(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: A61K 39/012 (06.01) C12N 1/36 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/US 03/00483 (30) Elsõbbségi adatok: P US (72) Feltaláló: DAVELAAR, Frans, Gerrit, NL-3881 EG Putten (NL) (73) Jogosult: Wyeth, Madison, New Jersey 079 (US) (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Baromfiparazita Eimeria törzsek szelektálása extraintestinalis sporozoitokon keresztül (7) Kivonat A találmány tárgya coccidiosis elleni vakcina elõállítására alkalmas immunogén törzs létrehozására szolgáló eljárás specifikus patogéntõl mentes donor madarak legalább egy csoportjának Eimeria fajból származó oocisztákkal történõ fertõzési ciklusát foglalja magában. A donor madarakból késõbb vért vesznek, majd azt specifikus patogéntõl mentes madarak második csoportjának fertõzésére alkalmazzák. A madarak második csoportjából oocisztákat gyûjtenek, s ezeket az oociszták felszaporítják, ami a ciklus befejezését jelenti. A ciklust ezután a felszaporított oociszták alkalmazásával megismétlik. Összesen körülbelül három ciklust követõen a végsõ immunogént begyûjthetik és kiindulási anyagként alkalmazhatják coccidiosis elleni vakcina elõállításához. HU T2 A leírás terjedelme 14 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány tárgyköre A találmány tárgyát Eimeria fajok újonnan kifejlesztett törzsei képezik, amelyek erõteljes immunogén tulajdonságokkal és csekély patogenitással bírnak, mely sajátságok elõnyösek az anticoccidia vakcinákhoz alkalmas oociszták elõállítása szempontjából. Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát új eljárások képezik Eimeria fajok legyengített törzseinek kinyerésére, melyek coccidiosis elleni vakcinák elõállítására alkalmasak. A találmány technikai háttere A coccidiosis egy madarakat megtámadó betegség, amelyet a számos coccidium faj (melyek az Apicomplexa altörzs Eimeria nemzetségébe tartozó intracelluláris protozoa paraziták) közül egy vagy több fertõzése okoz. A cocciodiosisról ismeretes, hogy több különbözõ Eimeria faj okozza, nevezetesen az Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, és feltehetõen az E. mivati és E. hagani. E fajok madarakra kifejtett patogén hatása eltérõ, s ebben a madár típusa is szerepet játszik. Ilyenformán, broiler-csirkében egy ilyen parazita (például E. acervulina) nagyon nagy károsodást okoz, mivel a vékonybél nagy hányadát fertõzi meg, ahol a táplálék emésztése a fõ funkció. Életciklusa során az Eimeria parazita számos stádiumon megy keresztül. Az életciklus azzal kezdõdik, hogy a csirke a földrõl történõ táplálkozás során vagy por belélegzésével lenyeli a fertõzõ stádiumot (amely spóraképzõ oocisztaként ismert). A spóraképzõ oociszta fala a zúzógyomorban és a bélcsatornában mechanikai hatásra megreped és négy sporocisztát bocsát ki. A sporociszták a nyombélbe kerülnek, ahol az epe és az emésztõ enzimek hatására sporocisztánként átlagosan két sporozoit szabadul fel. A sporozoitok mozgékonyak, és megfelelõ gazda epitheliumsejteket keresnek a penetrációhoz és a bennük történõ reprodukcióhoz. Az epitheliumsejtek fertõzése után a parazita életciklusának schizont fázisába kerül (schizontonként 8 6-tól akár 0-nál is több merozoitot létrehozva). A merozoitok a schizontból kiszabadulva készek további epitheliumok megfertõzésére. 2 ilyen ivartalan szaporodási ciklust követõen az intacelluláris merozoitok ivaros alakokká fejlõdnek, melyek nõivarú makrogametocitaként, illetve hímivarú mikrogametocitaként ismertek. A makrogrametocita mikrogametocitából felszabaduló mikrogaméták által bekövetkezõ megtermékenyítése után zigóta képzõdik, amely önmaga körül cisztafalat hoz létre. Az újonnan kialakult oociszta a fertõzött csirkébõl ürülék útján távozik. Az oociszta, megfelelõ környezeti feltételek (hõmérséklet, páratartalom, elégséges oxigénellátottság) megléte esetén fertõzõképes stádiumba kerül (sporulálódik), ezáltal képes új gazdát megfertõzni és a betegséget továbbterjeszteni. Ez azt jelenti, hogy a parazita madárról madárra történõ átterjedéséhez nincs szükség köztesgazdára. A madarak emésztõrendszerét érintõ Eimeria parazitafertõzés eredménye a tömeggyarapodás csökkenése, a lecsökkent táplálékhasznosítás, a tojástermelés szünetelése és bizonyos esetekben elhullás. Az intenzív baromfitermelés növekedésében e parazita miatt súlyosan veszteségek adódnak. A veszteségek az Egyesült Államokban és Európában, becslések szerint, évente több százmillió dollárt meghaladó nagyságúak. A coccidiosis leküzdésére számos kísérletet tettek. A kemoterápiás hatóanyagok kifejlesztése elõtt a fõ módszerek a fertõtlenítõszereket alkalmazó javított higiéniai intézkedések voltak (a használt alom mechanikai eltávolítása mellett). Ezen túlmenõen, a coccidiosztatikus hatóanyagok takarmányba és ivóvízbe történõ keverése a jó állattartási gyakorlattal párosulva némi sikert eredményezett a betegség leküzdésében. Mindazonáltal, az ilyen hatóanyagok hatékonysága