BEFELÉ REKTIFIKÁLÓ KLORID ÁRAM VIZSGÁLATA ASZTROCITÁN ÉS GLOMERULÓZA SEJTEN

Átírás

1 BEFELÉ REKTIFIKÁLÓ KLORID ÁRAM VIZSGÁLATA ASZTROCITÁN ÉS GLOMERULÓZA SEJTEN Dr. Makara Judit doktori (Ph.D.) értekezése Témavezeto: Dr. Spät András Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar Élettani Intézet Budapest Molekuláris orvostudományok tudományági Doktori Iskola Celluláris és molekuláris élettan program Semmelweis Egyetem

2 TARTALOMJEGYZÉK BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR 5 Az asztrocita kation csatornái 7 Az asztrocita Cl - háztartása 8 Az asztrocita anion csatornái 9 A) Ligandfüggo anion csatornák 9 B) Nem ligandfüggo anion csatornák 10 1) Sejtduzzadás hatására aktivált anion áram 11 2) Depolarizáció-aktivált anion áramok 11 3) Hiperpolarizáció-aktivált anion áram 12 Anion csatornák lehetséges élettani szerepe asztrocitában 13 A) A membránpotenciál szabályozása 13 B) KCl transzport 13 C) ph szabályozás 14 D) Klorid ionok intracelluláris szabályozó szerepe 15 E) Proliferáció és migráció szabályozása 15 F) A sejttérfogat szabályozása 16 Sejttérfogat változás hatásai a mellékvesekérgi glomerulóza sejt áramaira 17 CÉLKITUZÉSEK 19 MÓDSZEREK 20 Kísérleti preparátumok 20 A) Hosszútávú asztrocita sejttenyészet 20 B) Akut agyszelet 21 C) Glomerulóza tenyészet 21 D) Mechanikus agykérgi sérülés (szúrt seb) mutéti technikája 22 2

3 Elektrofiziológiai mérések 22 A [Ca 2+ ] c fluorimetriás mérése 25 Patch-clamp oldatok 26 A) Asztrocita tenyészet 26 B) Agyszelet 27 C) Glomerulóza tenyészet 27 D) Gátlószerek 27 Fluorimetriához használt oldatok 28 Statisztikai kiértékelés 28 EREDMÉNYEK 29 Befelé rektifikáló áram jellemzése hosszútávú patkány agykérgi asztrocita tenyészeten29 A befelé rektifikáló áram gátlószer-érzékenysége 31 A befelé rektifikáló áram töltéshordozója 33 Az intracelluláris ATP szerepe 33 A befelé rektifikáló áram ph e -érzékenysége 35 A ph e -érzékeny áramkomponens Cl - -szelektivitásának vizsgálata 37 Kétféle asztrocita típus kimutatása in situ körülmények között 39 Befelé rektifikáló áram jellemzése komplex asztrocitán in situ 41 A Cl - áram nem detektálható ClC-2 "knock-out" egérben 44 A Cl - áram expressziója csökken reaktív asztrocitában 45 Cl - és Ca 2+ csatornák vizsgálata patkány glomerulóza sejten 48 Ozmolaritás hatása a K + által kiváltott [Ca 2+ ] c jelre glomerulóza sejten 54 3

4 MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 58 Befelé rektifikáló anion áram kimutatása tenyésztett és in situ vizsgált asztrocitán 58 A befelé rektifikáló Cl - áramot létrehozó csatorna azonosítása 60 A ClC-2 áram asztrocitában játszott lehetséges szerepe 62 A) A ClC-2 áram expressziója asztrocitában változik fejlodés és reaktív transzformáció során 62 B) A ClC-2 áram szerepe a membránpotenciál alakításában 63 C) A ClC-2 áram ph e érzékenysége 64 D) A ClC-2 csatornát befolyásoló egyéb tényezok esetleges szerepe 65 A glomerulóza sejt nyugalmi anion permeabilitása 67 Sejttérfogat változások hatása a glomerulóza sejt feszültségfüggo Ca 2+ csatornáira 68 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 72 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 73 IRODALOMJEGYZÉK 74 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 87 ÖSSZEFOGLALÁS 88 SUMMARY 89 4

5 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR A glia sejtek fo típusai a központi idegrendszerben (KIR) az asztrocita, az oligodendrocita és a mikroglia. A mikroglia elsosorban az agy védekezo funkciójában játszik szerepet, az oligodendrocita pedig a KIR-ben a fo mielinképzo elemet képviseli. Az asztrocita jellemzoen csillag alakú sejt, morfológiája azonban változó lehet. Az ún. fibrózus asztrocita elsosorban a fehérállományban fordul elo, hosszú, vékony, minden irányba kiterjedo nyúlványokkal rendelkezik. A protoplazmás asztrocita elsosorban a szürkeállományban található meg, és rövidebb, elágazó nyúlványai vannak. Morfológiája mellett az asztrocitára jellenzo bizonyos intermedier filamentumok, pl. a gliális fibrilláris savas protein (GFAP) és az S100 fehérje expressziója. A sejt nyúlványai gyakran végtalpakban végzodnek, amelyek részben neuronok (elsosorban szinapszisok illetve axonok), részben pedig kapillárisok vagy az agykamrák falának közelében helyezkednek el. Az asztrociták réskapcsolatok (gap junction) segítségével kiterjedt szincíciumot alkotnak. A hálózat dinamikusan változó lehet azáltal, hogy a réskapcsolatok nyitási állapota is szabályozott. Az asztrocita nem csak egyszeru térkitölto elem, funkciói igen sokrétuek. Egyik fo feladata, hogy biztosítja az idegsejtek környezetének, az agyi interstíciumnak a homeosztázisát. Rendkívül fontos ezen belül is az idegi aktivitás kapcsán az extracelluláris térbe kerülo K + pufferelése, mivel a [K + ] e alapvetoen befolyásolja a neuronok ingerlékenységét, a K + -on kívül azonban más ionok, így pl. a Ca 2+ és H + koncentrációjának szabályozása is lényeges. Az asztrocita szinaptikus rés körül elhelyezkedo nyúlványai izolálják a szinapszist, és részt vesznek egyes neurotranszmitterek eltávolításában, meghatározva a szinaptikus résben a neurotranszmitter koncentráció alakulását és ezáltal a jelátvitel erosségét és idotartamát. A kapilláris felé nézo végtalpak a vér-agy gát alkotásában és funkcióiban vesznek részt. Az asztrocita ezenkívül szerepet játszik az idegsejtek tápanyagellátásában. A fejlodo agyban az asztroglia segíti az idegsejtek vándorlását és szinaptikus kapcsolatok kialakítását, kifejlett agyszövetben ugyanakkor az idegi sérülések kapcsán aktiválódva gliaheget hoz létre, amely betölti a keletkezett szövethiányt, megakadályozza azonban az idegnyulványok regenerálódását. 5

6 Az eddig említett klasszikus funkciókon kívül, az utóbbi évek izgalmas új eredményei szerint lehetséges, hogy az asztrociták a neuronokkal együttmuködve maguk is aktívan részt vehetnek magasabb idegi muködésekben (2). Az asztrocita számos neurotranszmitter-receptorral rendelkezik, melyek révén reagálni képes a szinapszisban lejátszódó eseményekre. A szinapszis aktiválódása során a környezo asztrocitákban a citoplazma [Ca 2+ ] c megemelkedik, és a Ca 2+ jel hullámszeruen tovaterjedhet a sejthálózatban. Mivel a [Ca 2+ ] c jel hatására az asztrocita maga is képes neurotranszmitterek kibocsátására, szoros kommunikáció alakulhat ki az asztrocita és az idegsejt között (2). Ennek a kapcsolatnak a jelentosége ma élénk kutatások tárgya. A glia sejtek elektrofiziológiai tulajdonságairól az elso ismeretek az 1960-as és 70-es évekbol származnak. Kuffler és munkatársai gerinctelen fajok központi idegrendszerében (82, 83), valamint Ransom és mtsai macska agykéregben (113) mikroelektródával végzett kísérletei azt mutatták, hogy a glia sejtek in vivo kizárólag K + -szelektív, lineáris konduktanciával rendelkeznek, és nem expresszálnak feszültségfüggo áramokat. Ez beleillett a glia sejtekrol mint passzív, nem ingerelheto, támasztó sejtekrol kialakított képbe. Az 1980-as, 90-es években a sejtspecifikus glia tenyészetek és a patch-clamp technika kidolgozása és elterjedése azonban ezt a koncepciót robbanásszeruen megváltoztatta. A nagy érzékenységu patch-clamp módszer segítségével nyilvánvalóvá vált, hogy a tenyésztett glia sejtek (különösen az asztrocita) a neuronokhoz hasonló változatosságú ioncsatorna- és receptor készlettel rendelkeznek. Ezzel megindult a glia sejtek "újrafelfedezése", szerepük feltérképezése és átértelmezése pedig az idegkutatás egyik izgalmas új területévé vált. Ma már ismert, hogy az asztrocita számos neurotranszmitter-receptorral és ioncsatornával rendelkezik, amelyek révén reagálhat a szinapszisokban, tágabb értelemben az idegsejtekben lezajló eseményekre (130, 149, 150). Az asztrocita feszültség- és ligandfüggo (receptor) ioncsatornáiról szerzett ismereteink nagy része fejlodo (embrionális vagy újszülött) agyból nyert, hosszú távon (legalább 2 hétig) tenyésztett sejtekbol származik. A sejttenyészetnek a szelettel szemben elonyei, de hátrányai is vannak. Elonye, hogy homogén sejtpopuláción dolgozhatunk, a sejtek közti kapcsolatok nem befolyásolják az egyedi sejteken végzett méréseket, az extracelluláris folyadéktér gyakorlatilag végtelen, gyorsan és tetszolegesen változtatható és a sejtek a mérés számára könnyen hozzáférhetoek. 6

7 Ugyanakkor hátránya, hogy a sejtek enzimatikus vagy mechanikus izolálása és a tenyésztés körülményeinek hatására a sejtek csatornakészlete és génexpressziója jelentosen megváltozhat. A bonyolultabb geometriájú sejtek nyúlványai az izolálás során szintén sérülhetnek. Ezen kívül a kétdimenziós tenyészetben a letapadt sejtek egymással való kapcsolatai illetve alakváltozási lehetoségei is lényegesen eltérnek a háromdimenziós in vivo vagy in situ körülményektol. Hosszabb tenyésztés során szintén megszunik a sejtekre in vivo esetleg jellemzo polarizált vagy inhomogén fehérje eloszlás. Tehát, különösen az olyan hosszú távú sejttenyészetek esetén, mint az asztrocita tenyészet is, a sejttenyészetben kapott eredmények inkább irányadónak tekinthetoek, de mindenképpen in situ megerosítést igényelnek valódi élettani relevanciájuk megítéléséhez. Ezért az asztrociták vizsgálatában az utóbbi években elotérbe kerültek az akut agyszelet preparátumok, amelyekben a sejtek hosszú tenyésztés nélkül, in situ vizsgálhatók. Az in situ végzett kísérletek sok (de nem minden) esetben megerosítették a tenyészetben nyert eredményeket, igazolva, hogy azok nem mutermék eredményei voltak. Mivel ezekben a preparátumokban a sejtek eredeti kapcsolatrendszere többé-kevésbé megtartott marad, lehetové teszik annak megismerését, hogy a neuronokkal, más glia sejtekkel vagy kapillárisokkal együttmuködve milyen integrált szerepet játszik az asztrocita az idegszövet muködésében. Az asztrocita kation csatornái Az asztrocita csatornarepertoárjának feltérképezése és az egyes csatornák meghatározott funkcióhoz rendelése eddig a kation csatornák területén volt sikeresebb (150). Különösen a K + csatornák kutatása volt intenzív, részben, mivel az in vivo is kimutatott nagy K + konduktancia felelos az asztrocitára klasszikusan jellemzonek tartott erosen negatív membránpotenciáljának kialakításában, részben, pedig, mert e csatornák fontos szerepet játszhatnak a K + ionok csatorna-mediált felvételében és leadásában. A feszültségfüggo Na + és Ca 2+ áramok kimutatása különbözo asztrocita preparátumokon szintén nagy érdeklodést váltott ki, mivel ezek a csatornák fontos szerepet játszanak az ingerlékeny sejtek akciós potenciál-képzésében és a sejtek Na + - és Ca 2+ háztartásában. 7

