A MADARAK ANTIGÉNPREZENTÁLÓ DENDRITIKUS SEJTJEI Doktori tézisek Igyártó Botond-Zoltán Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Magyar Attila, egyetemi adjunktus, D.V.M., Ph.D. Hivatalos bírálók: Krenács Tibor, tudományos főmunkatárs, M.D., Ph.D. Balogh Péter, egyetemi docens, M.D., Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Spät András egyetemi tanár, az MTA tagja Szigorlati bizottság tagjai: Rajnavölgyi Éva egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc. Tóth Sára egyetemi docens, Ph.D. Budapest 2006
2 BEVEZETÉS A DENDRITIKUS SEJTEK A XX. század közepe táján kezdték felismerni a dendritikus sejtek (DC) immunválaszban betöltött szerepét. A DC-k részletes leírása és jellemzése Steinman és Cohn nevéhez fűződik (Steinman és Cohn 1973). Nevüket az idegsejtek bokorszerűen elágazó dendritnyúlványaihoz való hasonlóságuk alapján kapták. A DC-ket majdnem valamennyi szervben megtalálták. A DC-k receptoraik révén hatékonyan vesznek fel a környezetükből antigéneket. A felvett antigénekkel a DC-k a perifériás nyirokszervekbe vándorolnak, ahol azokat hatékonyan prezentálják az immunkompetens sejteknek. Eközben szolúbilis molekulák révén nagy távolságokra lévő sejtekre gyakorolnak hatást, és a fertőzés helyszínére vonzzák azokat. A bemutatott antigén felismerése után a limfociták aktiválódnak, egyesek ellenanyagokat kezdenek termelni (Blimfociták), míg mások ölőképessége fokozódik (T c - limfociták). Az ellenanyagok specifikusak a betolakodókra, így azok semlegesítését, ill. kiürülését segítik elő. Az aktiválódott T-sejtek képesek lesznek elpusztítani a betolakodók által megfertőzött sejteket. A dolgozat a DC-k két reprezentatív alpopulációját tárgyalja részletesen: a Langerhans sejtekét (LC) és a follikuláris dendritikus sejtekét (FDC). Az előbbi a legjobban karakterizált emlős DC-típus. Fontos szerepük van a bőrimmunitásban. Az itt felvett antigénekkel a legközelebbi nyirokcsomókba vándorolnak, ahol immunválaszt váltanak ki, vagy toleranciát indukálnak. Az FDC-knek (amint a nevük is mutatja a follikulusokban helyezkednek el) statikus szerepet szánnak, vagyis az odaszállított immunkomplexeket (IC) a felszínükhöz 2
kötik. Az így fogvatartott IC-knek fontos szerepük van a csíracentrum-képződésben, B-sejt szelekcióban, izotípusváltásban, affinitásérésben stb. CÉLKITŰZÉSEK A madarak DC-alpopulációinak eredetét és funkcióját tekintve vajmi keveset tudunk annak ellenére, hogy a háziállatok immunrendszerének vizsgálata mellett számos érv (gazdasági, állategészségügyi, humán megbetegedések modellezése) szól. Munkánk során két madár dendritikus sejtpopulációval: az epidermális dendritikus sejtekkel (EDC; ezek között találjuk meg a Langerhans sejteket (LC)), valamint a follikuláris dendritikus sejtekkel (FDC) kapcsolatos vizsgálatokat végeztünk. A Langerhans sejtekkel kapcsolatos célkitűzéseink: az EDC-k morfológiai és funkcionális jellemzése; az EDC-k izolálásának és tenyésztésének kidolgozása; a Langerhans sejtek vándorlási útvonalának a feltérképezése. A follikuláris dendritikus sejtekkel kapcsolatos célkitűzéseink: az FDC-k eredetének vizsgálata; az antigéntranszport vizsgálata a primer immunválasz során. 3
