HLA-B27 pozitivitás vizsgálati lehetőségei Pálinkás László, Uherkovichné Paál Mária, Berki Timea Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központ Immunológiai és Biotechnológiai Intézet
HLA-B27 Humán Leukocita Antigén B27 az I osztályú hisztokompatibilitási komplexhez (MHC-I) tartozó sejtfelszíni glikoprotein, amely a 6. kromoszóma B lókuszán kódolódik. Az MHC-I antigének az összes magvas sejtünk felszínén megtalálható, szerepük az intracelluláris antigének bemutatása a vírussal fertőzött, illetve daganatos sejtek elpusztítására képes CD8+ T sejteknek. Heterodimer protein: egy alfa láncból és egy béta 2 mikroglobulin alkotja. A kaukázusi populációban 8%, az afrikaiban 4%, a kínaiban 2-9% és a japánban 0.1-0.5% hordozza a HLA-B27 antigént. Mads Hald Andersen et al. 2005. Journal of Investigative Dermatology
HLA-B27 és patológia Szeronegatív spondylarthropátiák olyan gyulladásos izületi betegségek, ahol a szerológiai tesztek reuma faktor (RF) negatívak. A RF egy nem specifikus markere más reumás megbetegedéseknek (például a reumatoid artritisznek). Gyakori HLA-B27 pozitivitással járó alcsoportok: * Spondylitis ankylopoetika (kaukáziusiaknál ~92%), * reaktív arthritisz (Reiter szindróma) (~60-80%), * gyulladásos bélbetegséggel társuló arthritisz (~60%), * pszoriázishoz tárusló artritisz (~60%), * izolált anterior uveitisz (~50%), * nem differenciált spondylarthropátiák (~20-25%).
Spondylitis ankylopoetica A Bechterew kór (más néven spondylitis ankylopoetica, rheumatoid spondylitis) esetén a betegek több mint 90%-a HLA-B27 pozitív. Az ankylosis rigidséget, merevséget jelent, a spondyl pedig a gyulladt gerincoszlopot jelzi. Főleg fiatal férfiak betegsége, amely fájdalommal és gyulladással jár a keresztcsonti, a csigolyák közötti és a bordák izületeinél. Előrehaladott állapotban a mellkas és a gerinc teljes merevségéhez vezet. Ez nagyon kellemetlen, mivel végül egy görbe testhelyzetbe szorítja a beteget, amely szerencsére a mai kezelések hatására kevéssé gyakori végállapot.
Reiter szindróma Az izületi gyulladások egy fajtája, reaktív artritisz. A szindrómához tartozik a reaktív artritisz mellett legalább egy nem izületi gyulladás, például: szem, bőr vagy izom érintettség. A betegek kb. 80%-a HLA-B27 pozitív. A reaktív artritisz tünetei általában napokkal vagy hetekkel a kiváltó infekció után jelentkeznek. A tünetek több hétes hónapos időtartam alatt néha jelentkeznek, néha elmúlnak. A reaktív izületi gyulladás sokáig diangosztizálatlan maradhat, mert a tünetek néha nagyon enyhék.