az évek során csökken, részben a drogrezisztens coccidia-törzsek kifejlõdése miatt. Ezenfelül, számos kemoterápiás hatóanyagról bebizonyosodott, hogy alkalmazásukat követõen a baromfiak húsában maradványvegyületek mutathatók ki, ami e húsokat gyakran fogyasztásra alkalmatlanná teszi. A betegség megfékezésére tett további kísérletek immunológiai alapúak voltak. Ezek közé tartozik az élõ vakcinák kifejlesztése és a génsebészeti technikák alkalmazása a vakcinák elõállítására. E próbálkozások közül több a vakcina aktív komponenseként Eimeriaprotein alkalmazásán alapult. Például, Tomley és munkatársai ( és számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások) immunogén tulajdonságokkal bíró Eimeria-proteint, valamint ilyen proteineket kódoló DNS-szekvenciákat tártak fel. Hasonló megoldást tártak fel Kok és munkatársai is ( számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Andrews és munkatársai egy konkrét nukleinsavszekvenciájú DNSmolekulát tártak fel ( és ), míg Mewman és munkatársai ( számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) olyan tisztított antigénhatású proteint tártak fel, amely csirkében Eimeria necatrix vagy Eimeria tenella elleni immunreakció indukálására képes. Brown és munkatársai coccidiosis elleni vakcinát tártak fel ( számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Jelenleg olyan új coccidiosis elleni vakcinára van szükség, amely hatékony, könnyen adagolható és gazdaságos. Szükség van továbbá olyan új és invenciózus Eimeria törzsekre, amelyek baromfikban immunreakció kiváltására alkalmazhatók, abból a célból, hogy vakcinában történõ alkalmazás szempontjából megfelelõ oociszta álljon rendelkezésre. Ezenfelül, Eimeria törzsek legyengítésének új eljárásaira van szükség, hogy e törzsek alkalmazhatók legyenek vakcinák kifejlesztésére. Fentieken túlmenõen, olyan Eimeria törzsek kifejlesztésére van szükség, amelyek oocisztái vakcinába foglalva Eimeria fajok szélesebb spektruma ellen biztosítanak keresztvédettséget. A találmány összefoglalása A találmány értelmében izolált protozoa törzset tárunk fel, amelyre jellemzõ, hogy baromfikban coccidiosis elleni immunreakciót indukáló, nem patogén oociszták létrehozása céljából le van gyengítve. 2

3 Felismertük, hogy a coccidia-életciklusú és ezáltal extraintestinalis sporozoitokat létrehozó protozoa fajok alkalmasak vakcinafejlesztésben történõ felhasználásra. Ennek megfelelõen, a találmány elsõ megvalósítási módja értelmében, ahogy fentebb leírtuk, izolált protozoa törzset tárunk fel, amely egy legyengített coccidia faj. Az Eimeria nemzetségbe tartozó fajokról felismertük, hogy különösen elõnyösek coccidiosis elleni új, legyengített vírusvakcinák kifejlesztésére. Meglepõ módon, azt találtuk, hogy az Eimeria fajok sorozatos átoltással (passzálással) történõ legyengítésével olyan, nem patogén oociszták hozhatók létre, amelyeknek megmarad azon képességük, hogy baromfiban coccidiosis elleni immunreakciót indukáljanak. Ennek megfelelõen, a találmány célja egy Eimeria nemzetségbõl kiválasztott faj izolált, nem patogén törzsének feltárása, amely baromfiban coccidiosis elleni immunreakciót indukáló, nem patogén oociszták létrehozása céljából le lett gyengítve. Közelebbrõl, felismertük, hogy egy Eimeria faj törzsének egymást követõen legalább kilenc, specifikus patogéntõl mentes (SPF) madáron keresztül történõ átoltásával olyan legyengített, nem patogén Eimeria törzs hozható létre, amely megtartja azon képességét, hogy baromfiban coccidiosis elleni védõ hatású immunreakciót indukáljon. Ilyenformán, a találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint Eimeria nemzetségbõl kiválasztott faj izolált törzsét tárjuk fel, amely egymást követõen legalább kilenc SPF-madáron keresztüli átoltással le lett gyengítve, abból a célból, hogy baromfiban coccidiosis elleni védõ hatású immunreakciót indukáló, nem patogén oociszták legyenek létrehozhatók. Az Eimeria faj SPF-madarakon keresztüli túl sok egymást követõ átoltása az így létrehozott, legyengített törzs (coccidiosis ellen védõ hatású) immunreakciót indukáló képességének csökkenéséhez vezethet. Ilyen célra alkalmas, legyengített törzs kifejlesztése során megfelelõ egyensúlyt kell találni a legyengített törzs patogenitásának elégséges mértékû hiánya és coccidiosis elleni védettséget biztosító immunreakciót indukáló képessége között. Ennek megfelelõen, a kellõ hatékonyságú törzsek kifejlesztése során alkalmazott egymást követõ átoltások száma legfeljebb 2, elõnyösebben legfeljebb, még elõnyösebben 9. Egy legelõnyösebb megvalósítási mód szerint a megfelelõ legyengítést egy Eimeria faj törzsének SPF-madarakon végzett 9 12 egymás utáni átoltásával érjük el. A találmány céljainak megvalósításához az Eimeria faj törzseit elõnyösen a következõkbõl álló csoportból választjuk ki: Eimeria acervulina, Eimeria maxima, Eimeria tenella, Eimeria necatrix, Eimeria brunetti, Eimeria mitis, Eimeria praecox, Eimeria mivati, Eimeria