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Kísérleti állatok Az SPF White Leghorn tojásokat a mohácsi BiOvo cégtől, míg a konvencionális New Hampshire tojásokat és állatokat a gödöllői KÁTKI-tól vásároltuk. Az állatkísérleteink engedélyének száma: 79-000-2005. Hámizolálás A kimetszett bőrt 10-20 percre 2 M CaCl 2 oldatba helyeztük. Ezután sztereomikroszkóp alatt a hámot az alatta levő dermisztől finom csipeszek segítségével választottuk el. Az így nyert hámot 0,1 M tris pufferben mostuk, majd 4 %-os pufferolt formalinban fixáltuk. Enzim- és immunhisztokémia Az ATPáz festést Robins és Brandon (1981) leírása alapján végeztük el. Az immunohisztokémiai festések előtt a szöveteket PBSsel mostuk, majd 45 percig inkubáltuk primer ellenanyagokkal. A biotinilált szekunder ellenanyagokat az endogén peroxidáz blokkolás követte. Az ellenanyag kötődésének kimutatásához avidin-biotinilált peroxidáz komplexet (ABC) használtunk. Ezt 4-chloro-1-naphthol vagy NovaRED kit segítségével tettük láthatóvá. Egyszeres és kettős immunofluoreszcens jelölés esetén izotípus specifikus, Alexaval jelzett szekunder ellenanyagokat alkalmaztunk. A magfestés DAPI-val történt. Az immunhisztokémiai és immunfluoreszcens vizsgálatok során a csirke nyirokszöveti sejtekre specifikus, közel 50 ellenanyagból álló panelt használtunk. A bakteriális béta-galaktozidázzal (β-gal) kezelt állatok szerveiből készített kriosztátos metszeteken X-gal reagenssel 4
mutattuk ki az enzimet. A metszeteken ezt követően immunhisztokémiai, ill. immunfluoreszcens festéseket végeztünk. Az EDC-k turnovere Az állatokat 5-bromo-2-deoxyuridinnel (BrdU) oltottuk be intravénásan. Meghatározott időközönként (30 perc, 1, 2 és 4 óra) bőrbiopsziát vettünk nyúzatkészítés céljából. A nyúzatokon kettős immunofluoreszcens festést végeztünk anti- BrdU és más ellenanyagokkal. Az EDC-k izolálása és tenyésztése Kidolgoztuk a csirke epidermális sejtszuszpenzió enzimes előállításának módszerét. A steril körülmények között izolált bőrt diszpáz/dnáz tartalmú RPMI médiumban inkubáltuk. Ezt követően az epidermiszt elválasztottuk a dermisztől, majd az epidermiszt továbbemésztettük tripszinnel. Az így kapott sejteket RPMI médiumba vettük fel és Histopaque 1077-en szeparáltuk. Az EDC-k in vivo aktivációja Hapténnel (aceton:dibutil-ftalátban feloldott FITC) kezeltük a nyolchetes állatok tollmentes bőrfelületét. A kezelést követően különböző időpontokban hámot izoláltunk és immunohisztokémiai módszerekkel vizsgáltuk. Az adatokat (3 állat/csoport) páros t-teszttel hasonlítottuk össze (SPSS 13.0 verzió). A β-galaktozidáz felvételének nyomonkövetése Az állatokat intravénásan immunizáltuk 100 U β-gal oldattal. Az injektálást követően a kezelt állatok lépét meghatározott időközönként (45 perc, 2, 24 óra és 4 nap) kivettük, és fagyasztott metszeteket készítettünk. 5
