Füle Tibor. Humán papillómavírus a méhnyakrákokban és a környező szövetekben. Témavezető: Dr. Kovalszky Ilona

Átírás

1 Ph.D. ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Humán papillómavírus a méhnyakrákokban és a környező szövetekben Füle Tibor Témavezető: Dr. Kovalszky Ilona Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet 2005

2 2

3 Összefoglaló Napjainkban elfogadott tény hogy a magas kockázatú (high risk) HPV típusok egyedüli karcinogénként szerepelnek a méhnyakrák kialakulásában. Vizsgálatainkkal arra a kérdésre kerestünk választ, hogy a Semmelweis Egyetem I sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikájának in situ méhnyakrák miatt konizált és invazív méhnyakrák miatt radikálisan operált betegeinek szövettani vizsgálatra küldött anyagában milyen gyakorisággal fordul elő a három leggyakoribb magas kockázatú HPV típus: a 16, 18 és 33 típusok. Milyen gyakorisággal fordulnak elő a fenti HPV típusok a tumor melletti nyirokcsomó áttétekben, illetve az áttétmentes nyirokcsomókban. Valamint, hogy befolyásolja-e a HPV jelenléte és típusa a tumor progresszióját, illetve szerepelhet-e a HPV jelenléte prognosztikai faktorként. Megállapítottuk és ez az ismert irodalmi adatokkal egybecseng, hogy a vizsgált HPV típusok kisebb gyakorisággal fordulnak elő CIN III mintákban, mint invazív rákokban. A fenti HPV típusok az 50 vizsgált konizátum minta 56 %-ában voltak jelen. A vizsgált magyar betegcsoportban az invazív méhnyak rákok 92%-a HPV 16, 18 és 33 fertőzéssel kapcsolható össze. Az áttéttel rendelkező nyirokcsomók szignifikánsan nagyobb arányban tartalmaznak HR-HPV szekvenciát, mint a nem áttétes nyirokcsomók, ám ez nem feltétlenül utal a mikrometasztázisok jelenlétére. Követéses vizsgálataink nem találtak összefüggést a nyirokcsomók HR-HPV érintettsége és a betegek túlélése között. Úgy gondoljuk, hogy a tumorprogresszió késői szakaszában a vírusszekvenciák, vírusonkoproteinek jelenlétének feltehetőleg sem a tumorsejtek invazív fenotípusának kialakításában, sem a betegek túlélésének befolyásolásában nincs olyan nagy szerepe, mint azt eddig gondoltuk. Vizsgálataink szerint a HPV 16 genetikai anyaga, és egyes fehérjéi jelen vannak nem hámeredetű sejtekben is. HPV E6 és E7 fehérjék jelenlétére utaló immunreakciót tapasztaltunk a tumor melletti perifériás idegrostokban, és a tumor környéki erek endotéliumában. Ezekben a szöveti struktúrákban a HPV teljes genetikai anyagának jelenlétét is bizonyítottuk. Ennek alapján úgy gondoljuk, hogy a HPV közreműködhet eddig ismeretlen etiológiájú nem daganatos patológiás folyamatokban. Mindez felveti egy újfajta eddig nem ismert terjedési útvonalának lehetőségét, melynek felderítése a jövő kutatásainak feladata lesz. 3

4 4

5 1. Bevezetés Egyes becslések szerint az emberi daganatok, mintegy 15%-a tulajdonítható vírusfertőzés következményének. Az elmúlt 20 évben az emberi papillómavírus (HPV) számos típusáról bebizonyosodott, hogy fontos szerepet játszik különféle daganatos megbetegedések kialakításában. A HPV az egyik legismertebb onkogén DNS vírus. Ubiqviter kórokozó, melynek legalább 85 típusa különböztethető meg az E6, E7 és L1 génjeinek szekvenciája alapján. Bizonyos közlemények szerint ez a szám ma már száz felett van. A HPV elsősorban hámsejteket fertőz. A vírusfertőzés különböző jó-, és rosszindulatú elváltozásokat okozhat: szemölcsöket, hám cisztákat, anogenitális, orofaringeális és laringeális papillómákat, keratoacantómát és a hiperkeratózis egyéb fajtáit, mirigy-, és laphámrákot. A vírusfertőzés természetesen nem feltétlenül jár rosszindulatú daganatok kialakulásával, a különböző vírustípusok ugyanis eltérő transzformáló képességgel bírnak. Azokat a HPV típusokat, amelyek jelenléte mellett magasabb a malignus transzformáció kialakulásának kockázata, az un. high risk csoportba sorolják, míg azok a típusok, melyekkel összefüggésben ez a kockázat kisebb, a low risk csoportban kapnak helyet. A high risk típusok azok a HPV-k, amelyek előfordulása rosszindulatú tumorokban igen gyakori. A legismertebbek a HPV 16, 18, 31, 33, 39, 45, 52 és ben közölték először, hogy HPV 16 DNS emberi sejteket, keratinocitákat immortalizál. A vírus az anogenitális régióban főleg szexuális érintkezés útján terjed. A fertőzések többsége abortív, vagy az immunrendszer nagyon rövid idő alatt eliminálja a vírusfertőzött sejteket. Az immunrendszer defektusai növelik a HPV fertőzések klinikai megjelenését. A high risk HPV p53, és prb kötő onkoproteineket termel, és így képes akár egyedüli karcinogenezisre. Az E6 és E7 korai vírusfehérjék tehetők felelőssé a fertőzött sejtek malignus átalakulásáért. Preneoplasztikus léziókban a HPV-genom episzómák formájában található, invazív méhnyak karcinómákban viszont nagyobb gyakorisággal integrálódik a 5

