KÜLÖNBÖZŐ ANA KIMUTATÁSI MÓDSZEREK M ÖSSZEHASONLÍTÁSASA MAGYAR MÓNIKA, M DR. BERKES ENIKŐ 2005 MOLSZE
VIZSGÁLAT CÉLJAC 30 poliszisztémás autóimmun betegség gyanús páciens vérében vizsgáltuk meg a legfontosabb autoantitesteket különböző eljárásokkal, és ezen eljárások eredményét hasonlítottuk össze.
Különböző eljárásokkal kimutatható legkisebb ellenanyag koncentráci ciók Nefelometria Immunelektroforézis Radiális immundiffúzió Rakéta-immunelektroforézis Komplement fixáció Haemagglutináció Immunfluoreszcencia Enzim immunoassay (ELISA) Luminescencia Radio-immunoassay (RIA, Farr) Immunoblot 20 50 mg 20 40 mg 5 10 mg 2 10 mg 0.2 1.0 mg 0.2 1.0 mg 1 100 ng 0.2 100 pg 0.1 100 pg 0.1 100 pg 0.2 100 pg
ANA - ANF Az antinukláris antitest (ANA) vagy antinukleáris faktor (ANF) a sejtmag általános komponensei ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve: Ma mintegy 30 ANA-t ismerünk (pl: DNA, histon, RNA, Sm, SSA, SSB, centromer, PM/Scl, Jo-1, stb).
Poliszisztémás autoimmun kórképek SLE Primer Sjögren szindróma (pss) Kevert kötőszöveti betegség (MCTD) Polymyositis/Dermatomyositis (PM/DM) Progresszív szisztémás sclerosis (PSS) Rheumatoid arthritis (RA) Nem diferenciált kollagenózis (NDC) CREST sy.
ANA kimutatás s I. Szűrőteszt Indirekt immunfluoreszcencia patkányszövet(máj, vese, gyomor) HEp-2 sejt ELISA screen (HEp-2 mag- vagy sejtkivonat,tisztított és/vagy humán rekombináns antigének, illetve ezek különböző elegyei)
ANA kimutatás s II Szűrőteszt Indirekt immunfluoreszcencia patkányszövet(máj, vese, gyomor) HEp-2 sejt - A HEp-2 előnye, hogy nemcsak a mag hanem a sejt osztódási fázis elleni és citoplazmatikus antitesteket is kimutat.
ANA kimutatás III Mintázatok IIF technikával HEp-2 sejten Magban: Homogén Perifériás Granuláris Nukleoláris MND, ND Citoplazmában: riboszóma, lizoszóma, mitokondrium, Golgi készülék, citoszkeleton Sejtosztódás mintázatai Centromer ellenes antitest mintázata
ANA IV. A HEp-2 sejteken végzett vizsgálat az ANA kimutatás Golden standardja. Csak szűrővizsgálat, mert a mikroszkópos kép mintázata csak egyes esetekben teszi lehetővé az antitest azonosítását. Az ANA specificitását további vizsgálatokkal kell tisztázni: Elisa és blotting technikák.
ANA KIMUTATÁS S V. Szűrésre olyan ANA Elisa-t kell használni, amely valamennyi nuklearis antigent tartalmazza. Ha az Elisa teszt csak rész mag antigéneket tartalmaz, akkor egyéb antigének elleni antitestek láthatatlanok maradnak. Ugyanez érvényes a rekombináns antigének alkalmazásánál is.