Hagani, Eimeria adenoeides, Eimeria gallopavonis, Eimeria meleagridis és Eimeria meleagrimitis. Azt találtuk, hogy az Eimeria acervulina faj törzsei különösen alkalmasak a találmány szerinti legyengítésre, különösen olyan esetekben, ha az immunitást csirkékben kívánjuk kialakítani. Ennek megfelelõen, a találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módja szerint olyan törzset tárunk fel, amely coccidiosis elleni immunreakciót indukáló, nem patogén oociszták létrehozása céljából van legyengítve, mely törzs egy Eimeria acervulina törzs. A találmány egyik legelõnyösebb megvalósítási módja értelmében olyan Eimeria törzset tárunk fel, amely az Európai Sejttenyészet Gyûjteménynél ( European Collection of Cell Cultures ) 0911 nyilvántartási számon letétbe helyezett E. acervulina törzs (más néven A3C2A2-törzs) immunogén jellemzõivel bír. A találmány harmadik célkitûzésének megfelelõen, egy fentebb említett izolált törzset tárunk fel baromfiban coccidiosis elleni immunitás kialakítására történõ alkalmazásra. A találmány negyedik célkitûzésének megfelelõen, baromfivakcinát tárunk fel, amely Eimeria nemzetségbõl kiválasztott faj legyengített törzsének nem patogén oocisztáit és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz, mely oociszták coccidiosis elleni immunreakciót indukálnak. A találmány szerinti vakcinában alkalmazható oociszták elõnyösen extraintestinalis oociszták. Megállapítottuk továbbá, hogy madarakban coccidiosis elleni védõ hatású immunreakció indukálható olyan vakcinával végzett oltással, amely dózisonként legalább 4 megfelelõen legyengített Eimeria fajból származó oocisztát tartalmaz. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vakcina dózisonként legalább körülbelül 4 Eimeria oocisztát tartalmaz, mely Eimeria SPF-madarakban legalább kilenc egymást követõ átoltással lett legyengítve. Az e célra alkalmas Eimeria faj elõnyösen az Eimeria acervulina. A találmány ötödik célkitûzésének megfelelõen, eljárást tárunk fel Eimeria faj nem patogén oocisztáinak elõállítására, mely oociszták baromfiban coccidiosis elleni immunreakció indukálására képesek, mely eljárás egy Eimeria faj törzsének SPF-madarakban egymást követõen legalább kilenc alkalommal történõ átoltással végzett legyengítését foglalja magában. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint egy Eimeria faj törzsét a következõ lépésekbõl álló eljárással gyengítjük le: (i) legalább egy SPF-madár Eimeria oocisztákkal történõ beoltása; (ii) vér vétele az (i) lépésben beoltott madárból; (iii) legalább egy második SPF madár beoltása az (ii) lépésben vett vérrel; (iv) Eimeria oociszták gyûjtése egy (iii) lépésben beoltott madárból; (v) a (iv) lépésben gyûjtött oociszták legalább egy további SPF-madárban történõ szaporítása és e madárból oociszták gyûjtése; ahol az (i) (v) lépések egy legalább három alkalommal ismétlésre kerülõ ciklust reprezentálnak; és ahol az egyes ciklusok (v) lépésében gyûjtött oocisztákat a következõ ciklus (i) beoltási lépésében használjuk fel. Egy további elõnyös megvalósítási módnak megfelelõen, a találmány szerinti eljárással végzett legyengítéshez kiválasztott törzs az Eimeria acervulina faj egy törzse. 3

4 A találmány hatodik szempontjának megfelelõen, nem patogén oocisztákat tárunk fel, melyek a fentebb leírt eljárással hozhatók létre, és amelyek baromfiban coccidiosis elleni immunreakció indukálására képesek. A találmány utolsó célkitûzésének megfelelõen, eljárást tárunk fel baromfiak coccidiosis elleni oltására, melynek során az említett baromfiaknak legyengített Eimeria acervulinából származó legalább körülbelül 4 oocisztát adunk be, mely Eimeria SPF-madarakban legalább kilenc egymást követõ átoltással lett legyengítve. A találmány fenti és egyéb jellemzõi és elõnyei a találmány elõnyös megvalósítási módjainak alábbiakban bemutatásra kerülõ részletes leírása alapján még érthetõbbek lesznek. Az elõnyös megvalósítási módok részletes leírása A találmányt, valamennyi, alábbiakban bemutatásra kerülõ megvalósítási módjában, baromfiban történõ alkalmazásra dolgoztuk ki. Ahogy itt használjuk, a baromfi kifejezésen tojás vagy hústermelésre alkalmazott, háziasított madarakat értünk, amelyek közé, többek között, olyan kereskedelmileg fontos fajok tartoznak, mint a csirkék, pulykák, kacsák, ludak, gyöngytyúk, fácánok, galambok, páva, törpebaromfi (bantam) és hasonlók. Az egyik elõnyös megvalósítási módban a baromfi kifejezés házi csirke és pulyka fajokra, legelõnyösebben csirke fajokra vonatkozik. A találmány értelmében feltárt legyengített törzsbõl származó oocisztát illetõen, tudni kell, hogy nem kell szükségszerûen a teljes oocisztának immunreakciót indukálnia a coccidiosis ellen. Ennek megfelelõen, a találmány teljes organizmus(ok)ra vagy az(ok) részletére (részleteire) vonatkozik ideértve azon protein(eke)t, polipeptid(ek)et vagy aminosavszekvenciá(ka)t, amely(ek) alkalmas(ak) egy állatban, például baromfiban, immunreakció indukálására