Riboflavinum 1 01/2008:0292 RIBOFLAVINUM Riboflavin C 17 H 20 N 4 O 6 M r 376,4 [83-88-5] DEFINÍCIÓ 7,8-Dimetil-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-tetrahidroxipentil]benzo[g]pteridin- 2,4(3H,10H)-dion. E cikkely előírásait kell alkalmazni a fermentálással előállított riboflavinra. Tartalom: 97,0 103,0% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: sárga vagy narancssárga, kristályos por. Oldékonyság: vízben alig oldódik; etanolban (96%) gyakorlatilag nem oldódik. Oldatai fény hatására bomlanak, különösen lúgos közegben. Polimorfiára hajlamos (5.9).
Riboflavinum 2 AZONOSÍTÁS A. Fajlagos optikai forgatóképesség (lásd Vizsgálatok). B. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Vizsgálati oldat. 25 mg vizsgálandó anyagot 10 ml R vízzel 5 percig rázogatunk, és az így nyert szuszpenziót az oldhatatlan anyag eltávolítása érdekében megszűrjük. Összehasonlító oldat. 25 mg CRS riboflavint 10 ml R vízzel 5 percig rázogatunk, és az így nyert szuszpenziót az oldhatatlan anyag eltávolítása érdekében megszűrjük. Lemez: R VRK szilikagél lemez (2 10 μm). Kifejlesztőszer: R víz. Felvitel: az alábbiak szerint, minden egyes felvitt részletet hideg levegőáramban beszárítva: 1. felvitel: 2 μl R diklórmetán, majd 2 μl vizsgálati oldat; 2. felvitel: 2 μl R diklórmetán, majd 2 μl összehasonlító oldat. Kifejlesztés: 6 cm-es fronttávolságig. Szárítás: hideg levegőáramban. Előhívás: a lemezt 365 nm-es ultraibolya fényben értékeljük. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő főfolt helyét és méretét tekintve egyezzék meg az összehasonlító oldat kromatogramján látható főfolttal. C. Kb. 1 mg anyagot 100 ml R vízben oldunk. Az oldat áteső fényben halvány zöldessárga színű, ráeső fényben pedig élénk sárgászöld színben fluoreszkál; a fluoreszcencia ásványi savak, illetve lúgok hozzáadására megszűnik. VIZSGÁLATOK Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): 115 és 135 között (szárított anyagra).
Riboflavinum 3 50,0 mg anyagot karbonátmentes 0,05 M nátrium-hidroxid oldattal 10,0 ml-re oldunk. Az optikai forgatóképességet az oldódás befejeződését követő 30 percen belül mérjük. Abszorbancia (2.2.25). Vizsgálati oldat. A Tartalmi meghatározás során nyert végső oldatot egyenlő térfogatú R vízzel hígítjuk. Abszorpciós maximumok: 223, 267, 373 és 444 nm-en. Abszorbancia-arányok: A 373 /A 267 = 0,31 0,33; A 444 /A 267 = 0,36 0,39. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Az oldatokat közvetlenül a felhasználás előtt készítjük, és fénytől védjük. A-oldat: R nátrium-acetát 13,6 g/l-es oldata. Vizsgálati oldat. 0,120 g vizsgálandó anyagot ultrahang segítségével 10 ml 0,1 M nátrium-hidroxid oldatban oldunk, majd az oldatot az A-oldattal 100 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az A-oldattal 10,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az A-oldattal 100 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). Egy üvegcse CRS csúcsazonosításra szánt riboflavint (amely C- és D-szennyezőt tartalmaz), ultrahang segítségével 1 térfogatrész B- mozgófázis és 9 térfogatrész A-mozgófázis elegyének 1,0 ml-ében oldunk. Összehasonlító oldat (c). Az A- és a B-szennyező in situ előállításához 10 mg vizsgálandó anyagot 1 ml 0,5 M nátrium-hidroxid oldatban oldunk. Az oldatot 1,5 órán át nappali fényen hagyjuk állni, majd 0,5 ml R ecetsavat adunk hozzá, végül R vízzel 100 ml-re hígítjuk. Oszlop: méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm);
Riboflavinum 4 Mozgófázis: A-mozgófázis: R tömény foszforsav R víz (1+1000 V/V); B-mozgófázis: R acetonitril; Idő (perc) 0-5 5 20 20 25 25 35 35 45 A-mozgófázis (%V/V) 90 90 80 80 80 50 50 B-mozgófázis (%V/V) 10 10 20 20 20 50 50 Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 267 nm-en. Injektálás: 10 μl. Szennyezők azonosítása: a C- és a D-szennyező azonosításához a CRS csúcsazonosításra szánt riboflavinhoz mellékelt kromatogramot és a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenció a riboflavinra (retenciós ideje kb. 16 perc) vonatkoztatva: C- szennyező kb. 0,2; D-szennyező kb. 0,5; A-szennyező kb. 1,4; B-szennyező kb. 1,9. Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás: legalább 5, az A- és a B-szennyező között a c) összehasonlító oldat kromatogramján; a b) összehasonlító oldat kromatogramja egyezzék meg a CRS csúcsazonosításra szánt riboflavinhoz mellékelt kromatogrammal. Követelmények: korrekciós faktorok: a következő szennyezők mennyiségének kiszámításához a megfelelő csúcsterüleket a következő faktorokkal szorozzuk: A-szennyező 0,7; B-szennyező 1,4; C-szennyező 2,3; D-szennyező 1,4;
Riboflavinum 5 A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,25-szorosa (0,025%); B-, C-, D-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%); egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%); összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének ötszöröse (0,5%); elhanyagolási határ az A-szennyező kivételével: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%). Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 1,5%. Az anyag 1,000 g-ját szárítószekrényben 105 o C-on szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. A Szárítási veszteség vizsgálat során nyert maradékot vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS A meghatározást fénytől védett helyen végezzük. Barna üvegből készült, 500 ml-es mérőlombikban 65,0 mg anyagot 5 ml R vízben szuszpendálunk, miközben az anyagnak teljesen át kell nedvesednie. Ezután 5 ml R hígított nátrium-hidroxid oldatot adunk hozzá, és teljesen feloldjuk az anyagot. Amint az oldódás befejeződött, 100 ml R vizet és 2,5 ml R tömény ecetsavat elegyítünk az oldathoz, és az így nyert oldatot R vízzel 500,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 20,0 ml-ét barna üvegből készült, 200 ml-es mérőlombikba mérjük, R nátrium-acetát 14 g/l-es oldatának 3,5 ml-ét elegyítjük hozzá, majd R vízzel 200,0 ml-re hígítjuk. Az oldat abszorbanciáját a 444 nm-es abszorpciós maximumon mérjük (2.2.25). A C 17 H 20 N 4 O 6 -tartalmat a fajlagos abszorpciós koefficiens (A 1% 1cm = 328) alapján számoljuk ki. ELTARTÁS
Riboflavinum 6 Légmentesen záró tartályban, fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C, D. A. 7,8,10-trimetilbenzo[g]pteridin-2,4(3H,10H)-dion (lumiflavin), B. 7,8-dimetilbenzo[g]pteridin-2,4(1H,3H)-dion, C. 6,7-dimetil-8-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-tetrahidroxipentil]pteridin-2,4(3H,8H)-dion,
Riboflavinum 7 D. 8-(hidroximetil)-7-metil-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-tetrahidroxipentil]benzo[g]pteridin-2,4(3H,10H)-dion.