Immunológiai módszerek
poliklonális ellenanyagok monoklonális ellenanyagok specificitás heterogén homogén affinitás heterogén homogén izotípus heterogén homogén keresztreakciók gyakori nincs előállítás olcsó, egyszerű drága, speciális felszerelést igényel immunizálás tisztított antigénnel szennyeződés nem zavar mennyisége korlátozott korlátlan jellemzés specificitás/keresztreagáló képesség izotípus összetétel átlag affinitás finom specificitás izotípus affinitás ajánlott módszerek precipitáció agglutináció komplement aktiválás ELISA FACS / MACS blot - ELISA/RIA
A monoklonális ellenanyag előállítás menete George Köhler és Cesar Milstein, 1984 antigén tisztítás jelölés lépsejtek PEG mielómasejtek ellenanyag termelés sejtek HAT aszcitesz fagyasztás ellenanyag szelekció klónok felnövesztése klónozás
Antigén-ellenanyag kötődés kimutatása 1. Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek
Gél közegben végzett precipitációs módszerek Kétdimenziós egyszerű immundiffúzió Kétdimenziós kettős immundiffúzió antigén antigén ellenanyag Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis ag agarba kevert ellenanyag antigén antigén ea ellenanyag Machini-módszer Agaróz gél ellenanyag Ouchterlonz/m=dsyer Ouchterlony módszer Agar gél 1/128 Ea 1/2 1/128 Ag 1/2 1/64 Ag 1/4 1/64 Ea 1/4 1/32 1/16 1/8 1/32 1/16 1/8
direkt Agglutináció indirekt Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis passzív AB0 vércsoport Rh vércsoport antigének (Coombs teszt) autoantitestek vagy vírus antigének kimutatása
Komplement függő sejtlízis HLA tipizálás szerológiai módszere Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis alvadásgátolt PBMC szeparálás vér komplement forrás (friss nyúlsavó) allél-specifikus antisavók festék élő / pusztult sejtarány
módszer érzékenység ( g/ml ) jelzéses technikák ELISA < 0,001 RIA < 0,0001 immunfluoreszcencia < 1,0 precipitációs módszerek kettős immundiffúzió 1,0 10,0 ellenelektroforézis 0,1 1,0 immunelektroforézis 5,0 50,0 radiális immundiffúzió 1,0 10,0 rakéta elektroforézis 0,1 1,0 agglutinációk indirekt - direkt 0,01 1,00 passzív 0,005 0,1 agglutináció gátlás 0,001 0,01 komplement kötés 0,01 0,1
Antigén-ellenanyag kötődés kimutatása 2. Jelzéses technikák
Jelölés módja: - Enzimmel (HRPO, alkalikus foszfatáz) ELISA, ELISPOT, hisztokémia - Fluoreszcens festékkel (FITC, TRIC, Texasred, Rodamin, PE, CyChrom, Alexa) FACS, fluorescens mikroszkópia - Fémkolloidokkal (vas, arany) MACS, elektron mikroszkópia - Radioaktív izotópokkal RIA (radio immuno assay)
ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) 1. direkt ELISA 1 2 3 -- Enzimmel konjugált ellenanyag -- Ag % + szubsztrát + kromogén direkt 5 1 0,2 EA [c] mg/ml % direkt 25 5 1 Ag [c] mg/ml ellenanyag antigén determinánsok jelzés (enzim, pl. HRPO; radioaktív izotóp;fluorokróm)
2. indirekt ELISA indirekt OD 10x 100x 1000x EA hígítás monoklonális reagens ellenanyag második ellenanyag (anti-egér immunoglobulin) poliklonális reagens antigén determinánsok jelzés (enzim, pl. HRPO; radioaktív izotóp;fluorokróm) + szubsztrát + kromogén
Szendvics ELISA 1. Coat készítés elsődleges ellenanyag szilárd fázishoz kötődik 2. antigén (ismeretlen konc.) (fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok, vírusok, baktériumok, sejtek) Standard: ismert koncentrációjú antigén higításai kvantitatív meghatározáshoz szükséges 3. Antigén secifikus második allanyag jelzett (-HRPO) formában (biotin-sztreptavidin=erősíti a színreakciót, ld. ábra) 4. Szubsztrát (H 2 O 2 ) + kromogén (pl. TMB) A redukált (színtelen) TMB kromogén oxidálódik színváltozás (kék) 5. Reakció leállítása (H 2 SO 4 ) színváltozás (sárga) 6. Spektrofotometriás mérés Az első réteg után blokkolás (szabad kötőhelyek fedése), a további lépések között mosás (nem kötődött molekulák eltávolítása)
