KÉSZÍTETTE: BALOGH VERONIKA ELTE IDEGTUDOMÁNY ÉS HUMÁNBIOLÓGIA SZAKIRÁNY MSC 2015/16 II. FÉLÉV

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "KÉSZÍTETTE: BALOGH VERONIKA ELTE IDEGTUDOMÁNY ÉS HUMÁNBIOLÓGIA SZAKIRÁNY MSC 2015/16 II. FÉLÉV"

Tivadar Boros
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 KÉSZÍTETTE: BALOGH VERONIKA ELTE IDEGTUDOMÁNY ÉS HUMÁNBIOLÓGIA SZAKIRÁNY MSC 2015/16 II. FÉLÉV

2 TÉNYEK, CÉLOK, KÉRDÉSEK Kísérlet központja Neuronok és réskapcsolatokkal összekötött asztrocita hálózatok közötti GABAerg transzmisszió Elektrofiziológiai tulajdonságai Funkcionális szerepe Hipotézis GABA indukált Cl - mozgás (a [Cl - ] EC modulálása által) befolyásolja (fenntartja) a GABAerg transzmisszió hatását Az asztro GABA A R-ok ellensúlyozzák a posztszinaptikus GABA A R-ok, valamint a preszinaptikus és asztrocita GABA transzporterek általi [Cl - ] EC regulációját A réskapcsolatok kiegyenlítik az asztro hálózaton belüli ion koncentrációkat Cél A pre- és posztszinaptikus neuronok és asztrociták interakciójának feltárása az asztrociták szinaptikus Cl - viszonyaiban való részvételének becslésére

ellensúlyozzák a posztszinaptikus GABA A R-ok, valamint a preszinaptikus és asztrocita GABA transzporterek általi [Cl - ] EC regulációját A réskapcsolatok kiegyenlítik az

3 ANYAG ÉS MÓDSZER GAD67-GFP knock-in (GAD67 +/GFP ) egerek 350µm vastag hippokampális agyszeletek GABA B R-blokkoló (CGP55845, 3µM) az ACSF-ben CA1 asztrociták SR101 fluoreszcens festékkel megjelölve Whole cell patch clamp mérések GABA applikáció (1mM vagy 50µM) Cl - imaging Farmakológia

CA1 asztrociták SR101 fluoreszcens festékkel megjelölve Whole cell

4 EREDMÉNYEK

5 GABA APPLIKÁCIÓVAL KIVÁLTOTT ÁRAMOK GABA A R ÉS MGAT4 ÁLTAL MEDIÁLTAK Kísérleti felállás a GABA-indukált és Cl - áramok komponenseinek meghatározására GABA applikáció Whole cell voltage clamp mérés CA1 asztrocitákból GABA A R-blokkolók (picrotoxin és bicucculine) Specifikus GAT-inhibitorok (SNAP5114 [mgat4] és SKF89976a, NO711 [GAT1])

applikáció Whole cell voltage clamp mérés CA1 asztrocitákból GABA A R-blokkolók

6 GABA APPLIKÁCIÓVAL KIVÁLTOTT ÁRAMOK GABA A R ÉS MGAT4 ÁLTAL MEDIÁLTAK

7 GABA APPLIKÁCIÓ KÉTIRÁNYÚ CL - ÁRAMOT INDUKÁL GABA A R-ON ÉS MGAT4-EN KERESZTÜL CA1 ASZTROCITÁKBAN Kísérleti felállás a GABA-indukált [Cl - ] IC változások vizsgálata GABA applikáció Whole cell voltage clamp mérés CA1 asztrocitákból Cl - imaging MEQ fluoreszcens indikátorral

GABA-indukált [Cl - ] IC változások vizsgálata GABA applikáció Whole

8 GABA APPLIKÁCIÓ KÉTIRÁNYÚ CL - ÁRAMOT INDUKÁL GABA A R-ON ÉS MGAT4-EN KERESZTÜL CA1 ASZTROCITÁKBAN MEQ fluoreszcencia növekedése [Cl - ] IC csökkenése MEQ fluoreszcencia csökkenése [Cl - ] IC növekedése