vagy kiváltására. A nem patogén kifejezést szakember számára ismert értelemben használjuk, miszerint a beoltott madarak kis százalékában bármely vakcinázási program elõidézhet káros reakciót, s bizonyos esetekben ezzel összefüggõ elhullást. A nem patogén kifejezés érvényes az olyan vakcinázási programok esetén is, amelyeknél ilyen esetek elõfordulhatnak. Az átlagos elváltozási különösen hasznos lehet egy találmány szerinti eljárással legyengített törzs patogenitásának indikátoraként. Ez, alkalmas módon, SPF-madarakban az elváltozások beoltás utáni (p.i.) kialakulásának ellenõrzésével határozható meg. A beoltás után hat nappal a madarakat túlaltattuk és felboncoltuk. A bélcsatornai elváltozások Johnson és Reid leírása szerint [ Anticoccidial drugs: Lesion scoring techniques in battery and floor pen experiments with chickens ; Exp. Parasitol. 28, (1970)] pontozhatók. A találmány céljaira a nem patogén, legyengített törzs közelebbi meghatározása szerint olyan legyengített törzs, amely 4 legyengített oocisztával beoltott madarak csoportjában átlagosan 2,0 átlagos elváltozási ot, még elõnyösebben, legfeljebb ,8 átlagos elváltozási ot, még elõnyösebben, legfeljebb 1, átlagos elváltozási ot eredményez. A találmány céljaira az immunreakció kifejezésen sejtközvetítette reakciót vagy humorális reakciót kell érteni, amely coccidiosis ellen bizonyos szintû immunitást indukál, oly módon, hogy egy virulens protozoa törzzsel végzett késõbbi fertõzés esetén a vakcinázott madarakban bizonyos fokú védettséget nyújt azok elhullása, megbetegedése vagy lecsökkent gyarapodási teljesítménye ellen. A találmány szerinti legyengített törzzsel végzett oltással indukált védettség mértéke az eredeti vagy ahhoz hasonló legyengített törzzsel végzett késõbbi újrafertõzéskor kialakult elváltozás alapján határozható meg. E vonatkozásban a védõ hatású immunreakció olyan reakcióként definiálható, amely az eredeti vagy ahhoz hasonló legyengített törzsbõl származó 4 dózisú oocisztával végzett újrafertõzéskor legfeljebb 1,0 átlagos elváltozási ot, elõnyösebben legfeljebb 0,0 átlagos elváltozási ot, még elõnyösebben legfeljebb 0,2 átlagos elváltozási ot eredményez. A hivatkozásul fentebb említett pontozási technikának szerint, és az egyik legelõnyösebb megvalósítási módnak megfelelõen, a baromfiban coccidiosis elleni legerõteljesebb védõ hatású immunreakciót indukálni képes legyengített törzsekre 0,00 átlagos elváltozási regisztrálható. Az immunogén kifejezésen a fenti definíció szerinti immunreakciót indukáló képességet értünk. A találmány céljaira az oltás kifejezésen fertõzõ ágensek madarakba tetszõleges módon történõ bejuttatását értjük. Az egyik megvalósítási módnak megfelelõen, a találmány tárgya eljárás coccidiosis elleni vakcinában alkalmazható oociszták képzésére alkalmas immunogén törzs kinyerésére. Az eljárás megfelelõ immunogént tartalmazó legyengített törzs létrehozása céljából egy Eimeria faj donor baromfi példányokon végrehajtott legalább körülbelül három ciklusát foglalja magában. Ilyenformán, az eljárás az Eimeria törzs legyengítésére alkalmazható, ami a törzsnek nem patogén tulajdonságot kölcsönöz, és hatásossá teszi olyan oociszták képzésére, amelyek vakcinafejlesztésben immunreakciót indukálnak. A találmány egy további szempontjának megfelelõen, eljárást tárunk fel egy vagy több Eimeria törzs legyengítésére, mely eljárás a törzs specifikus patogéntõl mentes baromfik legalább három csoportján keresztül végrehajtott egymás utáni átoltását foglalja magában, ahol minden egyes ciklus legalább két egymást követõ oltássorozatot tartalmaz. A találmány tárgyát képezi egy további eljárás Eimeria acervulina legyengítésére, mely eljárás a következõ ciklust foglalja magában: a) specifikus patogéntõl mentes donor madarak legalább egy elsõ csoportjának virulens E. acervulinából létrehozott oocisztákkal történõ beoltása; b) vér gyûjtése a donor madarak elsõ csoportjából, a beoltás után körülbelül 3 6 órával végzett vérvétellel; 4

5 c) a specifikus patogéntõl mentes donor madarak legalább egy második csoportjának beoltása az összegyûjtött vérrel; d) a madarak második csoportjából oociszták gyûjtése; és e) az oociszták szaporítása, ezáltal lényegében a ciklus befejezése; majd a ciklus megismétlése az (e) allépésben felszaporított oociszták alkalmazásával; ahol körülbelül három teljes ciklus végrehajtása történik meg. Az elsõ ciklusban az eljárás a specifikus patogéntõl mentes (SPF) donor baromfi példányok (elõnyösen egy vagy több donor csirke) Eimeria fajból származó oociszták bizonyos mennyiségével történõ beoltását foglalja magában. A faj elõnyösen egy virulens Eimeria faj, amely gazdabaromfiban keringõ sporozoitokat képez; még elõnyösebben E. acervulina. Az oltást baromfiegységre (például egy madárra) vonatkoztatva körülbelül 6 8 oociszta, elõnyösen körülbelül 1 7 oociszta dózissal végeztük. Az oltást megelõzõen elõnyösen a szakirodalomból ismert módszerek alkalmazásával elõidézzük