bronchus kefecitológia T/N>1/10 (10%) T/N>10/1 (90%)

53 SQC TTF-1 - p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 +

54 p63 TTF-1 SQC HMW CK TTF-1 - p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 + Chromogranin

55 bronchoszkópos biopszia

56 p63 p63 SQC TTF-1 TTF-1 - p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 + TTF-1

57 ADC TTF-1 + p63 HMWKCKs CK7 +

58 CK-7 TTF-1 ADC CK-7 TTF-1 + p63 HMWKCKs CK7 + TTF-1

59 bronchoszkópos biopszia

60 CK7 CK7 ADC TTF-1 TTF-1 + p63 HMWKCKs CK7 + TTF-1

61 50, éves férfi Anamnézis: Strumektomia, Diabetes Mellitus II. típus Parkinson bet. Katarakta (opus) Stroke Agyi atrophia, Demencia Ösophagusfekély Hospitalizáció bronchitis miatt Felvételkor: Hypoglikémia, Exsiccatio Gastroskopia: szövettan: gyomorrák US: multiplexeuh: májmet. asp. Citologia, FNAB : kolorektalis cc. Met.??? Primer Tumor??? Gravis Anémia - Transfusiók - ext: tumoros kachexia

62 CK-7 CK-20 DARM Sigma cc.

63 CK-7 CK-20 gyomor cc.

64 CK-7 CK-20 MÁJ MET. IHC vizsgálatból következik: A májmetastasist a vastagbélrák adta.

65 MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA METHODIKA DNS DNS szekvenálás, genotipizálás PCR, hybridizációs technikák: Southern blot, gén polymorphysmus detektálása: PCR, SNP chipek gén kópiaszám meghatározása: FISH, competitív PCR, real time PCR: HER-2, n-myc fertőző ágensek meghatározása: HPV, Chlamydia pn., mycobacterium tuberculosis, EBV, Helicobacter pylori, Cytomegalovirus...

66 A Southern blot ( Northern blot, Western blot)

67 PCR: Polymerase Chain Reaction ciklus 1. lépés:denaturáció 1perc 94 C forward primer reverse primer 2. lépés: annealing 45 sec 54 C Taq polimeráz 3 3. lépés: extenzió 2 perc 72 C 3 dntp Exponenciális - 2 n! 2 36 = 68 billió kópia!!

68 Gélelektroforézis Makromolekulák keveréke futás iránya elektroforézis gél

69 Kapilláris elektroforézis/mikrofluid technológián alapuló automata elektroforézis rendszer

70 Multiplex PCR Species-specifikus primerek

71 Nested PCR

72 Szekvencia specifikus PCR (Sequence-specific PCR, SSP-PCR) MINDKETTŐ!!! Különböző hosszúságú termék!!

73 Valósidejű (Real -Time vagy kvantitatív) PCR

74 Szekvenálás klasszikus módszerek - kémiai (Maxam-Gilbert)

75 Szekvenálás automata (fluoreszcens) szekvenálás Automata dye primer szekvenálás Automata dye terminator szekvenálás

76 MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA FISH Fluorescent In Situ Hybridization Cytogenetika- kariogram

77 Large B-cell lymphoma, hidden and complex translocations: der (14)t, (1:14), (?; q32), t(3:14), (q27,q32) multicolorfish t: 1:14 whole chromosome painting

78 MOLECULAR PATHOLOGY Comparative Genomial Hybridization CGH

79 Formalinban fixált, paraffinba ágyazott: FFP (E) MIÉRT CSINÁLJUK? MIT SZERETNÉNK ELÉRNI? NAGY SZÖVETI MINTAKÉSZLET + ADATBÁZIS MINDENT, DE.. - DNS -RNS -FEHÉRJE SZEKVENÁLÁS KLÓNOZÁS MUTÁCIÓ ANALÍZIS mrns EXPRESSZIÓ (real time RT-PCR, DNS CHIP) mikrorns-ek IMMUNHISZTOKÉMIA WESTERN BLOT ANALÍZIS PROTEOMIKA