9 INTERNEURON TÜZELÉSSOROZAT GABA A R-MEDIÁLT ÁRAMOKAT INDUKÁL SZOMSZÉDOS ASZTROCITÁBAN Kísérleti felállás Az asztrocita GABA A R a GABA spillover hatására aktiválódnak, ezért a tényleges szinaptikus átvitelre való aktiválódásuk különbözhet a korábbi GABA applikáció hatásaitól Periszinaptikus asztrociták vizsgálata Kettős whole cell voltage clamp mérés CA1 interneuron-asztrocita párokból Stratum lacunosum-moleculare-ban vagy annak stratum radiatummal közös határán Stimulus: 500pA 50Hz 2s egyedi interneuron tüzelése által kiváltott áramok a szomszédos asztrocitából

Periszinaptikus asztrociták vizsgálata Kettős whole cell voltage clamp mérés CA1 interneuron-asztrocita párokból Stratum

10 INTERNEURON TÜZELÉSSOROZAT GABA A R-MEDIÁLT ÁRAMOKAT INDUKÁL SZOMSZÉDOS ASZTROCITÁBAN I inh-astro = inhibitory synapsedriven astrocytic currents

11 A GABA A R-OK A SZINAPTIKUS RÉSHEZ KÖZELEBB LOKALIZÁLTAK, MINT AZ MGAT4 TRANSZPORTEREK Kísérleti felállás A GABA A R-ok és mgat4 transzporeterek különböző lokalizációja? I inh-astro vizsgálata 20-40µM NO711-ben előinkubált szeletekben gátlódik a neuronális GABA-uptake (GAT1)

transzporeterek különböző lokalizációja?

12 A GABA A R-OK A SZINAPTIKUS RÉSHEZ KÖZELEBB LOKALIZÁLTAK, MINT AZ MGAT4 TRANSZPORTEREK

13 A RÉSKAPCSOLATOK KONDUKTANCIÁJA SEGÍT AZ I INH-ASTRO FENNTARTÁSÁBAN Kísérleti felállás_1 I inh-astro közeli (10-20µm) interneuron-asztrocita párok 89%-ában I inh-astro távolabbi (40-60µm) interneuron-asztrocita párok 40%-ában szignifikánsan kisebb amplitúdóval Lehet, hogy a GABA-mediált szignál réskapcsolatokon keresztüli terjedése miatt? Réskapcsolatokon keresztüli kommunikáció vizsgálata Réskapcsolat blokkolók (carbenoxolone [500µM] és octanol [1mM])

40%-ában szignifikánsan kisebb amplitúdóval Lehet, hogy a GABA-mediált szignál réskapcsolatokon keresztüli

14 A RÉSKAPCSOLATOK KONDUKTANCIÁJA SEGÍT AZ I INH-ASTRO FENNTARTÁSÁBAN

15 A RÉSKAPCSOLATOK KONDUKTANCIÁJA SEGÍT AZ I INH-ASTRO FENNTARTÁSÁBAN Kísérleti felállás_2 Az asztrocita GABA A R-mediált áramokhoz tartozó réskapcsolat konduktancia vizsgálata/tisztázása Lokális GABA applikáció UV laser photo-uncging módszerrel Whole cell voltage clamp mérés egy SLM asztrocitából 0.2% Lucifer sárga festék a belső oldatban az elektromos szinapszisokkal összekötött asztrociták vizualizációjára Réskapcsolat inhibitorok jelenléte nélkül 1-3 jelölt asztrocita

photo-uncging módszerrel Whole cell voltage clamp mérés egy SLM asztrocitából 0.