az oociszták sporulációját. A donor baromfi példányok száma változó lehet, de rendszerint körülbelül 3 csirkét, elõnyösen körülbelül 3 12 csirkét alkalmazunk, azzal, hogy a fiatal, keltetés utáni csirkék vagy csibék alkalmazása elõnyös. Következõ lépésként legalább néhány donor csirkétõl vért veszünk (elõnyösen a beoltás után körülbelül 3 6 órával, még elõnyösebben a beoltás után három órával). Az e donor csirkékbõl gyûjtött vért azután SPF baromfi példányok egy másik csoportjának (elõnyösen orális) beoltására alkalmazzuk. A vérmintákkal beoltott madarak e csoportjából oocisztákat gyûjtünk. Az oocisztákat elõnyösen a megfertõzött madarak ürülékébõl gyûjtjük. Ezeket az összegyûjtött oocisztákat SPF baromfi példányok újabb csoportjában szaporítjuk (a szaporítás, mint szakirodalomban alkalmazott kifejezés, növeli a rendelkezésre álló oociszták mennyiségét és/vagy koncentrációját). Ezt követõen a megfertõzött példányok ürülékét összegyûjtjük és abból oocisztákat nyerünk ki. Ezzel a lépéssel befejezhetjük az elsõ ciklust. Végül, a kapott oocisztákat elõnyösen a parazita következõ ciklusban végzett további átoltására alkalmazzuk. A fentieknek megfelelõen, egy ciklus a következõ lépésekbõl állhat: 1) Vérdonor madarak beoltása sporulálódott oocisztákkal. 2) Vérminták gyûjtése a donor madarakból. 3) Új madarak beoltása a donor madarakból gyûjtött vérrel. 4) A vérmintákkal beoltott madarakból oociszták gyûjtése. ) Oociszták szaporítása és összegyûjtése a következõ ciklusokban történõ felhasználáshoz. A második ciklusban, a fentebb leírt elsõ ciklusban az ürülékben talált oocisztákat, szaporítás és összegyûjtést követõen, SPF baromfi példányok következõ csoportjának beoltására alkalmazzuk. Az oociszták elõnyösen sporulálódott állapotúak. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint az elsõ ciklusban alkalmazottnál nagyobb dózisszint alkalmazása kívánatos. Ilyenformán, a második ciklusban a vérdonor madarak kezdeti beoltására az elsõ ciklusban kapott oociszták körülbelül 1 7 -tõl körülbelül 3 7 ¹ig terjedõ mennyiségét alkalmazzuk. A második ciklusban dózisonként elõnyösen körülbelül 2 7 oocisztát vagy az elsõ ciklusban alkalmazott dózisonkénti oocisztaszám kétszeresének megfelelõ oocisztát alkalmazunk. Ezután a második ciklusban alkalmazott SPF csirke példányokon megismételjük az fentebb leírt (2) () lépéseket. A második ciklust követõen megfertõzött baromfi példányok ürülékébõl gyûjtött oocisztákat a harmadik ciklusban SPF baromfik legalább egy harmadik csoportjának beoltására alkalmazzuk, ami egy adott Eimeria törzsre összesen három ciklust jelent. A harmadik ciklusban a vérdonor madarak kezdeti beoltására elõnyösen körülbelül 1 7 -tõl körülbelül 3 7 ¹ig terjedõ számú oocisztát alkalmazunk. Elõnyösen dózisonként körülbelül 2 7 oocisztát vagy az elsõ ciklusban alkalmazott dózisonkénti oocisztaszám kétszeresének megfelelõ oocisztát alkalmazunk. Ezt követõen a fentebb leírt (2) () lépéseket a harmadik ciklus részeként újra megismételjük. Szakember számára felmerülhet az Eimeria törzs újabb ciklusainak lehetõsége SPF baromfik további csoportjaiban, azonban ez esetünkben költség- és idõtényezõk miatt kevésbé elõnyös. Felismertük, hogy összesen körülbelül három ciklus alkalmazása elõnyös. Az E. acervulina végsõ törzsét a fenti három ciklusból álló eljárást követõen izoláljuk, mely törzs az eljárás eredményeként legyengített (attenuált) állapotú. A törzset a harmadik ciklus befejezését követõen, egy vagy több beoltott madárból nyerjük ki, és késõbb ezt a törzset használjuk immunogénként. A törzset vakcinához alkalmas oociszták létrehozása céljából SPF baromfiak további csoportjába oltjuk. Az oocisztákat elõnyösen a törzzsel megfertõzött baromfiak ürülékébõl betakarítva nyerjük. Az oociszták, kívánt esetben, vérbõl is betakaríthatók. Egy elõnyös Eimeria acervulina törzset sikerült izolálni, melyet A3C2A2-törzsnek neveztünk el. Ezt a törzset 01. december 19¹én az Európai Sejttenyészeti Gyûjteménynél ( European Collection of Cell Cultures ; Wiltshire SP4 OJG, Egyesült Királyság) 0911¹es elõzetes nyilvántartási számon helyeztük letétbe. A törzs e gyûjteményben hozzáférhetõ, és mûködõképes immunogén törzsként funkcionál. Az találtuk, hogy a fentebb leírt eljárással nyert Eimeria törzsbõl létrehozott oociszták vakcinába foglalva erõteljes immunogenitást fejtenek ki. Megállapítottuk továbbá, hogy ezek az oociszták sokkal kevésbé patogének, mint az eredeti (oltási ciklusok elõtti) Eimeria törzsbõl létrehozottak. A találmány szerinti eljárással létrehozott oociszták további jellemzõje, hogy általában sokkal nagyobb keresztreaktivitásúak, ami azt jelenti, hogy Eimeria fajok szélesebb spektruma ellen nyújtanak védettséget. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti Eimeriából, elõnyösen Eimeria acervulinából

