Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Ph.D. értekezés A VÉRTELENÍTÉS HASZNÁLATÁVAL ÖSSZEFÜGGŐ SZÖVETI SÉRÜLÉS VÁZIZMON Készítette: Dr. Turchányi Béla Szív- és érrendszeri betegségek élettana és klinikuma doktori program Programvezető: Dr. Juhász-Nagy Sándor egyetemi tanár Témavezető: Dr. Hamar János egyetemi magántanár 2005 Szigorlati Bizottság Dr. Mózes Tibor e. tanár Dr. Koller Ákos e. tanár Dr. Farkas Tamás c.e.m. tanár OBSI Opponensek: Dr. Telek Géza PhD Dr. Lantos János e. docens PTE
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK...2 PUBLIKÁCIÓK...3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...6 ÖSSZEFOGLALÁS...7 SUMMARY..9 BEVEZETÉS..11 CÉLKITŰZÉSEK...18 ANYAG ÉS MÓDSZER...19 EREDMÉNYEK...27 MEGBESZÉLÉS...47 FŐBB MEGÁLLAPÍTÁSOK...53 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 55 IRODALOM...56 2
Publikációk A disszertációval összefüggő közlemények: Turchányi B, Hamar J, Tömböl T, Siklós L.: Capsaicin delays regeneration of the neuromuscular junction of rat extensor digitorum longus muscle after ischemia. Muscle Nerve 2006 jan 3. (Epub ahead of print) Turchányi B, Réffy A, Tóth B, Hamar J.: Szelektív deafferentáció, indukált gyulladás, és a vértelenítés együttes hatása az extensor digitorum longus izom szerkezetére és kontrakciós erejére patkányon. Magyar Traumatológia Orthopédia Kézsebészet és Plasztikai Sebészet. 2005. 48 (4):352-363 Turchányi B, Tóth B, Rácz I, Vendégh Z, Fűrész J, Hamar J.: Ischemia Reperfusion Injury of the Skeletal Muscle after Selective Deafferentation. Physiol. Res. 2005. 54. 25-31, Turchányi B, Rácz I, Hamar J, Vendégh Z, Tóth B.: Érzőidegek szerepe a reperfúziós sérülést követő szöveti károsodásban. Magyar Traumatológia Orthopédia Kézsebészet és Plasztikai Sebészet. 2001. 44(1):3-8 Turchányi B, Szalontay T, Zacher G.: Kígyómarás okozta sérülések. Orvosi Hetilap 2000 141(20): 1067-1071 Cziffer E, Farkas J, Turchanyi B. Management of potentially infected complex hand injuries. J Hand Surg [Am]. 1991 Sep; 16(5): 832-834 Folyóiratban megjelent absztraktok: Turchányi B, Fűrész J, Hamar J.: Van-e kimutatható káros hatása az egy óránál rövidebb vértelenségnek? Magyar Sebészet. 2005 58(4) 276 (Előadás) 3
Turchányi B, Tóth B, Vendégh Zs, Hamar J.: Capsaicin pre-treatment beneficially influences reperfusion injury of the skeletal muscle. Acta Physiol. Hung. 2002 89(1-3): 70 (Poszter) Előadások: Turchányi B, Hamar J.: Szelektív deafferentáció szerepe a vázizomzat reperfúziós károsodásában Magyar Traumatológus Társaság Kongresszusa 2004 szeptember 25., Balatonfüred Turchányi B, Szalontay T, Zacher G.: Felsővégtagi compartement szindrómák Magyar Traumatológus Társaság Kongresszusa 2000. május, Debrecen Turchányi B.: Érdemes-e, lehet-e baleseti sebészeti kutatást végezni? Magyar Traumatológus Társaság Kongresszusa 1999. szeptember, Pécs Egyéb közlemények: Balogh J, Sárváry A, Turchányi B, Feczkó J, Molnár I.: Humerus szártörések kezelése flexibilis felfúrás nélküli reteszes szeggel. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet. 2003 46(2): 154-164 Turchányi B: Proximalis radiustörés. In: Cziffer E.(szerk): Operatív töréskezelés Budapest, Springer. 1997 361-367 Turchányi B, Szabó Gy.: A súlyos kézsérülések ellátása. Honvédorvos 1997 49(4): 286-295 Turchányi B, Cziffer E.: Háromdimenziós ligamentotaxis alkalmazása distalis radiustörések helyreállításában. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet. 1996 39(5): 383-388 4
Cziffer E, Farkas J, Turchányi B. A kéz csontdefektussal járó nyílt, potenciálisan fertőzött töréseinek kezelése halasztott korai csontpótlással. Magy Traumatol Orthop Helyreállító Seb. 1990 33(4): 297-302 Turchányi B, Cziffer E, Farkas J. Radiusfejecs protézis beültetés a friss sérülések ellátásában. Magy Traumatol Orthop Helyreállító Seb. 1990 33(3): 161-166 Turchányi B.: Kézigránát-hajítás közben keletkezett humerus törések. Honvédorvos 1988 40(2): 93-101 Kottra G, Turchanyi B, Takacs L. Renorenal vasomotor reflex. Acta Physiol Acad Sci Hung. 1981 57(2): 123-130 5
Rövidítések jegyzéke Az SI rendszerben használatos rövidítések nem szerepelnek a listán AP akciós potenciál CGRP calcitonin gene-related peptide DL distalis latencia EDL extensor digitorum longus EVI Egészség Védelmi Intézet HMÖ Heves Megyei Önkormányzat I ischaemia IL interleukin i.p. intraperitonealis KHK Központi Honvéd Kórház MH Magyar Honvédség n. nervus NCV ideg-vezetési sebesség NMJ neuro muscularis junctio NO nitrogén-monoxid PMN polimorfnukleáris R reperfúzió SEM Az átlag standard hibája SOL soleus TNF-α tumor nekrózis faktor alfa TRD train duration VIP vasoactive intestinal peptide 6
Összefoglalás A keringészavart követően a végtag, és adott esetben az egész szervezet sorsát, az izomzatot ért károsodás mértéke határozza meg. A biztonságosabb műtéti preparálás, a kisebb vérvesztés és a rövidebb műtéti idő érdekében a végtagsebészetben rutinszerűen alkalmazzuk a pneumatikus vértelenítés technikáját. A mai napig elfogadott elvek szerint két óra folyamatos vértelenítés megengedett, és 15-20 perces átmeneti reperfúzió (R) után az még egy órával meghosszabbítható. A műtétek utáni szövődmények hátterében a vértelenítés okozta másodlagos szöveti sérülés is állhat. Kísérleteinkben a még károsodást nem okozó vértelenítési időtartamot kerestük. Vizsgáltuk az afferens idegek szerepét és a NMJ károsodását a reperfúziós sérülésben, valamint a károsodott végtagból érkező gyulladásos választ. Állatkísérleteinkben a patkány extensor digitorum longus izmát ért károsodást a kontrakciós erő nagyságával jellemeztük fél egy és két óra ischaemiát (I) követően 1, 24, 72 és 168 órával. Fél és egy óra vértelenség után az izomerővesztés az első napot követően még fokozódik, előbbi esetben 80%-ra, utóbbiban 50 %-ra csökken. Az izomerő a fél órás I után egy héttel már újra teljes, míg egy óra I után egy héttel a regeneráció még nem mutatkozik. Két óra I után alig mérhető a vizsgált tartományban izomkontrakció. Szelektív deafferentáció (peptiderg rostok kapszaicinnel történő kikapcsolása) után a két óra I okozta izomerő veszteség szignifikánsan kisebb, mint ép szenzoros rostok mellett. A vértelenség és a deafferentáció csak a kezelt oldal izomerejét változtatta meg. Ha indukált gyulladással kombináljuk a reperfúziós sérülést, akkor az ellenoldalon is izomerő csökkenés jelentkezik, és a deafferentáció protektív hatása sem érvényesül. A NMJ ultrastruktúrájának elemzésével megállapítottuk, hogy az ischaemiát követően a preszinaptikus struktúrák elváltozása jelentős, az axon-terminális sérül, helyét Schwann sejtek nyúlványai foglalják el, míg a posztszinaptikus membrán változatlan marad. Az elváltozások az első órák után tovább súlyosbodnak, viszont az első hét végére már regeneráció jelei láthatóak. A szelektív deafferentáció hatására a NMJ regenerációja késlekedik. Átlag egy órás vértelenítéssel járó kis szövetkárosítást okozó felső végtagi műtéteken átesett betegeknél 10 perc R után polimorfnukleáris sejt szekvesztrációt, 24 óra R után a nagy műtétekre jellemző IL-6 koncentráció emelkedést találtunk. A vértelenség után 48 órával EMG vizsgálattal az alkaron szignifikáns idegvezetési 7
