-Két fő korlát: - asztrogliák rendkívüli morfológiája -Ca szignálok értelmezési nehézségei

Átírás

1 Nature reviewes ellentmondás: az asztrociták relatív lassú és térben elkent Ca 2+ hullámokkal kommunikálnak a gyors és pontos neuronális körökkel - minőségi ugrás kell a kísérleti és analitikai módszerekben - Ca 2+ hullámok felfedezése -> serkenthetőség ötlete - fiziológiás jelek átvitele az asztrocita Ca 2+ hullámokon keresztül - asztroglia= új játékos az információ feldolgozó rendszerben -Két fő korlát: - asztrogliák rendkívüli morfológiája -Ca szignálok értelmezési nehézségei

2 Asztroglia morfológia -korai mikroszkópia: a felépítés inkább hálózatos, mint dendritikus -később EM: kitüremkedések térbeli hálózata, (kitüremkedés: nm keskeny) -DE! EM hátránya fixiálás stb. finom struktúrák megváltozása -> élő asztrociták in situ vizsgálata -két-foton mikroszkópia: fluoreszcens jel detekció élő sejtekből -de homályos fluoreszcens jel, az ultravékony nyúlványok meghaladják a felbontóképességet (0,3-1,0 μm) -konvolúciós eljárással sem javítható, mivel a szomszédos nyúlványok közötti távolság is a felbontóképesség alá esik

3 Asztroglia morfológia B: 3D EM rekonstrukció patkány hippokampuszból C: piros: PSF-pont térbeli kiterjedése (2P mikroszkópia )

4 Az asztrogliák rejtélyes felépítése - Topólógiai szerveződés (belső összeköttetések): -dendritikus: fa szerű növekedés, nincsenek direkt összeköttetések vagy hurkok a magasabb rendű ágak között, klasszikus leány-ágas elágazások asztrociták elsődleges nyúlványai -szivacs szerű: gap junctionokon keresztüli összeköttetés azonos sejt különböző nyúlványai között (reflexív módon)? Vajon képesek-e fúzionálni az ultravékony nyúlványok? -az ultravékony nyúlványok hálózata a szómától különböző távolságokra egyformán sűrű -3D EM rekonstrukció, sárga: szómához közeli, kék: periférikus

5 Az asztrogliák rejtélyes felépítése - Regeneráció és membránfluiditás - patch pipetta nyúlványon való átszúrása nem okoz zavart a mért sejtfunkciókban és Ca 2+ -jelekben - nagy a membránok fúziós és szigetelő kapacitása - nagy membránfluiditás -> palacsinta szerű szétterülés a monolayer tenyészetekben

6 A Ca 2+ homeosztázis és az ER - Ca 2+ -homeosztázis kulcs útvonala az IP3 receptor szignaling -> Ca 2+ felszabadulás az ER raktárakból - Ca 2+ -függő rianodin receptorok; ER ATP-áz pumpái - Ca 2+ -hullámok generálódásához lényeges a Ca 2+ -érzékeny intracelluláris Ca 2+ raktár-receptorok alkalomfüggő aktivációja, ER fontos szerepe - dendrittüskékben az összefüggő ER struktúrák minimális mérete nm - ER/lokális citoplazma aránya 2-10% -3D EM rekonstrukció -3D EM rekonstrukció, hippokampusz CA1, piramissejt - ez az arány nem fenntartható az ultravékony asztroglia nyúlványokban ( nm) - ER és mitokondriumok a szinapszistól >0,5 μm távolságra a vastagabb ágakban

7 A Ca 2+ hullámok és Ca 2+ imaging - Ca 2+ -hullám kialakulása főleg a vastagabb nyúlványokon, passzív diffúzióval jut el, az ultravékony nyúlványokig - Ca 2+ -hullámok elemzése nagy felbontáson lehetséges csak - korai mikroszkópos technikák nem tették lehetővé a gyenge Ca 2+ -hullámok detektálását, és lassú (mp) Ca 2+ szignálokról számoltak be - a gyors lokális Ca 2+ jeleket (ún. hotspot) nem lehetett megkülönböztetni a háttérzajtól az alacsony jel-zaj arány miatt - kísérletről-kísérletre változó Ca 2+ -jelek -> átlagolás nem lehetséges - ma már fejlettebb technika: Ca 2+ szignaling indítása: - ic. Ca 2+ raktár receptorok ligandjainak fotolitikus felszabadítása - glutamát extracell. uncaging, whole-cell patch, bulk-loading stb - nagy érzékenységű Ca 2+ monitorozás: - ultraérzékeny raciometrimetrikus Ca 2+ szenzorok - genetikailag kódolt asztroglia specifikus Ca szenzorokra - nagy affinitású Ca 2+ szenzorok, de! a fluoreszcens jel tovább tart, mint a vált. (-kis affinitás -> csökkenti az érzékenységet)

8 A Ca 2+ hullámok és Ca 2+ imaging - minél több Ca 2+ kötött annál intenzívebb a fluoreszcens jel - DE! a fluoreszcens jel nem tükrözi a térbeli eloszlást és a [Ca 2+ ] időbeli változását - Ca 2+ imaging célja: a fiziológiai aktivitás hátterében álló molekuláris kaszkádok azonosítása - Ca 2+ dinamika megfejtése fontos a faktorok azonosításához - állandó állapot (steady-state) közelítés: kémiai reakció kinetikus egyenletének leegyszerűsítése - DE! a Ca 2+ kötődésnek és leválásnak gyorsabb legyen, mint a [Ca 2+ ] változása

9 A Ca 2+ hullámok és Ca 2+ imaging - nem állandó modellek a Ca 2+ fluoreszcenciára, az időbeliséget jól mutatják, de! sebességet és a térbeli inhomogenitást (hotspotok) nem - hippokampusz szemcsesejt axon: akciós potenciál -> Ca 2+ beáramlás, - narancs: különböző fluoreszcencia a Ca 2+ indikától és Ca 2+ koncentrációtól függően, - fekete vonal: kinetikus modell

10 C: az előző kísérlet teoretikus becslése, - fluoreszcencia változás az idő függvényében: meredekség deriválás, - különböző [Ca 2+ ] adása különböző ideig -> hasonló fluoreszcens görbe - nehézség: fluoreszcens jel értelmezése a telítődés közelében D: Ca 2+ hotspotok (sárga) az asztrocita nyúlványokban