KIMUTATÁSI MÓDSZEREKM IMMUNFLUORESZCENCIA ELISA IMMUNOBLOT
The molecule of life
Autoantigén Natív, kettős-szálú DNS (dsdna) Denaturált, egyes-szálú DNS (ssdna)
dsdns specifikus antitestek kimutatásának indikáci ciói SLE diagnózisának alátámasztása Differenciál diagnózis egyéb kötőszöveti kórképektől Prognosztikai érték Az SLE aktivitásának, nephritis kialakulásának, a kezelés hatékonyságának monitorozása Homogén ANA mintázat
Anti-dsDNA antitest kimutatási technikák ELISA Magas szenzitivitás alacsony specificitás Kis és nagy aviditású antitestek kimutatása Kvantitatív Izotípus meghatározásra alkalmas Hátránya: ss-dna szennyeződés okozta álpozitívitás Előállítási nehézség Spontán denaturáció
dsdns antitestek előfordul fordulása Általában alacsony titerű 1-12 % gyakoriság antitest pozitivitás Gyógyszeres lupus-like szindróma Juvenilis idiopathias arhritis (JRA) Szisztémás sclerosis Autoimmun májbetegség (PBC, CAH) Hashimoto thyreoditis Uveitis Meningitis Myastenia gravis Súlyos gyulladás (sejtszétesés), fertőzés (szepszis) Malignus kórképek (citotoxikus terápia) Egészséges véradó: <0.1 % (IgG típus, rizikó faktor, követés ajánlott)
SLE szerológiai diagnosztikája Pozitív homogén ANA, pozitív dsdna lelet alátámasztja az SLE diagnózisát dsdna antitest pozitivitás prognosztikus értékű vese vagy CNS szövődmény irányában Antitest titer korrelál a betegség aktivitásával Negatív dsdna nem zárja ki az SLE diagnózisát
ENA (extrah( extrahálható nukleáris antigének nek ) A ribonukleoproteinek és nem-hiszton proteinek olyan heterogén csoportja, amelyeknek különböző funkciója van a sejtmag metabolizmusában. Előállítás: borjú thymus, human lép, HeLa sejtek fiziológiás sós extrakciója, vagy rekombináns technikák alkalmazása
ENA KIMUTATÁSA IMMUNFLUORESZCENCIA ELISA IMMUNOBLOT
Antigénforr nforrás: : Természetes? Rekombináns ns? Az antigén legyen tiszta Természetes forrás Human szövet limitált mennyiség, sok komponens; bonyolult tisztítási folyamatok (sérülhet a fehérje stabilitása); etikai problémák (HeLa sejtek) Állati szövet limitált mennyiség, limitált homológia; csak akkor használjuk, ha más forrás nincs.
Autoantitestek elõfordulásának gyakorisága kötőszöveti autoimmun betegségekben (%) Betegség ANA Sm RNP SSA/Ro SSB/La Scl-70 Jo-1 SLE 80-100 10-25 10 15-30 5-20 SJÖGREN 80-95 50-80 40-60 SCLERODE RMA 70-95 10-33 PM/DM 40-95 20-30 MCTD 70-95 50-80 RA 30-60 0-5 0-2
ENA vizsgálatokról Az anti-ena antitestek meghatározása lényeges az autoimmun megbetegedésekben. Az ANA vizsgálata előzze meg az anti-ena kimutatását. Nem várható el 100 % korreláció az anti-ena és ANA vizsgálatok között. Az antigén lehet rekombináns vagy természetes, mindkét esetben vannak előnyök és hátrányok is, az irodalomban fellehető adatok nagyobbik része még temészetes eredetű antigént használ anti- ENA autoantitestek kimutatásánál.
VIZSGÁLATAINK I 30 betegből volt: 14 beteg IF pozitív 10 ANA Screen pozitív 10 dsdna pozitív 12 ENA screen pozitív 12 ENA subtípus pozitív 4 immunoblot pozitív
VIZSGÁLATAINK II. - IF és ANA screen vizsgálatok eredményei IF+ ANA+ IF- ANA+ IF+ ANA- IF- ANA- össz 12 4 2 12 30 - ANA screen és egyéb autoantitestek eredményei ANA+ AT+ ANA- AT+ ANA+ AT- ANA- AT- 7 10 1 12 30
VIZSGÁLATAINK III ENA screen és szubtipusok együttes vizsgálata esetén azt tapasztaltuk, hogy 12 ENA pozitív,12 subtípus pozitív esetet tudtunk kimutatni.az ENA csak jelzi a pozitivitást, subtípus pozitivitások pedig egyes betegségekre utalnak. Blotting módszerrel 30 vizsgált esetből 4 beteget találtunk pozitívnak. Az általunk választott módszer nem bizonyult elég érzékenynek.
