Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata A és B kurzus Function specific modul 10/1 Kísérletek tervezés; Életjelenségek megfigyelése, rögzítése, nyilvántartása Kaszaki József Sebészeti Műtéttani Intézet SZTE ÁOK 2015-2016-I. szemeszter
Tematika 2014-20152015 I. félév 1. Bevezetés. Az állatkísérletek törvényi szabályozása, az engedélyezések menete (BM). 2. Az állatkísérletek etikai vonatkozásai; Az állati jólét szempontjai; Az állatok tudományos célra való felhasználása mellett és ellen szóló érvek (BM) 3. Az állatkísérletek elméleti háttere és jelentősége; A helyettesítés, csökkentés és tökéletesítés (3R) követelménye; Állatmodellek az orvosbiológiai kutatásokban (BM) 4. A kísérleti állatok species specifikus biológiája I; Kis állatok (rágcsálók) bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája 5. A kísérleti állatok species specifikus biológiája II; Nagy állatok bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája 6. Állatokkal való bánásmód és kezelési formák 7. A kísérleti állatok tartásának jogi szabályozása és a környezetgazdagítás; A kísérleti állatok és állatházak higiénés fokozatai, a kísérleti állatház működtetése 8. A fájdalom, a szenvedés és a stressz felismerése; Az altatás és a fájdalomcsillapítás általános szabályai; Kíméletes végpontok és az eutanázia alkalmazása 9. A műtétek általános elvei, az aszepszis szabályai, alapvető sebészi beavatkozások és sebkezelés 10. Kísérletek tervezése; Életjelenségek megfigyelése, rögzítése, nyilvántartása November 17 11. Kísérletek és projektek tervezése, kivitelezése. A kísérleti adatok feldolgozása, a statisztikai analízis alapjai November 24 12. Állatkísérletek helyettesítése, ún. "alternatív" módszerek December 01 csak B kurzus hallgatók számára
Gyakorlati és elméleti vizsga időpontok kurzusonként Kurzus Elméleti vizsga Gyakorlati vizsga Állatkísérletek az Orvostudományban December 01 Szabadon választható kurzus 17.00-18.00 Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata A December 01 December 03 Kötelezően választható kurzus 17.00-18.00 17.00-18.00 ETR-ben hirdetett vizsga időpontok: December 08. 12.00- December 15. 12.00- Január 19. 12.00- Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata B December 11 December 11 Kötelezően választható kurzus 8.30-9.30 9.30-11.00 SKILL Seb. Műtét. Int.
Életjelenségek monitorozása I. Nem-invazív vizsgáló módszerek Hőmérséklet mérés Vérkeringés monitorozás: Pulzus tapintás, számolás; Nem-invazív vérnyomás mérés Elektrokardiogram Légzés monitorozás: légzésszám megállapítás légút biztosítás mesterséges lélegeztetés Kilégzett gázok monitorozása: Kapnográfia Pulzoximetria Kiválasztás: vizelet monitorozás
1. Hőmérséklet mérés Maghő = belső szervek hőmérséklete (testfelszínen - 4-5 0 C, a környezet függvényében) Befolyásolja: Hely Patkány Kutya Rectum: 37.1± 0.4 38.0 ± 0.4 Szájüreg: 36.7± 0.4 37.5 ± 0.4 Testrész fedettsége Nedvességtartalom Életkörülmények Napszak Bizonyos anesztetikumok, a műtét, keringési elégtelenség befolyásolhatják a hőmérseklet regulációt; Pentobarbitál hatására gyakori a hypotermia kísérlet alatt; Fűtőpárna alkalmazása szükséges a normál testhő fenntartásához.