A β-galaktozidáz in vitro felvételének tanulmányozása Kezeletlen állatok lépéből steril körülmények között 0,5-1 mm vastag metszeteket készítettünk. Az így nyert metszeteket inkubáltuk különböző összetételű tenyésztőmédiumban. Valamennyi tenyészethez β-gal-t adtunk. A kontroll metszeteket 1 ml PBS-ben vagy alapmédiumban, a kompetíciós metszeteket heparinnal-, dextránnal- vagy dextránszulfáttal (500 kd) kiegészített RPMI-ban inkubáltuk, 37 Con. A megfelelő inkubálás után a metszeteket lefixáltuk és X- gal előhívó folyadékkal kezeltük. Fehérjekémiai vizsgálatok A lépsejtek membránfehérjéit biotinnal jelöltük meg. Biotinálás után a sejteket detergenssel lizáltuk. A tisztított lizátumot immunprecipitációhoz használtuk fel. β-gal-lal fedett Sepharose gyöngyökkel végeztük a lépsejt lizátumok immunprecipitációját. A gyöngyökről redukáló körülmények között lefőzött mintákat SDS-PAGE-val vizsgáltuk. Az elektroforézist követően a szétválasztott fehérjéket nitrocellulóz membránra blottoltuk. A membránokat ABC-vel inkubáltuk. A komplex kötődési helyeit kloro-1- naphtol vagy NovaRed kit segítségével tettük láthatóvá. Az E5G12 monoklonális ellenanyagunk által felismert lépsejtantigén azonosításához lépet homogenizáltunk hideg lízispufferben. A lizátumot SDS-PAGE-n megfuttattuk és nitrocellulóz membránra blottoltuk. A blotot E5G12 ellenanyaggal, biotinilált szekunder ellenanyaggal, ABC-vel inkubáltuk és kemilumineszcens módszerrel hívtuk elő. EREDMÉNYEK I. Az epidermális dendritikus sejtek fenotípizálása 6
A hám DC-jeinek a kimutatására az irodalomban leírt ATPáz reakciót használtuk. Ezzel a módszerrel mintegy 2000 sejt jelölődött mm 2 -enként. Kísérleteink során két olyan ellenanyagot találtunk, amely teljesen átfedő festési mintázatot adott: a CD45- és a vimentin specifikus ellenanyagok. A csirke EDC-k mintegy 30-50 %-a hordoz MHCII-t. Azonosítottunk egy CD3 pozitív DC alpopulációt (5-10 %). Az ebbe tartozó sejtek nem expresszáltak TCR-t (α/β és γ/δ), MHCII-t, sem pedig CD4 vagy CD8-at. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy az epidermális dendritikus sejteken belül három DC alpopulációt sikerült azonosítanunk: 1). MHCII + /CD3 -. 2). MHCII - /CD3 -. MHCII - /CD3 + (1. ábra). EDC (ATPáz +, CD45 +, vimentin + ) Langerhans sejt MHCII +, CD3-45-50 % éretlen Langerhans sejt MHCII -, CD3-35-45 % NK-sejt MHCII -, CD3 + 5-10 % 1. ábra. Az EDC-k három alpopulációja Az EDC-ket enzimatikus kezelést követően mintegy 50 %-ra dúsíthatjuk, ha a natív epidermális sejtszuszpenziót Ficoll-on szétválasztjuk. 7
30 perccel az intravénás BrdU adást követően a nyúzatokban a CD45 + sejtek mintegy 4-5 %-a mutatott pozitivitást. Ez az arány a következő 2 vagy 24 órán belül szignifikánsan nem változott. Az epidermális dendritikus sejtek funkcionális vizsgálata A hapténfelvitelt (FITC) követően 1-2 órán belül az EDC-k egy része a hámban lekerekedett, majd a következő órákban számuk az elvándorlás miatt fokozatosan csökkenni kezdett. Mintegy 16-24 óra elteltével az EDC-k száma 60-70 %-kal csökkent (600-800 sejt/mm 2 ) a kontroll területhez képest. A kivándorolt FITC + sejtek elszórtan a dermiszben, valamint az ún. dermális limfoid nodulusokban akkumulálódtak. Ezen struktúrák központi szerkezeti vázát (az FDC