80 Optimális fixálandó anyagméret? 5 mm vastag alternatív archiválás: RNAlater, foly. nitr. fagyasztás 1 mm / óra Példa: 8 cm-es tumor rezekátum Ha a rezekátum közepéből származik a pathologiai mintavétel: kb. 3-4 óráig fixálatlan degradáció + műtéti relatív ischemia degradáció

81 MI HAT A SZÖVETRE?? FORMALIN (pufferolt?) ALKOHOLSOR HŐMÉRSÉKLET!!! PARAFFIN (száraz hő) FEHÉRJÉK KÖZTI KERESZTKÖTÉSEK FEHÉRJE DEGRADÁCIÓ KONFORMÁCIÓ VÁLTOZÁS TÖRÉSEK FEHÉRJÉK és NUKLEINSAVAK KERESZTKÖTÉSEK (methylol keresztkötés) DNS, RNS DEGRADÁLÓDIK DNS, RNS ÖSSZETÖREDEZIK Igaz következtetések levonására alkalmatlan a FFP anyag? Kérdés: minek a megválaszolására alkalmas a FFP anyag?

82 FFP anyagok Szöveti lokalizáció In vitro Immunhisztokémia In situ hibridizáció (CISH, FISH) DNS alapú technikák RNS alapú technikák Fehérje alapú technikák

83 A fixálási idő hatása a szöveti struktúrára 1 nap 3 nap 10 nap

84 A fixálás jelentősége Helico FISH túlfixált megfelelően fixált

85 Az előkezelés jelentősége hőkezelés (HER2 FISH) Gjedrum és mtsai: J. Mol. Diagnostics, 6:42-51, 2004 Real-time quantitative PCR of Microdissected Paraffin-Embedded Breast Carcinoma

86 Az előkezelés jelentősége enzimes emésztés (HER2 FISH) alulemésztett túlemésztett

87 A fixálási idő 1 nap hatása az izolált DNS minőségére 3 nap 10 nap

88 A fixálási idő 1 nap hatása az izolált RNS minőségére 3 nap 10 nap

89 A fóliázott mintákból izolált DNS fragmentációja Fóliázás: máj vese 1 vese 2 vese 3 gyomorák Nap: C o 1000 bp 500 bp FFP 1000 bp 500 bp Nap: máj vese 1 vese 2 vese 3 gyomorák FFP Izolálás (Qiagen) : QiAamp DNA FFPE Tissue Kit ~0,5 μg DNS/minta, 1.2%-os gél Nap: vese 2 vese 3 gyomorák 1000 bp 500 bp

90 MOLECULARIS PATHOLOGIA MINTA TRANSZPORT DNS izolálás: rövid szekvenciák: 500 big: erre alkalmas az FFPE anyag. Mutációs analízis, PCR amplifikáció vagy szekvenálás egyébként : EDTA-s vér vagy fagyasztott szövet vagy aspirációs cytologia DNS lysis pufferban. Tárolás 4 C, - 20 C vagy - 80 C!! IDŐHATÁR!! VÉSZHELYZET: 4 C-n (jégen) küldeni vagy fiz. sóban nedvesített gézben a molekuláris pathologia laborba! PATHOLOGIA! KONZULTÁLNI A LABORRAL!! (előtte... ) Mol. pathologia és ElMI!! Pl. vese diagnosztika!