6 gazdasejt DNS-ébe. Valószínűsíthető, hogy az integrálódásnak szerepe van a hámsejtek malignus átalakulásában. Az integráció révén az epithélium sejtjei gyorsabban osztódnak és a növekvő DNS instabilitás további genetikai károsodások előtt nyit utat. A CIN III ból invazív rákká való alakulás az irodalmi adatok szerint egyértelműen a vírusintegráció számlájára írható. Igen hosszú idő telhet el a fertőzéstől kezdve az intraepitéliális neoplázia megjelenéséig, majd az in situ karcinóma, végül az invazív tumor kifejlődéséig. Nyugati országok adatai szerint a 16 és 22 év közé eső nők körében a legnagyobb az anogenitális HPV fertőzés aránya. Ez a kezdődő és fokozott szexuális aktivitással, és a gyakori partnercserével hozható összefüggésbe. A CIN gyakorisága a éves korosztályban a legmagasabb. A méhnyakrák az évesek körében a leggyakoribb. A látens periódus tehát a primer infekció és a CIN kifejlődése közt több év is lehet. Az invazív növekedés kifejlődéséig pedig akár év is eltelhet. A méhnyakrák a világon a második leggyakrabban előforduló daganat a női szervezetben. Érzékeny technikákat használva több országból összegyűjtött méhnyakrák-minták 95%-ában találtak HPV 16, 18 vagy más high risk típusokat. HPV 16 az összes pozitív minta 50-60%-ában, HPV %-ban volt kimutatható. Az epidemiológiai vizsgálatok, ahol a vírusfertőzést PCR technikával igazolták, rámutattak arra, hogy a HPV fertőzés nagyobb kockázatot jelent a méhnyakrák kialakulásában, mint a dohányzás kockázata a tüdőrák létrejöttében. Alapos munkák mutatják be, hogy a HPV az esetek nagy részében jelen van a diszpláziás hámban a CIN, majd a rák kialakulása előtt. Más kockázati faktorok teljes hiánya is alátámasztja azt az elképzelést, hogy a high risk HPV típusok egyedüli karcinogénként szerepelnek. A daganat keletkezési mechanizmusának megismerése mellett kérdés az is, hogy a vírus jelenléte hatással van-e a tumor biológiai viselkedésére. Prognosztikai jelentőségű-e az, ha a műtét során eltávolított tumorban, illetve az áttétes, vagy tumormentes nyirokcsomókban ki tudjuk mutatni a vírust? Az alkalmazott módszerek érzékenységének szintje sokáig korlátozta a vírusok kimutatását. A hibridizációs technikák, majd a PCR bevezetése azonban lehetővé tette, hogy ma már akár egy-két víruskópia is kimutatható. Az is eldönthető, hogy a vírus a genomba integrálódott-e, vagy episzómálisan van jelen, aminek ahogy láttuk - 6

7 prognosztikai jelentőséget tulajdonítanak. A HPV fertőzés gyakoriságára vonatkozó régebbi adatok éppen a fentiek alapján valószínűleg alábecsültek. A magyar lakosság HPV fertőzöttségéről nincsenek pontos adatok. A rutin diagnosztikában elsősorban a nőgyógyászati panaszokkal érkezőket szűrik. Magyarországon évente mintegy 1300 új, általában későn felfedezett eset mellett évente 600 nő hal meg a méhnyakrák következtében. Ezzel az évek óta stagnáló aránnyal hazánkban a méhnyakrák a daganatos megbetegedések okozta halálozási statisztikákban a tizenegyedik, csak nőket tekintve a kilencedik helyen áll. A fejlett országokban a szűrési tevékenység intenzitásával arányosan mind a méhnyakrák előfordulása, mind pedig a halálozási adatok csökkenő tendenciát mutatnak, ezért ma a méhnyakrákot már nagyrészt megelőzhető betegségnek tartják, s vélhetően azokban az országokban, ahol a szűrési feltételek adottak ilyen Magyarország is -, az évek óta változatlan adatok csakis a személyes, vagy az egészségügyi ellátási rendszer mulasztásának rovására írhatóak. Magyarországon ban indult intenzív ösztönző kampány annak érdekében, hogy a különösen veszélyeztetett korcsoportba tartozó nők rendszeresen megjelenjenek méhnyakrákszűrésen. 7