VIZSGÁLATOK ÖSSZEFOGLALÁSA IF: DiaSorin teszt Hep2 sejteken Fitc IgG vel, Evans kontraszt festékkel ANA screen HYCOR Elisa teszt ENA screen HYCOR Elisa teszt ENA subtípusok HYCOR Elisa teszt Immunoblot D-Tek /Belgium/
ELVÉGZETT VIZSGÁLATOK SORSZÁM IF ANA ELISA ANA DsDNA ELISA ENA ANA8 Blue Dot SSA SSB Sm/RNP Sm ScL70 Jo1 474 Citop 5,0 25,0 0,0 Neg 1,8 N 0,9 3,9 0,4 0,7 478 N( Vp) <1,0 17,5 10,92 Neg 1,5 N 1,1 4,1 0,7 0,9 479 Citop 7,5 35,0 22,7 Neg 1,7 N 1,8 4,5 1,3 1,6 480 Neg 2,5 35,0 8,0 Neg 3,6 N 3,0 5,7 2,1 2,5 481 ++ h 20 25,0 8,0 Neg 1,7 N 2,4 3,8 1,5 2,3 484 multi dots 5,0 15,0 9,3 Neg 2,9 N 1,0 4,6 0,5 0,9 485 Neg 4,8 20,0 6,7 Neg 1,2 N 0,8 0,82 0,9 0,7 487 +/- 20 55,0 33,4 Neg 1,7 N 2,4 4,8 1,2 2,5 488 Neg 2,5 17,5 0,0 Neg 1,6 N 2,1 3,6 0,5 1,0 489 Neg 4,8 54,5 0,0 Neg 1,8 N 1,8 4,5 1,3 11,2 490 N Vp 5,3 25,0 6,7 Neg 2,3 N 1,8 10,0 0,6 1,6 125 p+- 20,0 25,0 21,8 Neg 2,6 N 1,7 7,2 2,4 1,8 126 ++++ h >100 130,0 f 13,3 Sm/RNP ++ 0,96 N 16,9 9,2 0,7 0,2 Centro ++ 127 ++++h 12,5 100,0 f 16,4 Neg 19,0 N 9,1 11,0 2,7 17,7 148 Neg 1,18 13,0 2,2 Neg 2,0 N 5,6 8,7 1,0 1,3 149 Neg 4,6 28,0 3,7 Ssa 4,0 N 2,4 4,3 3,6 3,6 151 ++++h 41,4 20,4 165,1 SSA++ SSB+ 5,1 15 1,4 4,0 0,8 1,0 152 Neg 2,0 151,1 1,6 Neg 2,6 N 1,2 4,1 1,0 0,7 153 ++ nukl 29,0 25,5 2,2 Centr ++ 6,4 N 2,2 5,9 0,5 0,5 154 Neg 1,9 14,6 9,8 Neg 3,3 N 2,5 9,4 3,8 1,4 155 +++ ran 12,6 148,0 15,0 Neg 4,6 N 2,6 4,8 7,4 2,6 156 +++ h 8,7 39,1 3,2 Neg 1,7 N 1,3 5,1 1,5 0,8 157 Neg 1,0 14,4 2,2 Neg 1,4 N 0,8 6,4 0,9 0,6 158 +++h 6,6 135,9 2,1 Neg 4,4 N 4,4 5,6 3,6 2,6 159 +++dots 29,3 16,5 13,7 Neg 149,6 P 2,2 8,0 1,6 1,4 160 N Vp 3,4 95,9 2,7 Neg 4,8 N 2,6 4,1 3,0 3,2 161 ++h 5,9 53,8 6,6 Neg 2,1 N 0,9 7,4 1,0 0,7 162 N Vp 3,7 46,2 5,5 Neg 4,6 N 5,0 3,7 2,5 2,3 555 N 1,7 18,7 1,9 Neg 3,2 3,2 2,8 3,3 3,0 2,0 163 +++ ran 47,6 103,7 174,7 SSA++ SSB++ 171,3 P 1,1 4,6 0,6 1,0 Összes:30 Poz:14 Poz8 Poz:10 Poz:12 Poz:4 Poz:3 Poz2 Poz:1 Poz:2 Poz:0 Poz:2
ÖSSZEFOGLALÁS ANA-k kimutatására először szűrőtesztet használjunk, mely ANA Elisa, illetve ANA IF legyen. Pozitivitás esetén további Elisa vizsgálatok dsdna, ENA screen illetve szubtipusok. Kiegészítésként Blot-ting? /centromer ellenes antitestek kimutatására/
ÖSSZEFOGLALÁS Az eredményeket nemcsak validálni, hanem véleményezni is kell.
dsdns antitestek előfordul fordulása Általában alacsony titerű 1-12 % gyakoriság antitest pozitivitás Gyógyszeres lupus-like szindróma Juvenilis idiopathias arhritis (JRA) Szisztémás sclerosis Autoimmun májbetegség (PBC, CAH) Hashimoto thyreoditis Uveitis Meningitis Myastenia gravis Súlyos gyulladás (sejtszétesés), fertőzés (szepszis) Malignus kórképek (citotoxikus terápia) Egészséges véradó: <0.1 % (IgG típus, rizikó faktor, követés ajánlott)
Autoantitest típusok diagnosztikus értékük k alapján n II. Betegség-specifikus antitestet detektálunk jellegzetes klinikai szimptómák nélkül meggyőződünk, hogy nem álpozitív konzultáció referencia laboratóriummal kontroll vizsgálat javasolt 3-6 hónapon belül pozitivitás eltűnik fertőzést követő poliklonális aktiváció terméke pozitivitás fennáll rendszeres követés ½ évente
Szükséges a klinikus és a laboros együttműködése. A klinikus ismerje a labor vizsgálatok szenzitivitását és specificitását. A laboros ismerje a betegségek klinikumát Diagnózis? Aktivitás? Therápiás effektus
Köszönjük a BIOMEDICA HUNGARIA KFT. anyagi és szakmai támogatását.