marker) 74.3 pozitív DC-k alkotják, míg széli részüket KUL01 + sejtek határolják. A dendritikus retikulum közötti teret T- és B-sejtek töltik ki. A FITC pozitivitás a nodulusokban a KUL01 és 74.3 sejtekre korlátozódott. EREDMÉNYEK II. A follikuláris dendritikus sejtek Intravénás beadást követően a β-gal pozitivitás kizárólag az ellipszoidokat körülvevő fehérpulpára (az emlőslép marginális zónájával analóg terület) korlátozódik. Kettősfestéssel igazoltuk, hogy a β-gal-t felvevő sejtek az ún. ellipszoid-asszociált sejtek (EAC). A β-gal felvétele után az EAC-k leválnak a PWP-ről és a PALS területére vándorolnak. Ennek a szélén csoportokat képeznek, melyekbe B-sejtek vándorolnak. Egyes β-gal + sejtek közvetlenül a tüszők csíracentrumába vándorolnak. A PWP-t elhagyó, citoplazmatikusan β-gal + EAC-k a vándorlás során fokozatosan elvesztették az EAC-specifikus 68.2 antigént, és a csíracentrumban lévő sejtek már 68.2 - -ak. A 8
csíracentrumokban lévő β-gal + sejtek viszont expresszálják az FDC kre jellemző 74.3 markert. Az általunk előállított monoklonális ellenanyag (E5G12) mind az EAC-kat, mind pedig az FDC-ket festi. Az E5G12 kolokalizációja β-gal + sejtekkel ezen időszak alatt nem változott, azaz a β-gal pozitivitás mindig az E5G12 + sejtekben volt kimutatható. Az antigénfelvétel folyamatát in vitro is tanulmányoztuk. Kompetíciós kísérleteket végeztünk, amelyben növekvő heparin koncentráció jelenlétében vizsgáltuk a β-gal felvételt. Negatív összefüggést találtunk a heparin koncentrációja és az antigén felvétel között, azaz minél nagyobb volt a heparin koncentrációja, annál inkább gátlódott az antigén felvétele; így 250 IU/ml heparin teljesen meggátolta a β-gal felvételt. A heparinhoz hasonlóan a dextrán-szulfát ugyancsak teljes gátlást okozott 10 µm koncentrációban. A semleges dextrán viszont mindezt nem befolyásolta. Immunprecipitációs kísérleteinkkel azonosítottuk a β-gal receptorát. β-gal gyöngyökkel precipitált lépsejt receptorfehérjék molekulatömege 52-53, ill. ~43-45 kda volt. MEGBESZÉLÉS A CSIRKE EPIDERMÁLIS DENDRITIKUS SEJTJEI Különböző kettősfestési kombinációkkal kiderítettük, hogy a csirke epidermiszben három EDC alpopuláció különíthető el; az I. típus: MHCII + /CD3 -, a II. típus: MHCII - /CD3 - és a III. típus: MHCII - /CD3 +. Az MHCII + /CD3 - EDC-ket az I. csoportba soroltuk. Az ebbe a csoportba tartozó sejtek fenotípusa áll a legközelebb az emlős LC-khez. A II. csoportba soroltuk az MHCII - /CD3 - sejteket. Ezekről a sejtekről azt feltételezzük, hogy a megfelelő 9
stimulus(ok) hatására MHCII + LC-vé érnek, azaz az I. típusú EDC-k prekurzorai vagy nyugvó formái. A harmadik csoportba sorolt sejtek (III. típus) az összes EDC-k mintegy 5-10 %-át teszik ki. Ezeket a sejteket fenotípusuk alapján intraepiteliális NK sejteknek tekinthetjük. Emlősök esetében (elsősorban az emberben) nagyon kevés adat áll rendelkezésünkre a hám NK sejtjeiről (Cameron és mtsai 2002). Ezen közleményekben szórványosan találtak NK sejteket normál humán epidermiszben. Ezzel ellentétben mi egy konstans, eléggé számottevő NK sejtpopulációt azonosítottunk