8 2. Célkitűzések Vizsgálataimmal az alábbi kérdésekre kerestem választ: 1.- Milyen gyakorisággal fordul elő a Semmelweis Egyetem I sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikájának in situ méhnyak konizátum, és az invazív méhnyakrák miatt operált betegek anyagában a három leggyakoribb magas kockázatú HPV 16, 18 és 33 típus? 2.- Milyen gyakorisággal fordulnak elő a fenti HPV típusok a tumor melletti nyirokcsomó áttétekben, illetve az áttétmentes nyirokcsomókban? Azonos HPV típust találunk-e a nyirokcsomó áttétekben és a primer tumorokban? 3.- Befolyásolja-e a HPV jelenléte és típusa a tumor progresszióját? 4.- Szerepelhet-e a HPV jelenléte prognosztikai faktorként? 5.- Szolgáltatnak-e új információt a betegség jobb megértéséhez a vírus morfológiai kimutatását célzó vizsgálatok? 3. Anyag és módszer 3.1. Anyagok Munkánk során 50 beteg in situ méhnyakrák mintája került feldolgozásra. A vizsgálatokat megelőzően ezek a betegek kolposzkópos és/vagy citológiai elváltozások miatt konizáción estek át. Az elmúlt 5 évben (2000. január 1. és december 31. között) az I. sz. Nőgyógyászati Klinikán 224 betegen végeztek radikális hiszterektómiát és parametriális és parailiacalis nyirokcsomó eltávolítást, azaz Wertheim műtétet. Ezek közül 150 beteg mintáját dolgoztuk fel. A műtét során a daganat kimetszésével párhuzamosan a nyirokutak által meghatározott hat anatómiai területről az arteria iliaca communis környéki, az arteria hypogastrica (iliaca interna) környéki valamint a fossa obturatoriában elhelyezkedő nyirokcsomók kerültek eltávolításra bal és jobb oldalról. Így összesen 150 tumor és 900 (6/beteg) nyirokcsomó minta állt rendelkezésre. 8

9 3.2. A módszerek Vizsgálataim során a következő módszereket használtam: I. Szövettani vizsgálatok II. Folyadékfázisú PCR-technikák: - Konvencionális PCR az emberi béta-globin gén, mint belső kontroll, detektálására - Nested PCR alkalmazása Humán papillómavírus 16, 18 és 33-as típusainak kimutatására II. In situ hibridizáció saját készítésű fluoreszcensen jelzett DNS próbával, és biotinált gyári próbával a HPV 16 genetikai anyag kimutatására. Vizualizálás enzimatikus szövettani technikával, illetve fluoreszcens technikával (indirekt FISH). III. Blottolási technikák alkalmazása a PCR specifitásának ellenőrzésére (Southern blot) valamint a próbajelölés hatékonyságának vizsgálatára (Dot blot) IV. Immunhisztokémia a HPV 16 fehérjék kimutatására V. Lézer mikrodisszekció mikroszkópikus méretű szöveti struktúrák kivágására nukleinsav izolálás céljából. VI. DNS szekvenálás VII. Statisztikai analízis 9

10 4. Eredmények 4.1. Vizsgálatok in situ karcinómákon A vizsgált 50 in situ karcinóma közül 28 esetben (a minták 56%-ában) volt detektálható HPV 16, 18 vagy 33 típus PCR technikával. Kettő vizsgált esetben két típus együttes előfordulása volt kimutatható, egy beteg esetében mindhárom típus detektálható volt. A szövettani vizsgálatok során HPV fertőzésre utaló direkt jelek 32 esetben (64 %), indirekt jelek 33 betegnél (66%) voltak megfigyelhetők. A matematikai elemzés eredménye szerint a HPV-fertőzésre utaló direkt jelek szövettani vizsgálatának érzékenysége 75%, specifitása 50%, HPV 16, 18, 33 típusok fertőzésére vonatkozó prediktív értéke 65%. A direkt szövettani jelek megléte jól jelzi a HR-HPV DNS jelenlétének valószínűségét (p=0,0675), bár a kapcsolat nem szignifikáns Vizsgálatok előrehaladott invazív méhnyakrák mintákon, és kismedencei nyirokcsomókon Szövettani vizsgálatok Minden tumort a FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics classification) szerint, és szövettanilag is osztályoztunk. A vizsgált tumorok többsége, mintegy 90%-a (135/150) laphámrák (133 squamosus és 2 anaplasztikus-squamosus) 10%-uk pedig adenocarcinoma (2 adeno-squamosus, 12 adenocarcinoma és 1 világossejtes carcinoma) (15/150) volt. Stádiumbeosztásukat tekintve a tumorok 2,6%-a (4/150) I/A, 33%-a (50/150) I/B, 25%-a (37/150) II/A, 36%-a (54/150) II/B, 0,7%-a (1/150) III/A és 2,6%-a (4/150) pedig III/B besorolású. A laphámrákok 44,4%-a (60/135), míg az adenokarcinómák 60%-a (9/15) adott nyirokcsomóáttétet. Az eredmény az adeno csoport kis mintaszáma miatt nem szignifikáns (p=0,126). Míg a lokális terjedést nem mutató daganatok 35,2%-a, addig a lokálisan invazív daganatok 52%-a adott áttéteket (p=0,0337). 10