Hőmérséklet monitorozása Hőmérők csipeszhőmérő
Testhőmérséklet Egészséges állat: fajra jellemző Betegállat: normálistól eltérő lehet magasabb (baktérium v. vírus okozta betegségek) vagy alacsonyabb Mérése: - leggyakrabban végbélben - ritkábban hüvelyben (magasabb) - bőrfelületen Állatfaj Egér 36,5-38 Patkány 37,5-38 Aranyhörcsög 37-38 Tengerimalac 38-40 Végbél hőmérséklet Cº Nyúl 38,5-39,5 sertés 38-40
Háziállatok testhőmérséklete ló 37,5-38 szarvasmarha 38-39 juh 38,5-39,5 kutya 38-39 macska 38,5-39,5 baromfi 39,5-42
2. Vérkeringés Egészséges állat: szívverések száma percenként fajra jellemző értékek Egér: 300-800 Patkány: 300-500 Aranyhörcsög: 120-140 Tengerimalac: 230-380 Nyúl: 130-325 Törpesertés 60-90 Kutya: 60-120 Macska 90-120 Ló 30-40 Szarvasmarha 50-80 Baromfi 150-200 vizsgálható: tapintással az állkapcson, a farok belső felén, nyakon
2.1. Vérnyomás A legfontosabb fiziológiai paraméter a vérnyomás, amelynek monitorozása a keringési állapot megismerésének egyik alapfeltétele. Az indirekt, nem invazív vérnyomás-mérés elsősorban rágcsálók (egerek, patkányok) esetében használt eljárás, amely során az állatok farkára helyezzük a mandzsettás érzékelőt. A mérés az oszcillotonometria ( elektromos vérnyomásmérő) elvén alapul.
Nem-invazív vérnyomás mérés rágcsálókon After training the rat to the tail cuff system, the rat is placed in a restrainer and warmed. A pneumatic pulse sensor is attached to its tail. A cuff is placed around the tail, and slowly inflated above the systolic pressure until it causes pulsations to cease, measured by the piezo-electric pulse sensor. The cuff pressure at which pulsations cease is taken to be the SBP in the tail. HR is determined automatically by counting pulses per unit time.
2.2. Elektrokardiográfia Állatkísérletek esetében is széles körben alkalmazott nem-invazív eljárás: a normális, illetve attól eltérő szívműködésről, ritmus zavarokról, a szívfrekvenciáról, a szívizom oxigén státuszáról ad információt. Standard EKG hullám A humán EKG jelhez képest jelentős eltérések lehetnek a kísérleti állatok esetében; Pl. fordított T hullám
3. Légzés vizsgálata A légzésszám az 1 perc alatti be- és kilégzések száma. Mérése megtekintéssel vagy tapintással történik. Megtekintéssel a mellkas és a has mozgását figyeljük; hideg időben a kilélegzett párás levegő is látható; tapintással a bordák mozgását érzékeljük.
Légzőszervrendszer Egészséges állat: fajra jellemző légzésszám Egér 100-200 Patkány 70-110 Aranyhörcsög 40-100 Tengerimalac 40-100 Nyúl 30-60 Baromfi 20-50 Sertés 8-18 Juh 20-30 Ló 10-15 Szarvasmarha 10-30 Kutya 15-30 Macska 20-30
3.1. Légzés biztosítás Endotrachealis intubáció Lényege: egy cső (tubus) bevezetése a szájon (vagy orron) át a légcsőbe: a légutak biztonságos szabadon tartása. Előnyei az extratrachealis módszerekkel szemben: 1. Az anatómiai holttér 40-50%-ra csökkenthető, az alveolaris ventilatio hatásfoka megnő, kivált nagyobb kockázatú betegeknél. 2. A manuálisan vagy gép segítségével áramoltatott levegő és anesztetikus gázkeverék csak a légzőrendszerébe juthat és nem a gyomorba. 3. A légúti váladék a hörgőrendszer csaknem minden részéből jól leszívható. 4. A fektetés nem okoz gondot a lélegeztetés fenntartásában (pl. hasrafordítás esetén).
Légút biztosítása az állatkísérletekben 1. Endotracheális intubáció szabad légutak biztosítása: nyomásmérés, légzési gázok (mintavétel), gyógyszer/anyagbeadás, BAL krónikus kísérletekben
Endotracheális intubació nagyállat modellben Laringoszkóp
Az intubálás eszközei Ruben-ballon szeleppel és maszkkal, tubuscsatlakozók, ragtapasz leszívókatéter, leszívópumpa laringoszkóp fecskendő laringeális maszk Guedel-tubus Magill-fogó endotrachealis tubusok
Intubálás laringoszkóppal 1. A laringoszkóp nyelét bal kézzel marokra fogjuk, és a lapocot a nyelv középvonalában a szájüregbe vezetjük, ha szükséges, a nyelvet a Z lapoccal balra félretoljuk; 2. A lapoc vége a nyelvgyök és az epiglottis közé kerül, a plica glossoepiglotticába, és a nyelvgyök felemelésével együtt felemelkedik a gégefedő is. 3. és feltárul a csúcsával felfelé álló, háromszög alakú hangrés.