ELISA kivitelezése:
ELISA kit különféle antigének mennyiségi meghatározására
Antigén-ellenanyag elsődleges kapcsolódásának kimutatásán alapuló: jelzéses módszerek 1. ELISA 2. Fénykibocsátás detektálásán alapuló módszerek Fluoreszcencia, lumineszcencia (Sejtanalitikai módszerek: FACS, CLM)
Fluoreszcencia Egy gerjesztett molekula elektronátmeneteit (relaxáció) kísérő foton kibocsátás (emittáció) Egy foton elnyelése, az ABSZORBCIÓ (1) váltja ki Egy gerjesztett elektronállapot (S1 ) jön létre, mely először a legalacsonyabb S1 vibrációs szintre relaxál (2), majd Fluoreszcencia kibocsátás vagy egyéb relaxációs folyamatok (3) során visszatér az alapállapotba: a kibocsátott fluoreszcencia mindig hosszabb hullámhoszú, mint az elnyelt hullámhossz Fluorofórok lényeges paraméterei Emissziós (kibocsátási) spektrum Gerjesztési (elnyelési, excitációs) spektrum
Miért jó fluoreszcens technikákat használni? pmol/l érzékenységű a radioaktív jelölés lenne hasonlóan érzékeny, de az veszélyes térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz (határ: 1-100 ns, ami a fluoreszcencia életideje) spekrofluorimetria multiparaméteres fluoreszcens mikroplate reader áramlási citofluorimetria (FACS) fluoreszcens mikroszkópia Fluorofórok A flurofórok olyan molekulák, melyek képesek az elnyelt fényt jó hatásfokkal fluoreszcencia formájában kibocsátani Természetes fluorofórok: Trp, Tyr, koenzimek, szteroidok, DNS/RNS Gyakori szintetikus és szemi szintetikus fluorofórok: Fluoreszcein, Rhodamin, Etídium bromid, Propídium jodid, fikobiliproteinek (RPE, APC)
Alapelvek Sejtszuszpenzió áramoltatása zárt keringési rendszerben Áramlási citofluorimetria (FACS) Hidrodinamikai fókuszálás kis keresztmetszetű kapilláris fejbe Egyszerre 1 sejt megvilágítása lézerrel Sejtről érkező fluoreszcencia és fényszórás detektálása Adatok digitálsi feldolgozása és tárolása
Áramlási citofluorimetria Mit detektálunk? fluoreszcens jeleket Fényszórás: a megvilágító lézer fénye beleütközik a detektálandó részecskébe (sejt, gyöngy, stb) Két típusa: előre szóródó (FSC=forward scatter) sejt méret oldalra szóródó (SSC=side scatter) granuláltság
Áramlási citofluorimetria Előnyök Sejtenkénti multiparaméteres analízis Nagy sebesség (akár 10.000 sejt/perc) Sejtszortírozás lehetősége (tetszőleges tulajdonság alapján) Felhasználás Klinikumban: sejtpopulációk arányának, sejttípusok abszolút számának meghatározása, aktivációs állapot meghatározása, citokinek mérése Kutatásban: gyakorlatilag bármire : populációk mennyisége/minősége, sejtosztódás, sejtaktiváció, sejthalál, ionok, citokinek meghatározása
Eredmények feldolgozása
Sejtpopulációk a lépben. Kvadráns analízis limfocita markerekkel B limfociták FL-2 : sigm spec. antitest Nincs kettősen pozitiv sejt! T limfociták nem limfoid sejtek FL-1: anti-cd3
FL-2 : anti-cd8 sejtszám Kvadráns-analízis (pl. T sejt populációk a timuszban) érett, CD8+ citotoxikus T-limfocita (5-7%) TÍMUSZ éretlen, CD4+ és CD8+ T-limfocita (~ 80 %) TCR/CD3 expresszió? éretlen, CD4- és CD8- T-sejt (3-5 %) FL-1 : anti-cd4 FL-3 : anti-cd3 érett, CD4+ helper T-limfocita (~ 10 %) (10-20.000 sejt)