11 A lokális terjedést nem mutató daganatok mellett a nyirokcsomók 9,6%-ában, míg a lokálisan invazív daganatok mellett a nyirokcsomók 17,9%-ában találtunk áttéteket (p=0,001). PCR vizsgálatok HPV-pozitív esetnek tekintettük azokat a betegeket, melyek tumor-, vagy nyirokcsomó mintáiban vírusszekvenciát találtunk, így 92 %-a a betegeknek a vizsgált 3 HPV típus valamelyikét hordozta. A vizsgált esetekben talált HPV típus arányok: HPV 16 82,7%, HPV 18 36%, HPV 33 16%, 1 beteg esetében más HPV típust detektáltunk. 42 beteg mintáiban (28%) a vizsgált típusok közül kettőt, vagy hármat egyszerre tudtunk kimutatni. Szövettani és PCR vizsgálatok összevetése A laphámrákok 75,5%-a míg az adenokarcinómák 66,7%-a volt HR-HPV pozitív. Adeno csoportban a HPV pozitív esetek aránya kisebb, de a kis mintaszám miatt ez nem szignifikáns. (p=0,33) A két csoport jelentős különbséget mutatott a nyirokcsomóminták HPV pozitivitásában. A laphám eredetű tumorok nyirokcsomóinak 41%-a, a mirigyhám eredetű tumorok nyirokcsomóinak 32,2 %-a volt pozitív. A különbség éppen nem szignifikáns p=0,0537. A HPV 16, 18 és 33 típusok előfordulásának különbségében szembetűnő, hogy a HPV16 pozitív esetek aránya a laphámrákok esetén magasabb (64,44% vs. 40%, p=0,0321). Az eredmény a kis mintaszámú adeno csoport ellenére is szignifkáns. A primer tumorok HR-HPV fertőzöttségében a daganatok stádium szerint bontott két csoportja közt nem volt különbség (75,9% vs. 72,9%). A HR-HPV érintett nyirokcsomók arányának összevetésekor azt a meglepő eredményt kaptuk, hogy a magasabb klinikai stádiumú tumorok szignifikánsan kisebb (44,1% vs. 38% p=0,0425) arányban hordoznak HR-HPV-t. Az egyes típusok előfordulásának aránya statisztikailag sem a tumor mintákat, sem a nyirokcsomómintákat tekintve nem különbözik a két csoportban. 11

12 A nyirokcsomó áttéttel rendelkező esetek HPV-PCR vizsgálata Az adatok statisztikai vizsgálata során összevetettük a tumorban talált HPV típust az áttétes nyirokcsomók meglétével. A HR-HPV asszociált tumorok mellett magasabb arányban találtunk áttétet a beteg nyirokcsomóiban, ez az eredmény azonban nem szignifikáns. (47,3% vs. 41,7%, p=0,2748) Ugyanígy elmondhatjuk, hogy egyik általunk vizsgált HPV típussal asszociált méhnyakrák sem ad gyakrabban áttétet a nyirokcsomókba, mint a HPV negatív tumorok. A legnagyobb különbség a HPV 18 esetében mutatkozik, de statisztikailag ez sem szignifikáns. (51,3% vs. 41,7%, p=0,261) A 150 esetből a szövettani vizsgálat 69 beteg nyirokcsomóiban talált áttétet. E csoporton belül a betegek 94 %-a (65/69) rendelkezett legalább egy HPV pozitív nyirokcsomóval. A 81 szövettanilag negatív nyirokcsomókkal rendelkező beteg mintáit értékelve hasonlóan magas arányban 90%-ukban (73/81) találtunk legalább egy olyan nyirokcsomót, amelyben ki lehetett mutatni HPV DNS-t. A két adat közt statisztikailag nincs különbség. Ha a fenti betegcsoportok nyirokcsomó mintáit részletesen megnézzük, azt találjuk, hogy az előbbi csoport 65 betegének 390 nyirokcsomó mintájából 120-ban volt szövettanilag igazolható áttét, melyek 65%-a (78/120) volt HR- HPV pozitív, és a minták igen nagy részében, 35%-ban (42/120), nem tudtunk vírusszekvenciákat detektálni. A betegcsoport 270 szövettanilag negatív nyirokcsomójának már csak 46,3%-a (125/270) volt víruspozitív. (negatív 53,7% (145/270) a különbség szignifikáns p<0,001) A 73 nyirokcsomó áttéttel nem rendelkező, ám víruspozitív beteg összesen 438 nyirokcsomó mintájának csupán 36%- ában (158/438) találtuk meg a vizsgált HPV típusok valamelyikét (a különbség szintén szignifikáns p<0,001). Klinikai paraméterek 121 beteg átlag 48 hónapos klinikai követése során a tumor 29 beteg esetében jelent meg újra, 3 esetben távoli áttétként. Ezen betegek körében a méhnyak daganata miatt 27 haláleset történt. Kaplan-Meier féle túlélési analízissel 36 hónap átlagos túlélés mellett sem a HR-HPV E6 gén jelenléte, sem az egyes HPV típusok jelenléte a tumorban nem befolyásolta a betegek túlélését. A nyirokcsomóáttét nélküli betegek 12