sebesség csökkenést mutattunk ki, mely 30 nap után sem normalizálódott minden esetben. Vizsgálataink szerint fél óra vértelenítés egyébként egészséges szervezetben már kimutatható de egy héten belül múló elváltozásokat okoz. Az egy és két órás vértelenség hatása minőségileg más. A két óra vértelenség utáni izomerő csökkenés deafferentációval mérsékelhető. Gyulladásos környezetben a fél óra vértelenség hatása is jelentős, és az ellenoldalon is észlelhető. Már egy órás vértelenséggel járó műtétek után sejtszekvesztráció, súlyos szöveti sérülést jelző citokin koncentráció és tartós axonkárosodás mutatható ki. Ennek alapján ajánlható, hogy a vértelenségi idő egyébként intakt szöveteken az egy órát, gyulladásos környezetben a fél órát ne haladja meg. 8
Summary INJURY OF THE SKELETAL MUSCLE CONNECTED WITH THE USE OF TOURNIQUET Consequences of the disturbed bloodsupply to the limb are determined by the degree of muscles injury, which can lead to complications of the whole body. The advantages of rutinely used pneumatique tourniquet are: more safe preparation, less blood loss and shorter operating time. The commonly accepted limit for continuous tourniquet time is 2 hours, and it is allowed to use it for another plus hour after a 15-20 minute long transient reperfusion (R). The secondary tissue injury, provoked by the tourniquet itself, could be at the cause of postoperative complications. In our experiments we tried to determine duration of tourniquet, which is harmless. We investigated the role of the afferent neurons and the damage of NMJ in reperfusion injury, as well as the systemic inflammatory response generated in the affected limb. In our animal model the injury of the extensor digitorum longus muscle was characterized by the loss of contractile force after ½, 1 and 2 hour (h) of ischemia (I) and 1, 24, 72 and 168 h of reperfusion (R). The loss of muscle contraction force after ½ and 1 h ischemia was more impaired after the first day of reperfusion, the worst values are 80 % and 50 % respectively. After a week of reperfusion the recovery of the muscle contraction force of ½ h ischaemia group was complete, but there was no restoration in the group of 1 h ischemia. There was no measurable muscle contraction force after 2 h ischemia. The loss of contractile force after 2 h ischemia is significantly reduced after selective deafferentation (i.e. blocking the peptidergic fibers by capsaicin pretreatment). We did not find any effect of ischaemia/reperfusion, with or without deafferentation, on the muscle contraction force of the contra-lateral side. Reperfusion injury, combined with artificial inflammation, caused loss of muscle contraction force in the contra-lateral side and the protective effect of deafferentation could not develop. Analyzing the ultrastructure of NMJ after ischemia/reperfusion we found significant damage of presynaptic elements, the axon terminal was fragmented and replaced by Schwann cells, while the postsynaptic membrane remained intact. The above changes got more aggravated after the first hour, but there were signs of regeneration at the end of first week. The regeneration of MNJ was delayed after selective deafferentation. We found sequestration of polymorphonuclear cells after minor surgery of upper limb in humans operated by 1 9
hour long tourniquet at 10 minutes reperfusion. We also found elevated IL-6 concentration after 24 hour, which is characteristic for major operations. The NCV of the forearm decreased significantly 48 hours after the use of tourniquet and even it was not normal after 30 days in most cases. We have shown that 30 minutes long tourniquet provokes measurable, but within a week reversible changes even in healthy organisms. The effects of tourniquet lastin for one and two hours are different in quality. The loss of muscle contraction force after 2 hours tourniquet can be reduced by selective deafferentation. The effect of half hour ischemia in inflamed milieu is significant and can be observed even in the contra lateral side. One hour tourniquet ischemia and reperfusion can elicit cell sequestration elevated cytokine concentrations, characteristic for tissue damage and long lasting axonal damage. We recommend that tourniquet time should not be longer than 1 hour at intact tissues and only 30 minutes in inflamed milieu. 10
Bevezetés A végtagok keringéskárosodását követően a végtag, és adott esetben az egész szervezet sorsát az izomzat károsodása határozza meg. A XX. század utolsó negyedére a kis és nagyvégtag replantáció, a revascularizáció, az érnyeles szövetátültetés rutinszerűvé váltak. A végtagsebészetben a biztonságosabb preparálás, a kisebb vérveszteség, a rövidebb műtéti idő érdekében 50 éve elterjedt a mesterséges keringészavar, a tourniquet vértelenítés technikája. Az 1980-as évekig felhalmozott tapasztalatok alapján, a mai napig oktatott alkalmazási előírások szerint a vértelenítés megengedhető maximális ideje 2 óra, melyet 15-20 perc (felengedés) reperfúzió után további 1 órával szabad kiegészíteni (81). Az addigi ismeretek szerint a két óránál rövidebb keringészavarnak nem volt sem átmeneti, sem tartós szisztémás hatása. E felfogás szerint normotermiás körülmények között a végtagok különböző szöveteinek maximális ischaemia tűrő képessége a következő: izomzaté 4 óra, perifériás idegé 8 óra, zsírszöveté 13 óra, bőré 24 óra a csonté 96 óra, mert a bekövetkező károsodások hosszútávon reverzibilisek (10). Erre alapozva a mozgásszervek sebészetében a Magyarország és a világ számtalan