a csirke epidermiszben. Az itt található NK sejtek szerepet játszhatnak az esetleges vírusfertőzések leküzdésében. Funkcionális kísérleteinkben azt találtuk, hogy perkután alkalmazott haptén (FITC) hatására a CD3 pozitív sejtek nem vándorolnak ki az epidermiszből. Ez arra utal, hogy másféle stimulust igényelnek az aktivációjukhoz. A LC-k kinetikáját alaposan tanulmányozták mind egér-, mind pedig humán bőrben (Czernielewski és mtsai 1985, Larregina és mtsai 2001, Merad és mtsai 2002). Ezek a vizsgálatok bebizonyították, hogy a hámban lévő LC-k osztódnak. Intravénásan adott BrdU-t használva elsőként bizonyítottuk, hogy a csirkebőr hámjában az EDC-k osztódásra képesek. Funkcionális vizsgálatainkkal bebizonyítottuk, hogy az EDC-k részét képező madár LC-szerű sejtek képesek válaszolni antigénstimulusra. Bebizonyítottuk, hogy nemcsak a fenotípusuk hasonlít az emlős LC-khez, hanem funkcionálisan is teljesítik az LC kritériumot. Ezért az EDC-k két típusát (I-II) az LC-szerű elnevezés helyett csirke Langerhans sejt (csls) elnevezés illeti meg. Kimutattuk, hogy antigénfelvétel után a cslc-k az ún. dermális nodulusokba vándorolnak. Ezeket a nodulusokat az emlősök nyirokcsomójához hasonló funkciót ellátó szerkezeteknek (analógjainak) tekinthetjük. 10
Szerveződésük vizsgálata a nyirokcsomó kialakulásának a mechanizmusait tárhatja fel. AZ ELLIPSZOID-ASSZOCIÁLT SEJT, MINT FOLLIKULÁRIS DENDRITIKUS SEJT PREKURZOR Korábbi kísérletek igazolták, hogy az EAC-k különféle antigének felvételére képesek. Antigénfelvételt követően, a különböző időközökben vett minták elektronmikroszkópos vizsgálata azt mutatta, hogy az EAC-k leválnak az ellipszoid felszínéről és a lépen belül vándorolni kezdenek. A PALS területén, ill. esetenként a csíracentrumokban azonosítottak hasonló morfológiájú sejteket. Ezek a megfigyelések szolgáltatták a kellő alapot kísérleteinkhez, amelyek arra irányultak, hogy feltárjuk az EAC-FDC-k között fellelhető esetleges kapcsolatot. Különböző sejtpopulációkra specifikus ellenanyagok alkalmazásával, valamint a bakteriális β-gal antigén felhasználásával sikerült bebizonyítanunk, hogy a CD45 + EAC-k, mint FDC-előalakok viselkednek. Kísérleteink szerint EAC-k feltehetőleg mintázatfelismerő receptorok révén veszik fel az antigént. Ezt követően leválnak az ellipszoidról és vándorolni kezdenek, majd a fehérpulpában FDC-kké érnek és csíracentrum-képződést indukálnak. Sikerült azonosítanunk két olyan receptort, amelyek részt vehetnek a β-gal megkötésében. Az ~50, ill. ~45 kda méret és specificitás alapján feltételezhetjük, hogy a humán DC-SIGNnel rokon fehérjé(k)ről lehet szó (Geijtenbeek és mtsai 2000, Appelmelk és mtsai 2003). Azt is kimutattuk, hogy a β-gal felvétel szulfatált poliszachariddal gátolható volt. Az irodalomból ismert, hogy az emlősök CD14 receptorának az LPS felvételét szintén szulfatált poliszacharidokkal lehet gátolni. Elképzelhető, hogy a β-gal felvételét egy CD14 (- szerű) receptor végzi. A β-gal western blotját szénhidrát 11