13 esetén szignifikánsan magasabb 84,5% betegségmentes túlélést találtunk, a metasztatikus nyirokcsomóval rendelkező betegek 59,5%-os túlélési arányával szemben (p=0,0021). A progresszió mentes túlélésben viszont nem volt szignifikáns különbség a HR-HPV pozitív nyirokcsomóval rendelkező, és azzal nem rendelkező betegek közt In situ vizsgálatok A nested PCR-ral vizsgált mintákat in situ módszerekkel is megvizsgáltuk a diagnózis morfológiai alátámasztása érdekében. Immunhisztokémiával a vírus korai fehérjéinek, E6 és E7 onkoproteinjének elhelyezkedését, in situ hibridizációval a vírus genetikai anyagának lokalizációját vizsgáltuk. Szándékunk szerint az ISH reakciók információt nyújtanak arról, hogy a HPV genetikai anyagnak milyen a fizikai állapota a tumorsejtekben, azaz episzómális avagy integrált formában van jelen. Episzómális formájú vírusgenomra jellemző a diffúz sejtmagi festődés, kiterjedt, apró pontokból összeálló szignál, ami az egyes sejtmagokban különbözőképpen jelentkezik. Ellentétben például az előrehaladott stádiumú méhnyakrák sejtjeiben a magon belüli festődés egy helyre lokalizálható, pontszerű, s ez a festődés minden sejtben megfigyelhető. Ezt a festődést a vírusgenom integrált fizikai állapotaként értékeltük. Gyakran ez a jellemző festődés a tumor környékéről származó kismedencei nyirokcsomóáttétekben is megfigyelhető volt HPV-re utaló jelek nem epiteliális szövetekben Meglepetésünkre az in situ módszerek alkalmazásakor néhány beteg esetében a tipikus laphámra lokalizálódó reakció mellett egyéb nem hámeredetű szövetben is találtunk pozitív jeleket mutató sejteket. Ilyenek voltak például az endotélsejtek, bizonyos mononukleáris sejtek, és az idegrostok Schwann sejtjei. Ötven HPV 16 asszociált laphámkarcinómát vizsgáltunk immunhisztokémiával. Nyolc mintában találtunk a tumorsejtek pozitív festődése mellett HPV E6 fehérjére utaló reakciót a tumor melletti perifériás idegrostokban, ezek közül 6 mintában a tumorkörnyéki erek endotéliuma is erős pozitivitást mutatott 13

14 Az erekben a reakció az endotélsejtekben volt látható, a szignálok pontos lokalizációját konfokális lézermikroszkóppal vizsgáltuk. Az HPV E6 elleni immunreakció az endotélsejtek citoplazmájában volt látható. Az immunreakció egyes idegrostokban sokkal kifejezettebb volt, s ez az erős festődés független volt a használt immuntechnikától, jelerősítéstől, enzimatikus, vagy fluoreszcens vizualizációs módszertől. Metszetenként nem minden egyes idegrost volt pozitív, voltak olyan ideg átmetszetek is melyek nem festődtek, olykor közvetlenül egy pozitív reakciót mutató idegrost mellett. Kettős immunreakcióval vizsgáltuk a metszetekben jelenlévő idegelemek és az érintett HPV pozitív idegrostok viszonyát. A jelenség oka nem az idegrostokban jelenlévő valamilyen epitóp és az E6 hasonlósága miatt fennálló keresztreakció. A mintákon HPV 16 E7 elleni immunhisztokémiai reakciót is végeztünk. Hasonlóan az E6 elleni reakciókhoz, a fenti minták esetében a daganatsejtek mellett a tumor környékén lévő erek endotéliuma, és a perifériás idegek pozitívan festődtek. Ugyanezeken a metszeteken a HPV fő kapszidfehérjéje (L1) elleni antitesttel is végeztünk immunhisztokémiai vizsgálatot, ám a kérdéses szöveti struktúrákban az E6 immunreakciókkal ellentétben festődést nem tapasztaltunk. Indirekt in situ hibridizációval vizsgálva az említett mintákat, hasonló eredményeket kaptunk. A HPV szekvenciák kimutatását célzó saját készítésű fluoreszcein jelzett próbák, valamint a gyári biotinált DNS-próbák a fenti metszeteken végzett vizsgálatok során pozitív reakciót adtak peritumorális területeken elhelyezkedő endotélsejtekben és az idegátmetszetekben. Lézer mikrodisszekció segítségével kivágtuk a HPV 16 E6 immunpozitív ereket és idegrostokat mintegy 2-5 mm-es távolságban a tumorsejtektől. A DNS izolálást követően ezeket a mintákat PCR-rel vizsgáltuk. A HPV 16 E6 ORF PCR vizsgálat során mind az idegrostok, mind pedig a kivágott érstruktúrák pozitív eredményt hoztak. A kapott PCR termékeket megszekvenáltuk, a szekvenciák analízise szerint az amplikon tökéletes egyezést mutat a HPV 16 E6 fehérjét kódoló szekvencia megfelelő fragmentjével (GenBank accession no. AF404702). A biológiai és a technikai negatív kontrollok eredménye szerint a kontamináció a vizsgálatok során kizárható. A vírusgenom fő kapszidfehérjéjét kódoló regió PCR vizsgálata a fenti mintákban hasonlóan pozitív eredményt hozott, ami a teljes vírusgenom jelenlétét valószínűsíti a vizsgált sejtekben. 14