16 A RÉSKAPCSOLATOK KONDUKTANCIÁJA SEGÍT AZ I INH-ASTRO FENNTARTÁSÁBAN

17 A RÉSKAPCSOLATOK KONDUKTANCIÁJA SEGÍT AZ I INH-ASTRO FENNTARTÁSÁBAN Kísérleti felállás_3 Ezen GABA-indukált áramok/depolarizáció réskapcsolatokon keresztüli terjedésének oka lehet különböző ionok (pl. K + ) elektrokémiai grádiense Technikai probléma: a GABA uncaging és MEQ gerjesztési tartománya átfed Cl - imaging nem használható Páros whole cell mérések kapcsolt asztrocitákból Egyenlő holding potenciál, K + -csatorna szuppresszió (EC Ba 2+ és IC Cs + ) SR-ben 50µm távolságban

K + ) elektrokémiai grádiense Technikai probléma: a GABA uncaging és MEQ gerjesztési tartománya átfed Cl - imaging nem

18 A RÉSKAPCSOLATOK KONDUKTANCIÁJA SEGÍT AZ I INH-ASTRO FENNTARTÁSÁBAN

19 GAP JUNCTION-BLOKKOLÓK NÖVELIK AZ E IPSC K AKTIVITÁS-FÜGGŐ DEPOLARIZÁCIÓS ELTOLÓDÁSAIT Kísérleti felállás A Cl - mozgása az asztrocita hálózaton belül létfontosságú lehet a GABAerg szinapszisok [Cl - ] EC szabályozásában a GABA A R-okon keresztüli Cl - efflux által Gap junction blokkolók hatásának vizsgálata az E IPSC -re Whole cell voltage clamp mérések CA1 asztrocitákból Farmakológia: CNQX (20µm); D-AP5 (50µm); CGP55845 (3µm) IPSC-k kiváltása tetanizálással (50Hz, 2s, 100x pA) Különböző holding potenciálok (-30 és -80mV között) Octanol (1mM)

junction blokkolók hatásának vizsgálata az E IPSC -re Whole cell voltage clamp mérések CA1 asztrocitákból Farmakológia: CNQX (20µm); D-AP5

20 GAP JUNCTION- BLOKKOLÓK NÖVELIK AZ E IPSC K AKTIVITÁS-FÜGGŐ DEPOLARIZÁCIÓS ELTOLÓDÁSAIT ΔE IPSC = a 90. és 2. stimulus E IPSC je közötti különbség (szignifikáns) depolarizációs shift Oka: a Cl - gradiens változása a GABA A R-ok általi Cl - intracelluláris akkumuláció miatt

stimulus E IPSC je közötti különbség (szignifikáns) depolarizációs

21 MEGVITATÁS 1) Fiziológiásan magas [Cl - ] IC mellett a GABA applikáció kétirányú Cl - áramot indukál GABA A R-on és mgat4-en keresztül CA1 asztrocitákban (előbbin efflux, utóbbin influx GABA felvételével párhuzamosan). 2) A GABA spillover az asztrocita GABA A R-ok aktiválásával elsődlegesen Cl - effluxot indukál a szinaptikus réshez való közelebbi lokalizációjuknak köszönhetően. 3) Asztrociták közötti réskapcsolatok GABA A R-mediált áramokat is továbbítanak a GABAerg transzmisszió által mediált Cl - effluxot (így az [Cl - ] EC ) homeosztatikusan szabályozott a réskapcsolatokkal összekötött asztrocita hálózat által

Hasonló dokumentumok

-Két fő korlát: - asztrogliák rendkívüli morfológiája -Ca szignálok értelmezési nehézségei

-Két fő korlát: - asztrogliák rendkívüli morfológiája -Ca szignálok értelmezési nehézségei Nature reviewes 2015 - ellentmondás: az asztrociták relatív lassú és térben elkent Ca 2+ hullámokkal kommunikálnak a gyors és pontos neuronális körökkel - minőségi ugrás kell a kísérleti és analitikai