ortopéd-traumatológiai osztályán naponta többször alkalmazzák a vértelenséget, melyről pontos országos adat nem áll rendelkezésre. A HMÖ Egri Markhot Ferenc Kórház 70 ágyas Traumatológiai és Kézsebészeti Osztályán 2001. január 1. és 2004. december 31. között 2225 műtétnél alkalmaztunk fél óránál rövidebb, míg 1973 műtétnél fél óránál hosszabb vértelenséget. Klinikai tapasztalat, hogy a betegek egy részénél a korai posztoperatív szak szövődménymentessége, a végtag makrocirkulációjának kifogástalan volta ellenére elhúzódó végtagödéma, fájdalmasság, paresthesia, izomgyengeség, nehezen magyarázható sebgyógyulási zavar, vagy csak hosszú hónapok alatt javuló reflex sympaticus distrophia alakulhat ki. E szövődmények lehetséges okaként a felhelyezett kötések szorossága okozta keringéskárosodás, azaz a reperfúziós szöveti sérülés Volkmann munkássága óta ismert (103). A perifériás ideg, az izomzat és az egész végtag vértelenítés utáni működészavarait a leszorító mandzsetta direkt nyomására is visszavezették. A XX. sz. utolsó évtizedében fordult a gyógyítók és kutatók figyelme a két óránál rövidebb ischaemia káros következményei felé. A különböző szöveti sérülések kombinálódhatnak is. A már eleve keringéskárosodott, toxikus ártalomnak 11
kitett, gyulladásos vagy idegműködésében sérült szövetek ischaemia toleranciája lényegesen eltérhet a fiatal, egészséges szervezet szöveteinek tűrőképességétől. A doktori értekezésben összefoglaltam kutató munkám azon eredményeit, melyeket 2 óránál nem hosszabb keringészavar hatására észleltünk egészséges, gyulladásos, vagy deafferentált végtagokon. Eredményeink a jelenleg érvényes szakmai ajánlásokban szereplőknél rövidebb ideig, maximum fél - egy óráig tartó mesterséges ischaemia használata mellett szólnak. Az irodalmi háttér bemutatásakor elsősorban azokra az elváltozásokra szorítkozom, melyeket két óránál rövidebb ischaemiát követően találtak. A pneumatikus vértelenítés technikája 50 éves múltra tekint vissza (13). Használata ma sem egységes. Egyes ajánlások szerint a megfelelő vértelen műtéti terület biztosításához a mandzsetta szükséges nyomása combon a szisztolés vérnyomás érték háromszorosa, felkaron a kétszerese. Mások szerint az alsó végtagon maximum 400, felsőn maximum 200 Hgmm az elfogadott nyomás, illetve a szisztolés vérnyomás felett maximum 100-120 Hgmm-s túl -nyomás alkalmazása biztonságos bármely végtagon. Abban egységes az irodalom, hogy szélesebb mandzsettával kisebb nyomás alkalmazása is elegendő, de a lábszárra illetve az alkarra tett mandzsetta nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket (8, 21, 61, 63). A tourniquet technikával létrehozott keringés zavar a keringés teljes leállását jelenti, ami ha átmeneti időre is de az amputációval egyenértékű, mert minden más esetben - érelzáródás, lekötés, lefogás, érsérülés, szubtotális amputáció kapcsán - valamilyen collaterális keringés megmarad, ami a szövetek túlélése szempontjából jelentős de nem standardizálható körülményt jelent (saját munkacsoportunk nem publikált adata). A károsodás valójában a keringés helyreállása után kezdődik. A szabadgyökök képződése már 10 perc ischaemia után kimutatható, és 2 órás keringésleállást követően maximális szintet ér el (14). A szabadgyökök megjelenésével párhuzamosan a complement rendszer aspecifikus aktiválódása is megtörténik, mely a PMN sejtek letapadását provokálja (84). A legújabb eredmények szerint az oxigén hiányában az endothel felszínén neoepitope jelenik meg, melyhez IgM típusú antitest kötődik már az ischaemia alatt, és ez az antigén antitest complexum a reperfúzió során vezet a complement aktiválódáshoz (18). Mindez a korai reperfúzió - számos kóros, pozitív visszacsatolású folyamatot indít be, melyek membránkárosodásokhoz, a polymorfnukleáris (PMN) sejtek és thrombocyták kitapadásához, aktiválódásához, gyulladásos mediátorok és interstitialis ödéma képződéséhez vezetnek, miáltal a 12
szövetkárosodás napokig súlyosbodik. Ezt nevezzük késői reperfúziónak. A regeneráció az első hét végén már egyértelműen észlelhető, de a 4. hét végére sem mindig teljes.(25, 80, 90, 97) A mai napig sem egyértelmű, hogy a keringéskárosodott területen a reperfúzió során észlelhető jelenségek: az endothel károsodás, az intersticiális ödéma, a fehérvérsejtek kitapadása és migrációja, a thrombocyta kitapadás és thrombusképződés közül melyik az elsődleges. A vértelenítésben térdműtött betegeken gyakrabban előforduló trombózisok miatt indított vizsgálatok során nagyobb thromboxanb2 koncentrációkat mértek, és azt találták, hogy már a reperfúzió 5. percétől emelkedés mutatható ki, és ez a venulák trombózisához vezet (106). A thromboxan szint emelkedése már 10 perc vértelenítés után kimatatható (56). Emberi izom capillárisainak endotheljén a sejtek 3-4 százalékában volt kimutatható a capillaris keringés gátját képező ödéma képződés. Ez az arány elég ahhoz, hogy kiterjedt capilláris no-reflow alakuljon ki, hiszen 20-40 endothel sejt határol egy capillarist (30). Egy órás vértelenség után 15 perccel elektronmikroszkóposan kimutatható a capillárisok falának, azaz az endothelnek a megnyílása, mely ödéma képződéshez vezet (74). A szabadgyökök mellett, velük egyidőben keletkeznek a leukotriének, melyek a PMN sejtek aktiválódásáért felelősek. Öt perccel a két óra leszorítás után a keringés károsodott végtag visszereiben és nyirokereiben a fehérvérsejt és thrombocytaszám alig fele a beáramló vér sejtszámainak (49, 55). A mastocyták károsító hatására hívja fel a figyelmet az a tanulmány, ahol 70 perc ischaemia és 24 óra reperfúzió után egészséges egerek izomrostjainak jóval nagyobb hányada károsodott, mint a genetikailag mastocyta hiányos egereké (53). Az in vivo fluorescens mikroszkópos technika bevezetése a mikrocirkuláció tanulmányozásában látványos fejlődést hozott. Láthatóvá lett, hogy elsősorban a postcapillaris venulák falán indul meg az endothelkárosodás, a fehérvérsejtek mozgásának lassulása, kitapadásuk, majd migrációjuk, a capillárisok inhomogenitása, az interstitialis ödéma képződés, de továbbra sem dőlt el, hogy a reperfúziós sérülés során mi az elsődleges kórfolyamat. (27). Hasonló modell arra is lehetőséget adott, hogy a reperfúzió első 48 órájáig megfigyelhető legyen az átjárható kapillárisok aránya. Patkány gracilis izmon 4 óra keringészavar után a reperfúzió első 8 órájáig nőtt 13