15 5. Az értekezés főbb megállapításai A vizsgált HPV típusok kisebb gyakorisággal fordulnak elő CIN III mintákban, mint az irodalmi adatok, és saját vizsgálataink szerint - invazív rákokban. Kevés adat áll rendelkezésünkre arról, hogy mi a kapcsolat és a prognosztikus összefüggés a CIN III az invazív folyamatokat közvetlenül megelőző klinikai állapot és az egyes HPV típusok között. A méhnyakrákokban fellelhető leggyakoribb HPV típusoknak (16, 18, 33) vizsgáltuk a jelenlétét 50 olyan esetben, ahol a szövettan CIN III-at mutatott. A találati arány az anyagunkban 56 % volt. Vizsgálataink alapján a közvetlen és a közvetett morfológiai jelek meglehetősen alacsony érzékenységgel, kis specifitással és gyenge prediktív értékkel mutatták a PCR vizsgálattal bizonyított HR- HPV fertőzés meglétét, ami szerint a morfológiai jelek alapján diagnosztizált vírusfertőzés megbízhatósága kérdéses. Bár meg kell jegyeznünk, hogy a morfológiai jelek kialakításában több mint 20 anogenitális HPV típus szerepet játszhat, a jelen vizsgálat viszont csak a három leggyakoribb HR HPV-re volt bizonyító erejű. Emellett a malignusan transzformálódott sejtekben a HPV életciklusa nem teljes így valószínűleg a jól ismert morfológiai változások a malignus tumorsejtekre nem jellemzőek. A vizsgált magyar betegcsoportban a méhnyak rákok 92%-a HPV 16, 18 és 33 fertőzéssel kapcsolható össze. A negatív esetekben (a fennmaradó 8%) általános HPV specifikus primerekkel (MY09/MY11 és GP5+/GP6+) sem tudtunk vírus-dns-t kimutatni. Tény, hogy az invazív méhnyakrákokban a HR-HPV-k aránya magas, sőt szignifikánsan magasabb, mint a CIN II/III, IS carcinomákban, így vitathatatlan hogy a magas kockázatú HPV típusoknak a méhnyakrák kialakításában fontos szerepe van, és gyakorlatilag szinte csak a HR-HPV asszociált IS karcinómákból lesz invazív rák. Az áttéttel rendelkező nyirokcsomók szignifikánsan nagyobb arányban tartalmaznak HR-HPV szekvenciát, mint a nem metasztatikus nyirokcsomók. Ugyanakkor kiemelnénk azt az eredményt is, hogy az előbbiek 35 %-a vizsgálataink szerint vírusnegatív volt. Ez a jelenség érdekes módon főleg a magasabb klinikai stádiumú (FIGO II feletti) tumorok környezetében levő nyirokcsomók esetében volt 15

16 megfigyelhető. Ezek szignifikánsan kisebb (44,1% vs. 38% p=0,0425) arányban hordoztak HR-HPV-t. Azonban a HPV eredetű nukleinsav szekvenciák kimutatását a nyirokcsomókban sokan nem tekintik a mikrometasztázisok egyértelmű jelzésének, és így diagnosztikus eszköznek, illetve prediktív faktornak sem. Követéses vizsgálataink nem találtak összefüggést a nyirokcsomók HR-HPV érintettsége és a betegek túlélése között. A nyirokcsomó áttétek megléte a műtét pillanatában szignifikánsan rontja a betegségmentes túlélést, azonban sem a HR HPV E6 gén jelenléte, sem az egyes HPV típusok jelenléte a tumorban, vagy a nyirokcsomókban a daganatos betegek túlélését nem befolyásolta. A HPV szerepe a karcinogenezis kései folyamataiban nem olyan kifejezett A magasabb klinikai stádiumokban felfedezett tumorok HPV státusza már nem feltétlenül tükrözi a kialakulási viszonyokat. Eseteink 16%-ában találtunk vírusnegatív tumorminta mellett HR-HPV pozitív nyirokcsomókat, ami arra enged következtetni, hogy a kései stádiumú feltehetőleg igen heterogén, sokféle genetikai hibával rendelkező tumorban számos olyan sejtklón található, melynek már nincs szüksége a HPV onkoproteinek sejtproliferációs hajtóerejére, illetve annak elvesztése nem hoz változást a tumorsejt életében. A HPV 16 genetikai anyaga, és egyes fehérjéi jelen vannak nem hámeredetű sejtekben is. A morfológiai vizsgálatok váratlan eredményeket hoztak. Immunreakciót, illetve hibridizációs szignált nem csak a típusosan leírt laphám-, illetve tumorsejtekben találtunk. Pozitívnak bizonyultak egyéb sejtek, endotélsejtek, gyulladásos sejtek, idegrostok sejtjei is. Jelenleg nem találtunk hasonló adatot az irodalomban. A felismerés, hogy a HPV-k a gazdasejtek szélesebb spektrumában is fennmaradhatnak, új távlatokat nyit a papillómavírusok epidemiológiájában és patofiziológiájában, annak ellenére, hogy a jelenség mögött húzódó pontos mechanizmusok jelenleg tisztázatlanok. Azt gondoljuk, hogy a HPV 16 E6 protein, és emellett a teljes vírusgenom megjelenése az érendotéliumban az endotélsejtek antigénprezentáló funkciójával lehet 16