8 Úgy tunik, hogy ezen csatornák expressziója erosen függ a környezet hatásaitól, elsosorban a neuronális muködéstol (150). Bár több hipotézis létezik funkcióikra vonatkozóan, végso helyüket az asztrocita élettani és patológiás muködésében még nem sikerült megfeleloen tisztázni. Az asztrocita Cl - háztartása A klorid csatornák szerepének megértéséhez elengedhetetlen annak ismerete, hogy milyen a Cl - megoszlás a sejt és a külso tér között, hiszen ez meghatározza az ion egyensúlyi potenciálját és ezáltal az elektrokémiai hajtóero nagyságát és irányát egy adott membránpotenciálon. A Cl - ionok megoszlása lehet passzív, vagy pedig a sejtek aktívan halmozzák vagy eltávolítják azokat. Az asztrocita intracelluláris Cl - koncentrációjáról meglehetosen kevés konkrét adat áll rendelkezésre, ezek azonban többnyire azt mutatják, hogy az asztrocita citoplazma [Cl - ] i -ja magasabb, mint a passzív megoszlásból számított érték (71, 155, 159). Ez arra utal, hogy ebben a sejtben nyugalomban is muködnek aktív Cl - halmozó mechanizmusok. Ilyen mechanizmus lehet a Na + /K + /2Cl - szimporter és a Cl - - /HCO 3 antiporter (71, 74, 76). Asztrocita sejttenyészeten körülbelül 30 és 50 mm közötti citoplazma [Cl - ] i értéket állapítottak meg radioaktív 36 Cl meghatározással, Cl - szelektív mikroelektródával, Cl - érzékeny fluoreszcens festékkel, valamint patch-clamp módszerrel (8, 13, 70, 72, 74, 155). In situ agykéregben 36 Cl-dal az asztroglia [Cl - ] i -t mm-nak becsülték (128). Ezekkel ellentétben, tengerimalac szaglókéregben mikroelektródás módszerrel ennél jóval alacsonyabb (a passzív megoszlásnak megfelelo, 6 mm-os) glia [Cl - ] i -t mértek (5), azonban ebben a vizsgálatban a glia sejteket nem azonosították, így nem kizárt, hogy esetleg oligodendrocitából származtak az adatok. A magas [Cl - ] i következményeként a Cl - egyensúlyi potenciálja elméletileg az asztrocita membránpotenciáljánál pozitívabb érték lehet, ami azt jelenti, hogy a nyugalmi potenciálon egy Cl - csatorna nyitása Cl - kiáramlást okozna. Ezzel összhangban állnak azok a neuronmentessé tett patkány agyszeletben, GFAP-pozitív asztrocitán végzett in situ patch-clamp mérések, amelyekben a GABA A receptor-aktivált Cl - áram depolarizáló hatású volt (89), illetve ahol Cl - csatorna gátlószer adására 8

9 hiperpolarizáció következett be (156). Frissen izolált (47) és hosszútávú asztrocita tenyészeten (69) szintén kimutatható volt a GABA A receptorok aktivációjának depolarizáló hatása. Az asztrocita anion csatornái A) Ligandfüggo anion csatornák A neuronon leírt GABA A és glicin csatornákhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkezo neurotranszmitter által aktivált anion áramok számos preparátumon kimutathatóak voltak asztrocitán, jelenlétük széles körben elfogadott (összefoglalva lásd 150). Mint az elozo fejezetben leírtam, a GABA A adásakor asztrocitán depolarizáció következik be. A depolarizáció hatására feszültségfüggo Ca 2+ csatornákon keresztül történo Ca 2+ beáramlást és [Ca 2+ ] c emelkedést figyeltek meg felnott patkányagyból akutan izolált hippocampális asztrocitán (47) és fiatal egéragyból nyert corpus callosum szeletekben vizsgált asztrocitán (11). A GABA A csatorna aktiválása ezenkívül több preparátumon K + csatornák gátlását váltotta ki (150). A neurotranszmitter-aktivált anion csatornák funkcionális jelentosége még nem kelloen tisztázott, feltételezések szerint szerepük lehet az extracelluláris [Cl - ] e, a ph i, esetleg az asztrocita proliferációjának és differenciálódásának szabályozásában. Szintén a ligandfüggo anion csatorna áramok körébe sorolhatók a glutamát transzporterekhez kapcsolt anion áramok is. A glutamát szinaptikus résbol történo eltávolításáért felelos transzporterek összetett muködésuek: transzporterek és anion csatornák egyben (127, 140). A fehérje mint transzporter jól meghatározható sztöchiometriával muködik, ugyanakkor glutamát adásakor egy, a transzport ciklushoz nem kapcsolható Cl - áram is aktiválódik, melynek tulajdonságai egyértelmuen csatorna muködésre utalnak. A glia sejtekre jellemzo glutamát transzporterek (EAAT1 és 2) esetében az anion áram kisebb, mint a többi transzporternél (127, 140). A ligandfüggo anion csatornákkal értekezésemben bovebben nem foglalkozom. 9

10 B) Nem ligandfüggo anion csatornák A korai, ionszelektív mikroelektródával vagy 36 Cl izotóppal végzett vizsgálatok eredménye ellentmondásos volt a nyugvó asztrocita Cl - permeabilitása tekintetében. Az asztrocita élettani muködésének vizsgálatában úttöro szerepet játszó Kuffler és munkatársai által piócán és kétéltueken in vivo végzett vizsgálatok szerint az asztrocita membránpotenciálja igen pontosan, a Nernst egyenlet által megjósolt módon követi az extracelluláris [K + ] változásait, nem függ azonban a [Cl - ] e változásaitól (82). Ezt az eredményt más szerzok is megerosítették egéragyból származó tenyésztett asztrocitán (153). Ez arra utalt, hogy e sejt nyugalmi Cl - permeabilitása elhanyagolható a K + -éhoz képest. Ez a viselkedés nem volt azonban érvényes minden preparátumra és minden asztrocitára. Kimelberg és mtsai (73) szerint tenyésztett patkány agykérgi asztrociták mintegy 10 %-án a külso Cl - helyettesítése nem-permeábilis anionra kb. 10 mv-os depolarizációt okozott, miközben a sejtek nagy részének membránpotencálja nem változott. Hasonló, néhány sejten megfigyelt depolarizáló hatást észlelt a külso Cl - elvonásakor tenyésztett pióca asztrocitán Walz és Schlue (152) is. Mindez arra utal, hogy az asztrociták a Cl - csatorna suruség szempontjából heterogének, és bizonyos sejtekben a Cl - permeabilitás nem elhanyagolható. Ezen túlmenoen ugyanakkor mindazok a mérések, amelyek a passzív megoszlásból adódónál jóval magasabb citoplazma [Cl - ] i -t mutattak ki asztrocitában, közvetve arra utaltak, hogy a nyugalmi Cl - konduktancia (bár nem elhanyagolható) valószínuleg nem lehet túlságosan nagy, hiszen ha az lenne, akkor rajta keresztül a felhalmozott Cl - gyorsan el tudná hagyni a sejtet. Az asztrocitában potenciálisan expresszált Cl - áramok megismerése azonban csak a patch-clamp korszak beköszöntével indult meg (159). A patch-clamp módszerrel eddig jellemzett feszültségfüggo anion csatornákat patkányból vagy egérbol származó hosszútávú asztrocita tenyészeten írták le, így mostanáig nem voltak megbízható ismereteink az in vivo expresszált anion áramokról. Szintén nem vizsgálták még e csatornákat regionális heterogenitás vagy az agy fejlodésével bekövetkezo változások szempontjából. 10

11 1) Sejtduzzadás hatására aktivált anion áram Ismert, hogy hipozmózissal eloidézett sejtduzzadás hatására az asztrocitából ozmolitként szolgáló nagyméretu anionok passzív kiáramlása következik be, ami feltehetoleg a sejttérfogat normalizálását szolgálja (106, 107). Az anion leadás (legalábbis részben) feltehetoleg egy számos emlos sejtféleségen leírt, térfogat-érzékeny kifelé rektifikáló anion csatornán keresztül jön létre (VSOAC; volume sensitive organic osmolyte and anion channel), melynek permeabilitása anionokra széles köru (96, 119, 138). (Rektifikációról a csatornamuködés szempontjából akkor beszélhetünk, ha azonos töltéshordozó-koncentrációjú extra- és intracelluláris oldatokban mérve egy csatorna feszültség-áram összefüggése a lineáristól eltér, tehát a csatorna egyik irányba jobban vezet, egyenirányít.) Ezt alátámasztották azok a kísérletek, melyekben különbözo, sejtalak-változással járó manipulációk mint pl. a sejtek lekerekítése tripszinnel vagy szérummentes Ringer oldattal, továbbá hipozmózissal eloidézett duzzasztás enyhén kifelé rektifikáló Cl - áram aktivációját okozta, amely áram gátolható volt Cl - csatorna gátlószerekkel (31, 86). Az aktin polimerizációjára ható anyagok (citokalazinok, falloidin, intracelluláris ATP emelése) befolyásolták a Cl - áramot, ami szintén a citoszkeleton szabályozó szerepét bizonyította (86). A kifelé rektifikáló csatornát egycsatornás felállásban mérve kimutatták az intracelluláris oldalon adott aktin közvetlen szabályozó hatását is (87). Egy másik munkacsoport kísérleteiben a csatorna aktivitását tirozin- és MAP kinázok szabályozták (31). Ezek a jelátviteli utak aktiválódhatnak duzzadás hatására (100). 2) Depolarizáció-aktivált anion áramok Teljes-sejt patch-clamp módszer segítségével az elso, feszültségfüggo anion csatornát a 80-as évek közepén figyelték meg asztrocitán (12, 53). A csatorna 40 mvnál pozitívabb membránpotenciáloknál aktiválódott, és erosen kifelé rektifikáló áramot hozott létre, mely nagyobb anionokra, mint glutamát vagy aszkorbinsav, nem volt átjárható. Az áram a teljes-sejt felállás létrehozása után néhány perc alatt, lassan fejlodött ki, amit arra utalt, hogy vagy valamilyen intracelluláris faktor lassú kimosódása, vagy a citoszkeleton átrendezodése, sejtalakváltozás felelos a csatorna szabályozásáért. Késobbi vizsgálatok szintén felhívták a figyelmet arra, hogy a 11