6 származó oociszták alkalmazásával elõállított vakcina legalább három, elõnyösen legalább négy további Eimeria faj (ideértve, többek között, a következõket: E. maxima, E. tenella, E. necatrix és E. brunetti) ellen nyújt védettséget. A találmány tárgyához tartoznak további immunogén törzsek, illetve azokból származó termékek, például oociszták és ilyen oocisztákat tartalmazó vakcinák is, melyek az E. acervulina törzs illetve a találmány szerinti, fentebb leírt eljárásokkal létrehozott járulékos termékek tulajdonságaival bírnak. A találmány szerinti végsõ vakcinának egy állatban elégséges szintû immunogén reakció indukálása céljából dózisonként legalább körülbelül 4 oocisztát (elõnyösen sporulálódott oocisztát) kell tartalmaznia. A vakcina tartalmazhat nagyobb dózisonkénti oociszta mennyiséget is (például legalább körülbelül oociszta/dózis); ilyenformán, körülbelül 4 és körülbelül 6 közötti dózisonként oociszta mennyiség kívánatos. Az általunk feltárt vakcina orálisan, szubkután, intradermálisan, intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, intravénásan vagy intranazálisan, továbbá a szakirodalomban ismert egyéb adagolási módokon adható be. Az említettek közül általában az orális adagolás elõnyös. Ennek megfelelõen, a vakcinát a fiatal baromfiaknak ivóvízzel vagy tömegtakarmányozás útján adhatjuk be. A vakcina beadható in ovo is, de általában fiatal állatoknak post ovum adagoljuk (általában a legjobb jelöltek a néhány órástól néhány hetesig terjedõ életkorúak). Általában állatonként egy dózist adunk be, de a találmány oltalmi köréhez tartozik az emlékeztetõ oltások beadása is. A találmány szerinti vakcina gyógyászatilag elfogadható hordozóval van formulálva, amely lehet vizes közeg, illetve szuszpenzió vagy emulzió és hasonlók. A hordozó a szakirodalomból ismert sókat, tartósítószereket, puffereket, stabilizálószereket és emulgeálószereket is magában foglalhat. Ezen túlmenõen, a vakcina teljesítményének javítása vagy aktivitásának (például a kiváltott immunreakció) növelése érdekében egy vagy több adjuvánst is tartalmazhat, mely adjuvánsok közé olyan anyagok tartoznak, mint az olajok, muramil-dipeptid, alumínium-hidroxid, szaponin, polianionok, amfipatikus anyagok és hasonlók. A gyógyászatilag elfogadható hordozó dózisonkénti elõnyös mennyisége beleértve az adjuváns(ok)ét is körülbelül 0,001 ml¹tõl körülbelül ml¹ig terjedhet, elõnyösen körülbelül 0,1 ml¹tõl körülbelül ml¹ig, még elõnyösebben körülbelül 0, ml¹tõl körülbelül 1 ml¹ig. A találmány szerinti vakcina tartalmazhat egyéb, baromfiban immunogénként funkcionáló anyagokat is. Például, a találmány szerinti vakcina részeként bizonyos betegségeket okozó patogénekkel [például Newcastle betegség vírussal (NDV)] összefüggõ immunogének lehetnek jelen. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti vakcina lehet monovalens, valamint di¹, tri¹, tetra- vagy pentavalens stb. A következõ példákat a találmány különbözõ elõnyös szempontjainak szemléltetése céljából mutatjuk be, s nem értelmezhetõk úgy, mintha a találmány oltalmi körét ezekre korlátoznánk Példák A következõ példákat szemléltetési célból mutatjuk be, s nem értelmezhetõk úgy, mintha a találmány oltalmi körét ezekre korlátoznánk. 1. Anyagok és módszerek 1.1 Anyagok Csirkék és tartásuk Arbor Acres keltetõbõl (Putten, Hollandia) beszerzett, coccoidosismentes hím Arbor Acres brojlereket egynapos korukban izolált körülmények között ketrecekben tartottunk. A csirkék bizonyos hányadát donor csirkeként alkalmaztuk, és ezeket 14 napos korukban sporulálódott Eimeria acervulina oocisztákkal oltottuk be. Valamennyi, egy passzáláshoz kiválasztott donor madarat egy ketrecben tartottuk. A beoltás után 3 vagy 6 órával, alkalmanként három donor csirkétõl vért vettünk, és az elkülönített vérmintákat három további csirke beoltására használtuk. Az elsõ donor csirkébõl vett vérrel kezelt madarakat egy ketrecben tartottuk. A csirkék ürülékében vizsgáltuk az oociszták jelenlétét, és a kiválasztott pozitív mintákból származó oocisztákat a következõ átoltáshoz használtuk fel. A végsõ immunogén törzs létrehozásához három egymást követõ ciklust hajtottunk végre. A kiválasztott pozitív mintákból származó oocisztákat a következõ ciklus megkezdése elõtt mintánként négy SPF-csirkében szaporítottuk. Az SPF-csirkéket az Animal Health Service -tõl (Deventer, Hollandia) szereztük be, és csoportosan izolált ketrecekben tartottuk. Az 1. és 3. ciklust követõen betakarított oociszták patogenitását meghatároztuk és összehasonlítottuk az eredeti törzs patogenitásával (dózisonként, coccidiosismentes hím Arbor Acres broiler törzsenként négy dózis, ciklusonként összesen 80 madár alkalmazásával). A 3. ciklus után betakarított oociszták patogenitásának meghatározására alkalmazott csirkék egy részét felhasználtuk ezen oociszták immunogenitásának eredeti törzzsel végzett újraoltás utáni meghatározására is (az eredeti törzs immunogenitásával összehasonlításban). A csirkéket izolált ketrecekben tartottuk. Valamennyi madarat az Animal Health Service állattartó eszközeiben (Deventer, Hollandia), a Het Spelderholt (Beekbergen) 3. házában helyeztük el, és coccidiosis elleni szerek nélküli takarmánnyal tápláltuk. Elsõ ciklus Ebben a ciklusban 26 brojlert alkalmaztunk. Nyolc donor csirkét sporulálódott Eimeria acervulina oocisztákkal oltottunk be, és a beoltás után 3, illetve 6 órával három-három (összesen hat) donor csirkébõl vért vettünk. A hat külön vérminta mindegyikével három további csirkét oltottunk be, és két pozitív ürülékmintából tisztított oocisztákat SPF-csirkékben felszaporítottunk. Egy felszaporított izolátum patogenitását meghatároztuk. A csoportokat és a csirkék számát a következõkben mutatjuk be: 6