Légút biztosítása az állatkísérletekben 2. Tracheostomia: tracheatubus vagy katéter bevezetése a tracheába egy nyíláson keresztül sebészi beavatkozás során. Indikációk: a szabad légutak biztosítása hosszú időre, mesterséges lélegeztetés, légzésmechanikai mérések.
3.2. Mesterséges lélegeztetés Mesterséges lélegeztetés: respirátor segítségével juttatjuk a levegőt a tüdőbe a trachea tubuson keresztül. Cél: oxigenizáció növelése, a ventilláció biztosítása atelektázia megszüntetése Indikáció: Spontán légzés akadályozott, pl.mellkas megnyitás esetén
Mesterséges lélegeztetés Pozitív nyomással: belégzéskor az alveolárisnál nagyobb nyomással áramlik a levegő a tüdőbe Térfogat-kontrollált respirátorral: belégzés a beállított légzési térfogat beáramlásáig, beállított frekvenciával, v. percventillációval, belégzés/kilégzés (túlnyomásos szeleppel elkerülhető a kóros nyomás).
Harvard Apparatus Inspira Advanced Safety Single Animal Pressure/Volume Controlled Ventilators Egértől macska méretű állat lélegeztetésére alkalmas (15 g to 10 kg) Egyszerűen használható Négy modell: Térfogat vezérelt(belégzés tartó funkcióval vagy anélkül) Nyomás vezérelt(belégzés tartó funkcióval vagy anélkül) Légúti nyomás monitorozás: jelzi a túl alacsony vagy magas nyomást Asszisztált mód, ami megkönnyíti a leszoktatást Állítható be/kilégzési arány (I:E arány - 1:4-től 4:1-ig) Altatógép elemeként is használható (nem gyúlékony altatógázokhoz)
4. Légzési gázok monitorozása Nem-invazív Kapnometria Kilégzett CO 2 mérése Infravörös abszorpciós fotometria módszerével Pulzoximetria Az artériás oxigén szaturáció mérése a keringési terület infravörös fényelnyelésének analízise alapján Invazív: vérgázanalízis Artériás pco 2 meghatározás - nagyon pontos - nem folyamatos Artériás po 2 Oxigén szaturáció Meghatározás - nagyon pontos - nem folyamatos
4.1. Kapnográfia vs Kapnometria Kapnográfia Az endotracheális CO 2 (ETCO 2 ) értékének mérése és a változás kijelzése (CO 2 hullámforma) A módszert alkalmazó eszköz neve: kapnográf Kapnometria Az ETCO 2 érték mérése (nincs hullámforma) Az eszköz elnevezése: kapnométer
Abszorpciós sávok
Egyetlen kilégzés CO 2 analízise (Single Breath CO 2 ) % CO 2 Kilégzési térfogat
4.2. Pulzus oximetria (pulzoximetria) 1. Folyamatos, nem invazív módszer az artériás oxigén szaturáció és a szívfrekvencia mérésére. 2. A módszer legnagyobb előnye (és sikere) az artériás vér oxigén szaturációjának mérése a teljes pulzációs ciklus alatt a keringési terület infravörös fényelnyelésének analízisével.
Pulzus oximetria Működési elv 1. Az oxi és dezoxi-hemoglobin infravörös detektálása 2 külön hullámhosszon A 2 LED által kibocsátott infravörös fény hullámhossza
Pulzus oximetria Működési elv 2: az artériás pulzus által hozzáadott többlet variábilis - fényelnyelést alkalmazzák az ao 2 szaturáció kiszámítására
Kapnográf / pulzoximéter Mért paraméterek EtCO 2 kilégzett CO 2 RR FiCO 2 belégzett CO 2 SaO 2 O 2 szaturáció P légzési frekvencia szívfrekvencia folyamatos monitorozása. OxiMax N-85 Szenzorok
5. A kiválasztás monitorozása A húgyhólyag katéterezése Definíció: a húgyhólyag mesterséges kiürítése Cél: terápiás (műtéti előkészítés) Cél: terápiás (műtéti előkészítés) diagnosztikus (folyadékháztartás monitorozása, urológiai, mikrobiológiai vizsgálatok) Óradiurézis mérése (ml/kg/óra): veseműködés ellenőrzés
Katéterek Anyaga: műanyag, latex vagy szilikon. Nagysága: a külső átmérő mértékegysége 1 Charriére (1 Ch) vagy 1 French (1 F) (=0,33 mm) Leggyakrabban Foley-katétert használunk (ballonos, Leggyakrabban Foley-katétert használunk (ballonos, könnyen rögzíthető).