az elzáródott kapillárisok aránya és ezzel egyenes arányban az elhalt izomzat nagysága, ami ekkorra érte el a 100 %-t (75). Az izomzat károsodása sokféle paraméterrel jellemezhető. Eredeti funkciója, a kontrakcióképessége nagyon sok összetevő függvénye. A mikrokeringés mellett az izomzat energiaraktárainak feltöltöttsége és az energia felhasználási képessége, az izomrostok épsége, neuromuscularis junctio (NMJ), a motoros idegrost szerkezeti és működési integritása külön-külön, vagy akár egymással kölcsönhatásban befolyásolják a kontrakciók erejét. A reperfúziós sérülés jellemzésére és egyben gyors és lassú izomcsoportok különböző hypoxia tűrőképességének kimutatására a korai reperfúzióban észlelhető tetanusos kontrakciós erő változásokkal először Gardner foglalkozott (29). Fish (25) hasonlította össze 1, 2, 3 és 4 óra leszorítást követően a regeneráció két hét - utáni kontrakciós erőket. Rácz (80) a gyors (EDL) és lassú (SOL) izomrostok reperfúziós sérülésének sajátosságait vizsgálta. Befolyásolja az izom sérülését és ez által a kontrakciós erő nagyságát a vértelenítésre használt eszköz direkt nyomása, és a nyomás értéke is (68). A prekondicionálás nem bizonyult egyértelműen védőhatásúnak az ischaemia hatására bekövetkező haemodinamikai változásokat és az izomkontrakciós erő csökkenést illetően, de az is nyilvánvalóvá vált, hogy az izomzat és a neuromuscularis junctio különbözően reagál az ischaemiára (2, 24, 34, 43, 97, 104). Gyulladásos környezetben bekövetkező ischaemia-reperfúziós sérülés hatását tudomásom szerint még nem tanulmányozták. A gyulladáskor észlelt jelenségek, a vazodilatáció, az endothel permeábilitás fokozódás, és a PMN sejtek kitapadása és migrációjuk fokozódása a szenzoros idegek retrográd ingerlésével is kiváltható. Ezt a jelenséget nevezzük neurogén gyulladásnak (7). A hő, fájdalom és kémiai ingerek hatására az érzővégkészülékeken nem csak afferens elektromos impulzusok keletkeznek, hanem azzal egyidőben neuropeptidek választódnak ki, melyek az idegvégződés mikrokörnyezetében effektor működésszerűen a kis erek tonusát, permeábilitását, a fehérvérsejtek működését szabályozzák. A sensoros idegvégződésekben a CGRP, a substance P, a neurokinin A, a somatostatin és a VIP együtt található meg (54, 87). A mytogen hatásukkal sebgyógyulásban is szerepet játszó Neurokinin A és B, valamint a Somatostatin mintegy 50 % os érellenállás csökkentésre képes (99). Az arteriolák vasodilatációjában a CGRP a leghatékonyabb. A substance P a nagyobb arteriolákat tágítja, a CGRP hatását fokozza, a thrombocyták és a leukocyták kitapadását okozza a venulákban (73). A szenzoros idegek neuroendokrin 14
működésekor, vagy retrográd ingerlés következtében a neuropeptidek hatására jönnek létre a neurogén gyulladásra jellemző jelenségek. Ezek a kettős működésű idegrostok a peptiderg rostok (44, 92, 93). A neuropeptideknek az izomzat keringésének szabályozásában, nyugalmi állapotban, munkavégzés közben és a reperfúziós sérülés kapcsán egyaránt fontos szerepük van. (96, 102). Az oxigénhiány a peptiderg idegrostoknak ugyanúgy ingere, mint a hő és fájdalom. A reaktív hyperaemiában a CGRP szerepe nem egyértelmű (28), de az izomműködés hatására kialakuló értágulatért a CGRP a felelős (102). A vasoactive intestinal peptide (VIP) képes akár a 4 órás ischaemia szabadgyökképző és izomerő erő vesztés hatását kivédeni (100). A CGRP a perifériás idegek axon terminálisában van jelen. A neurogén gyulladás minden tünete kivédhető, a neuropeptidek hatásai felfüggeszthetőek a kapszaicin általános, vagy helyi adásával, a szelektív deafferentációval (44, 45, 92, 93). Ennek alapján feltételeztük, hogy a szelektív deafferentáció, a gyulladás neurogen komponenseinek kikapcsolása a reperfúziós sérülésre is hatással lesz. A kapszaicinnek jelen tudásunk szerint a motoneuronok működésére nincs közvetlen hatása (26). A klinikai tanulmányok a vértelenítés idegműködési zavart okozó hatását először a mandzsetta direkt nyomására vezették vissza (82, 83). Önkéntes egészséges embereken felkarra vagy alkarra helyezett mandzsettával fél óránál rövidebb ischaemiát létrehozva akciós potenciál (AP) amplitúdó és a nervus medianus lefutása mentén különböző mértékű de a leszorítás idejével közel azonos idő alatt elmúló idegvezetési sebesség csökkenést mutattak ki. A gyorsan múló károsodást a rövid leszorítási idővel, az ideg lefutása mentén észlelt különböző vezetési csökkenés változásokat a rostszerkezet (a Ranvier féle befűződések távolságának) egyenetlenségével magyarázták (35, 60). Ischaemizált patkány EDL izmán 50 perc után sikerült NMJ átvezetési zavart kimutatni úgy, hogy a n. ischiadicus vezetési sebessége, és az EDL izom direkt izomhasról történő ingerelhetősége még kifogástalan volt (39). Hypothermiával az egy óránál hosszabb ischaemia vezetési sebesség és AP amplitúdó csökkentő hatását sikeresebben lehet kivédeni az ischaemia, mint a reperfúzió alatti hűtéssel (67). Emberen, önkénteseken 20 perces felkarvértelenség után a n. medianuson 25 %-ra csökkent sensoros AP amplitúdót, 110 %-ra nyúlt sensoros AP latenciát, 160 % -ra megnyúlt sensoros AP tartamot írtak le, ami egy órán belül normalizálódott. Ugyanezen kísérletben a n. ulnaris motoros latenciája érdemben nem változott (40). A késői reperfúzióban történő elektrofiziológiai elváltozásokkal kevesebb kutató foglalkozott. A különböző nyomással (200, 300, 400 Hgmm) és különböző ideig (1, 2, 15
3 h) fenntartott alsó végtagi vértelenség elektrofiziológiai hatását patkányon 6 héten át követték (71). Azt találták, hogy a combra helyezett mandzsettától proximalisan ingerelve a lábszárizmokat elektromos működés a nagyobb mandzsettanyomástól hamarabb leáll (55, 35, 15 perc). Az elektrofiziológiai javulás lassabb, mint a klinikai. Míg az állatok négy hét után a végtaghasználatukban gyógyultnak látszottak, hat hét után is kimutathatóak a spontán denervációs potenciálok és az izmok akciós potenciáljainak károsodása. A két órás és egy órás vértelenség hatása közti különbség szignifikánsan nagyobb volt, mint a kisebb és nagyobb nyomások hatásai közti különbség. Az interleukinok gyulladásos folyamatokban betöltött szerepét, egymásra és a gyulladásos reakcióra való hatását mintegy 20 éve vizsgálják. Műtéti vagy más szöveti sérülés kapcsán az IL-1β, a TNF-α és az IL-6 kerültek a vizsgálatok középpontjába. Előbbiek okozzák a catecholamin és a prosztaglandin