7 Csoport Csirkék száma Felhasználás D 8 donor csirke A1, A2, A3 3 3 beoltás után 3 órával levett vérrel beoltott csirkék B1, B2, B3 3 3 beoltás után 6 órával levett vérrel beoltott csirkék 11, két pozitív mintából (A2 és A3) származó oociszták felszaporítása Patogenitás 2 az elsõ ciklus utáni és az eredeti törzs patogenitása További ciklusok A következõ két ciklus mindegyikében brojlert alkalmaztunk. Hat donor csirkét sporulálódott Eimeria acervulina oocisztákkal oltottunk be, és a beoltás után három órával három donor csirkébõl vért vettünk. A három elkülönített vérmintával három újabb csirkét oltottunk be, és a pozitív ürülékmintákból tisztított oocisztákat SPF-csirkékben szaporítottuk. A 3. ciklus után meghatároztuk felszaporított izolátum patogenitását és immunogenitását. A csoportokat és a csirkék számát a következõkben mutatjuk be: Csoport Csirkék száma Felhasználás D 6 donor csirke A, B, C 3 3 beoltás után 3 órával levett vérrel beoltott csirkék I 2 4 pozitív mintákból származó oociszták felszaporítása (2 ) Patogenitás 2 a harmadik ciklus utáni és az eredeti törzs patogenitása/immunogenitása Oltóanyagok Az Eimeria acervulinát eredetileg a Central Veterinary Laboratoryból (Weybridge, UK) kaptuk, és az Animal Health Service-nél (Deventer, Hollandia) oltottuk át (passzáltuk). Az extraintestinalis sporozoitok elsõ ciklusához sóoldatban 7 /ml sporulálódott Eimeria acervulina oocisztát tartalmazó szuszpenziót készítettünk. A következõ két ciklushoz sóoldatban 2 7 /ml sporulálódott Eimeria acervulina oocisztát (az elõzõ ciklusból felszaporítva) tartalmazó szuszpenziókat készítettünk. 1.2 Eljárások Beoltások A donor csirkéket orálisan (begyükbe) 14 napos korukban csirkénként 1 ml sóoldatban 7 (1. ciklus), illetve 2 7 (következõ ciklusok) sporulálódott Eimeria acervulina oocisztával oltottuk be. A csirkéket a beoltás elõtt 12 óra hosszat koplaltattuk. A donor csirkék egy részét (három-három csirkét) a beoltás után 3 vagy 6 órával szívpunkcióval kivéreztettük, s vérüket 1 ml vérre NE lítium-heparint tartalmazó ml¹es heparinizált csövekbe (Sarstedt, Etten-Leur) gyûjtöttük. A csirkéket intramuszkuláris injekcióval beadott xilazinnal (Rompun; mg/testtömeg¹kg) és ketaminnal (2 mg/testtömeg¹kg; AUC, Cuijck, Hollandia) érzéstelenítettük. Az egyes külön vérmintákat három további 14 napos csirke orálisan (begybe) történõ beoltására használtuk fel (egy csirkére 3 ml heparinizált vérrel). A beoltás elõtt tíz perccel a madaraknak orálisan 1 ml lúgos szuszpenziót adtunk be, amelynek összetétele a következõ volt: ml csapvízben szuszpendált darab, gyógyszertárban vásárolt Rennie tabletta (tablettánként 680 mg kalcium-karbonát és 80 mg magnéziumkarbonát) Oociszták izolálása A maradék donor madarak, illetve a vérrel beoltott madarak ürülékét a beoltás utáni 3. naptól a 6. vagy 7. napig bezárólag 24 óránként, ketrecenként összegyûjtöttük, és az oocisztákat a következõk szerint számláltuk. Az összegyûjtött ürülékbõl abban az esetben tisztítottunk oocisztákat, ha az oocisztaszám sóflotálásos technikával végzett meghatározás alapján pozitívnak bizonyult. Tisztítást követõen az izolált oocisztákat 2% (m/v) kálium-bikromát-oldatban szuszpendáltuk, és a szuszpenziókat az oociszták sporulációjának indukálása érdekében hagyományos akváriumi szellõztetõ alkalmazásával, légbuborékokkal 29 C¹on 48 óra hosszat levegõztettük, majd megszámláltuk a szuszpenziókban lévõ oocisztákat. A sporulálódott oocisztákat mintánként négy SPFmadárban szaporítottuk. Hat napos korukban az SPFmadarakat orálisan (begyükbe) ürülékmintákból származó 3 ml sporulálódott oocisztákkal oltottuk be. A beoltás utáni 4. naptól a 6. napig az SPF-madarak ürülékét ketrecenként összegyûjtöttük, az ürülékbõl oocisztákat tisztítottunk és megszámláltuk. Az 1. ciklus utáni szaporításhoz az I1 és I2 csoportokba tartozó madaraknak az A2 és A3 ürülékmintából (melyek összesen 000, illetve oocisztát tartalmaztak) származó oocisztákat adtunk be. A következõ ciklusok után kinyert izolátumokat a bennük lévõ oociszták csekély száma miatt kétszeresükre szaporítottuk Az ürülékekben lévõ oociszták számlálása Ketrecenként körülbelül 2 friss ürüléket gyûjtöttünk össze, majd maximum 0 g ürüléket lemértünk, % (m/v) nátrium-klorid-oldatban szuszpendáltuk (sûrûség=1,1) és homogenitásig kevertük. A szuszpendált ürülék 1 ml¹es aliquotjait 9 ml telített nátrium-klorid-oldattal elegyítettük. Az oocisztákat a hígított ürülékszuszpenzióból három példányban készített mintákban, számlálócella alkalmazásával (Hawkley szerint) számláltuk, és kiszámítottuk az oociszták ürülékgrammonkénti számát. 7