A katéterezéshez szükséges eszközök - megfelelő méretű katéter - csatlakozó steril cső és zsák - bucik a lemosáshoz - dezinficiáló oldat - fiziológiás sóoldat (fecskendőben) a ballon feltöltéséhez - steril katéter csúsztató olaj (Instillagel) - steril gumikesztyűk
Életjelenségek monitorozása II. Invazív keringés vizsgáló módszerek Vénás nyomás Artériás nyomás, pulzus Kis vérköri, pulmonalis nyomás Kapilláris keringés Perctérfogat Véráramlás
Szenzor / transducer A szenzor /jelátalakító (transducer) olyan eszköz, mely energiát konvertál ( hő, fény, hang, nyomás, mozgás, áramlás), másik energia formává, azaz elektromos energiává; o o o o Szenzitivitás (érzékenység) - azt a minimum input jelet jelenti, amely detektálható output változást hoz létre; Range - a vizsgált paraméter még mérhető maximum és a minimum értékének különbsége; Pontosság a mérés reprodukálhatóságának a foka Felbontás a legkisebb detektálható input növekedés, amely detektálható output jelet eredmémyez;
A direkt (közvetlen) nyomásmérés Eszközei: Az ér lumenébe vezetett cső (kanül). A pontos nyomásmérés feltétele a légtelen, minél merevebb és rövidebb kanül. Nyomásmérő transducer membránjának/piezoelektromos kristályának deformációja biztosítja a mechamikai jel elektromos jel átalakítást. A transducer kimenete elektromos jel, amit erősíteni és tárolni lehet;
A keringés alacsony és magas nyomású rendszere
1. Véna biztosítás Általában a v. jugularis externa, v. femoralis a legalkalmasabb. A vénás kanül lehetővé teszi a fenntartó anesztetikum, vizsgálandó készítmények és az infúzió beadását, valamint vérminta vételt. A megfelelően pozicionált v. juguláris katéter a centrális vénás nyomás (CVP) mérését teszi lehetővé, amelyből a keringő volumenre lehet következtetni.
1. Centrális véna biztosítása, vénás nyomás mérés v. jugularis 1 Nyomás szenzor v. femoralis 2 Hemodinamikailag a jobb kamra preloadjára utal; Jelzi az érpálya töltöttségét; Szélsőséges helyzetekben jelzi a nagyfokú hypo-, illetve hypervolaemiát.
Centrális vénás nyomás mérés A CVP normál érték: 3-8 Hgmm
2. Artériás nyomás mérés A. carotis A. femoralis Nyomás szenzor
A mérés lépései 1. A nyomásmérő rendszer üzembe helyezése, 2. Arteria kanülálása 3. Csatlakozás a mérőrendszerhez Buborékmentesség + heparin (1-2 egység /ml) 4. 4.A kanül biztonságos rögzítése 5. A transducer nulla pontja 6. A transducer rögzítése a szív szintjében 7. Mérés kezdete
Nagy vérköri vérnyomás Hemodinamikailag a szív afterloadja. Az adekvát szervperfúzió fenntartása szempontjából kiemelkedő jelentőségű az átlagos artériás vérnyomás megfelelő szinten való tartása. A pulzusnyomás (szisztolés-diasztolés nyomás különbség) jelzi a volumenstatust; Magas pulzusnyomás: vasodilatatio, hypervolaemia; Alacsony pulzusnyomás: vasoconstrictio, hypovolaemia
Pulzusszám A perctérfogat egyik fő meghatározója. Gyors kompenzációs lehetőséget nyújt a szöveti oxigenizációs, illetve, a keringési igények kielégítésére. Ezért a hypovolaemiás betegek általában tachycardiásak, bár akut vérveszteség esetén nem ritka a bradycardia sem.
