Rövid és hosszútávú sejtkultúrák, funkcionális tesztek Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Pécsi Tudományegyetem
Bevezetés Definíció: az élő szervezeten kívül (in( vitro) ) tartunk élő sejteket Cél: a kísérleti állatok kímélése, ha lehetséges sejtek funkcionális vizsgálata Előny: precízen kontrollált kísérleti körülmények Kezdetek: 1885. Roux embrionális madár sejtek 1889. amnion folyadékban tartott humán bőrsejteketb
Osztályozás Sejt szövet, szervkultúra Rövid távú hosszú távú kultúra
Rövid távú kultúrák A különböző szervezetekből, szövetekből izolált sejtek 1-2 napig in vitro is eltarthatók, de proliferációt csak stimulálás után lehet kiváltani. 30-50 osztódás után ezek a sejtek a legtöbb esetben elpusztulnak. Néhány sejt azonban túlélhet és folyamatosan osztódhat. Néhány sejtvonal ilyen egyedi, folyamatosan osztódó, túlélő sejtekből l származik.
Hosszú távú kultúrák A sejtvonalak általában tumoros eredetűek. A tumoros fenotípus könnyebben alkalmazkodik az in vitro tenyésztési körülményekhez, mint a normális fenotípusú sejtek. A folyamatosan osztódó sejteknek ezen tulajdonsága a nagyobb kromoszómaszám következménye lehet. (pl. 70-80 chromosoma a HeLa tumor sejtvonalban).
Tenyésztési körülmények Teljes sterilitás! Inkubátor (állandó ~37 C C hőmérsékleth mérséklet, ~ 90 % páratartalom, pco 2 ~ 5-6 %) Tenyésztő oldat (médium) optimális ph, tápanyagok (szénhidrátok, aminosavak, nukleotidok,, vitaminok, peptidek,, hormonok, növekedési faktorok), antibiotikumok. A sejtek hosszú távú tárolása folyékony nitrogénben lehetséges.
Szövettenyésztő steril fülke (laminar air flow)
Tenyésztő edények és médium
Sejtvonalak HepG2 HeLa Jurkat
Életképesség meghatározása Festékkizárásos tesztek: Tripan kék 7-amino-actinomycin D Propidium-iodide
Fagociták funkcionális tesztjei Izoláció: üveg vagy műanyag m felületekhez kitapadnak Migráció: spontán, irányított (chemotaxis( chemotaxis), skin-window test Phagocytosis: nem-opszonizált (nem sepecifikus receptorok által lektinek), opsonizált (Fc receptor dependens, complement receptor dependens phagocytosis) Respiratory burst, phagoc agocyta a enzimek: NBT-teszt, myeloperoxidase, acid-phosphatase, alkalic-phosphatase, lyzozime Mediátor torok,, cytokinec tokinek: IFNg, TNFa, leukotrienek prostaglandinok, tromboxanok, histamine stb. termelés kimutatása ELISA, RIA, FIA módszerrel.
Phagocytosis
Phagocytosis
Phagocytosis
Phagocytosis
O 2 szabadgyök produkció
Limfocita funkcionális tesztek Limfociták poliklonális aktivációja: növényi lektinek (PHA, ConA), bakteriális sejtfal komponensek (LPS, dextrane-sulphate) T-sejtek funkcionális tesztje: citotoxikus aktivitás detektálása - Cr release assay NK-sejtek funkcionális tesztje: tumor sejt lízis (target sejtvonal: K562) B-sejtek funkcionális tesztje: Ig detektálás (Ig( produkció immuncitokémiával, ELISA-val, plaque-forming sejt-szám (PFC), Ig génátrendeződés dés detekció PCR-ral,, passzív kután anafilaxia (PCA) teszt
Limfocita funkcionális tesztek Kevert limfocita kultúra (Mixed( lymphocyte culture): Transzplantáció előtti vizsgálat Citokinek termelése ELISA, Elispot, multiplex tesztek
Mikrogyöngyök felhasználása multiplex mérésekben A mikrogyöngyök felhasználásában az áttörést a multiplex technika kifejlesztése jelentette: Valamilyen jellemző szerint később pontosan azonosítható mikrogyöngyök összekeverése Egyetlen méréssel több adathoz jutunk
Mikrogyöngyök azonosításának lehetőségei Méret alapján Fluoreszcencia intenzitás alapján Mikrogyöngybe töltött PE molekulák száma
Luminex xmap technológia A gyöngyöket feltöltik a speciális festék keverékkel
Luminex xmap technológia A különböző gyöngy klasztereket össze lehet keverni. Mivel minden egyes gyöngy egyéni felismerési jelet hordoz, az 100 xmap xmap detekciós microgyöngy rendszer klaszter detektálni tudja, hogy melyik gyöngy melyik klaszterhez tartozik. Elméletileg 100 különböző mérést lehet így egyetlen mintában egyszerre elvégezni. FL3 fluoreszcencia intenzitás FL2 fluoreszcencia intenzitás
Molekulák felkötése a gyöngyök felszínére Antitestek Oligonukleotidok Peptidek Receptorok Egyszerű kémiai (kovalens) kötéssekkel különböző anyagokat könnyen a mikrogyöngyök felületére lehet kötni.
Felhasználási lehetőségek DNS vizsgálat Immun vizsgálat Receptor-ligand vizsgálat Enzim vizsgálat
Luminex xmap technológia Citokinek FL3 fluoreszcencia intenzitás FL2 fluoreszcencia intenzitás
Luminex xmap technológia Autoantitestek FL3 fluoreszcencia intenzitás FL2 fluoreszcencia intenzitás
Luminex xmap technológia Kinázok FL3 fluoreszcencia intenzitás FL2 fluoreszcencia intenzitás
Mikrogyöngy klaszter detektálása A vörös lézer a mikrogyöngyökben található vörös és infravörös festékét is gerjeszti, lehetővé téve a gyöngy besorolását valamelyik klaszterbe a lehetséges 100 közül.
Detektáló paraméter detektálása A zöld lézer a mikrogyöngyök felületéhez kötődő detektáló fluorofórt gerjeszti, lehetővé téve a mintában lévő a n y a g mennyiségének meghatározását.
BD TM Cytometric Bead Array (CBA) Citokin mintázat detekció multiplex mikrobeadek segítségével Humán gyulladásos citokin kit
Humán gyulladásos citokin CBA kit Találat szám (count) Klaszterező paraméter (FL3)
Standard görbe kalkulálás 20 pg/ml 625 pg/ml 5000 pg/ml FL2 MFI CC 10.000