Az ioncsatorna fehérjék szerkezete, működése és szabályozása. A patch-clamp technika

Átírás

1 Az ioncsatorna fehérjék szerkezete, működése és szabályozása. A patch-clamp technika Panyi György November 12.

2 Mesterséges membránok ionok számára átjárhatatlanok

3 Iontranszport a membránon keresztül: transzport fehérjékre van szükség! extracelluláris citoszolikus zárt nyitott ATP ADP+P i ATP-függő pumpa ioncsatorna transzporter ion/s ion/s ion/s

4 Nettó töltés átjutása a membránon ÁRAM Két csatorna szimultán nyitása Membránpotenciál nyitott zárt Az egyedi ioncsatorna áramok néhány pa (10-12 A) nagyságrendűek Az egyedi ioncsatorna vezetőképesség (G=I/U) nagyságrendje néhányszor 10 ps (10-12 S, S:Siemens)

5 Az ioncsatornák integráns (transzembrán) fehérjék

6 Nobel Díj, Kémia, 2003 Roderick MacKinnon for structural and mechanistic studies of ion channels Crystal structure of the voltage gated potassium channel, S5-S6 Peter Agre, for the discovery of water channels

7 Az ioncsatorna egyszerűsített működési modellje: a membránon keresztül érő hidrofil pórus hajtóerő + nyitott kapu ionáram

8 Az elektrokémiai gradiens és a vezetőképesség határozza meg az ionáram nagyságát és irányát egyensúly esetén nincs nettó áram [K + ] o =5 mm E m =E K I = G (E m E K )= 0 E m [K + ] i =140 mm + RT [K ] i EK = ln = 89 mv + zf [K ] T= 37 o C, z=1 I = G(E m E K )= 0 o E m E K I = G(E m E K ) 0 E m <E K I<0, sejtbe irányuló K + áram E m >E K I>0, sejtből kifelé folyó K + áram

9 Az ioncsatornák osztályozása Kapuzás szerint megfelelő inger hatására bekövetkező konformáció változás a fehérjében, mely a csatornák különböző állapotaihoz vezet (pl. zárt, nyitott, inaktivált állapotok). Szelektivitás alapján csak bizonyos fajta ion (vagy ionok) számára átjárható a pórus (pl. nagy szelektivitású, kis szelektivitású, és nem szelektív csatornák).

10 Kapuzás I. A csatornák felosztása a nem vezető (zárt) és vezető (nyitott) állapot közötti átmenetet kiváltó inger alapján: feszültség kapuzott a membránpotenciál megváltozása (pl. idegsejtek depolarizáció aktiválta K + és Na + csatornái). ligand kapuzott a ligand bekötődése az extracelluláris oldalon (p.l ideg-izom kapcsolatban az acetikolin receptor). i.c hírvivő molekula által kapuzott a ligand bekötődése az intracelluláris oldalon (pl a Ca 2+ aktiválta K + csatorna). membrán feszülés által kapuzott ( stretch gated ) a membrán feszülése (pl. limfociták térfogatszabályzásában Cl csatornák nyitása).

11 Kapuzás II. Az ioncsatornák lehetséges kapuzási állapotai: -funkcionális állapotok (vezető, nem-vezető) -szerkezeti állapotok (pl. zárt, nyitott, inaktivált) E m Ny (O) /vezető Z (C) /nem-vezető I /nem-vezető O C +50 mv -120 mv 0.5 pa 100 ms I

12 A feszültség kapuzott ioncsatornák főbb szerkezeti elemei extracelluláris pórust alkotó S5-S6 hurok α α K + α citoszolikus feszültség érzékelő α NH 2 Feszültség érzékelő domén: a membránpotenciál változás érzékelése pórust kialakító domén: konduktancia pórust alkotó S5-S6 hurok négy alegység együtt alkot egy funkcionáló csatornát szelektivitási szűrő: a csatorna ion szelektivitásáért felelős extracelluláris S4 S6 S6 S4 citoszolikus S4-S5 kapcsoló kapu

13 Kapuzás III. A feszültség szenzor azonosítása feszültség szenzor egy pozitív töltéssel kevesebbet tartalmazó feszültség szenzor Nyitási valószínűség open probability WT R368Q test potential (mv) Membrán potenciál (mv)