Fluoreszcens (konfokális) mikroszkópia a minta előkészítése gyakorlatilag azonos a FACS-al lokalizáció meghatározására elsősorban itt is a sejtekről érkező fluoreszcens jelet detektáljuk
Konfokális fluoreszcens mikroszkópia lézer-pásztázás, optikai szeletelés: Z-scan, 200-500 nm, digitális fluoreszcens képalkotás, 3D-rekonstrukció Fehérje-fehérje vagy fehérje-lipid kolokalizáció: CLSM Imaging Dendritikus sejt zöld: ic3b piros: LAMP-1( lizosz.asszoc.mb.prot.) sárga (overlay) : ic3b-lamp asszociáció
A fagocitózis vizsgálata Fagocitált partikulum: latex, élesztő, baktérium opszonizált (IgG és/vagy komplement) formában is - Inkubálás: 1 óra, 37 C - Értékelés: fénymikroszkóppal CLM vagy citofluoriméterrel pl. FITC-jelzett partikulumok fagocitózis index vagy fagocitózis % megállapítása, illetve flooreszcencia intenzitás mérése (Egér és humán makrofág sejtvonalak használata) Konfokális lézer mikroszkópos felvétel DC fagocitózisról
Sejtkultúra készítés és fenntartás: Pipetták Steril tenyésztőedények Steril tápfolyadék Steril fülke CO2 termosztát
IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA Primer sejtek (állati, emberi): - lép - tímusz - csontvelő - nyirokcsomó - hasüreg - vér Vér - vérplazma ( alakos elemek ) - eritrociták - trombociták - leukociták - granulociták - neutrofil - bazofil - eozinofil - limfociták - monociták Sejtvonalak: Korlátlanul osztódó állati és humán eredetű sejtek
IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA Sejtpopulációk elválasztásának alapja: 1. Fajsúly különbség Sűrűség grádiensen történő centrifugálás 2. Egyedi funkciók Monocita, makrofág: adherencia, fagocitózis Neutrofil granulocita, dendritikus sejt: fagocitózis B-sejtek: ellenanyag termelés (tapadása nylon-vattához) T-sejt: citotoxikus reakció (bvvs kötődés - rozetta-képzés) 4. Sejtfelszíni marker Panning technikák, FACS Komplement-mediált lízis (ellenanyaggal megjelölt sejtek komplement hozzáadására lizálnak, a markert nem expresszáló sejtek elkülöníthetők).
A limfocita populációk megoszlása emberi vérben
A vér összetevői vérsavó: natív (alvadásgátló mentes) vér része
Sűrűség grádiens centrifugálás VÉR B Plazma Ficoll Fajsúly: 1.077g/c m 3 T Gr Mo Centrifugálás: 500g, 30 min vvt PMNS: perifériás mononukleáris sejtek 80% T+B+Gr 10% Mo és B Mo Adherens sejtek (Mo) eltávolítása: adherencia (kitapasztás)
Monocita eredetű dendritikus sejtek (MDC) in vitro differenciáltatása ÉRETLEN DC immdc GM-CSF IL-4 CD14- MHCII+ CD83- MR+ TNF-α Patogén stimulus GM-CSF IL-4 Mo mamdc MONOCITA GM-CSF ÉRETT DC CD14+ MHCII+ MAKROFÁG CD14+ MHCII+ Mf CD14- MHCII++ CD80+ CD83+ CD86+ MR- Sejtek tenyésztése: NHS/FCS(magzati borjú savó)-tartalmú tápfolyadékban vagy szérummentes médiumban
FAGOCITASEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSÉRE 5. Dendritikus sejtek antigén felvétele FITC-dextrán, torma-peroxidáz endocitózisa LEGGYAKRABBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLATOK 1. Korai aktivációjának kimutatása (NF-κB magi transzlokációja aktivált dendritikus sejtekben) 2. Dendritikus sejtek citokin produkciója (Pl. aktivált DC-k által termelt IL-12 meghatározása: mrns, microbead assay, ELISA, immunhisztokémia) 3. Dendritikus sejtek kölcsönhatása más sejtekkel Allogén CD4 + T-sejtek proliferációjának mérése 4. Dendritikus sejtek migrációja A kemokinek a DC-k kemotaxisát és endotélen keresztüli migrációját váltják ki. A migráció mértéke transwell plate-ben vizsgálható.
