CELLULÁRIS SZÍV- ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK. Dr. Virág László

Átírás

1 CELLULÁRIS SZÍV- ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK Dr. Virág László

2 Intracelluláris mikroelektród technika Voltage clamp technika Patch clamp technika

3 Membrane potentials and excitation of impaled single muscle fibers. J. Graham, R. W. Gerard. J Cell Physiol Aug;28(1): J Cell Physiol Dec;34(3):

4 J. Physiol. (I95I) 115, Coraboeuf, E. & Weidmann, S. (1949a). C.R. Soc. Biol., Paris, 143, Coraboeuf, E. & Weidmann, S. (1949b). C.R. Soc. Biol., Paris, 143, 1360.

5 Intracelluláris mikroelektród technika

6 Ag/AgCl 3 M KCl R e ~ MOhm µm

7

8 erősítő számítógép ingerlő d e r A/D P Detektált jel szervfürdő 0mV d: ingerlő elektróda e: mikroelektróda r: referens elektróda P: preparátum 50 mv 100 ms

9

10

11

12 0 mv APA 50% 100 ms 20 mv V max 90% RP APD 50 előinkubáció APD 90 anyag kimosás 60 perc perc 60 perc

13 Voltage clamp technika Cole KS (1949) Dynamic Electrical Characteristics of the Squid Axon Membrane. Arch. Sci. Physiol. 3:

14 Két mikroelektródás voltage clamp teszt potenciál parancsjel (voltage command) holding potenciál makroszkópikus nátrium-áram

15 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ (1981) Improved Patch-Clamp Techniques for High-Resolution Current Recording from Cells and Cell-Free Membrane Patches. Pflügers Arch. 391:

16

17

18

19 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (1) Szívjunk be egy kis membrán darabot a mikropipetta hegyének belsejébe (átmérő ~ 1 µm) Sejt

20 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (2) Gigaohm-seal R > 1 GOhm Sejt

21 M. Sokabe and E Sachs, The Journal of Cell Biology, Volume 111, , 1990.

22 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. Sejt

23 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete zárt nyitott (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. + + Sejt

24 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete zárt nyitott zárt (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. Sejt

25 Nátrium csatornák tulajdonságai parancsjel (voltage command) 10 msec

26 Két mikroelektródás voltage clamp teszt potenciál parancsjel (voltage command) holding potenciál makroszkópikus nátrium-áram

27 Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak

28 Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. makroszkópikus nátrium áram

29 Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik makroszkópikus nátrium áram

30 Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 300 felvétel szummája makroszkópikus nátrium áram

31 Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 5. A csatornák inaktivációja miatt a másodszori nyitás nagyon ritka 300 felvétel szummája makroszkópikus nátrium áram

32 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak. 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 5. A csatornák többször is kinyílhatnak, ha nincs inaktiváció Slowly inactivating K current channel (Ram & Dagan, 1987)

33 Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Cell-Attached

34 Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Insideout patch

35 Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Whole Cell

36 Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell

37 Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell outsideout patch

38

39 Whole cell konfiguráció

40 Whole cell konfiguráció

41 Whole cell konfiguráció R s R c C m C m R s

42 A whole cell konfiguráció Intracelluláris oldat Mikropipetta Patch-clamp erősítő Extracelluláris oldat + _ Sejt _ + + IBM PC -20 mv mv -40 mv 10 ms ms

43

44

45

46

47 Run-down jelenség ATP-függő kálium áram

48 Run-down jelenség L típusú kalcium áram

49 Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell Whole Cell, perforated patch - amphotericin-b - nystatin

50 Run-down jelenség L típusú kalcium áram

51 Sejtizoláció - Ca 2+ - mentes perfúzió - emésztés (kollagenáz...) - mechanikai agitáció

52 L típusú kalcium áram 400 ms 0 mv -40 mv 100 ms 200 pa

53 L típusú kalcium áram -40 mv -35 mv I Ca amplítúdó (pa) Potenciál (mv)

54 L típusú kalcium áram -40 mv -30 mv I Ca amplítúdó (pa) Potenciál (mv)

55 L típusú kalcium áram -40 mv -25 mv I Ca amplítúdó (pa) Potenciál (mv)

56 L típusú kalcium áram -40 mv -20 mv I Ca amplítúdó (pa) Potenciál (mv)

57 L típusú kalcium áram -40 mv -15 mv I Ca amplítúdó (pa) Potenciál (mv)

58 L típusú kalcium áram -40 mv -10 mv I Ca amplítúdó (pa) Potenciál (mv)

59 L típusú kalcium áram -40 mv 55 mv I Ca amplítúdó (pa) 0 Áram-feszültség (I-V) karakterisztika Potenciál (mv) előinkubáció anyag kimosás 5-10 perc 5-10 perc perc