12 citoszkeleton szabályozhatja az asztrocita anion csatornáit. Letapadt, lapos asztrocitán anion konduktanciát általában nem mutattak ki (6, 63), ugyanakkor kiszakított membrándarabban megfigyelheto volt kis (5 ps) és nagy vezetoképességu (több száz ps) feszültségfüggo Cl - csatornák aktivitása (63, 103, 129). Utóbbi, nagy vezetoképességu csatornák élettani jelentosége vitatott. Ezen csatornák nyitási valószínusége 0 mv körül a legnagyobb. Gyengén szelektálnak különbözo anionok között, de kis mértékben Na + -ra is átjárhatóak, valójában tehát nem-szelektív pórusoknak tekinthetok. Tulajdonságai alapján feltételezik, hogy a mitokondrium külso membránjában megtalálható feszültségfüggo anion csatorna plazmamembránban elhelyezkedo rokonai (36, 159). Az egycsatornás méréssel kimutatott többi csatorna közül csak néhányat sikerült a teljes-sejt módszerrel vizsgált áramokkal azonosítani, így pl. egy negatív feszültségeken aktív, kis vezetoképességu csatorna feltehetoleg a hiperpolarizáció-aktivált anion áramnak felel meg (lásd B/3. pontban és a Megbeszélés fejezetben). 3) Hiperpolarizáció-aktivált anion áram A fenti anion csatornákon kívül leírtak asztrocitán egy hiperpolarizáció-aktivált, befelé rektifikáló (befelé egyenirányító) Cl - áramot is, amely azonban csak akkor vált jelentos amplitúdójúvá, ha a sejteket több héten keresztül kezelték egy membránpermeábilis camp analóggal, a dibutiril-camp-vel (dbcamp). Az áram elektrofiziológiai tulajdonságait tekintve a ClC-2 elnevezésu 1992-ben klónozott, hiperpolarizáció-aktivált Cl - csatornán keresztül folyó áramhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkezett (142). A Xenopus oocitában expresszált ClC-2 áramról ismert, hogy hipozmózissal eloidézett sejtduzzadás, valamint acidózis aktiválja (54, 67). Kísérleteink kezdetén az asztrocita hiperpolarizáció-aktivált áramát szabályozó tényezok még nem voltak ismertek. 12

13 Anion csatornák lehetséges élettani szerepe asztrocitában A) A membránpotenciál szabályozása A klasszikus szemlélet, amelyet Kuffler korai in vivo mikroelektródás kísérleteinek eredményei alapoztak meg, az asztrocita egyik fo jellegzetességének tekintette az erosen negatív (?70 mv vagy annál negatívabb) nyugalmi membránpotenciált. E felfogás olyannyira uralkodóvá vált, hogy az asztrocita azonosításának egyik általános kritériumának tekintették az ehhez közeli nyugalmi potenciál értéket, és a pozitívabb membránpotenciállal rendelkezo sejteket (a sejt sérülését vagy tökéletlen mérési körülményeket feltételezve) kizárták az értékelésbol. A patch-clamp módszer és a sejtek immunológiai azonosítása azonban ennél összetettebb kép feltárásához vezetett. Kimutatták, hogy mind a tenyésztett, mind az agyszeletben vizsgált asztrociták membránpotenciálja heterogén: a sejtek egy csoportja valóban 60 mv-nál negatívabb membránpotenciált mutat, azonban jelentos számban találhatók ennél pozitívabb (átlagosan körülbelül?45 mv-os) értékkel rendelkezo sejtek is (95, 164). Egyelore ellentmondóak az irodalmi adatok arra nézve, hogy ez két elkülönítheto asztrocita populációnak felel-e meg. A pozitívabb membránpotenciál kialakításában résztvevo tényezok között Na + és esetleg Ca 2+ áramok mellett szerepe lehet a Cl - áramoknak is. Mivel a korábban írtak értelmében az asztrocitában a Cl - egyensúlyi potenciálja a membránpotenciálnál pozitívabb érték, egy Cl - csatorna esetleges aktivációja a sejt depolarizációjának irányába hatna. A Cl - csatornák szerepe a nyugalmi potenciál kialakításában még nem tisztázott. B) KCl transzport Az asztrocita fo feladatainak egyike a K + felvétele a neuronaktivitás helyén, majd ezen ionok leadása a nyugalomban lévo területek vagy kapillárisok felé (98, 157). A K + felvétel mechanizmusai között transzporterrel történo, valamint csatorna-mediált felvétel egyaránt szerepet játszik. A transzporterek közül a legtöbb bizonyíték a Na + /K + - ATPáz és a Na + /K + 2Cl - szimporter részvételére van (27, 157). A csatorna-mediált 13

14 felvétel elofeltétele, hogy az asztrociták réskapcsolatok segítségével kiterjedt szincíciumot alkotnak (111). A neuronaktivitás helyén a magas extracelluláris [K + ] miatt a K + egyensúlyi potenciálja (E K ) pozitív irányba tolódik, ami az ott elhelyezkedo asztrocitákat depolarizálja. A szincícium azonban lehetové teszi, hogy az aktivitás helyétol távolabb eso, nyugalomban lévo sejtek saját membránpotenciáljukat mintegy "rákényszerítsék" az aktivitás helyén lévo sejtekre. Ezáltal az utóbbi sejtek membránpotenciálja a E K -nál negatívabb értéket vesz fel, így a K + csatornákon keresztül K + beáramlás következhet be. A K + a távolabbi, nyugalomban lévo agyterületeken szintén elektrokémiai grádiensének megfeleloen távozik a szincíciumból. A csatorna-mediált K + mozgásban kulcsszerepet játszanak a befelé rektifikáló K + csatornák (K ir ; 33, 98, 157). Az irodalomban feltételezik, hogy a K + transzportjával egyidejuleg Cl - csatornákon keresztül történo Cl - felvétel- és leadás is történhet (45, 157). A Cl - áramot létrehozó csatorná(ka)t még nem azonosították, de valószínuleg olyan csatornáról lehet szó, amely a nyugalmi potenciál környékén, illetve enyhe depolarizáció esetén vezetoképes. Mivel kismértéku [K + ] e emelkedés feltehetoleg még nem vált ki jelentos duzzadást vagy depolarizációt az asztrocitában, kis ingerek esetén a térfogat- vagy depolarizáció-aktivált Cl - csatornák valószínuleg nem vesznek részt a folyamatban. C) ph szabályozás Az idegi aktivitás fokozódása több más ion mellett az agyi interstícium H + koncentrációját is befolyásolja. Az extracelluláris ph (ph e ) nyugalmi értékét különbözo agyterületeken mikroelektródás meghatározással 7,2-7,4 közöttinek találták (19, 112). Az idegi stimuláció hatására bekövetkezo ph e változások azonban meglepo módon az egyes agyterületeken eltéro jellegueknek bizonyultak (20, 34). Bizonyos agyi régiókban tisztán savas vagy lúgos irányú eltolódást kaptak, ugyanakkor pl. patkány hippocampusban (154) vagy rája kisagyban (115) komplex ph e jeleket figyeltek meg, melyek 0,1-0,3 ph egység nagyságú savas és lúgos irányú komponensekbol tevodtek össze. Kóros állapotokban, mint pl. az ún. terjedo gátlás ("spreading depression") vagy hipoxia, akár 1 ph egységnyi savanyodás is kialakulhat (19). Gyors ph e jelek létrehozásában elsosorban az ionotróp és metabotróp neurotranszmitter receptorok 14

15 aktiválódása játszhat szerepet, de a neuronok és glia sejtek megváltozott metabolikus aktivitása szintén befolyásolhatja (ha lassabban is) a ph e -t (19, 20, 34). A sav-bázis háztartás változásának hatására mindkét sejttípusban beindulnak ph szabályozási mechanizmusok is, amelyek hozzájárulhatnak a ph e szignálok alakulásához. Számos megfigyelés bizonyítja, hogy az asztrocita szerepet játszik a ph e szabályozásában (64, 80, 85, 118). Az asztrocita rendelkezik szénsav-anhidráz enzimmel, valamint különbözo, ph szabályozással összefüggo transzporterekkel, mint a Na + - /HCO 3 szimporter, a Na + /H + antiporter vagy a Cl - /HCO - 3 antiporter (18, 34). A transzporterek aktivitása függ a transzportált ionok koncentrációjától, ezért az anion csatornák, melyek a Cl - (és esetleg HCO - 3 ) intracelluláris homeosztázisát közvetlenül befolyásolják, kihatással lehetnek a sejt ph szabályozására is. Kísérleteink kezdetén nagyon kevés információval rendelkeztünk arról, hogy a neuronaktivitással járó fiziológiás ph e -változások hogyan befolyásolják az asztrocita anion csatornáinak muködését. D) Klorid ionok intracelluláris szabályozó szerepe A Cl - intracelluláris koncentrációja és annak változása a sejt ph háztartásán és a Cl - -ot szállító kerrierek aktivitásán kívül befolyásolhat egyéb sejtfunkciókat is (7). Közelmúltban végzett vizsgálatok arra utalnak, hogy például az asztrocitán leírt, gyorsan aktiválódó és inaktiválódó K + áram kinetikája nagyban függ az intracelluláris Cl - koncentrációtól (8). A szerzok szerint ezzel a mechanizmussal magyarázható az a korábbi, többek által megerosített megfigyelés, miszerint asztrocitán a GABA A receptor aktiválása a sejt K + áramainak gátlásához vezet (lásd 150). Nem kizárt, hogy a [Cl - ] i változásai hasonló mechanizmussal más transzportfolyamatokat is szabályozhatnak. E) Proliferáció és migráció szabályozása Mint azt a korábbiakban említettem, a nyugvó asztrocita Cl - permeábilitása viszonylag kicsi a K + permeábilitáshoz képest. Ezzel szemben irodalmi adatok szerint a tumoros átalakuláson átment (emberi gliómákból és asztrocitómákból izolált) asztrocita 15

16 Cl - permeábilitása igen jelentos: megközelíti vagy akár meghaladja a K + permeábilitást. A tumoros sejt egy chlorotoxin-érzékeny, kifelé rektifikáló Cl - áramot expresszál, (114, 143, 145), melynek farmakológiai gátlásával a proliferáció, illetve migráció mérsékelheto volt (114, 143). A klorid áram aktivitása a sejtciklus fázisaival összefüggésben változott, a szerzok feltételezése szerint a citoszkeleton átrendezodése következtében (144). Az áram aktivációja megfigyelheto volt a sejtek spontán alakváltozása során is (114). Tulajdonságai alapján ez az áram hasonló a tenyésztett asztrocitán megfigyelt, sejtduzzadás által aktivált kifelé rektifikáló Cl - áramhoz. Ennek megfeleloen a tumoros sejtben történo aktivációját magyarázhatja a sejtosztódás során megnövekedo sejttérfogat. Egy hipotézis szerint a csatornán keresztül létrejövo anion kiáramlás a sejttérfogat csökkenését segíti elo, a kisebb sejtméret pedig elonyös lehet az invazív migráció szempontjából (114). A duzzadás-aktivált anion csatorna szerepét a proliferáció szabályozásában több más sejttípuson is kimutatták (100). F) A sejttérfogat szabályozása A neuronok aktivitásának fokozódásakor már élettani körülmények között is bekövetkezhet az asztrocita duzzadása a KCl akkumuláció és a neurotranszmitter felvétel következtében, ezen kívül e sejtek térfogat-növekedése kimutatható agyi trauma vagy hipoxia kapcsán is (78). A zárt koponyaurben a sejttérfogat szabályozása kritikus fontosságú lehet. In vitro körülmények között kimutatták, hogy hipozmotikus duzzadást követoen az asztrocita ozmotikusan aktív molekulákat (és következésképp vizet) ad le, és ezen regulatórikus térfogatcsökkenés ("regulatory volume decrease", RVD) során térfogatát a normál érték közelébe tudja visszaállítani (41, 75, 106). A folyamatban fontos szerepet játszhatnak a fentebb leírt, duzzadásra aktiválódó, Cl - mellett esetleg nagyobb aminosavak és származékaik (taurin, glutamát, aszpartát) sejtbol történo kiáramlását is lehetové tevo anion csatornák (151). A RVD Cl - csatorna gátlószerekkel lassítható volt tenyésztett asztrocitában (120). Az anion csatornán keresztül bekövetkezo aminosav-kiáramlás nem csak az asztrocita térfogatszabályozása szempontjából lehet fontos, hanem aminosav neurotranszmitterek kibocsátási útjaként is szolgálhat (77). Ez utóbbi mechanizmus sejtduzzadással járó patológiás helyzetekben hozzájárulhat a glutamát excitotoxicitáshoz (77), de pl. a hipotalamusz ozmoszenzitív magjaiban 16