szint emelkedést, a lázat, a szív frekvencia fokozódását, míg az IL-6- az acut fázis fehérjék szintézisét indítja meg a májban. Az IL-6 az IL-1β és a TNF-α hatására termelődik a fibroblastokból, kerato-, és monocytákból és az endothel sejtekből (4). Az IL-6 két órával a szöveti sérülés után már megjelenik, és mennyisége arányos a végzett műtét, vagy elszenvedett sérülés kapcsán keletkezett szövetkárosodással (3). Ha 24 óra alatt nem csökken a szintje, akkor dinamikája minden más tünet, vagy paraméternél jobban és előre mutatja az esetleg bekövetkező szövődményt. (9, 22). Az IL-8 képződését az IL-1 vagy a TNF-α indítja be. Az IL-8 a PMN sejtek hatékony aktivátora, de emellett számtalan más életés kórélattani hatása ismert. Előbbiek: haematopoesis, angiogenesis, utóbbiak: mitogén hatás, szabadgyök képzés, nitrogén oxid (NO) felszabadítás, sejtfelszíni adhéziós molekulák képzése. Az osteoblastok működését közvetlen módon gátolja. Reumás gyulladásban, osteoarthritisben, psoriasisban, csont-izületi gyulladásokban, tápcsatorna gyulladásos kórképeiben az IL-8 szintje magas. A többek között a PMN sejtekben termelődő IL-10 a sejtes immunválaszt fékezi, és általában felülvezérli, gátolja a citokinek termelését. Az IL-10 nagy mennyiségben van jelen a törési, vagy más szöveti haematomákban míg az érpályában akár normális lehet a szintje (38). Súlyos sérülések után amennyiben a szérumszintje nem emelkedik, szeptikus szövődmény, több szervi elégtelenség várható (50). Az IL-12 elsősorban monocytákban termelődik, a T sejtek és a killer sejtek proliferációját és aktivitását okozza, elősegíti az interferon termelést, és gátolja az IgE 16
szintézist. Kiterjedt égési sérüléseknél a másodlagos fertőzések kivédésében bizonyított szerepe van (76). Két óra kétoldali alsóvégtagi ischaemia sertésen szisztémás tüneteket okoz. Ezek: a szérum IL-6 szintjének emelkedése, phagocyta kitapadás, fokozódó folyadéktartalom a tüdőinterstíciumban és az ebből következő romló gázcsere (36). Átlag 40 perces hasi aorta kirekesztéssel járó aneurysma műtéteken átesett betegeknél a kirekesztés után 12 órával mérték a legmagasabb IL-6 szintet és ehhez már mindig társult kimutatható ventillációs zavar is (3). Emberen térdműtétek közben alkalmazott átlag 2 órás vértelenítés felengedése után az operált végtagból és a szisztémás vénás vérmintából H 2 O 2, xantin és xantin oxidáz, glutathion és szérum-húgysav vizsgálatakor azt kapták, hogy míg a szisztémás keringésben nem észlelhető szintváltozás, a helyi vénás vérben a reperfúzió első 10-15 percében minden vizsgált anyag szintje szignifikánsan magasabb, amely emelkedés a reperfúzió 30-ik percéig mutatható ki (62). Természetesen nemcsak nemzetközi kutatócsoportok értek el eredményeket a végtag ischaemia reperfúziós sérülésének tanulmányozásában, hanem jelentős eredmények születtek magyar kutatók munkái nyomán is: Józsa két órás vértelenségi idővel járó kéz műtétek közben végzett izombiopsiák során mérséklet interstitialis ödémát és endothel sejt duzzanatot írt le, míg az izomrostokon, a szinapszisokban és a motoros idegroston nem talált érdemi elváltozást (47). Rácz és munkacsoportja a különböző típusú izomrostok ischaemia toleranciáját hasonlította össze (80). Tömböl és munkatársaik vizsgálták először a NMJ szerkezetének változását a reperfúziós sérülésben (97). Németh és munkatársai a prekondicionálás hatását vizsgálták a reperfúziós során állatkísérletben (70), míg Szokoly és munkacsoportja a hűtés hatását kutatta az ischaemia reperfúziós sérülésben (91). 17
Célkitűzések Célunk az volt, hogy meghatározzuk: 1. A vázizomzatot ért károsodás nagyságát az izom kontrakciós erejének mérésével jellemezve milyen hosszú az a vértelenítés, amelyet az egyébként egészséges patkány extensor digitorum longus (EDL) izma már szignifikáns, de gyorsan múló károsodással vészel át? 2. A szelektív deafferentálás (a neuropeptidek hiányának) hatására megváltozik-e a két óránál nem hosszabb ischaemiát követő reperfúziós szöveti sérülés patkány EDL izmán? 3. A kombinált szöveti sérülésben, a gyulladás, az ischaemia és a szelektív deafferentáció hatásai hogyan kombinálódnak? 4. Van-e kimutatható hatása a két óránál rövidebb vértelenítéssel, kis szövetkárosítással járó műtétek közben bekövetkező szöveti sérülésnek a perifériás ideg működésében, illetve a polimorfnukleáris sejtek és a gyulladásos mediátorok aktiválódásában? 18
Anyag és módszerek 1. 1 Ischaemia modell Állatkísérleteinkhez átlag 300 g-s hím Wistar patkányokat használtunk. A kísérletek minden fázisát 35 mg/kg Pentobarbital i.p. anaesthesiában végeztük. Az állatokat speciális, a mérés céljára kifejlesztett temperált padon a hátukra fektettük (Experimetria KFT, Budapest). A fél, egy és két órát tartó vértelenítést a combtőre felhelyezett standard gumigyűrűvel értük el, melyet korábbi kísérleteink során dolgoztunk ki. (Rácz 1997). A vértelenítés nyomása a gumigyűrű elaszticitásából és átmérőjéből volt számítható. Az állatok méretei és a felhelyezés különbözőségéből adóan 300 és 400 Hgmm között változott. A méréseket 1 óra illetve 1, 3 és 7 nap reperfúzió után végeztük. 1. 2. Izomkontrakció mérés A nervus ischiadicust a comb tövében 1 cm-s bőrmetszésből kipreparáltuk és bipoláris elektródára tettük. Így alkalmaztuk az indirekt ingerlést. A lábszár középső harmadában az EDL izmot 2 cm-s metszésből kipreparáltuk és az izomhas közepére bipoláris elektródát helyeztünk a direkt ingerlés céljából. A lábháton a bőrt eltávolítottuk, a retinaculum extensorumtól distálisan kipreparáltuk az EDL inát és azt erőmérőhöz rögzítettük (FSG01-típus, Experimetria Kft, Budapest). Az erőmérőt minden mérés előtt kalibráltuk. Az előkíséreltek során meghatározott 20 g előfeszítést alkalmaztunk, hogy az izom eredeti nyugalmi feszülésének megfelelő helyzetben legyen. Az ingerlés paraméterei a következők voltak: frekvencia: 75 Hz, áramerősség: 9 ma, impulzus szélesség: 1 ms, TRD: 3 s. Ezek a paraméterek a kétszeres rheobasisnak feleltek meg és supramaximális erősségűek voltak. Direkt és indirekt ingerlést egyaránt alkalmaztunk. Izometriás tetanusos kontrakciókat mértünk, mindkét oldalon mindkét ingerlés fajtából ötöt-ötöt. A regisztrátumot számítógépes program segítségével rögzítettük és értékeltük (Experimetria Kft. Isosys software). A károsított oldal erejét mindig a károsodást nem mutató másik oldal erejéhez viszonyítottuk. (1. 1. 1. ábra) 19