festéssel vizsgálva kiderült, hogy az irodalmi adatokkal ellentétben a β-gal glikoprotein. Ez magyarázatul szolgálhat a szulfatált poliszacharid gátló hatására. Emellett más, mintázatfelismerő receptor is szóba jöhet, hiszen a C-típusú lektinek ligandjait jórészt neutrális és szulfatált poliszacharidok képezik (Cambi és mtsai 2005). Kísérleteinkből származó adatok nehezen egyeztethetők össze az emlős adatokkal, hiszen ott az FDC-k nem hemopoetikus eredetét alátámasztó irodalmi adatok vannak túlsúlyban. Az emlős FDC-ket statikus elemekként tárgyalják, amelyek szerkezeti vázként a hozzájuk szállított IC-k megkötésében/fogvatartásában játszanak szerepet. ÖSSZEFOGLALÁS 1. A madár epidermális dendritikus sejtekkel kapcsolatban: Kidolgoztuk az EDC-k izolálását és tenyésztését. Elvégeztük a csirke EDC-k részletes fenotipikus karakterizálását. Azonosítottunk három EDC alpopulációt: 1. MHCII + /CD3 - ; 2. MHCII - / CD3 - ; 3. MHCII - / CD3 +. Kimutattuk, hogy az 1., ill. 2. alpopulációk funkcionálisan is LC-kként viselkednek. A 3. alpopulációt epidermális NK sejteknek tekinthetjük. Bebizonyítottuk, hogy az EDC-k a hámban osztódásra képesek. Azonosítottuk a csirke LC-k egyik vándorlási végállomását, a dermális limfoid nodulust. 12
2. A madár FDC-kkel kapcsolatos eredményeink: Bebizonyítottuk, hogy az EAC-k, mint pre-fdc-k vesznek részt az antigén felvételében. Leválnak az ellipszoidról, új csíracentrumokat hoznak létre, ahol FDC-kké érnek. A bakteriális β-gal-t a CD45 + EAC-k humorális faktorok (Ig, C) segítsége nélkül veszik fel. Kimutattuk, hogy az antigén felvételében specifikus receptor(ok) vesz(nek) részt; a felvétel szulfatált poliszacharidokkal gátolható. A disszertációhoz kapcsolódó publikációk listája 1. Igyarto BZ, Magyar A, Olah I. (2006) Origin of follicular dendritic cell in the chicken spleen. Cell Tissue Res, in press. IF: 2.383 2. Igyarto BZ, Lacko E, Olah I, Magyar A. (2006) Characterization of chicken epidermal dendritic cells. Immunology, 119: 278-88. IF: 3.507 A disszertációhoz nem kapcsolódó publikációk listája 3. Kabell S, Igyarto BZ, Magyar A, Hajdu Z, Biro E, Bisgaard M, Olah I. (2006) Impact of heterophil granulocyte depletion caused by 5-fluorouracil on infectious bursal disease virus infection in specific pathogen free chickens. Avian Pathol, 35: 341-8. 13
IF: 1.789 4. Felfoldi B, Imre G, Igyarto B, Ivan J, Mihalik R, Lacko E, Olah I, Magyar A. (2005) In ovo vitelline duct ligation results in transient changes of bursal microenvironments. Immunology, 116: 267-75. IF: 3.507 5. Nagy N, Igyarto B, Magyar A, Gazdag E, Palya V, Olah I. (2005) Oesophageal tonsil of the chicken. Acta Vet Hung, 53: 173-88. IF: 0.53 Összesített IF: 11,716 A disszertáció témájához kapcsolódó fontosabb előadások/poszterek 1. Igyártó Botond., Oláh Imre., Magyar Attila.: A madarak Langerhans sejtjei. VI. Ph.D. Tudományos Napok, Semmelweis Egyetem. 2004. április 8-9. 2. Igyártó Botond, Oláh Imre, Magyar Attila. Madár Langerhans sejtek. XII. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Pécs, 2004. 3. Botond Igyártó, Imre Oláh, Attila Magyar. Langerhans cells in avian skin. 8 th Avian Immunology Research Group Meeting, Munich, Germany, 2004. 4. Botond Igyártó, Attila Magyar, Imre Oláh. Follicular dendritic cell differentiation in the chicken spleen. XXXV. Hungarian Society for Immunology Meeting, Sopron, Hungary 2005. 5. Botond Igyártó, Attila Magyar, Imre Oláh. Precursors, differentiation and function of avian follicular dendritic cell. 10 th International Congress, International Society for 14