17 esetleges élettani szabályozó szerepére is komoly bizonyítékok vannak, ahol az asztrocita által a hipozmotikus duzzadást követo RVD során leadott taurin módosítja a vazopresszin-termelo idegsejtek muködését (62). Sejttérfogat változás hatásai a mellékvesekérgi glomerulóza sejt áramaira Az elobbiekben említett regulatórikus térfogatcsökkento mechanizmust, illetve az abban feltehetoleg részt vevo, térfogatváltozás által aktivált Cl - áramokat asztrocitán kívül számos más sejtféleségen kimutatták (60, 138). Speciális azonban azoknak a sejteknek az esete, melyek ozmoszenzitív funkcióval rendelkeznek. Ilyen sejtek esetében a RVD nem lenne feltétlenül elonyös, hiszen a szabályozás által csökkenne a muködésüket szabályozó inger erossége. Valóban van adat arra, hogy pl. a hipotalamusz vazopresszin-termelo ozmoszenzitív neuronjai nem szabályozzák aktívan térfogatukat (52). Ugyanakkor nagyon keveset tudunk arról is, hogy ozmoszenzitív sejtekben a sejttérfogat változásai milyen módon hoznak létre választ a sejt muködésében. A mellékvesekéreg glomerulóza sejtje által termelt aldoszteron szintén a só-víz háztartás egyik meghatározó hormonja, mégis, eddig csak egy munkacsoport vizsgálta a sejttérfogat változásainak hatását az izolált glomerulóza sejt muködésére. Schneider és mtsai szerint a hipozmózissal történo duzzasztás glomerulóza sejten nem vált ki RVD-t (57), ugyanakkor növeli a citoplazma Ca 2+ koncentrációját ([Ca 2+ ] c ) és fokozza az aldoszteron termelését (160). Azt is kimutatták, hogy a glomerulóza sejt fiziológiás ingere, a [K + ] e emelkedése szintén sejtduzzadást vált ki, amelyet nem követ regulatórikus térfogatcsökkenés (57). Schneider és mtsai kísérleteiben mind az ozmotikus duzzasztás, mind a K + emelés által kiváltott aldoszteron termelés függött az extracelluláris Cl - koncentrációtól: kisebb hatást kaptak Cl - -mentes külso oldatban (58, 161), ami arra utalt, hogy a glomerulóza sejt Cl - háztartása szerepet játszhat a jelközvetítésben. Más szteroid termelo sejteken - mint pl patkány Leydig-sejt és szarvasmarha mellékvesekérgi faszcikuláta-retikulárisz (kortizol-termelo) sejtek esetében - szintén feltételezik, hogy Cl - csatornák szerepet játszanak az inger okozta hormonválasz kialakításában (30, 38). A glomerulóza sejt Cl - csatornáiról nagyon keveset tudunk. Quinn és mtsai (109) 17

18 mérései szerint a külso Cl - koncentráció nem befolyásolta a sejtek nyugalmi potenciálját, ami arra utalt, hogy a glomerulóza sejt Cl - permeábilitása nem jelentos. Mások patch-clamp módszerrel kimutattak egy ACTH által aktivált, kifelé rektifikáló anion csatornát (25), azonban a nyugvó sejt Cl - csatornáit patch-clamp módszerrel tudomásunk szerint még senki nem vizsgálta. Kísérleteink kezdetén nem állt rendelkezésre irodalmi adat arról sem, hogy az ozmolaritás-változások milyen hatást fejtenek ki a sejt jelátviteli mechanizmusaiban részt vevo ioncsatornákra, így pl. a K + hatását közvetíto feszültségfüggo Ca 2+ csatornákra. A patkány glomerulóza sejt feszültségfüggo Ca 2+ áramainak két típusát mutatták ki: az alacsony küszöbu, gyorsan aktiválódó és inaktiválódó T típusú áramot (39, 91, 148) és a magas küszöbu, lassan aktiválódó és inaktiválódó L típusú áramot (39, 88, 148). A két áramtípus küszöbét munkacsoportunk??70 mv-os (T áram), illetve??57 mv-os (L áram) értékunek mérte (Várnai et al., 1998). Az L típusú áram küszöbe tehát jelentosen alacsonyabb a glomerulóza sejten, mint a más sejteken általánosan meghatározott küszöbérték (-20 mv; 59). Az irodalomban elfogadott nézet szerint a fiziológiás ingert jelento, néhány mm-os [K + ] e emelkedés hatását elsosorban a T csatornán keresztül létrejövo Ca 2+ beáramlás közvetíti (28, 88), bár ez az elmélet nem magyarázza meg kielégítoen azt, hogy a [K + ] e szubmillimoláris emelése hogyan hoz létre [Ca 2+ ] c jelet (Várnai et al,. 1998). A feszültségfüggo Ca 2+ csatornák emellett az angiotenzin II hatásmechanizmusában is szerepet játszhatnak (61, 88). Minden olyan tényezo tehát, amely a T- és L típusú csatornák muködését módosítja, jelentosen befolyásolhatja a fiziológiás agonisták glomerulóza sejtre kifejtett hatását. (A glomerulóza sejt Ca 2+ áramok korábbi összefoglalását lásd 132) 18

19 CÉLKITUZÉSEK 1. Vizsgálni kívántuk, hogy idegsejttel együtt tenyésztett asztrocitán jelen van-e valamely nem ligandfüggo, nyugalmi állapotban feltehetoleg aktív anion konduktancia. 2. Amennyiben ilyen áram kimutatható, jellemezni kívántuk elektrofiziológiai tulajdonságait és gátlószer-érzékenységét, továbbá reakcióját a sejt külso (ph e ) vagy belso környezetének (ATP) olyan változásaira, melyek anion csatornák részvételével az asztrocita élettani muködését befolyásolhatják. 3. Vizsgálni kívántuk, hogy az in vivo körülményeket jól közelíto agyszelet preparátumon kimutatható-e a sejtkultúrán leírt anion áramok valamelyike nyugvó asztrocitán. Tanulmányozni kívántuk, hogy hogyan változik az anion áramok muködése az asztrocita in vivo reaktív transzformációja során. Tisztázni kívántuk továbbá az asztrocitán in situ kimutatható anion áramo(ka)t létrehozó csatornák molekuláris hátterét. 4. Választ kerestünk arra a kérdésre, hogy az asztrocitán megfigyelheto anion áramokhoz hasonló konduktancia kimutatható-e nyugalomban a tole jelentosen eltéro tulajdonságokkal rendelkezo mellékvesekérgi glomerulóza sejten. 5. Vizsgálni kívántuk, hogy a sejttérfogat változásai hogyan befolyásolják a glomerulóza sejt feszültségfüggo Ca 2+ csatornáinak muködését, és ezen keresztül a glomerulóza sejt fiziológiás ingerekre adott [Ca 2+ ] c válaszát. 19

20 MÓDSZEREK Kísérleti preparátumok A) Hosszútávú asztrocita sejttenyészet A vegyes asztrocita-neuron tenyészet készítéséhez újszülött (1-3 napos) Wistar patkányokat használtunk. Dekapitálás után az agyat a koponyából eltávolítottuk, és elülso pólusát (a prefrontális kéregrészt) szikével apró darabokra vágtuk. A szövetet 5 percig emésztettük Ca 2+ - és Mg 2+ -mentes, 7,5 mg/ml tripszint (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) és 1 mg/ml DNázt (Sigma, tartalmazó módosított Hank's oldatban (ph 7,4), majd 1,25 mg/ml DNáz tartalmú, 0,3 % szarvasmarha szérum albuminnal (BSA; Serva, Heidelberg, Németország) kiegészített módosított Hank's oldatban (Sigma) történo pipettázással tovább zúztuk. Az izolálás alatt minden oldat 200?M kinurénsavat (Sigma) tartalmazott a neuronok túlélésének elosegítésére. A sejteket centrifugálás (157 g, 2? 15 perc) után 25 cm 2 alapterületu sejttenyészto edényekbe tapasztottuk le kb. 2? 10 4 /cm 2 suruségben, és 10 % fötális borjú savóval (Protein, Biokémiai Gmk, Gödöllo), 100 NE penicillinnel és 100? g/ml streptomycinnel kiegészített Dulbecco-féle (DMEM) tenyészto oldatban (GibcoBRL, termosztátban inkubáltuk (5% CO 2, 37 o C, 100 %-os páratartalom). A tenyészto oldatot 3 naponta cseréltük. A 2-8 hetes tenyésztés után az addigra összefüggo asztrocita rétegen ülo egyéb sejteket órás horizontális rázás útján eltávolítottuk. A megmaradt asztrocitákat tripszinnel felvettük, majd üveglemezekre újra letapasztottuk és további 2-4 napig inkubáltuk. A második tenyészetet immuncitokémiai módszerrel ellenorizve a sejtek %-a pozitívnak bizonyult az asztrocita-specifikus markerre, a gliális fibrilláris savas fehérjére (GFAP). Mérés elott néhány perccel a tenyészto oldatot egy standard külso oldatra cseréltük, mely (mm-ban) 137 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 0,5 MgCl 2, 10 HEPES, 11 glukóz összetételu volt (ph 7,4). Méréseinkhez különálló, lapos, sokszögu, néha vastag elágazó nyúlványokkal rendelkezo sejteket választottunk. Az eredmények a további morfológiai részletektol függetlenek voltak. 20

21 B) Akut agyszelet A "knock-out" egereken végzett kísérleteken kívül minden agyszeletben történt mérésünket olyan transzgenikus egértörzsön végeztük, melyben a GFAP gén promotere által szabályozottan a sejtek felerosített zöld fluoreszcens fehérjét (EGFP) termelnek (Tg(GFAP/EGFP); 101). Mivel az asztrociták azonosításához elegendo mennyiségu EGFP-t a heterozigóta állatok is termelnek, mind homo-, mind heterozigóta állatokat felhasználtunk. A ClC-2 "knock-out" egerek Dr. Thomas Jentsch laboratóriumából származtak (17). Valamennyi "knock-out" állat homozigóta (-/-) volt. Az agyszeleteket felnott (4 hetesnél idosebb) egerekbol nyertük. Dekapitálás után az agyat 5 % CO 2 -dal buborékoltatott jeges bikarbonát-pufferelt oldatba (BPO) helyeztük, melynek összetétele (mm-ban) 134 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 1,25 K 2 HPO 4, 23 NaHCO 3 és 9 glukóz (ph 7,4) volt. Az agy lehutése után ?m vastag koronális vagy transzverzális szeleteket készítettünk vibratom (Vibracut; FTB Feinwerktechnik, Bensheim, Németország) segítségével. A szeleteket a mérés kezdetéig (1-7 óráig) szobahomérsékletu, 5 % CO 2 -dal buborékoltatott BPO-ban tároltuk. C) Glomerulóza tenyészet A mellékvesekérgi glomerulóza sejteket standard félszintetikus tápon tartott, g-os Wistar patkányokból nyertük. Az állatokat dekapitáltuk, majd a mellékveséket eltávolítottuk. Az ún. kapszuláris szövetet (rostos tok + zona glomerulosa) leválasztottuk és kisebb darabokra vágtuk. A szövetet 25 percig emésztettük 1,2 mg/ml kollagenázt tartalmazó, 2 mg/ml BSA- val kiegészített Krebs- Ringer-HEPES-glukóz (KRHG) oldatban (fo ionok: 146 Na +, 3,6 K +, 1,22 Mg 2+, 1,8 Ca 2+, ph 7,4) majd 0,2 mg/ml szójabab tripszin inhibitort (Sigma) és 0,2 mg/ml DNázt tartalmazó KRHG oldatban történo pipettázással tovább diszpergáltuk. Az izolált sejteket tartalmazó felülúszót eltettük, majd a megmaradt szövetet újra emésztettük és pipettáztuk. A két frakcióból nyert sejteket centrifugálás (100 g, 10 perc) után polilizinnel fedett üveglemezre tapasztottuk le, majd módosított Krebs-Ringerbikarbonát és M199 oldat (GibcoBRL) térfogat%-os keverékében (40C oldat; végso koncentrációk (mm): 146 Na +, 3,6 K +, 0,5 Mg 2+, 1,2 Ca 2+, ph 7,4) termosztátban 21