91 MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA CÉLJA Diagnosztikai és terápiás kérdések eldöntése Hematológia: pl. Philadelphia kromoszóma (CML) Lágyrész tumorok TERÁPIÁS CÉLPONTOK MEGHATÁROZÁSA Emlő cc. : HER-2 HERCEPTIN kezelés? Tüdő/colon cc.: k-ras mutáció EGFR gátlók b-raf n-ras EGFR mutáció Melanoma: b-raf Fertőző ágensek kimutatása, tipizálása: pl. HPV, Cytomegalovírus, Chlamydia pn., TBC, Helicobacter pylori clarythromycin rezisztencia meghatározás

92 MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA CÉLJA Felvetett diagnózis megerősítése, genotypus pontosítása, polymorphysmus vizsgálata pl. CML ( Philadelphia chr.), lymphoma tipizálás, Wilson kór, Haemochromatosis dg. MRD: Minimal Residual Disease!! Pl. Emlőrák - csontvelő, haematológiai betegségek - csontvelő

93 MOLECULARIS PATHOLOGIA ALAPJAI Tumor Diagnosztika Fertőző ágensek diagnosztikája Genetikai betegségek diagnosztikája

94 DAGANAT A RÁK is egyfajta GENETIKAI betegség!! Egy vagy több beteg gén hatása következtében alakul ki!!

95 DAGANAT Korai diagnózis, screening Pontosabb diagnosztika, Differenciáldiagnosztika, tipizálás, Prognosis, kezelés PREDIKTÍV PATHOLOGIA HOGYAN???

96 1. Tüdőrák célterápiás érzékenységének meghatározása EGFR exon mutáció vizsgálat K-RAS exon 2, codon 12/13 mutáció vizsgálat EML4-ALK fúziós gén vizsgálat EGFR, MET kópiaszám vizsgálat (FISH) 2.Vastagbélrák célterápiás érzékenységének vizsgálata K-RAS és B-RAF mutáció vizsgálata EGFR exon-2-7 mutáció vizsgálata EGFR kópiaszám meghatározás(fish) MSI státusz meghatározás: MLH1 és MSH2 inaktiválódás kimutatása (IHC) EGFR, MET kópiaszám vizsgálat (FISH) 3. Emlőrák célterápiás érzékenységének meghatározása HER-2 kópiaszám meghatározás (FISH) HER-2 ec-domain deléció vizsgálata p95 4. Malignus melanóma célterápiás érzékenységének meghatározása B-RAF mutáció vizsgálata N-RAS mutáció vizsgálata (codon 61) KIT mutáció vizsgálata (exonok) EGFR, MET kópiaszám vizsgálat (FISH) 5. Vesefejlődési rendellenességek genetikai hátterének tisztázása - Wilms tumor dg. WT1 mutáció analízis 6. HP antibiotikus rezisztencia vizsgálat FISH 7. HPV kimutatás (PCR) 8. Hematológiai diagnosztika: pl. Philadelphia chr transzlok. BCL-ABL fúziós gén Polycythemia vera: JAK2 pontmutációk Primer myelofibrosis: JAK2 v. MPL mutációk anaplasticus nagy B sejtes lymphoma: ALK átrendeződés mantle cell lmyphoma: Cyclin D1-IgH fúziós gén 9. Lágyrész daganatok diagnosztikája: Ewing sarcoma: FL1-EWS fúziós gén Liposarcoma: CHOP/TLS fúziós gén Clear cell src: EWS-ATF1 fúziós gén

97 CML - GLEEVEC terápia

98 Philadelphia-Chromosome

99 MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA MÓDSZEREI GENOMIKA, PROTEOMIKA, METABOLOMIKA!! (Chip technológia ) CYTOGENETIKA!! DNS: génkópiaszám (HER-2-ErbB2, n-myc), mutáció detektálás (mucoviscidózis, k-ras, EGFR ), LOH, génátrendeződés, fúziós gének (bcr-abl) kimutatása RNS: jelenleg igen ritka, de később: Expressziós profil meghatározása!!! Dg.!! FEHÉRJE: ELISA, WESTERN-blot, immunh.!