17 kapcsolatban. Ezzel ellentétben úgy gondoljuk, hogy az idegelemekben a vírus genetikai anyagának és E6 fehérjéjének jelenléte alapvetően más eredetű. Valószínűleg mind a fehérje, mind a DNS a neuronokban, vagy a Schwann sejtekben jött létre. A masszív immunpozitivitásnak csakis egy intenzív fehérjeprodukció lehet az oka. Aktív DNS replikációs folyamatok hiányában ezekben a sejtekben számos akadálya van a vírus DNS replikációjának, és a virionképzésnek. Kutatásaink szerint bár a teljes genetikai anyag jelen van, azonban részben inaktív, valószínűleg csak a korai gének fejeződnek ki. Így azt feltételezzük, hogy az E6 termelődésének ellenére az érintett idegsejtekben sem HPV DNS-replikáció sem virion formáció nem folyik. Az idegsejtek valószínűleg zsákutcát jelentenek a papillómavírus számára, mivel ezek a sejtek nem tudják támogatni a vírus életciklusát. Ezért nem valószínű, hogy ezek a sejtek további fertőzés, esetleges vírus reaktiváció forrásai lennének az emberi szervezetben. Ugyanakkor egy érett idegsejt évek, esetleg évtizedek alatti folyamatos korai vírusfehérje termelésének következménye jelenleg ismeretlen. Úgy gondoljuk, hogy a jelenség további vizsgálata megmutatja az összefüggést a HPV 16 jelenléte és az érintett sejtek valamilyen patológiás folyamatai között. Azt gondoljuk, hogy a jól ismert folyamatok mellett létezik egy alternatív HPV terjedési útvonal is. További kutatásaink feladata tisztázni, milyen módon kerülhet a vírus az idegsejtekbe. 17

18 6. Az eredmények összefoglaló értékelése Összefoglalva eredményeink alapján azt gondoljuk, hogy a magas kockázatú HPV típusoknak rendkívül erős tumorindukáló hatása van, amely a rákmegelőző állapotoktól a korai invazív tumorokig növekvő vírusasszociációban nyilvánul meg. A késői stádiumú méhnyakrákban a víruspozitivitás stagnáló, vagy csökken. A vírusfehérjék jelenléte a tumorsejtek bizonyos százaléka számára még fenntartó erőt, proliferációs hajtóerőt jelent, amely számos káros genetikai változást idéz elő. A szervezetben működő tumoreliminációs immunfolyamatok elsősorban a víruspozitív sejtek ellen irányulnak. Ehhez hozzáadódik a daganat elleni kezelések hatása. Ezek következtében kialakulhat egy olyan tumorsejtpopuláció, melyben más genetikai abnormalitások meglétére tevődik át a hangsúly, és ezek a sejtek fenotípusában (pl. áttétképző hajlam) is nagyfokú változásokat eredményeznek. Így a tumorprogresszió késői szakaszában a vírusszekvenciák, vírusonkoproteinek jelenlétének feltehetőleg sem a tumorsejtek invazív fenotípusának kialakításában, sem a betegek túlélésének befolyásolásában nincs olyan nagy szerepe, mint azt eddig gondoltuk. A rákkeltő vírus kimutatása és a fertőzés felszámolása csökkentheti az okozott tumorok gyakoriságát. Az ismételten ascus vagy P3 citológiájú és CIN I-III esetek HPV vizsgálatát az indokolja, hogy a magas kockázatú HPV típusok jelenléte biztosan elősegíti az in situ rákok invazívvá alakulását. Az általunk vizsgált in szitu rákoknak csak 56%-ában tudtuk kimutatni a magas kockázatú HPV típusok onkogenitásért felelős E6 génszakaszt, ami az invazív esetek 92%-ában jelen van. Ez arra utal, hogy a fertőzés jelentős szereppel bír az in situ méhnyakrákok invazívvá alakulásában. Invazív méhnyakrákokon történő vizsgálataink alapján azonban azt mondhatjuk, hogy a HPV esetében a vírus kiiktatását célzó terápiás eljárások alkalmazása kizárólag a korai klinikai stádiumokban, vagy inkább rákmegelőző állapotokban jöhet szóba, amikor a vírusnak a daganatképződés folyamataiban még kulcsszerepe van. Az emberi papillómavírus jelenléte nem a megszokott epiteliális szövetekben felveti a vírus egy újfajta eddig nem ismert terjedési útvonalának lehetőségét, melynek felderítése a jövő kutatásainak feladata lesz. Ennek alapján nem zárható ki a HPV közreműködése eddig ismeretlen etiológiájú nem daganatos patológiás folyamatokban. 18

19 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények bibliográfiai adatai Elsőszerzős közlemények Prognostic significance of high risk HPV status in advanced cervical cancers and pelvic lymph nodes Tibor Füle, Zsolt Csapó, Miklós Máthé, Péter Tátrai, Viktória László, Zoltán Papp, Ilona Kovalszky. Gynecologic Oncology közlésre elfogadta a megjelenés várható ideje: 2005 IF: 2,083 The presence of Human papillomavirus - 16 in neural structures and vascular endothelial cells Tibor Füle, Miklós Máthé, Zsuzsanna Suba, Zsolt Csapó, Tibor Szarvas, Péter Tátrai, Sándor Paku, Ilona Kovalszky. Virology közlésre elfogadta a megjelenés várható ideje: 2006 IF: 3,071 A humán papillomavírus (HPV) molekuláris kimutatása Füle Tibor, Kovalszky Ilona. Nőgyógyászati Onkológia 2005; 10:3-8 A vírusok molekuláris diagnosztikája [The molecular diagnostics of viruses] [Article in Hungarian] Fule T, Kovalszky I. Magyar Onkológia 2002 Apr 30;46(1):