22 (5% CO 2, 37?C) tartottuk, és az izolálást követo elso ([Ca 2+ ] c mérés) vagy második (patch-clamp mérés) napon használtuk fel. Mérés elott néhány perccel a tenyészto oldatot egy standard külso oldatra cseréltük, mely (mm-ban) 137 NaCl, 3,6 KCl, 2 CaCl 2, 0,5 MgCl 2, 10 HEPES, 11 glukóz összetételu volt (ph 7,4). D) Mechanikus agykérgi sérülés (szúrt seb) mutéti technikája A Tg(GFAP/EGFP) egereket érzéstelenítettük (ketamin- hidroklorid : xylazinhidroklorid = 4:1; 30? l) adásával, majd sztereotaktikus készülékre (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) helyeztük. A koponyatetot fúróval megnyitottuk, majd 27-es standard méretu steril tut szúrtunk 3 mm mélyre a jobb félteke A1,5, L1,5, V2,5 koordinátáiban. A bormetszést varrattal zártuk. A kísérleti preparátumok készítése során minden, az állatvédelemre vonatkozó intézményi és törvényi eloírást betartottunk. A kísérleti protokollokat jóváhagyta a Semmelweis Orvostudományi Egyetem Állatvédelmi és Etikai Bizottsága (124/1994; 17/1998), illetve a német Landesamt für Arbeitsschutz (Berlin; G0086/98). Elektrofiziológiai mérések Kísérleteinkben a patch-clamp technika "teljes-sejt" típusát alkalmaztuk (1. ábra), annak klasszikus vagy ún. perforált változatában. A teljes-sejt patch-clamp módszer során a plazmamembrán és egy üveg mikropipetta vége között rendkívül nagy (GOhm-os) ellenállású kapcsolatot alakítunk ki. A klasszikus változat esetén (1A ábra) a kapcsolat létrejötte után a pipettahegy alatti membránrészt enyhe szívással átszakítjuk, ezáltal a citoplazma összetételét a pipettában található oldat határozza meg. A pipettában, illetve a külso (extracelluláris) oldatban elhelyezett elektródák segítségével a teljes plazmamembránon keresztül folyó áramot tetszolegesen beállított feszültségértékek mellett mérhetjük. 22

23 Az ún. perforált-patch eljárás esetében (1B ábra) a szoros kapcsolat létrejötte után a membránfoltot nem szakítjuk át. Ehelyett a sejttel az elektromos kapcsolatot az teremti meg, hogy a pipetta oldatban lévo pórusképzo anyag, a nisztatin beépül a pipetta alatti membránrészletbe, és azt egyértéku ionokra (elsosorban kationokra, de kisebb mértékben anionokra is) átjárhatóvá teszi. A nisztatint (Sigma) a mérést megelozo két órán belül frissen oldottuk fel dimetil-szulfoxidban (DMSO), és 240? g/ml végkoncentrációban adtuk a pipetta oldathoz. Elektród Pipetta I m +100 mv Külso oldat Pipetta oldat Sejt -100 mv Nisztatin I m +100 mv -100 mv 1. ábra. A patch-clamp teljes-sejt mérési mód (fent) és annak nisztatinnal perforált változata (lent) 23

24 Kísérleteinkben két fo protokolltípust használtunk: a feszültséglépést (voltage step) és az ún. ramp ( rámpa, felhajtó ) protokollt. A feszültséglépés során a sejt membránpotenciálját igen rövid ido alatt, egy lépésben változtatjuk meg, míg a ramp protokoll esetében a feszültségváltozás egy kezdo és végérték között folyamatosan, lineárisan történik. Ezen protokoll elemeket, vagy ezek kombinációját tetszoleges számban ismételhetjük. Az egyes ismétlések között a membránpotenciált ún. tartófeszültségen, stabilan tartjuk. Az izolált sejteken végzett mérésekhez a sejteket tartalmazó fedolemezt Diaphot 300 inverz mikroszkóp (Nikon, Tokió, Japán) tárgylemeztartójára helyeztük. Az agyszeleteket Axiovert FS fluoreszcens mikroszkóp (Zeiss, Oberkochen, Németország) tárgylemeztartójára helyezett üveglemezen rögzítettük egy platinakeretre tekert nylon szálakból álló rács segítségével. A pipettákat boroszilikát üvegkapillárisból húztuk Sutter P-87-es pipettahúzó segítségével (Sutter, Novato, CA, USA). A pipetta oldattal töltött pipetták ellenállása 3-8 MO volt. A külso oldatot Ag-AgCl elektródon keresztül földeltük. Azoknál a kísérleteknél, ahol a Cl - koncentrációt változtattuk, Dri-Ref-2SH (World Precision Instruments, Aston, UK) 3 M-os KCl-ot tartalmazó referencia elektródot használtunk az Ag-AgCl elektród helyett, így az oldatcserék során az elektródpotenciál változásai ± 3 mv-nál minden esetben kisebbek voltak. Az agyszeleten végzett kísérleteknél az elektródot 3 M KCl-dal töltött agar híd kötötte össze a külso oldattal. Az elektromos jelek erosítéséhez izolált sejteknél Axopatch-1D (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), agyszeletnél pedig EPC-9 (HEKA electronics, Lambrecht/Pfalz, Németország) patch-clamp erosítot használtunk. Az áramjeleket izolált sejteknél 1 khz-en, agyszeletnél 3 khz-en szurtük (a 3 db-es csillapítás frekvenciája). A digitalizáláshoz a mintavételezés izolált sejten 4 khz-en, míg agyszeletnél 3 vagy 10 khz-en történt. A nem specifikus háttér konduktanciákból származó áramokra nem korrigáltunk. A mérésekhez, adattároláshoz és kiértékeléshez izolált sejtnél PClamp (Axon), agyszeletnél WinTida 4.02 (HEKA) programot használtunk. A különbözo külso oldatokat gravitáció által hajtott, több befolyócsöves mikroperfúziós rendszerrel juttattuk el a sejtekhez. Izolált sejten végzett méréseinknél ennek közös kifolyócsöve kb. 50? m távolságra helyezkedett el a vizsgált sejttol, így az oldat a sejt közvetlen környezetébe jutott. A Cl - koncentráció változtatásával járó 24

25 méréseket kis térfogatú (?100? l) külso oldatban végeztük, és oldatváltoztatásnál a teljes mennyiséget cseréltük. Agyszeleten végzett kísérleteinknél a teljes szeletet perfundáltuk. Az izolált sejten végzett kísérletek többségét 30?C-on végeztük, kivéve (technikai okok miatt) a Cl - koncentráció változtatásával járó méréseket (5. és 7. ábra). Utóbbiak, valamint az agyszeleten végzett mérések szobahomérsékleten (25?C) történtek. Az áramdenzitás meghatározásakor az áram amplitúdót a sejtméretre normalizáltuk, amely a sejtmembrán kapacitásával arányos. A tenyésztett asztrociták kapacitása 50,9 ± 22,5 pf (n=157); a glomerulóza sejteké 7,6 ± 2,0 pf (n=52) volt, míg a hippocampus szeletekben a komplex asztrociták kapacitását 25,7 ± 10,2 pf-nak (n=7) mértük. A [Ca 2+ ] c fluorimetriás mérése Az üveglemezre letapasztott glomerulóza sejteket Indo-1 Ca 2+ -érzékeny fluoreszcens festék acetoxi-metilészter formájával (2?M; TefLabs, Austin, TX, USA) percig inkubáltuk 40C oldatban, CO 2 termosztátban 37?C-on. Töltés után a fedolemezt fluoreszcens méréshez kialakított inverz mikroszkóp (Diaphot 300, Nikon, Tokió, J) futheto tárgyasztalára tettük. A méréseket 30?C-on végeztük. A méréshez egyedül álló glomerulóza sejteket választottunk, melyeket monokromátor segítségével (PTI, South Brunswick, NJ, USA) 355 nm-es hullámhosszú fénnyel világítottunk meg. A fluoreszcens jeleket 400 és 500 nm-es hullámhosszokon mértük egy-egy fotoelektron sokszorozóval (Model 712, PTI), a 400 és 500 nm-en mért jelek arányát ("ratio") a PClamp program segítségével számítottuk. A ratio értékek kalibrációja során a Ca 2+ koncentrációt a [Ca 2+ ] c = K D??? [(R-R min )/(R max -R)] képlet segítségével számítottuk ki (55), ahol R a ratio (400/500 nm),? az 500 nm-es fluoreszcens jelek 0 és telíto Ca 2+ koncentráció mellett mért aránya, K D pedig a festék in vitro disszociációs konstansa Ca 2+ -ra (230 nm). Az R min -t, R max -ot és?-t Indo-1-gyel töltött sejteken végzett kalibráció segítségével határoztuk meg (n=5). Az R min -t 10?M ionomycin jelenlétében Ca 2+ mentes extracelluláris oldatban mértük (összetétel (mm): 137 NaCl, 3,6 KCl, 0,5 25

26 MgCl 2, 5 mm EGTA, 10 mm HEPES, 11 mm glukóz, ph 7,4), míg az R max -ot 10 mm Ca 2+ hozzáadásával értük el. Egyedi glomerulóza sejtek [Ca 2+ ] c -ját Indo-1 fluoreszcens festékkel meghatározva 204? 28 nm-os nyugalmi értéket kaptunk (n=54). Ugyanezen tenyészeteken Fura-2-vel mérve a nyugalmi [Ca 2+ ] c 132? 25 nm-nak bizonyult (n=9). Patch-clamp oldatok A) Asztrocita tenyészet A külso oldatok összetételét az 1. táblázat ismerteti. A pipettaoldat összetétele (mm-ban): 125 CsCl, 0,25 CaCl 2, 0,5 MgCl 2, 7,65 EGTA, 10 HEPES, 5 Na 2 ATP (ph 7,2) volt. Amikor az ATP-t elhagytuk az oldatból, az ozmolaritás fenntartása érdekében az ATP-t szacharózzal helyettesítettük. Az oldatok ozmolaritását ozmométerrel ellenoriztük (MicroOsmometer 3MO, Advanced Instruments, Norwood, MA, USA). Oldat Na + K + NMDG + Cl - szacharóz HEPES PIPES ph S ,4 (NaOH) S ,4-7,9 (NaOH) S3a * ,9 (HCl) S3b ,9 (HCl) S4a ,9 (TEA-OH) S4b ,9 (TEA-OH) S1-S4 10 Ba 2+, 25 TEA +, 2 4-AP, 0,5 Mg 2+, 11 glukóz, mosm 1. táblázat. Külso patch-clamp oldatok összetétele asztrocita tenyészethez A koncentrációkra vonatkozó adatok mm-ban értendoek. * mielott a ph-t 7,9 to 6,9-re csökkentettük TEA: tetraetil-ammónium 4-AP: 4-aminopiridin NMDG + : N-metil-D-glukamin 26