100 DNS CHIP globális gén expressziós profil

101 Sorlie et al., PNAS 98, , 2001

102

103 Az invazív ductalis carcinoma genetikai altípusai Normál emlő-szerű Luminális (A/B) ER+ Bazális típus ER-/PgR-/HER2- Triple negatív DE EGFR+ Her2+ (amplifikált) emlőrák EGFR+

104 Targeted Therapy CÉLZOTT TH. DEFINICIÓ: Olyan gyógyszerek, hatóanyagok, antitestek, melyek jelátviteli útvonalakat, folyamatokat, illetve élettani működéseket céloznak, melyek a daganatos sejtekben egyedi, specifikus módon alul vagy túlműködnek: Növekedési faktorok Receptorok Gének Angiogenesis Tumor ph DE : Ezek az útvonalak nem annyira egyediek

105 HCC PATHOGENESIS Thorgeirsson, S.S. and J.W. Grisham, Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma. Nat Genet, (4): p

106 Llovet J.M., Bruix J. Hepatology :

107 Llovet ASCO 2007

108 Phase III SHARP Trial Overall survival (Intention-to-treat) 1.00 Survival Probability Sorafenib Median: 46.3 weeks (95% CI: 40.9, 57.9) Placebo Median: 34.4 weeks (95% CI: 29.4, 39.4) 0 Patients at risk Sorafenib: Placebo: Hazard ratio (S/P): 0.69 (95% CI: 0.55, 0.88) P= * Weeks *O Brien-Fleming threshold for statistical significance was P= Llovet ASCO 2007

109 Phase III SHARP Trial Time to progression (Independent central review) 1.00 Probability of Progression Sorafenib Median: 24.0 weeks (95% CI: 18.0, 30.0) Placebo Median: 12.3 weeks (95% CI: 11.7, 17.1) Hazard ratio (S/P): 0.58 (95% CI: 0.44, 0.74) P= Weeks Patients at risk Sorafenib: 299 Placebo: Llovet ASCO 2007

110

111 ErbB Family and Ligands EGF TGF-α Amphiregulin β-cellulin HB-EGF Epiregulin No Known Ligands Heregulins HB-EGF Heregulins β-cellulin Extracellular Tyrosine Kinase Domain Intracellular ErbB-1 HER1 EGFR ErbB-2 HER2 neu ErbB-3 HER3 ErbB-4 HER4

112 AKT EGFR(1)

113

114 Tímár és Ostoros, L.A.M., 2007 Horn et al., J. Clin. Oncol., 27:4262, 2009

115

116

117 12&13 59&61 p21 ras ** *** ** * GTP/GDP Binding Switch Region Aktiváló Ras Mutációk GTP Hydrolysis GTP Exchange GTP Structures from Sprang S.R., Annu. Rev. Biochem : GDP

118 K-Ras mutációanalízis Anyag: műtéti rezekátum, biopszia Friss HE festett metszet TU-sejt arány meghatározása Makrodisszekció (tisztaság, keresztkontamináció elkerülése!) DNS izolálás RFLP; szekvenálás

119 K-ras mutáci ció meghatároz rozás s 2-es 2 exon 12-es kodon - PCR-RFLP RFLP M + - M

120 RFMD (Restriction Fragment Microfluidic based Detection) The flurescence labelled and microfluidic based detection is a sensitiv technology to detect the results of restriction fragments The system produces rapid, reproducible, and reliable separation of nucleic acid samples. Run time: 40 min/11 samples

121 Sensitivity of the PCR (RFMD) method Dilution range was generated from K Ras mutant (H358) and wild type( LCLC) cell line to define the sensitivity of this PCR RFLP method.we were able to detect 2% mutant DNA with Experion electrophoresis system