NF-κB magi transzlokációja LPS aktivált dendritikus sejtekben Konfokális lézer mikroszkópos vizsgálat Kontroll LPS aktivált Sejtmag NFkB
Opszonizált fagocitózis
Kemotaxis teszt - Kemotaktikumok kiváltják az immunsejtek migrációját - felső edényben sejtszuszpenzió, alsó edényben kemotaktikum, a kettő között filter - kemotaktikus inger hatására membránon átjutó sejtek számának meghatározása - standard alkalmazása transwell plate
Limfociták izolálása Sejtpopulációk elválasztása: 1. Sűrűség grádiensen történő centrifugálás (alvadásgátolt vér) 2. Monocita-granulocita eltávolítás: adherencia, fagocitózis 3. Limfocita: T, B (B-sejtek tapadása nylon-vattához, T-sejt bvvs kötődés - rozetta-képzés) 4. Panning technikák 5. Komplement-mediált lízis
Sűrűség grádiens centrifugálás VÉR B Plazma Ficoll Fajsúly: 1.077g/c m 3 T Gr Mo Centrifugálás: 500g, 30 min vvt PMNS: perifériás mononukleáris sejtek 80% T+B+Gr 10% Mo és B Mo Adherens sejtek (Mo) eltávolítása: adherencia (kitapasztás)
T sejtek izolálása rozetta képződés segítségével B T T T T sejtek T T T T T B sejtek Rozetta: emberi T sejteken: CD2 + birka vörösvértest Ficoll Ficoll T T T T sejtek T
További szeparálási módok: Panning (kipányvázás): Petri csésze felszín fedése ellenanyaggal, amely egy adott sejtfelszíni markerra specifikus A nem kötődő sejtek óvatos lemosása Ellenanyaggal fedett sejtek komplement függő lízis útján való eltávolítása: T/B limfocita szuszpenzió T sejtek + anti-cd3 + komplement forrás (nyúl savó) T sejtek lizálnak, B sejtek használhatók Nyugvó és aktivált B sejtek elkülönítése: Percoll gradiensen 55 %, 58 % 65 % Percoll oldat
Sejtszeparálás mágneses mikrogyöngyökkel Dynabead gyöngyök sejt marker specifikus ellenanyaggal fedve Gyors, egyszerű, hatékony elválasztás pozitív negatív szelekció Negatív sejtek 99% depléció Többféle ellenanyag keverve Sejtek érintetlenek Pozitív sejtek 99% tisztaság mágnes
A sejtszeparálás hatékonyságának ellenőrzése Folyadék áramlási citometriás méréssel Kontroll, 1 Izolálás Izolálás előtt előtt (T+B) (T+B) T sejtek eltávolítása komplementtel 2 T sejtek eltávolítása B sejtek eltávolítása panning-el 3 B sejtek eltávolítása B220: B sejt marker CD3: T sejt marker B220 CD3 T - T - B - B -
Funkcionális vizsgálatok Antigén: szolubilis, vagy antigénprezentáló sejt + peptid B sejt T sejt Mitogén:LPS, PWM, SpA, PHA, ConA, Anti-antigén receptor (BCR, TCR): anti-iggam, anti-könnyűlánc, anti-idiotípus ellenanyagok, vagy anti-cd3 Poliklonális aktiválás
Limfociták funkcionális vizsgálata
Ellenanyag termelés ELISA ELISPOT Plakk Citokin termelés ELISA FACS PCR Apoptózis DNS festés Citokróm-C felszabadulás Caspase aktivitás Annexin Proliferáció DNS festés (sejtciklus) CFSE festés Triciált (3-H) timidin beépülés
Primer és szekunder humorális válasz
Ellenanyag termelés ELISA ELISPOT Plakk Citokin termelés ELISA FACS PCR Apoptózis: DNS festés Citokróm c felszabadulás Caspase aktivitás Annexin Proliferáció DNS festés (sejtciklus) CFSE festés Triciált (3-H) timidin beépülés
IL - 10 Cytokin mérés ELISA-val OD492 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,0087x - 0,0031 0 0 50 100 150 citokin (pg/ml) IFN-gamma 0,6 Szendvics ELISA: Ellenanyag citokin ellenanyag* OD492 0,4 0,2 y = 0,0061x + 0,086 0 0 20 40 60 80 citokin (pg/ml) Eltérő epitópokra specifikus ellenanyagok 1 0,8 IL-4 Kanatitatív mérés: ismert koncentrációjú citokin hígítási sorral OD492 0,6 0,4 0,2 y = 0,0064x + 0,0126 0 0 50 100 150 citokin (pg/ml)
Ellenanyagtermelő B sejtek kimutatása B sejtek tenyésztése antigénnel fedett edényben mosás Enzimmel konjugált anti-ig-vel való inkubálás mosás Kromogén hozzáadása Limfokintermelő T sejtek kimutatása A T sejtel tenyésztése a kérdéses limfokinre specifikus ellenanyaggal fedett edényben mosás A limfokinnek egy másik epitopját felismerő, enzimmel konjugált ellenanyaggal való inkubálás mosás Kromogén hozzáadása ELISPOT A citokint termelő Tsejtek, vagy az ellenanyagot termelő plazmasejtek gyakoriságának meghatározása pozitív sejtek megszámolása
Ellenanyag termelés ELISA ELISPOT Plakk Citokin termelés ELISA FACS PCR Apoptózis: DNS festés Citokróm c felszabadulás Caspase aktivitás Annexin Proliferáció DNS festés (sejtciklus) CFSE festés Triciált (3-H) timidin beépülés
Limfocita aktiváció lép LPS ConA Proliferáció (3H-timidin beépülés) + + tímusz LPS ConA - +
Proliferáció meghatározása CFSE osztódás: 3 2 1 0 osztódás: 3 2 1 0 CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) CFSE FL-1 Beépül az élő sejtekbe Észterázok hasítják az acetát csoportot A hasított molekula fluoreszcenssé alakul és a sejtben marad
Proliferáció meghatározása CFSE Az osztódó sejtek arány meghatározható