27 B) Agyszelet Standard fiziológiás külso oldatként bikarbonát-pufferelt sóoldatot (BPO) használtunk, melynek összetételét az agyszelet preparálásnál írtam le. A Cl - áramok méréséhez használt oldat (ún. NMDG-bikarbonát oldat) összetétele a következo volt (mm-ban): 117 NMDG-Cl, 23 NMDG-HCO 3, 5 CsCl, 2 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, és 9 glukóz (ph 7,4). A külso oldatokat folyamatosan buborékoltattuk 5 % CO 2 -dal. A pipettaoldat (mm-ban) 140 CsCl, 1,1 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 5 EGTA és 10 HEPES (ph 7,3) összetételu volt. C) Glomerulóza tenyészet A Cl - és Ca 2+ áramok méréséhez használt, különbözo ozmolaritású külso oldatokat egy hipozmotikus alapoldatból készítettük, melynek tartalma (mm-ban) 90 NMDG-Cl, 10 TEA-Cl, 0,5 MgCl 2, 10 BaCl 2, 3,6 KCl, 2 NaCl, 11 glukóz és 10 HEPES (ph 7,4, 240 mosm) volt. A külso oldat ozmolaritását szacharóz hozzáadásával emeltük 250, 290 és 330 mosm-ra (Ba250-Ba330 oldatok). A ph e változások hatásának vizsgálatához az asztrocita tenyészetnél megadott S2 oldatot használtuk. A pipettaoldat a klasszikus teljes-sejt módszer esetén (mm-ban) 137 CsCl, 0,25 CaCl 2, 0,5 MgCl 2, 7,65 EGTA, 10 HEPES, 5 Na 2 ATP (ph 7,2) összetételu volt. A nisztatin-perforált teljes-sejt mérésnél (mm-ban) 140 Cs-glukonát, 5 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES (ph 7,3) tartalmú oldatot használtunk. D) Gátlószerek Minden gátlószert, melynek gyártóját külön nem jelöltem, a Sigma cégtol vásároltunk ( Az antracén-9-karboxisavat (9-AC), 5-nitro-2-(3- fenilpropilamino)benzoátot (NPPB; Tocris, és nifluminsavat naponta frissen oldottuk dimetil-szulfoxidban (DMSO), és 1:1000 hígításban tettük S1 külso oldatba. A tetraetil-ammóniumot (TEA) és 4-aminopiridint (4-AP) porban mértük be a külso oldatba. 27

28 Fluorimetriához használt oldatok A [Ca 2+ ] c méréséhez használt különbözo ozmotikus koncentrációjú oldatokat egy hipozmotikus alapoldatból készítettük, melynek tartalma (mm-ban) 112 NaCl, 3,6 KCl, 2 CaCl 2, 0,5 MgCl 2, 10 HEPES, 11 glukóz (ph 7,4, 245 mosm) volt. A külso oldat ozmolaritását szacharóz hozzáadásával emeltük 250, 290 és 330 mosm-ra. A K + koncentráció emelésével járó kísérletekben az oldatok azonos ozmolaritását a kontroll oldathoz adott NMDG-Cl-dal biztosítottuk. Statisztikai kiértékelés Az adatokat minden esetben átlag ± a középérték szórása (S.E.M.) értékben adtam meg. A kiértékelés során egy- és kétmintás t-próbát, valamint önkontrollos variancia analízist alkalmaztunk, a Statistica program (Tulsa, OK, USA) segítségével. Post hoc összehasonlításhoz a Tukey-féle szignifikancia különbség tesztet használtuk. Szignifikáns különbségnek minden esetben a p<0,05 szintu eltérést tekintettük. 28

29 EREDMÉNYEK Befelé rektifikáló áram jellemzése hosszútávú patkány agykérgi asztrocita tenyészeten Az asztrocita anion áramainak vizsgálatához a külso oldat és a pipetta oldat összetételét úgy választottuk meg, hogy a sejt fo konduktanciáját jelento K + áramokat kiküszöböljük. Ennek érdekében minden hosszútávú sejttenyészeten végzett kísérletünkben a pipetta oldat K + helyett Cs + -ot tartalmazott, a külso oldatban pedig 10 mm Ba 2+ -mal, valamint TEA és 4-AP segítségével gátoltuk a K + csatornákat. Mint azt az 1. táblázat jelzi, ezen gátlószerek kivételével a külso oldat összetételét az egyes kísérletekre optimalizálva változtattuk. A teljes-sejt állapot elérését követoen S1 külso oldat jelenlétében a?100 mv-os tartófeszültségrol 15 másodpercenként ismételt, 1 másodperc hosszú, +40 mv-ig tartó folyamatos depolarizáció (ramp protokoll) segítségével széles feszültségtartományban térképeztük fel a sejtmembrán konduktanciáját. Mint az a 2. ábrán látható, az idoben egymást követo görbéken a negatív feszültségtartományban növekvo amplitúdójú, befelé irányuló áram volt megfigyelheto. A jelenség szinte minden vizsgált sejten kimutatható volt. Az áram növekedése 5-10 percig tartott, vizsgálatát a tartós állapot kialakulása után kezdtük el. Elso lépésként meghatároztuk az áram aktivációs kinetikáját és feszültség-áram összefüggését (3. ábra). Ehhez 0 mv-os tartófeszültségrol 1 másodperc hosszú feszültséglépésekbol álló sorozatot alkalmaztunk a 120 és +40 mv közötti tartományban. A 3A ábrán egy ilyen mérés során nyert görbéket mutatok be, ahol látható, hogy míg +40 és 20 mv között gyakorlatilag nem mérheto áramváltozás a feszültséglépés hatására, negatívabb potenciálokon egy lassan aktiválódó, befelé irányuló áram jelent meg, amely nem inaktiválódott még akkor sem, ha a membránt 15 másodpercig 100 mv-on tartottuk. Az aktiváció kinetikája két exponenciális komponensbol álló egyenlettel jól leírható volt, melyek idoállandói (? 1 és? 2 ) 120 mvon 331,3 ± 41,1 ms-nak, illetve 38,8 ± 9,9 ms-nak adódtak. Az ugyanezen a feszültségen meghatározott, sejtméretre normalizált steady-state áramamplitúdó 21,7 ± 10,5 pa/pf volt (n=20). A feszültség-áram összefüggés meghatározásához az egyes 29

30 E (mv) ábra. Befelé irányuló áram lassú idobeli kialakulása a negatív feszültségtartományban agykérgi asztrocita sejttenyészeten K + csatorna gátlószereket tartalmazó külso oldatban (S1) a sejtmembránt 100 mv-os tartófeszültségrol folyamatosan depolarizáltuk +40 mv-ig, majd szimmetrikusan visszatértünk a tartófeszültségre. A görbék ugyanazon sejten 15 másodpercenként felvett áramprofilt mutatnak. A B E (mv) E (mv) I (pa) I/I ms ábra. A befelé irányuló áram aktivációs kinetikája és feszültség-áram összefüggése tenyésztett asztrocitán (A) Az áram végleges kialakulását követoen S1 külso oldatban 0 mv-os tartófeszültségrol 15 másodpercenként 1 másodperc hosszú feszültséglépést alkalmaztunk 120 és +40 mv között, 20 mv-os különbségekkel (egy reprezentatív sejt görbéi). (B) Az egyes lépések végén mért áramértékek a feszültségérték függvényében, a 120 mv-on mért (maximális) áramértékre (-1) normalizálva (n=7). 30

31 feszültséglépések végén mért átlagáramokat ábrázoltuk a maximális ( 120 mv-os) áramértékekre normalizálva (3B ábra, n=7). Az áram 40 mv-nál negatívabb membránpotenciálnál kezdett aktiválódni, és amplitúdója az ennél negatívabb feszültségeken meredeken nott, tehát az áram befelé rektifikált. Az áram megfordulási potenciálja 0 mv körüli érték ( 4,5 ± 3,6 mv) volt, amely az adott kísérleti körülmények között arra utalt, hogy vagy vegyes egyértéku kation áramról, vagy pedig klorid ionok által létrehozott áramról van szó, mivel ezen ionok koncentrációja a membrán két oldalán közel azonos volt. A befelé rektifikáló áram gátlószer-érzékenysége A vizsgált áram kinetikája felvetette két csatornaféleség: a hiperpolarizációaktivált anion csatorna, illetve a hiperpolarizáció-aktivált nem specifikus kation csatorna (I h ) lehetséges szerepét. Mindkét csatorna áramtípusát leírták már több más sejtféleség mellett asztrocitán is (45, 56). Mivel farmakológiai tulajdonságaik jelentosen különböznek, megvizsgáltuk a befelé rektifikáló áram gátlószer-érzékenységét (4. ábra). Az áramot 0 mv-ról 120 mv-ra történo, 15 másodpercenként alkalmazott feszültséglépésekkel aktiváltuk. A hiperpolarizáció-aktivált Cl - csatornák ismert gátlószerei közül a Cd 2+ és a Zn 2+ jelentos mértéku, reverzibilis gátlást fejtett ki; 100?M-os koncentrációban a Cd 2+ 52,2 ± 11,6 %-kal (4A ábra; n=5), a Zn 2+ pedig 36,0 ± 4,5 %-kal (n=4) csökkentette az áram amplitúdóját. Az anion csatornák szerves gátlószerei közül az extracellulárisan alkalmazott 1 mm 9-AC 33,8 ± 7,7 %-kal (4B ábra; n=6), 200?M NPPB 26,7 ± 6,4 %-kal (n=3) gátolt, míg 300?M nifluminsav 14,8 ± 3,5 %-os gyenge gátlást okozott (n=3, 4C ábra). Ezzel szemben a hiperpolarizációaktivált nem specifikus kation csatorna szervetlen gátlószere, az extracellulárisan adott Cs + 3 mm-os koncentrációban nem fejtett ki gátló hatást (n=3). A gátlószer-érzékenység vizsgálata tehát valószínusítette, hogy a befelé rektifikáló áram egy klorid csatornán keresztül jön létre. 31

32 0-120 E (mv) A B Cd pa 200 ms kontroll kimosás 250 pa 9-AC kontroll kimosás C I/I kontroll ????? kontroll Cd 2+ Zn 2+ 9-AC NPPB niflu. Cs + 4. ábra. A befelé rektifikáló áram gátlószer-érzékenysége tenyésztett asztrocitán Az áramot 15 másodpercenként ismételve 0 mv-ról 120 mv-ra történo hiperpolarizáló feszültséglépésekkel aktiváltuk, S1 külso oldatban. Minden gátlószert extracellulárisan alkalmaztunk. A kétértéku kation 100?M Cd 2+ (A) és a szerves gátlószer 1 mm 9-AC (B) reverzibilisen gátolta a hiperpolarizációra aktiválódó áramot (reprezentatív görbék). (C) A 120 mv-os lépés végén mért áramamplitúdó változása a kontroll értékre normalizálva 100?M Cd 2+, 100?M Zn 2+, 1 mm 9-AC, 200?M NPPB, 300?M nifluminsav, valamint 3 mm Cs + hatására. Az oszlopokban az elemszámokat tüntettük fel. A szignifikáns gátlást csillag jelöli. 32