122 EGF Receptor L domén Furin-like domén EGFR Receptor L domén Extracelluláris domén Transzmembrán régió Intracelluláris domén Katalitikus kináz domén Tirozin foszforilációs hely (Y1068) STAT3 MAPK G719C dele746-a750 del747-t751inss del747-p753inss AKT L858R 790M e19 e20 e21 L861Q Query: 266 tgcaactcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacaca 325 Sbjct: 2603 tgcagctcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacaca 2662 Query: 326 aagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagatcgcaaagggcatga 385 Sbjct: 2663 aagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagatcgcaaagggcatga bp Exon NM_

123 EGFR-HRM exon , 20, 21 szekvenálás

124 EGFR2/HER2 jelátviteli pálya p (fiziológi giás s körülmk lmények között) k Herceptin PTEN

125 Disease-Free Survival Romond H et al. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer NEJM 2005; 353: AC TH % AC T 87% 75% 85% 67% N Events AC T AC TH HR=0.48, 2P=3x10-12 Years From Randomization B31/N9831

126 MOLECULARIS PATHOLOGIA HER-2 emlőrák HER2 amplifikáció normál

127 HER2 expression in breast cancer 3+ CB11 Amp HER2/CEP17

128

129 n-myc gene-amplification - Schwab et al. : THE LANCET Oncology, 4:472, 2003

130 Neuroblastoma - n-myc gene-amplification

131 Neuroblastoma - n-myc Gene-amplification - FISH

132 MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA FISH - húgyhólyagrák egészséges Húgyhólyag rák

133 MOLECULARIS PATHOLOGIA ALAPJAI Tumor Diagnosztika Fertőző ágensek diagnosztikája Genetikai betegségek diagnosztikája

134 TMA transcription-mediated amplification NASBA nucleic acid sequence-based amplification

135 Hybrid Capture Assay (HPV, HBV, CMV) A sejtből izolált DNS-t specifikus egyszálú RNS próbával hibridizáltatjuk. A jellegzetes struktúrájú DNS/RNS hibridet felismeri a a plate-re kötött antitest. Egy másodlagos antitesttel hívjuk elő a reakciót (kemiluminescens leolvasás) Érzékenysége: HPV 1000 kópia DNS RNS próba antitest másodlagos antitest

136 MOLECULARIS PATHOLOGIA HPV genotypizálás

137 HPV és a fejnyaki rákok hazánkban Lokalizáció HPV előfordulási gyakoriság (%) Méhnyak Penis Szájüreg Gége Nyelőcső Cardia Tüdő Szentirmay et al. Canc Met Rev 2005

138 HELICOBACTER PYLORI KIMUTATÁS Microhullám Helico -FISH

139 HELICOBACTER PYLORI KIMUTATÁS Microhullám Helico, Rezisztencia -FISH

140 HELICOBACTER PYLORI KIMUTATÁS Microhullám Helico, Rezisztencia -FISH

141 3 years old female Heart TX : dilatative cardiomyopathy Clinical diagnosis: Pneumonia Lung fibrosis CMV infection sepsis Arrhytmia Respiratory insuffitiency Pathology: Heart TX status post Lung fibrosis Pneumonia ARDS

142 49508/10 bjk. LUNG TX Semi-sterile samples : Non sterile samples 1. Heart 8. Lung 2. Lung 9. Liver 3. Brain 10. Adrenal gland 4. Spleen 11. Spleen 5. Liver 12. Kidney 6. Adreanl gland 7. Kidney PK- positive control (sequenced verified CMV DNA) NK- negative control

143 MOLECULARIS PATHOLOGIA ALAPJAI Tumor Diagnosztika Fertőző ágensek diagnosztikája Genetikai betegségek diagnosztikája

144 Egygénes betegségek és kimutatásuk molekuláris biológiai módszerekkel

145

146 26 éves nő 8 éve szed fogamzásgátlót Bizonytalan hasi panaszok Májenzym-emelkedés Hasi UH + CT: májban körülírt terime Műtét: májresectio Szövettani vizsgálat

147 DG: Focalis nodularis hyperplasia Differenciál diagnosis: HCC HCA CCC CCA Metastasis

148