1. 1. 1. ábra Patkány EDL izom kontrakciós-erő regisztrátum 1 óra ischaemia és 72 óra reperfúzió után indirekt ingerléskor kontrakciós erő gramban 100 80 60 40 20 0 1 1200 2399 3598 4797 5996 7195 8394 9593 ingerlés 3 másodpercenként kezelt, bal oldal kezeletlen, jobb oldal 1. 1. 1. ábra: izometriás tetanuszos kontrakció regisztrátum-képe. A kezeletlen jobb és a kezelt bal oldalról egyidőben készítve (Isosys Software, Experimetria) egy óra I és 72 óra R után indirekt ingerléskor 20 g-os előfeszítést alkalmazva. 2. 1. Szelektív deafferentálás A peptiderg rostok kikapcsolása céljából feltártuk a kezelt, bal alsó végtag n. ischiadicusát a comb tövében és kapszaicin 1% s oldatával átitatott 10 x 10 x 5 mm-s spongostan szivacsot helyeztünk köré fél óra időtartamra (Jancsó 1967). 30 perc után a sebet kiöblítettük és zártuk. A további kísérleteket egy hét elteltével végeztük. 2. 2. Izomkontrakció mérés szelektív deafferentálás után A vértelenítés és a reperfúziós idők azonosak voltak az 1. 1. pontban leírtakkal, az izomkontrakciós erő mérése pedig az 1. 2. pontokban leírtak szerint történt. Az 1. és 2. csoportban 6-6 állaton, 5-5 mérést végeztünk. 3. Indukált gyulladásos és reperfúziós szöveti sérülés együttes hatásának vizsgálata szelektív deafferentáció után 3. 1. Gyulladás indukció és kontrakciós-erő mérés A gyulladást a bal lábszár középső harmadának elülső felszínén a bőr alá (nem izomba) fecskendezett 0,25 ml/kg terpentin (Budalakk) oldattal provokáltuk. A terpentin dózisát és beadásának idejét egyrészt irodalmi adatokból másrészt előkísérletek során határoztuk meg (Urban 1979, Baumgartner 1982). Amennyiben ezt deafferentálással kombináltuk akkor azt a 2. pontban leírtak szerint egy héttel korábban elvégeztük. 20
Deafferentációval és ischaemiával kombinálva a kapszaicin kezelés egy héttel korábban, a leszorítás pedig közvetlen a terpentin befecskendezése után történt. Fél, illetve 2 órás leszorítás után 6, 24. 72, 168 órával mértük az 1. 2. pontban leírtak szerint az izomkontrakció nagyságát. Mivel itt a nem kezelt oldalon is észleltünk kontrakcióserő csökkenést, ezért minden mérési eredményt a semmilyen kezelést nem kapott kontroll állatok adataihoz hasonlítottunk. 3. 2. Fénymikroszkópos szövettani vizsgálatok A 3. 1. pontban leírt mérések után az EDL izmot 4 %-s pufferolt formaldehid oldatban fixáltuk, haematoxillin-eosinnal festettük, és 40 x-s nagyítás mellett értékeltük az elváltozásokat. Az észlelt elváltozásokat súlyosságuk szerint három fokozatra osztottuk. Ezek leírása az eredmények fejezetben található. 4. A NMJ elektronmikroszkópos szerkezetének vizsgálata ischaemia és deafferentációt követő ischaemia után A NMJ szerkezetét a 6 kontroll, 6 csak kapszaicinnel kezelt és a különböző ischaemiareperfúziós kategóriákban 3-3 állaton vizsgáltuk. Az állatok alsó végtagjait az aortán keresztül előbb 100 ml fiziológiás sóval, majd 200 ml jéghideg 4 % paraforlmaldehid és 2,5 % -s glutáraldehyd 0,1 M Nátrium-foszfát puffer (ph 7,4) oldatával perfundáltuk. A kivett mintákat további 24 óráig a perfúzióhoz használt oldatban, négy fokon, majd a továbbiakban, a végleges feldolgozásig 0,1 M Nátrium-foszfát pufferben mínusz 18 o C-n tároltuk. Fénymikroszkópos feldolgozással választottuk ki a NMJ-ban gazdag területeket és abból 0,02 mm vastag darabokat szeltünk, amiket további 2 óráig 4 C -n 1% -s OsO 4 ban posztfixáltunk, dehidráltunk, majd Durcupan-ba ágyaztunk. A keletkezett blokkokból 0,5 μm vékony szeleteket készítettünk. A NMJ struktúráját 12000 x nagyítás mellett értékeltük. Az értékelés szempontjai a következők voltak: (i) a szinaptikus gödör térfogatát milyen arányban tölti ki a Schwann sejt, (ii) a postszinaptikus és a preszinaptikus membrán felszínek hogyan aránylanak egymáshoz. A számításokat a következők szerint végeztük: (i) a szinaptikus gödör térfogatát az axon-terminalis térfogata (V ax ) és a Schwann sejt térfogata adta (V Sch ). A Schwann sejt relatív térfoglalását [R(V) Sch ] a következő képlet szerint kaptuk: R(V) Sch = V Sch / (V Sch + V ax ). (ii) a poszt- és preszinaptikus felszínek arányát [R(S) pp ] a következők szerint határozzuk meg: A 21
szinaptikus gödör alakja a kezelések hatására nem változott, így a posztszinaptikus membrán felszínét (S post ), a vele szembenéző, de tőle eltávolodott axonterminalis Schwann sejt által le nem fedett membránfelszínhez (S virt ) hasonlítottuk (R(S) pp = S post /S virt ). 1. 1. 2. ábra) Ezeket a háromdimenziós paramétereket az erre kifejlesztett pontszámlálós és rácsvonal technikákkal határoztuk meg (Gundersen 1988). pre virt Sch Sch m AT s v m AT V V AT a post b post 1. 1. 2. ábra. Vázlatos rajz az egészséges (a), és az ischaemia reperfúzió hatására megváltozott szinapszisról (b). AT: axon terminális (fehér), Sch: Schwann sejt (szürke), V: vacuolum, SV: szinaptikus vesiculum, m: mitokondrium, post: posztszinaptikus membrán, pre: preszinaptikus membrán, virt: a posztszinaptikus felszínnel szemben fekvő Schwann sejt által le nem fedett membránfelszín 5. Elektrofiziológiai vizsgálatok A vértelenítés okozta ischaemia és nem a vértelenítő mandzsetta nyomásának kimutatható károsító hatását kerestük, ezért a méréseket olyan szakaszon végeztük, amelyek teljes egészükben a leszorító mandzsettától az ujjvégek felé estek. A vizsgálatokba 30-70 perc (átlag 48 perc) közötti felkari vértelenséggel járó elektív műtéteken átesett betegeket vontunk be. A részvétel írásbeli felvilágosítás és beleegyezés után önkéntes volt. A műtéteket a MH KHK Baleseti Sebészeti Osztályán és a HMÖ Egri Markhot Ferenc Kórházának Traumatológiai és Kézsebészeti Osztályán végeztük. A 15 beteg, akiknek átlagéletkora 51 év volt (42-64), kis szövetroncsolással járó műtéteken estek át, melyek aponeurectomia, tendolysis voltak. A vértelenséget általában a szisztolés vérnyomás értékének kétszeresére állítottuk be, átlagértéke 290 22