33 A befelé rektifikáló áram töltéshordozója Amikor a Na + és K + ionokat a nagyméretu, nem permeábilis kationnal, NMDG + - vel helyettesítettük, az áram amplitúdója és karakterisztikája nem változott, ami megerosítette, hogy az áram létrejöttéért nem kationcsatorna felelos (ábrát nem mutatok). A klorid ionok töltéshordozó szerepét az ún. farok-áram (tail current) megfordulási potenciáljának vizsgálatával igazoltuk (5. ábra). Az áramot egy hiperpolarizáló feszültséglépéssel aktiváltuk, majd pozitív lépést alkalmaztunk a 40 és +60 mv közé eso tartományban (5. ábra, fent). Pozitív feszültségen az addig aktív csatorna bezárul, ami az áram exponenciális lecsengéséhez vezet, ez az ún. farok-áram. A farok-áram megfordulási potenciálja ott található, ahol az áram meredeksége nulla. A kísérlet optimalizálása érdekében a külso oldatban a Na + és K + ionokat NMDG + -re cseréltük. A Cl - egyensúlyi potenciálját úgy változtattuk, hogy a külso oldatban az NMDG-Cl-ot szacharózzal helyettesítettük, így a Cl - koncentrációt 143 mm-ról 46 mmra csökkentettük. Az alacsonyabb klorid koncentrációnál a Nernst-egyenlet alapján számolt Cl - egyensúlyi potenciál 29,1 mv-tal a pozitív irányba tolódik. Az 5A és 5B ábra egy reprezentatív sejt eredeti regisztrátumait mutatja be a kétféle klorid koncentráció esetén, míg az 5C ábrán a farok-áramok meredeksége látható a feszültség függvényében. Ha a külso Cl - koncentrációt 143 mm-ról 46 mm-ra csökkentettük, a megfordulási potenciál +1,7 ± 1,6 mv-ról +26,4 ± 2,0 mv-ra tolódott (n=5). A mintegy 25 mv-os mért eltolódás jól közelíti a Cl - egyensúlyi potenciáljának számított változását, ami azt mutatja, hogy az áram töltéshordozója döntoen a Cl -. Az intracelluláris ATP szerepe Több Cl - áramról ismert, hogy megjelenésük, kinetikájuk függ a citoplazma ATP koncentrációjától (48, 138). Munkacsoportunk patkány glomus caroticum kemoreceptor sejten is igazolta, hogy a befelé rektifikáló Cl - áram amplitúdója jelentosen nagyobb, ha a pipetta nem tartalmaz ATP-t (Petheo et al., 2001). Ezért megvizsgáltuk, hogyan befolyásolja az asztrocita befelé rektifikáló Cl - áramának viselkedését, ha a pipetta oldatból elhagyjuk az ATP-t. Azonos preparátumokon meghatározva ATP jelenlétében 33

34 A E (mv) I (na) ms B 0 I (na) C E (mv) dekség (pa/ms) 5. ábra. A befelé rektifikáló áram Cl - szelektivitásának vizsgálata tenyésztett asztrocitán Az áramot hiperpolarizációval aktiváltuk, majd különbözo feszültségértékekre léptünk 40 és +60 mv között, 15 másodpercenként. (A-B) Egy reprezentatív sejten felvett görbék 143 mm (S3a oldat; A) és 46 mm (S4a oldat; B) külso [Cl - ] e mellett (ph e 6,9). (C) A farok-áramok meredeksége a feszültség függvényében 0 és +40 mv között a kétféle [Cl - ] e esetén. A meredekséget az A és B ábrán bemutatott, szaggatott vonalakkal határolt szakaszon egyenes illesztésével határoztuk meg (n=5). 34

35 a maximális áramamplitúdó 120 mv-on 26,9 ± 18,3 pa/pf volt (n=7). Az ATP izozmotikus helyettesítése szacharózzal nem befolyásolta a kialakuló áram maximális amplitúdóját ( 28,2 ± 17,0 pa/pf, n=6), tehát (a kemoreceptor sejttol eltéroen) tenyésztett asztrocitán a befelé rektifikáló Cl - áram amplitúdója független az intracelluláris ATP jelenlététol. A befelé rektifikáló áram ph e -érzékenysége A befelé rektifikáló Cl - áram érzékenységét a külso ph változásai iránt az élettani, illetve kórélettani szempontból releváns 6,4-7,9 ph tartományban vizsgáltuk (6. ábra). Amikor a külso oldat ph-ját 7,4-rol 7,9-re emeltük, a 120 mv-on mért steadystate áram amplitúdója 18,0 ± 2,9 %-kal csökkent. Ezzel szemben, hasonló mértéku extracelluláris acidózis (ph e 6,9) hatására az amplitúdó 17,8 ± 5,8 %-os növekedése volt megfigyelheto (6A és 6B ábra, n=7). A ph e további csökkentése 6,4-re már nem okozott további amplitúdóváltozást. A ph e változtatása az aktiváció kinetikáját is befolyásolta (6C ábra): a vizsgált ph e -tartományban az aktiváció mindkét idoállandója ph e 6,9-nél volt a legkisebb, azaz az aktiváció ezen a ph e -n volt a leggyorsabb, míg ph e 6,4-nél az aktiváció jelentos lassulása következett be, amit az idoállandók (elsosorban a? 2 ) növekedése jelzett. A ph e változtatás hatása minden esetben gyors és kimosható volt. 35

36 A E (mv) I (pa) sec 7.4 B C I/I phe?/? ? 1?? ph e 6. ábra. A külso ph változtatásának hatása a befelé rektifikáló áramra tenyésztett asztrocitán (A) Különbözo ph e értékek mellett mért áramgörbék egy reprezentatív sejten. A befelé rektifikáló áramot 15 másodpercenként ismételt, 0-ról 120 mv-ra történo hiperpolarizáló feszültséglépésekkel aktiváltuk. Az S2 külso oldat (mely a megfelelo intracelluláris H + -pufferelés érdekében HEPES mellett PIPES-t is tartalmazott) ph-ját 6,4, 6,9, 7,4 és 7,9 értékekre állítottuk be. (B) A ph e hatása a steady-state áram amplitúdójára (n=7). Az áramértékeket a ph e 7,4 mellett mért amplitúdóhoz viszonyítva adtuk meg. (C) A ph e hatása az aktiváció kettos exponenciális kinetikáját leíró? 1 és? 2 idoállandókra (n=7). Az idoállandók relatív változását a ph e 7,4 mellett mért értékekhez viszonyítva tüntettük fel. 36

37 A ph e -érzékeny áramkomponens Cl - -szelektivitásának vizsgálata Annak kizárására, hogy a ph e változtatása nem az általunk vizsgált anion áramra, hanem valamely egyéb, a befelé rektifikáló Cl - áram mellett párhuzamosan muködo áramkomponensre fejtette ki hatását, bizonyítani szerettük volna, hogy a ph e - érzékeny komponens valóban anionszelektív. Ehhez a befelé rektifikáló Cl - áramot hiperpolarizáló ramp protokollal aktiváltuk, majd 1 másodperc hosszú ramp depolarizációt alkalmaztunk 100-tól +50 mv-ig (7. ábra, bekeretezve). A depolarizációs ramp szakasz alatt a csatorna még nem zárul be teljesen, ezért amennyiben a hiperpolarizációval aktivált áramunkat valami (pl. a ph e ) gátolja vagy aktiválja, a befolyásolt áramkomponens megfordulási potenciálját ezen a szakaszon megmérhetjük. A töltéshordozó egyensúlyi potenciáljánál (ahol a nettó fluxus nulla) az áramerosséget a ph e nem befolyásolja, tehát a két görbe itt keresztezodik. Ha a ph e - érzékeny áramkomponens töltéshordozója a Cl -, akkor a [Cl - ] e változtatásakor az áramkomponens megfordulási potenciáljának követnie kell a Cl - egyensúlyi potenciáljának elméleti eltolódását. A kísérlethez használt külso oldatokban a Na + -ot és K + -ot NMDG + helyettesítette (S3 és S4 oldatok). Kontroll [Cl - ] e (143 mm; S3) mellett a ph e emelése 6,9-rol (S3a) 7,9-re (S3b) gátolta a membrán konduktanciáját (7B ábra, n=5). A gátolt áramkomponens megfordulási potenciálja +2,5 ± 1,8 mv volt. Ezután a [Cl - ] e -t 46 mmra csökkentettük, az NMDG-Cl szacharózzal való helyettesítésével (S4). Alacsony [Cl - ] e jelenlétében megismételve a ph e változtatását a ph e -érzékeny komponens megfordulási potenciálja +28,4 ± 2,1 mv-ra tolódott (7A ábra), ami jól közelíti a Cl - egyensúlyi potenciáljának számolt változását (+29,1 mv eltolódás). Ez bizonyítja, hogy a ph e - érzékeny komponens valóban anion áramnak felel meg. 37

38 A [Cl - ] e =46 mm ph e 7.9 B ph e 6.9 E (mv) ms pa 7. ábra. A ph e -érzékeny áramkomponens anion-szelektivitásának vizsgálata tenyésztett asztrocitán A befelé rektifikáló áramot 100 mv-ra történo folyamatos hiperpolarizáló "ramp"-pel aktiváltuk, amelyet depolarizáló "ramp" követett +50 mv-ig (bekeretezett ábra, a protokoll értelmezését lásd a szövegben). A depolarizáló szakasz szaggatott vonalakkal kiemelt részén mért áramgörbék (A) 46 mm (S4 külso oldat) és (B) 143 mm (S3 külso oldat) [Cl - ] e esetén, kétféle ph e mellett (egy reprezentatív sejten végzett mérés). Az acidózis által aktivált áramkomponens megfordulási potenciálját a szaggatott vonalak jelzik (n=5). 38

39 Kétféle asztrocita típus kimutatása in situ körülmények között Eddig bemutatott asztrocita méréseinket hosszútávú (>2 hét) tenyészeten végeztük. A tenyésztés során a sejt csatorna-expressziója azonban jelentosen megváltozhat. Ezenkívül az asztrocita tenyészetet a bevett módszernek megfeleloen 3 napnál fiatalabb újszülött állatokból készítettük, a rágcsálók agya azonban csak a születés után több héttel éri el a felnottre jellemzo fejlettséget. Ezért megvizsgáltuk, hogy felnott egéragyból készített akut agyszeleten is kimutatható-e a tenyésztett asztrocitán megfigyelt anion áram. Kísérleteinkhez egy genetikailag módosított egértörzset használtunk, amelynek asztrocitái EGFP-t expresszálnak a GFAP-t termelo gén promotere által szabályozottan (101). Az asztrocitákat mérés elott fluoreszcens mikroszkóp segítségével az EGFP jelenléte alapján azonosítottuk. A patch-clamp módszer teljes-sejt felállását alkalmaztuk, a pipettaoldat minden esetben Cs + -ot tartalmazott K + helyett. Elso kísérleteinket a hippocampus CA3 régiójában található sejteken végeztük. Morfológiai és elektrofiziológiai tulajdonságaik alapján az asztrociták két típusát tudtuk elkülöníteni, melyek megfeleltek az irodalomban korábban in situ leírt "komplex" és "passzív" asztrocita típusoknak (32, 101, 136). A komplex sejteket halványabb EGFP fluoreszcencia, kerek vagy ovális sejttest és csak néha látható vékony, hosszú nyúlványok jellemezték (8A ábra). A 70 mv-os tartófeszültségrol rövid de- és hiperpolarizáló lépések sorozatát alkalmazva fiziológiás összetételu külso oldatban ezen a sejttípuson komplex feszültségfüggo áramprofil volt megfigyelheto (8C ábra, n=12). Ezzel szemben a passzív sejtek erosebben fluoreszkáltak és kiterjedt nyúlványrendszerük jól látható volt (8B ábra), a fenti protokollal pedig jelentos nagyságú, feszültségtol független passzív konduktanciát mutattak (8D ábra, n=6). A Cl - áramok vizsgálhatósága érdekében a fiziológiás külso oldatot olyan oldatra cseréltük, melyben a Na + és K + ionokat NMDG + -vel és Cs + -mal helyettesítettük (NMDG-bikarbonát oldat), mivel ezáltal nemcsak a K + áramokat, hanem az esetleg jelenlévo I h áramot is gátolhatjuk. A sejtek konduktancia-változását 0 mv-ról 100 mvra történo ismétlodo feszültséglépésekkel követtük. Na + és K + ionok hiányában a 39

40 KOMPLEX PASSZÍV A B C D 3 2 I (na) 1 0 I (na) ms -1-2 E F 4 I (na) NMDG kontroll 500 ms I (na) NMDG kontroll 8. ábra. Két asztrocita típus kimutatása egér akut hippocampus szeletben in situ Komplex (A) és passzív (B) asztrocitát ábrázoló nagy nagyítású fluoreszcens felvétel. (C-D) A 70 mv-os tartófeszültségrol 15 ms hosszú feszültséglépéseket alkalmaztunk 160 és +60 mv között egy reprezentatív komplex (C) és passzív (D) sejten, BPO-ban. (E-F) A sejteket 0 mv-ról 1,5 másodpercig 100 mv-ra hiperpolarizáltuk egy lépésben, majd folyamatosan depolarizáltuk +50 mv-ig. A kontroll külso BPO-t NMDGbikarbonát oldatra cseréltük. Reprezentatív komplex (E) és passzív (F) sejt. 40