20 Társszerzős közlemények Detection of high-risk HPV (16, 18, 33) in situ cancer of the cervix by PCR technique. Pete I, Szirmai K, Csapo Z, Szantho A, Fule T, Gallai M, Kovalszky I. Eur J Gynaecol Oncol 2002;23(1):74-8 I.F.: 0,395 Detection of Chlamydia pneumoniae in liver transplant patients with chronic allograft rejection. Lotz G, Simon S, Patonai A, Sotonyi P, Nemes B, Sergi C, Glasz T, Fule T, Nashan B, Schaff Z. Transplantation May 27;77(10): I.F.: 3,568 Abstracts presented at the II. Hungarian Cell Analysis Conference, May 4-6, 2000, Budapest, Hungary: Introduction János Gergely Cytometry Volume 46, Issue 3, Communications in Clinical Cytometry I.F.: 2,317 Nem az értekezés témájában megjelent közlemény Stromal Syndecan-1 Expression is an Adverse Prognostic Factor in Oral Carcinomas Miklós Máthé, Zsuzsanna Suba, Zsolt Németh, Péter Tátrai, Tibor Füle, Gábor Borgulya József Barabás, and Ilona Kovalszky Oral Oncology közlésre elfogadta a megjelenés várható ideje: IF: 2,000 20

21 Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki mindazoknak, akik munkámhoz útmutatásaikkal és segítségükkel hozzájárultak. Külön köszönet illeti témavezetőmet Dr. Kovalszky Ilonát aki önzetlen szakmai és emberi segítségnyújtással, töretlen elszántsággal éveken keresztül kalauzolt végig a HPV kutatás rögös útjain. Köszönettel tartozom Dr. Gallai Mónikának és Egedi Krisztinának, akiktől mind elméleti, mind gyakorlati téren munkám kezdetekor a legtöbb segítséget kaptam, továbbá Kovács Anitának, aki főleg az utóbbi években volt pótolhatatlan segítségemre. Külön köszönet illeti Dr. Máthé Miklós szintén a PhD fokozat megszerzéséért küzdő sorstársamat, akinek munkája és segítsége nélkül ez a munka nem jött volna létre. Köszönöm továbbá Tátrai Péternek, hogy a konyhanyelvi angoltudásommal megírt kézirataimat töretlen lelkesedéssel gyúrta át elfogadásra érdemes nyelvezetűvé. Hálás vagyok Dr. Kopper László egyetemi tanárnak az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet jelenlegi, és Dr. Szende Béla egyetemi tanárnak, az intézet volt vezetőjének, amiért lehetőséget biztosított, hogy az intézetben rendelkezésre álló sokféle műszert, és módszert használhattam, elsajátíthattam és alkalmazhattam. Külön köszönet illeti Dr. Paku Sándort, aki szakértelmével, és a Konfokális Lézermikroszkóp mágikus erejével biztosította a tökéletes fluoreszcens képeket. Köszönöm a jelenleg hivatalos nevén Molekuláris Diagnosztika és Molekuláris Onkofarmakológiának nevezett ám tradicionálisan mindenki által csak Biokémia laborként ismert laboratórium minden volt és jelenlegi munkatársának, közvetlen munkatársaimnak, név szerint: Baghy Kornéliának, Bedi Katalinnak, Csorba Gézáné Maricának, Dr. Dudás Józsefnek, Felletár Györgynének, Dr. Hariszi Revekkának, Hollósi Péternek, Dr. Jeney András professzornak, Dr. Kozma T. Gergelynek, László Viktóriának, Dr. Lásztity Jovánkának, Dr. Németh Attilának, Oláhné Nagy Júliának, Péterfia Bálintnak, Dr. Pogány Gábornak, Szarvas Tibornak, Tátrai Enikőnek, Tátrai Péternek, Dr. Tímár Ferencnek, akik munkám elvégzéséhez segítő baráti légkört teremtettek. Köszönöm az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet minden tagjának, hogy munkámat maximális segítőkészségüket élvezve végezhettem. Köszönöm Dr. Papp Zoltán professzornak, a Semmelweis Egyetem I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika vezetőjének, és Dr. Csapó Zsolt docensnek, a Klinika szülész-patológusának, hogy a kutatómunkában zökkenőmentes, összehangolt együttműködést biztosítottak. Közreműködésükkel sem a biológiai mintákból, sem a szükséges klinikai adatokból nem szenvedtem hiányt, valamint bölcs tanácsaikkal segítették a közlemények megszületését. Köszönöm továbbá Láng Ferencnének és Raum Lászlóné Katának és a Klinika szövettani laborjában dolgozó minden munkatársnak, hogy mindig a szükséges mennyiségű és minőségű vizsgálati anyagról gondoskodtak. Valamint külön köszönöm Dr. Balega Jánosnak és Dr. Than Nándornak, hogy a klinikai adatok beszerzésének és feldolgozásának nehéz, hálátlan feladatában segítettek. Köszönetemet fejezem ki Dr. Berencsi Györgynek, aki munkám során virológiai tudását osztotta meg velem, pótolhatatlan tanácsaival segítette tevékenységemet és a közlemények megszületését, s olyan tényekre hívta fel a figyelmemet, melyek meghatározzák a kutatómunka folytatását. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Sejtanalitikai munkacsoportjának, Dr. Sipos Ferencnek, Spisák Sándornak és Dr. Molnár Bélának, hogy lehetővé tették számomra, és segítették a Mikrolézer berendezés mikrodisszektor használatát. És végül hálás vagyok szüleimnek, feleségemnek és gyermekeimnek, akik mindenben támogattak a PhD munkával töltött évek alatt. 21