Hgmm (250-320) volt. A műtéteket axillaris plexus anaesthesiában végeztük. Mértük a nervus ulnaris, és/vagy nervus medianus könyök és csukló közötti vezetési sebességének (NCV) és akciós potenciál (AP) amplitúdójának, és a distális latenciának (DL) változását a vértelenítésben végzett végtagon műtét előtt és utána 2, illetve 30 nappal. A distalis felületi mérő elektróda a hypothenaron illetve a thenaron volt. Az eredményeket számítógépen értékeltük és rögzítettük (Cadwell Sierra EMG/EP, USA, 2001). 6. Klinikai laboratóriumi paraméterek, gyulladásos mediátorok mérése 6. 1. A vizsgálatba bevont betegek Olyan elektív műtéteket választottunk, ahol műtét során izomszövetet nem károsítottunk mechanikusan, a beteg a vizsgálat előtt egy hétig és a vizsgálat alatt gyulladás-gátlót vagy véralvadás-gátlót nem kapott. A beavatkozások: aponeurectomia, tendolysis, partialis synovectomia voltak, melyek az irodalomban elfogadottan a kis szövetkárosító hatású beavatkozások közé tartoznak (Cruickshank 1990). Egyes anaestheticumok, mint a Propofol is rendelkezhetnek antioxidáns hatással (Kahraman 1997, Cheng 2002), ezért csak vezetéses (axillaris) érzéstelenítésben végzett műtéteket vontunk be a vizsgálatba (az anaestheticum dózisa szokványosan 20 ml 1% Lidocain és 20 ml 0,75 %-s Naropin). A műtéteket a HMÖ Egri Markhot Ferenc Kórházának Traumatológiai és Kézsebészeti Osztályán végeztük. Betegeink életkorát, nemét, a műtét okául szolgáló diagnózist és a felkar-vértelenítés idejét az 1. táblázat tartalmazza. 23
beteg kora, neme diagnózis vértelenség ideje 58 éves M. Dupuytren 55 49 éves M. Dupuytren 60 64 éves M. Dupuytren 45 47 éves Contractura digitorum 35 42 éves Tenosynovitis chr. 35 64 éves M. Dupuytren 35 59 éves M. Dupuytren 70 54 éves Tenosynovitis chr. 70 59 éves M. Dupuytren 70 1. táblázat. A vérkép, vérgáz, nekroenzim és citokin Koncentráció vizsgálatokba bevont betegeink adatai A kutatási program megfelelt a vonatkozó Dekrétumoknak, és a Kórházi Etikai Bizottság elvárásainak. A betegek tájokoztatás után írásbeli beleegyezésüket adták a vizsgálatokhoz. 6. 2. A vértelenítés A leszorítást a felkarra helyezett 8 cm széles mandzsettával, a szisztolés vérnyomás kétszeresével idéztük elő. Úgynevezett elevációs vértelenséget használtunk, azaz a mandzsetta felfújása előtt a végtagot 3 percre felemeltük, hogy a vénák spontán kiürüljenek. A vértelenségi időt gondosan mértük. Az átlag vértelenítési idő 53 perc (min: 35, max: 70 perc) volt. A vértelenítő nyomást a szisztolés vérnyomásérték kétszeresére állítottuk be így értéke 250-320 Hgmm között változott. 6. 3. Vérvételek A vértelenítő mandzsetta felfújása előtt közvetlenül és leeresztése után 10 perccel az érintett végtag cubitális, vagy radiális artériájából és cubitális vénájából vettünk vért. 24 és 48 óra után az operált végtag cubitális vénájából ismét vérmintákat vettünk. Vérvételenként 4,5 ml EDTA-s és 7 ml natív vért vettünk le (BD Vacutiner Systems, Plymuth, UK), ezenkívül vérgázanalízishez 2-2 ml (0,5 % -nyi Nátrium-Heparinnal 24
kevert) vérre volt szükség. A vérgázalanalízishez levett vért azonnal légmentesen lezártuk és a méréseket 10 percen belül elvégeztük. A natív vérből a savót lecentrifugáztuk (3000 ford/perc 10 percig) majd 2 x 0,5 ml savót eppendorf csőben mínusz 80 o C ra lefagyasztottunk a flow-citometriás mérésekhez. A többi vizsgálat a vérvételt követő 4 órán belül megtörtént az addig szobahőmérsékleten tárolt vérből. 6. 4. Vizsgált paraméterek vérgázanalízis, vércukor, szérum-na +, K +, hemoglobin, haematocrit, vörösvértest szám, fehérvérsejt szám, (ezen belül segment-, stab-, granulocyta, monocyta, lymphocyta basophyl-sejt és monocyta szám) thrombocyta szám, C-reaktív protein (CRP), kreatinin-kináz, laktát-dehydrogenáz, szérum glutaminsavoxalecetsav-transzamináz, szérum glutaminsav-phosphorsav-transzamináz, interleukinok (IL-1b, IL-6 IL-8, IL-10, IL-12), TNF-α. 6. 5. Labortechnikai módszerek A vérkép vizsgálatok Sysmex XE 2100 automatán történtek, a minőségi vérképet Romanovszky festés után 100x nagyítás mellett Wescor automatán történő leolvasással határoztuk meg. Kémiai vizsgálatokat Bayer ADVIA 1650 automatán, a vérgáz vizsgálatokat Bayer Rapidlab 865-típusu vérgázanalizátorral végeztük. Az egyes mintákban az IL-1b, IL-6 IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α citokinek koncentrációját multiplex technikával FACS Array (Becton-Dickinson, USA) flowcytométerben (MH EVI) határoztuk meg CBA Human Inflammation Kit (Becton- Dickinson, USA) felhasználásával. Statisztikai értékelés Az izomkontrakció méréseknél, ahol leszorítást és/vagy deafferentációt alkalmaztunk a statisztikai értékelésnél független változók voltak a kapszaicin előkezelés (0 vagy +) az ischaemia hossza (fél, 1 vagy 2 óra) a reperfúzió időtartama (1 óra és 1, 3, vagy 7 nap), valamint az ingerlés típusa (direkt, vagy indirekt). Függő változó volt a bal (kísérleti) oldali EDL izom kontrakciós ereje a nem kezelt jobb oldali izom erejének százalékában kifejezve. Az indukált gyulladás és ischaemia kombinálásával kapott izomkontrakciós erő eredményeit az átlag SD (4-4 állat/csoport) alakban jelentettük meg. A normál 25
eloszlás ellenőrzése után két csoport összehasonlítását Student-féle t-teszttel, míg több csoport összehasonlítását ANOVA és Student-Newman-Keuls módszerrel végeztük. A statisztikai értékelésre a Statistica programot (6.0 verzió Stat-Soft, USA) használtuk variancia analízissel (Anova teszt). Az utólagos hipotézisek vizsgálata (post- hoc tesztként) Tukey HSD teszttel történt. Az indukált gyulladás vizsgálati csoport kivételével az adatokat átlag ± SEM alakban adtuk meg. Amennyiben az adatok nem normál eloszlásúak voltak, akkor Kruskal - Wallis tesztet alkalmaztunk (elektrofiziológiai vizsgálatok). Az elektronmikroszkópos vizsgálatok quantitativ értékelésénél a kontroll csoportban a normál eloszlást a Kolgomorov Smirnov teszttel ellenőriztük. A kezelt és nem kezelt szinapszisokon talált elváltozásokat a Student-féle t-teszttel hasonlítottuk össze. A kapott eredményeket p <0,05 esetén tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. 26