Célja: megállapítani 3. Vérgáz analízis az állatok vérgáz statusát (O 2 felvétel, CO 2 leadás a tüdőben, vér ph), a tüdő és vese működését, és szerepét a savbázis egyensúly fenntartásában, légzőszervi betegségeket. Fázisok: mintavétel, tárolás (szállítás), mérés vérgázanalizátorral, adatok korrekt interpretálása, a beteg kezelése.
Mintavétel Nem megfelelő eszközök, a minta nem megfelelő kezelése pontatlanság A mintavétel előtt, a kanül térfogatának 4 szeresét leszívjuk/eldobjuk (5 ml-es leszívó fecskendő használata)! A mintavevő fecskendő (2 ml-es) alvadásgátló heparint tartalmaz (50-100 U/ml vér; a kónusz feltöltése)! A minta mennyisége: max. 1 ml vér; Levegőbuborékok eltávolítása a fecskendőből. Fecskendő lezárása.
Mérés vérgázmérővel AVL Compact 2 (AVL Medical Instruments) Mintadetektáló rendszer: érzékeli a levegőbuborékokat, érzékeli a minta mennyiségét, vezérli a minta helyzetét. Minta térfogat: min. 55 µl Mérési idő: 20 sec
Vérgáz és sav-bázis paraméterek: Mért paraméterek: po 2, pco 2, ph Számított paraméterek: BE, HCO 3-, O 2 sat, cto 2, Metabolitok: claktát, cglükóz Elektrolitok: ck +, cna +, ccl -, cca 2+
Eredmények értékelése A vérgázanalízist befolyásoló tényezők: láz: pao 2, paco 2 hipotermia: pao 2, paco 2 levegőbuborékok hosszú idejű (>30 perc) tárolás.
4. Véráramlás - Perctérfogat (CO) mérés A általában a Fick módszerrel határozzuk meg a véráramlást A Fick módszer alapja: 10 részecske / perc
Indikátor higításos módszer koncentráció (g/l L) Festék bolus injekció Festék minta koncentrác ió koncentráció (g/l L) 0 Idő (perc) 0.5 0 Idő (perc) 0.5
Transzpulmonális termodilúciós módszer elve Bolus injekció Tüdő Katéter az a. femoralisban
Perctérfogat mérés rágcsálókban V. jugularis katéter és hideg fiziológiás só injektálás (0,3-0,5 ml) Termoszenzor katéter a carotis artériában Femoralis artéria katéter Vérnyomás transducer Adat gyűjtő-monitorozó komputer rendszer
Perctérfogat monitorozás sertésen Mesterséges lélegeztetés CVP katéter PiCCO monitor Kilégzett CO 2 monitorozás kapnográffal Vérnyomás és termoszenzor katéter
A Perctérfogat mérés technikája Standard mennyiségű (2,5-5-10-20 ml), hideg fiziológiás só oldatot adunk nagy sebességgel a jobb pitvarba. A folyadék pontos hőfokát a beinjektálás pontján hő szenzor méri. Az artériás oldalon lévő termisztor katéter, egy másik elektromos hőmérő, mely a hűtött vérbólus" tovahaladását érzékeli. A monitor a vér átmeneti hőmérséklet változásából termodilúciós görbét rajzol. A görbeterület integrálásával a monitor számítógépe megadja a perctérfogatot.
Kalkulált hemodinamikai paraméterek a vénás, az arteriás nyomás és a perctérfogat (CO) alapján Szívindex = CO/test felszín (ml/min/m 2 ) Verő térfogat = CO/szívfrekvencia (ml) Perifériás érellenállás = (Artériás nyomásvénás nyomás)/co
8.2. Az intesztinális permeábilitás vizsgáló módszerei Gravimetriás analízis Kapilláris permeabilitás Epitheliális permeabilitás Gravimetria szövet mintavétel; Nedves-súly mérése Szárítás súlyállandóságig, majd száraz-súly mérés Nedves / Száraz súly = ödéma becslése
Köszönöm a figyelmet!