Kiváltó faktorok 30-60 nappal az izületi gyulladás előtt: enterális urogenitális néha pulmonális (légúti) infekciók. Feltételezett infektív ágensek: Salmonella ssp. Yersinia enterocolitica Chlamydia trachomatis
EFI standardok HLA tipizálásra 5.6. kiadás (November 16, 2008) K fejezet Betegség asszociációnál egyetlen HLA típus vizsgálata K2.000 Antigén vizsgálat K2.100 Kontroll sejteket kell vizsgálni minden új reagensnél. - negatív sejt - pozitív sejt - keresztreagáló sejt K2.200 Kontroll szérumot kell vizsgálni minden vizsgálatnál. - negatív szérum - pozitív szérum - keresztreagáló szérum K3.000 Molekuláris technika Minden vizsgálatnál szükséges - pozitív DNS - negatív DNS használata. European Federation for Immunogenetics
Áramlási citometria 10 4 G r SSC SSC-Height Ly M o LASER (488nm) 10 0 0 256 512 768 1024 FSC-Height FSC Side scatter = granularitás Fizikai paraméterek Forward scatter = méret LASER
Áramlási citometria HLA-B27-FITC CD3-PE LASER BD TM HLA-B27 System Anti-HLA-B27 FITC Anti-CD3 PE clone GS145.2 (IgG1, kappa) clone SK7 (IgG1, kappa)
HLA-B27 szűrő teszt a-cd3-pe Granularitás SSC-Height CD3 PE 10 4 Setup Beads CD3-PE / HLA-B27-FITC 10 0 0 256 512 768 1024 FSC-Height 10 4 CD3+ Cut off (setup beads) Negatív minta Pozitív minta Cell count Count Count Count 93 70 47 23 MFI = 140 0 0 125 250 375 500 HLA B27 FITC 62 47 31 16 0 0 125 250 375 500 HLA B27 FITC 20 15 10 5 MFI < 140 MFI > 140 10 0 0 256 512 768 1024 FSC-Height Méret 0 0 125 250 375 500 HLA B27 FITC a-hla-b27 - FITC
Izotípus kontroll teszt Limfociták kapuzása Izotípus (negatív) kontroll 10 4 10 4 0,02% 0,02% Granularitás SSC-Height Ly egér IgG1 - PE Mouse IgG1 PE 10 0 0 256 512 768 1024 FSC-Height Méret Simultest Control (Beckton Dickinson) 99,97% 0,00% 10 0 10 4 Mouse IgG2a FITC egér IgG2a - FITC Anti-keyhole limpet hemocyanin-fitc clone: X40 (IgG2a) Anti-keyhole limpet hemocyanin-pe clone: X39 (IgG1)
Konfirmáló HLA-B27 teszt HLA-B27 Negatív HLA-B27 Pozitív 10 4 0,49% 0,00% 10 4 0,10% 1,86% a-hla-b7 - PE HLA B7 PE a-hla-b7 - PE HLA B7 PE 99,30% 0,21% 1,07% 96,97% 10 0 10 4 HLA B27 FITC 10 0 10 4 HLA B27 FITC a-hla-b27 - FITC a-hla-b27 - FITC IOTest (Bekman Coulter) Anti-HLA-B27-FITC Anti-HLA-B7-PE clone: HLA-ABC-m3 (IgG2a) clone: BB7.1 (IgG1)
Keresztreakció HLA-B7-tel HLA-B27 - / HLA-B7 + HLA-B27 + / HLA-B7 + 10 4 93,96% 4,90% 10 4 10,73% 89,02% a-hla-b7 - PE HLA B7 PE a-hla-b7 - PE HLA B7 PE 1,14% 0,00% 0,21% 0,04% 10 0 10 4 HLA B27 FITC 10 0 10 4 HLA B27 FITC a-hla-b27 - FITC a-hla-b27 - FITC IOTest (Bekman Coulter) Anti-HLA-B27-FITC Anti-HLA-B7-PE clone: HLA-ABC-m3 (IgG2a) clone: BB7.1 (IgG1)
Molekuláris biológiai diagnosztika kétes esetekben 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp GH - ktrl (450bp) HLA-B*27 (180bp) + - Minta 1 Minta 2 Olerup SSP TM HLA-B*27 alacsony felbontás
Minőségügyi szemlélet Részt veszünk a (United Kingdom National External Quality Assessment Service) HLA-B27 programjában. 2008 óta NAT-1/1552/2008 számon akkreditált vizsgáló laboratórium vagyunk. Laboratóriumunk minőségirányítási rendszerét a következő ISO standardok alapján építette ki: MSZ EN ISO/IEC 17025:2005 Vizsgáló- és kalibrálólaboratóriumok felkészültségének általános követelményei MSZ EN ISO 15189:2007 Orvosi laboratóriumok. A minőségre és a felkészültségre vonatkozó külön követelmények
Vizsgálati eredmények 2009. I. félévében 6625 beteget vizsgáltunk, ebből 305 esetben (5%) kértek HLA-B27 kimutatást. Keresztreagáló negatív (11%) Keresztreagáló pozitív (2%) HLA-B27 pozitív (19%) HLA-B27 Negatív (68%)
Köszönöm a figyelmet!