Eredmények 1. Izomkontrakció mérés különböző leszorítási idők után A kezelésben nem részesült állatok EDL izmának ereje mindkét oldalon mindkét fajta (direkt és indirekt) ingerléskor 65 g (± 5) volt, a 20 g-os előfeszítési érték felett. Mivel az egyoldali ischaemia az ellenoldalon kontrakciós-erő változást nem okozott a kezelt oldalon mért értékeket az egészséges oldalhoz hasonlítottuk, és százalékban fejeztük ki. 1. 2. 1. Izomerő fél óra ischaemia után Az első 24 órában alig volt mérhető izomerő veszteség az ingerlés módjától függetlenül. 72 óra reperfúzió után találtuk a leggyengébb, szignifikánsan csökkent erőt, az eredetinek 82%-t, míg 168 óra reperfúzió után az izomerő normalizálódott. Az ingerlés módja szerint nem volt különbség a csoportok között (1. 2. 1. ábra). 1. 2. 1. ábra. Izomerő az ellenoldalhoz képest fél óra leszorítás után 100 80 * % ± SEM 60 40 20 indirekt ingerlés direkt ingerlés 0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap reperfúziós idő 1. 2. 1. ábra. Az EDL izom kontrakciós ereje az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) fél óra tourniquet ischaemia valamint 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió után Szürkecsíkos oszlop: indirekt ingerlés Feketepöttyös oszlop: direkt ingerlés * : szignifikáns különbség az ép és a kezelt oldal között (p <0,05) 1. 2. 2. Izomerő egy óra ischaemia után Minden reperfúziós időben mindkét ingerléssel szignifikáns izomerő csökkenés mérhető. Egy óra illetve 3 nap után az indirekt ingerlésre szignifikánsan kisebb erő mérhető. A csökkenés a 3. napig kimutatható, a legalacsonyabb érték indirekt ingerléssel 32 %, direkt ingerléssel 51 % százalék. A 7. napon már javuló érték mérhető, de a regeneráció még tovább tart (1. 2. 2. ábra). 27
1. 2. 2. ábra. Izomerő az ellenoldalhoz képest egy óra leszorítás után % ± SEM 100 80 60 40 # * * # * * indirekt ingerlés direkt ingerlés 20 0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap reperfúziós idő 1. 2. 2. sz. ábra. AZ EDL izom kontrakciós ereje az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) egy óra ischaemia után 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió elteltével Szürkecsíkos oszlop: indirekt ingerlés Feketepöttyös oszlop: direkt ingerlés * : szignifikáns különbség az ép és a kontroll érték között (p <0,05) # : szignifikáns különbség a kétféle ingerlés móddal kapott érték között (p <0,05) 1. 2. 3. Izomerő két óra ischaemia után Indirekt ingerléssel egyik időpontban sem volt mérhető kontrakció. Direkt ingerléskor a négy mérési időben 6 %, 11 %, 16%, 11 %, volt a kimutatható kontrakciós erő. Ez statisztikailag szignifikánsan több volt, mint az idegről történt ingerléskor kapott érték (1. 2. 3. ábra). A regeneráció még 4 hét után sem volt teljes (Rácz 1997). 1. 2. 3. ábra. Izomerő az ellenoldalhoz képest két óra leszorítás után 100 % ± SEM 80 60 40 # # # # indirekt ingerlés direkt ingerlés 20 0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap reperfúziós idő 1. 2. 3. sz. ábra. Az EDL izom kontrakciós ereje az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) két óra ischaemia után 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúziós időkben Szürkecsíkos oszlop: indirekt ingerlés Feketepöttyös oszlop: direkt ingerlés # : szignifikáns különbség a kétféle ingerlés móddal kapott érték között (p <0,05) 28
2. Izomerő szelektív deafferentáció és különböző leszorítási idők után A n. ischiadicus kapszaicines előkezelése önmagában nem volt hatással az EDL izom kontrakciós erejére. Ezeket a mérési adatokat nem tüntettük fel. A szelektíven deafferentált izom a vértelenítés különböző időtartamára nem egyformán reagált. Az ép, ellenoldalon nem észleltünk kontrakciós erő változást, ezért a kezelt oldal erejét az egészséges oldalhoz viszonyítottuk és az eredményt százalékban adtuk meg. 2. 1. Izomerő deafferentáció és fél óra vértelenség után Az 1 óra, 3 és 7 nap reperfúzió után lényegében ugyanolyan kontrakciós erőt mutatott a szelektíven deafferentált EDL izom, mint az egyébként ép szenzoros rostokkal bíró. Szignifikáns különbség egyedül az egy nap reperfúziónál mutatkozik, ahol az indirekt ingerlésnél a kapszaicin kezelés védőhatásúnak bizonyul. (2. 1. 1. és 2. 1. 2. ábra) 2. 1. 1. ábra EDL izom kontrakciós ereje deafferentáció és fél óra vértelenség után direkt ingerléssel 2. 1. 2. ábra EDL izom kontrakciós ereje deafferentáció és fél óra vértelenség után indirekt ingerléssel 100 100 * % ± SEM 80 60 40 20 kapszaicin 0 kapszaicin + % ± SEM 80 60 40 20 kapszaicin 0 kapszaicin + 0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap reperfúziós idő 0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap reperfúziós idő 2. 1. 1. és a 2. 1. 2. sz. ábrák. Az EDL izom kontrakciós ereje direkt ingerléskor az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) előzetes deafferentálás és fél óra tourniquet ischaemiát követően 1 órával, illetve 1, 3 és 7 nappal Fekete csíkos oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Pepita mintás oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) Kitöltött fekete oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Fekete-fehér rácsos oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) * : szignifikáns különbség a kapszaicinnel kezelt és nem kezelt csoport között (p <0,05) 29
2. 2. Izomerő deafferentáció és egy óra vértelenség után A kapszaicinnel kezelt csoportban direkt ingerléskor 3 és 7 nap reperfúzió után, indirekt ingerléskor 1 és 7 nap reperfúzió után mintegy 30 % -al gyengébb volt a kontrakciós erő, mint a nem kezelt csoportban. (2. 2. 1. és 2. 2. 2. ábra) 2.2.1.ábra EDL izom kontrakciós ereje deafferentáció és egy óra vértelenség után direkt ingerléssel 2. 2. 2. ábra EDL izom kontrakciós ereje deafferntáció és egy óra vértelenség után indirekt ingerléssel 100 80 100 80 % ± SEM 60 40 20 * * kapszaicin 0 kapszaicin + % ± SEM 60 40 20 * * kapszaicin 0 kapszaicin + 0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap 0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap reperfúziós idő reperfúziós idő 2. 2. 1. és 2. 2. 2. sz. ábrák. EDL izom kontrakciós ereje indirekt ingerléskor az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) előzetes deafferentálás és egy óra tourniquet ischaemia, valamint 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió után Fekete csíkos oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Pepita mintás oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) Kitöltött fekete oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Fekete-fehér rácsos oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) * : szignifikáns különbség a kapszaicinnel kezelt és nem kezelt csoport között (p <0,05) 2. 3. Izomerő deafferentáció és két óra vértelenség után A deafferentált izom ereje mindkét ingerlési mód alkalmazásakor szignifikánsan több volt, mint ép szenzoros rostok mellett. Direkt ingerléskor az 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió után az ép oldal erejéhez viszonyítva: 22%, 15%, 28%, 38 %, illetve indirekt ingerekre: 24%, 16%, 14%, 35% (2. 3. 1. és 2. 3. 2. ábra). 30