14 Kapuzás IV. az inaktivációért felelős domain azonosítása a.) vad típusú K + csatorna Current Wild-type Deletion mutant Δ6-46 b.) mutáns K + csatorna Current Zagotta et al. 1990

15 Az ioncsatornák osztályozása szelektivitás alapján Nagy szelektivitású csatornák, négy alegység: K +, Na +, Ca 2+, Cl - Kis szelektivitású csatornák, öt alegység: Acetilkolin receptor, csak kationokra specifikus Nem szelektív csatornák: Gap junction csatorna (hat alegység)

16 A szelektivitást biztosító mechanizmusok Szelektivitási szűrő kálium ion pórus hurok 20Å K + K + K + pórus üreg méret alapján: ami nem fér be a pórusba az nem megy át a csatornán töltés alapján: a nem megfelelő töltésű ion nem mehet át specifikus kölcsönhatások alapján: a megfelelő méretű és töltésű ionok közötti válogatás

17 Töltés alapján szelektál a nikotinerg acetilkolin receptor (ligand kapuzott ion csatorna) pórus filter acetilkolin kötőhely extracell. plazmamembrán citoszolikus kapu

18 Specifikus kölcsönhatások a pórus és az ionok között I. röntgen krisztallográfiás kép a pórusról Szelektivitási szűrő kálium ion pórus hurok K + K + K + pórus üreg szelektivitási filter (GYGD) a pórusban tartózkodó ionok

19 Specifikus kölcsönhatások a pórus és az ionok között II. A vízburok helyettesítése a szelektivitási szűrőben K + : 1.33 Å Na + : 0.95 Å szelektivitási szűrő kálium ion pórus hurok H hyd = 322 kj/mol H hyd = 406 kj/mol K + K + ion a szelektivitási szűrőben K + Na + K + pórus üreg ion vizes közegben K + Na +

20 Hogyan tanulmányozhatók az ioncsatornák? Az ionáramok mérésével a patch-clamp technika alkalmazásával R f I p - + V ki E m I m V tart áram (pa) mv aktiváció -80 mv +30 mv -10 mv -50 mv inaktiváció -40 mv idő (ms)

21 cell attached patch whole cell vákuum húzás outside out patch

22 Patch pipetta a sejten ill. EM kép hőpolírozást követően Sakmann, Nobel lecture, 1992, Neuron 8:

23 Az ioncsatornák főbb funkciói Membránpotenciál kialakítása és szabályozása nyugalmi potenciál E m = RT p K[K] i + p Na[Na] i + p Cl[Cl] o ln Fz p [K] + p [Na] + p [Cl] K o Na o Cl i extracell. citoszolikus K + Na + Cl

24 Az ioncsatornák főbb funkciói Membránpotenciál kialakítása és szabályozása nyugalmi potenciál akciós potenciál Membránpotenciál (mv) +50 felszálló szár: depolarizáció 0 70 küszöb leszálló szár: repolarizáció Küszöb alatti ingerek utó hiperpolarizáció Vezetőképesség [mmho/(cm 2 )] Na + permeábilitás K + permeábilitás Idő (ms)

25 Az ioncsatornák főbb funkciói Membránpotenciál kialakítása és szabályozása nyugalmi potenciál akciós potenciál E m RT p K[K] i + p Na[Na] i + p Cl[Cl] o = ln Fz p [K] + p [Na] + p [Cl] extracell. K o Na o Cl i Intracelluáris ionkoncentráció változások kialakítása [Ca 2+ ] i emelkedés Az idegvégződés depolarizációjakor a feszültség-kapuzott Ca 2+ csatorna (1) kinyílik, Ca2+ influx szinaptikus vezikula szekréció (2). citoszolikus A. 1 K + Na + Cl 2 Idegsejt akciós potenciál Izomsejt Szarkoplazmatikus retikulum

26 Az ioncsatornák gyógyszerek támadáspontjai 1, pórus blokkolók e.c. gátlás i.c. gátlás

27 Az ioncsatornák gyógyszerek támadáspontjai 2, kapuzást módosító molekulák e.c. gátlás i.c.