41 komplex sejten a konduktancia drasztikusan csökkent (8E ábra, n=11), míg a passzív sejten csak kismértéku gátlás következett be (8F ábra, n=6). Befelé rektifikáló áram jellemzése komplex asztrocitán in situ Komplex asztrocitán az NMDG-bikarbonát oldat adása után a konduktancia további alakulását olyan protokollal követtük, amelyben 0 mv-ról lassú (2,5 másodperces) folyamatos hiperpolarizációt alkalmaztunk 120 mv-ig, melyet egy gyors depolarizáló ramp követett +50 mv-ig (9A ábra, fent). Hasonlóan a patkány agykérgi asztrocita sejttenyészeten tapasztaltakhoz (2. ábra), a hiperpolarizáló ramp negatív potenciáltartományában egy növekvo amplitúdójú, befelé irányuló áram volt megfigyelheto (9A ábra), amely kb. 3-5 perc alatt érte el a stabil állapotot. Az áram kialakulásának végén és kezdetén felvett görbéket egymásból kivonva megkapjuk a lassan kialakuló áramkomponenst (9B ábra). Az áramkomponens 40,5 ± 7,5 mv-os küszöbbel aktiválódott (n=9), megfordulási potenciálja pedig (a depolarizáló szakaszon leolvasva) +4,8 ± 11,1 mv-nak adódott. Ez a Cl - számolt egyensúlyi potenciáljához (+2,8 mv) közeli érték, ami valószínusíti, hogy az áram Cl - csatornán keresztül folyt. Ezen áram kialakulása 11 komplex sejtbol 10-en megfigyelheto volt. A stabil állapot kialakulása után meghatároztuk az áram aktivációs kinetikáját és feszültségfüggését (10A ábra). A befelé irányuló áram a sejttenyészeten vizsgált áramhoz igen hasonló kinetikát mutatott: kb. 40 mv-nál negatívabb feszültségeken lassan aktiválódott, és nem mutatott inaktivációt 1,5 másodperc alatt. Meghatároztuk a teljes (a feszültséglépések végén mért) steady-state áram feszültség-áram összefüggését (10B ábra, n=10), valamint külön a lassan aktiválódó áramkomponens feszültség-áram összefüggését (10C ábra, n=10). Ez utóbbi komponens (melyet a feszültséglépés végén mért áramértékbol a lépés elején mért áramérték kivonásával határoztunk meg) eros befelé rektifikációt mutatott. Az áramkomponens aktiválódása negatív potenciálokon a teljes steady-state konduktanciában is enyhe befelé rektifikáció megjelenéséhez vezetett (10B ábra). A steady-state áram amplitúdója 100 mv-on 89,7 ± 24,0 pa volt, amely sejtméretre normalizálva 4,6 ± 2,1 pa/pf értéket jelentett. A steady-state áram amplitúdóját 300?M Cd 2+ 53,4 ± 3,9 %-kal csökkentette (10D ábra, n=5). 41

42 A E (mv) I (pa) ms a b c B 20 0 I (pa) ábra. Befelé irányuló áram lassú megjelenése hippocampális komplex asztrocitán in situ (A) NMDG-bikarbonát külso oldatban a 0 mv-os tartófeszültségrol 10 másodpercenként 2,5 másodperc hosszú folyamatos ramp hiperpolarizációt alkalmaztunk 120 mv-ig, majd 500 ms hosszan folyamatosan depolarizáltunk +50 mv-ig. Az a, b és c görbék egy reprezentatív sejten 40 másodperces idoközökkel nyert áramot mutatnak. (B) Az A ábrán látható mérésben a c (120 másodperc) és az a (0 másodperc) görbe kivonásával izoláltan megkaptuk a lassan aktiválódó áramkomponenst. 42

43 0 +40 E (mv) ms B I (pa) I (pa) -50 D E (mv) I (pa) Cd 2+ kontroll 500 ms ábra. Befelé rektifikáló áram jellemzése komplex asztrocitán in situ (A) A 0 mv-os tartófeszültségrol 1,5 másodperc hosszú feszültséglépéseket alkalmaztunk a mv-os tartományban 10 másodpercenként, NMDGbikarbonát oldatban (reprezentatív sejt). (B) A feszültséglépések végén mért áramértékek a feszültség függvényében (n=10). (C) A lassan aktiválódó áramkomponens amplitúdója a feszültség függvényében. A komponens amplitúdóját úgy határoztuk meg, hogy a lépés végén mért áramértékekbol levontuk a lépés kezdetén a kapacitatív áram lecsengése után mért értéket (n=10). (D) 300?M Cd 2+ hatása a befelé rektifikáló áramra (reprezentatív mérés, n=5). Az áramot 10 másodpercenként aktiváltuk 100 mv-ra történo hiperpolarizáló feszültséglépésekkel. 43

44 Az áram jelenlétét megvizsgáltuk ugyanezen kísérleti körülmények között az agykéregben is. A cortexben a hippocampusban találtakkal megegyezoen kimutatható volt a kétféle asztrocita sejttípus, és 7-bol 6 komplex asztrocitán a befelé rektifikáló áram jelenléte. Az agykérgi sejten mért áram kinetikája, amplitúdója és Cd 2+ - érzékenysége megegyezett a hippocampusban kimutatott árammal (ábrát nem mutatok). Passzív asztrocitán nem tudtunk olyan körülményeket teremteni, melyek mellett egy kis amplitúdójú Cl - áram megbízhatóan kimutatható lett volna (lásd 8F ábra), mivel a Na + és K + helyettesítése NMDG + -vel és Cs + -mal nem gátolta kelloképpen a passzív konduktanciát. Ezen a sejten a befelé rektifikáló áram fokozatos kialakulása az adott körülmények között nem volt észlelheto (n=6), bár néhány sejt esetében a hiperpolarizáló lépések során megfigyelheto volt egy lassan aktiválódó, befelé irányuló áramkomponens jelenléte. Ezt a komponenst azonban a domináló passzív konduktancia ingadozása miatt nem tudtuk azonosítani. A Cl - áram nem detektálható ClC-2 "knock-out" egérben Mivel a hiperpolarizáció-aktivált Cl - áram tulajdonságai hasonlóak a Xenopus oocytában expresszált ClC-2 Cl - csatorna által létrehozott áram jellemzoihez (142), megvizsgáltuk, hogy valóban ez a csatorna felelos-e az általunk vizsgált áram kialakításáért. Ehhez egy olyan transzgenikus egértörzset használtunk, melyben a ClC-2 gént inaktiválták (17). Mivel ezek az állatok nem expresszálnak EGFP-t, a komplex asztrocitát elektrofiziológiai jellemzoik (komplex feszültségfüggo áramprofil, nagy amplitúdójú feszültségfüggo Na + áram hiánya, NMDG-bikarbonát oldatra adott reakció) alapján azonosítottuk (11A és 11B ábra). A kontroll (EGFP-t expresszáló) állatoknál alkalmazottal megegyezo kísérleti körülmények között a ClC-2 "knock-out" egerek hippocampusának CA3 régiójában a vizsgált 9 komplex asztrocita egyikén sem volt kimutatható a befelé rektifikáló áram jelenléte. Az áram teljes kialakulásához kontroll állatokban szükséges ido kivárása után az aktivációs protokoll alkalmazásakor a hiperpolarizáló lépéseknél nem jelent meg a lassan aktiválódó komponens (11C ábra), továbbá 300?M Cd 2+ alkalmazása a 100 mv-on mért áram amplitúdójában nem okozott szignifikáns változást (n=4, ábrát nem mutatok). A feszültséglépések végén 44

45 mért áram feszültségfüggésén látható, hogy a ClC-2 "knock-out" állatok steady-state árama (a kontroll, EGFP-expresszáló állatokéval ellentétben, lásd 10B ábra) nem mutat befelé irányuló rektifikációt (11D ábra, n=7). A Cl - áram expressziója csökken reaktív asztrocitában Az agyszövet különbözo eredetu, pl. mechanikus sérülése vagy ischemiás károsodása esetén a sérülés környezetében asztrociták aktiválódnak, ún. reaktív asztrogliózis alakul ki. A reaktív asztrocita mind morfológiailag, mind elektrofiziológiai tulajdonságai tekintetében különbözik a nyugvó sejttol, így pl. mérete nagyobb, fokozottan expresszál GFAP-t, csatornakészletében pedig jellemzo a befelé rektifikáló K + áram csökkenése (122), míg más, pl. feszültségfüggo Ca 2+ áramok kifejezodése fokozódik (163). A hiperpolarizáció-aktivált Cl - áram változását reaktív asztrocitán az EGFP-t termelo felnott egerek jobb oldali parietális kérgében, tu beszúrásával okozott mechanikus sértéssel (ún., "stab wound", szúrt seb) vizsgáltuk, míg a bal oldali kéreg kontrollként szolgált. A mutéti beavatkozás után 2-4 nappal a sérülés helye fluoreszcens mikroszkóppal jól azonosítható volt a környezo, erosen fluoreszkáló (azaz fokozottan GFAP-termelo) reaktív asztrociták jelenléte alapján (12A és 12B ábra). A komplex áramprofillal rendelkezo reaktív sejtek közül csak azokat a sejteket elemeztük, ahol a passzív konduktancia 100 mv-on az NMDG-bikarbonát oldat adásakor 300 pa-nál kisebb értékre csökkent (a sejtek 80 %-a). Az áram kimutatásához a korábban is alkalmazott aktivációs protokollt használtuk. A kontroll oldalon a vizsgált 6 sejt mindegyikén jelentos amplitúdójú befelé rektifikáló Cl - áram aktiválódott (12F ábra). Ezzel szemben, a sértés oldalán a vizsgált 8 reaktív sejtbol 5-nél a befelé rektifikáló áram nem volt detektálható (12C ábra), míg a maradék 3 sejten kis amplitúdójú hiperpolarizáció-aktivált komponens kimutatható volt (12D ábra). 45

46 B 1.0 I (na) NMDG ms ctr D 150 E (mv) ábra. A befelé rektifikáló áram nem mutatható ki ClC-2 "knock-out" egérbol származó komplex asztrocitán in situ (A) Reprezentatív komplex asztrocita jellegzetes feszültségfüggo áramprofilja ClC-2 "knock-out" egér hippocampusában in situ. Az oldatok és a feszültségprotokoll azonos a 9C ábrán leírtakkal. (B) A külso BPO cseréje NMDG-bikarbonát oldatra a konduktancia jelentos csökkenéséhez vezetett (oldatok és a feszültségprotokoll leírása a 9E ábrán). (C) Aktivációs protokoll által kiváltott áram egy reprezentatív sejten (oldatok és protokoll azonos a 10A ábránál leírtakkal). (D) A feszültséglépések végén mért áramértékek a feszültség függvényében (n=7). I (pa) 46

47 Sértett oldal A B C E (mv) D I (pa) I (pa) ms -200 E Kontroll oldal F I (pa) ábra. A befelé rektifikáló Cl - áram vizsgálata reaktív asztrocitán in situ (A) Kis nagyítású fluoreszcens kép a sértés helyén. A szúrcsatorna körüli reaktív sejtek erosen fluoreszkálnak (nyilak). (B) Nagy nagyítású fluoreszcens kép egy reaktív asztrocitáról. (C-D) Aktivációs protokoll során mért áramok két reprezentatív reaktív sejten (protokoll és oldatok leírását lásd a 10A ábránál). (E) Kis nagyítású fluoreszcens kép a kontroll oldalról. A nyugvó sejtek fluoreszcenciája gyengébb (nyilak). (F) Aktivációs protokoll során mért áram egy reprezentatív kontroll sejten. 47