Developmental and Comparative Immunology, Charleston, South Carolina, USA, July 2006. 6. Botond Igyártó, Attila Magyar, Imre Oláh. Characterization of chicken Langerhans-like cells. 10 th International Congress, International Society for Developmental and Comparative Immunology, Charleston, South Carolina, USA, July 2006. 7. Botond Igyártó, Attila Magyar, Imre Oláh. Reevaluating the Origin and Function of Follicular Dendritic Cells in the Chicken Spleen. 9 th International Conference DENDRITIC CELLS, Edinburgh, Scotland, September 2006. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom a családomnak és a jövendőbelimnek, akik mindig mellettem álltak, buzdítottak és támogattak. Hálás köszönettel tartozom Dr. Magyar Attilának, témavezetőmnek, hogy munkámat lelkiismeretesen, önzetlenül irányította. Köszönöm azt a rengeteg értékes gyakorlati és elméleti tudást, amit átadott nekem. Nemcsak szakmailag, hanem emberileg is sokat tanultam tőle. Köszönettel tartozom Dr. Oláh Imre professzor úrnak a szakmai és emberformáló beszélgetésekért, továbbá az anyagi támogatásokért, amelyek lehetővé tették tudásom és ismeretségi köröm bővítését tudományos konferenciákon. Dr. Szél Ágoston professzor úrnak, tanszékvezetőnek hálásan köszönöm az önzetlen anyagi és emberi segítséget, amelyek lehetővé tették a doktori munkám befejezését. Köszönetemet szeretném kifejezni a Fejlődésbiológiai Laboratórium valamennyi munkatársának: Dr. Nagy Nándor, 15
Dr. Kocsis Katalin, Dr. Kittner Zsuzsanna, Dr. Herbert Minkó Krisztina; Dr. Hajdú Zoltán és Dr. Biró Éva Ph.D.- hallgatóknak a segítségükért és a jó laborlégkörért. Külön köszönet illeti Vidra Györgynét, Fügedi Jutkát és Orbán Editet a szakmai és emberi támogatásukért, akik asszisztensi munkájukkal gördülékennyé tették a tudományos munka menetét, illetve Urák Beátát a számítógépes munkákban való segítségért. Felföldi Balázs Ph.D.-hallgatónak az együtt barátságban eltöltött tudományos éveket köszönöm. A fagyasztott félvékony technika elsajátításában nyújtott segítségéért köszönet illeti Dr. L. Kiss Anna egyetemi docenst és Dr. Botos Erzsébet Ph.D.-hallgatót. Dr. Kiss Józsefnek, Újvári Zsuzsának és Kézdi Dorottyának az immun-elektronmikroszkópiában nyújtott segítségükért mondok köszönetet. Külön köszönettel tartozom: Pál Margitnak és Szemere Lászlóné Katalinnak a félvékony és ultravékony metszési technikák megtanításáért, továbbá Takács Tivadarné asszisztensnőnek a kriosztátos technikáért, Zsigmond Juditnak, Dr. Kerényi Tibornénak és Bakó Máriának az általános szövettani technikákban nyújtott segítségükért. Hálával tartozom a Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet valamennyi munkatársának barátságukért és támogatásukért. 16