8 1.2.4 Patogenitás Az 1. és 3. ciklus után meghatároztuk az oociszták patogenitását, és összehasonlítottuk az eredeti törzs patogenitásával (dózisonként brojler és mintánként négy dózis alkalmazásával). A madarakat 8 napos korukban, orálisan madaranként 3, 4, és 6 sporulálódott oocisztával oltottuk be. A csirkéket csoportonként ketrecekben tartottuk. A beoltás utáni 4. naptól a 6. vagy 7. napig a ketrecenként összegyûjtöttük az ürüléket, és az ürülékben a fentebb leírtak szerint megszámláltuk az oocisztákat. A beoltás utáni 6. napon a madarakat villamos árammal leöltük, a leolt madarakat felboncoltuk, és a beleikben tapasztalható elváltozásokat Johnson és Reid (lásd fentebb) szerint pontoztuk. Az 1. ciklus után betakarított oociszták patogenitásának meghatározásához a beoltás után hat órával valamennyi madarat leöltük és megmértük. A 3. átoltás után betakarított oociszták patogenitásának meghatározásához a beoltás után hat nappal mindegyik csoportból öt madarat leöltünk, és a többi madarat az immunogenitás meghatározásához használtuk. A beoltás utáni 4. naptól a 6. napig ketrecenként tíz madár ürülékét, míg a 7. napon ketrecenként öt madár ürülékét gyûjtöttük össze Immunogenitás A 3. ciklus után betakarított oociszták immunogenitását meghatároztuk és az eredeti törzs immunogenitásával hasonlítottuk össze (csoportonként a patogenitás meghatározásához alkalmazott öt brojler alkalmazásával). Valamennyi madarat lemértük, és a beoltás után 9 nappal orálisan, az eredeti törzsbõl származó sporulálódott oocisztával (madaranként) újraoltottuk. Az újraoltás utáni 4 6. napokon az ürüléket ketrecenként összegyûjtöttük és az oocisztákat a fentebb leírtak szerint megszámoltuk. Az újraoltás után hat nappal villamos árammal valamennyi madarat leöltük és megmértük. Mindegyik madarat felboncoltuk és bélelváltozásaikat a fentebb leírtak szerint pontoztuk táblázat Patogenitás az elsõ ciklust követõen 2. Eredmények 2.1 Oociszták izolálása Elsõ ciklus A beoltott csirkék ürülékében a beoltás után három nappal nem találtunk oocisztákat. A donor madarakból beoltás után 3 órával vett vérrel beoltott madarak ürülékében inkább találtunk oocisztákat, mint a donor madarakból beoltás után 6 órával vett vérrel beoltott madarak ürülékében. A beoltás után öt nappal az A2 és A3 csoport valamennyi ürülékmintája oociszta-pozitív volt, és e csoportok ürülékébõl oocisztákat tisztítottunk. Sporuláció után a következõ mintákat kaptuk: Csoport Oociszta/ml Össztérfogat (ml) A A Az A2 és A3 csoportból betakarított oocisztákat SPF-madarakban szaporítottuk. A szaporítás után az A2 csoportból izolált oocisztákkal beoltott madarak ürülékében lévõ oociszták összezsugorodottak voltak és életképességük nem volt egyértelmû. A 12 csoportba tartozó madarakból (amelyek az A3 csoportból izolált oocisztákkal voltak beoltva) 00 ml oocisztát takarítottunk be ( oociszta/ml), és meghatároztuk ezen oociszták patogenitását. Második ciklus A C csoportból származó egyik ürülékminta a beoltás utáni. és 6. napon oociszta-pozitív volt, és az e napokon gyûjtött ürülékekbõl oocisztákat tisztítottunk. Az A3C2-nek elnevezett izolátum csekély számú oocisztát tartalmazott, így azokat SPF-madarakban felszaporítottuk. A felszaporítást követõen 24 6 oocisztát takarítottunk be, majd ezeket SPF-madarakban továbbszaporítottuk. Harmadik ciklus Az A csoport egyik beoltás után nappal vett ürülékmintája oociszta-pozitív volt, így az ürülékbõl oocisztákat tisztítottunk. Az A3C2A2-nek elnevezett izolátum csekély számú oocisztát tartalmazott, így azokat SPF-madarakban kétszer szaporítottuk. A felszaporítást követõen betakarítottuk az oocisztákat és meghatároztuk patogenitásukat és immunogenitásukat. 2.2 Patogenitás Meghatároztuk az 1. és 3. ciklus után betakarított oociszták patogenitását. Az eredményeket az 1. és 2. táblázatban foglaljuk össze. Az 1. ciklust követõen az átlagos testtömegben, az átlagos elváltozási ban vagy az oociszták ürülékgrammonkénti számában nem tapasztaltunk egyértelmû különbséget. Dózis (oociszta/ madár) n= A3 izolátum (g) ürülék ( 3 )* (g) ürülék ( 3 )* , , , ,2 00 8

9 1. táblázat (folytatás) Dózis (oociszta/ madár) n= A3 izolátum (g) ürülék ( 3 )* (g) ürülék ( 3 )* 391 2, , , ,1 9 * a 4 6. napokon gyûjtve A 3. ciklust követõen, 4 oociszta/madár vagy nagyobb dózisoknál a 3. ciklusból származó oociszták esetében kisebb átlagos elváltozási okat kaptunk, mint az eredeti törzzsel. Mindazonáltal, az ürülékgrammonkénti oocisztaszám esetében az eredeti törzzsel összehasonlítva nem tapasztaltunk egyértelmû különbségeket. Az oociszták száma mindkét esetben a beadott dózisnak megfelelõen alakult. Az izolált törzs legnagyobb dózisával beoltott madarak ürülékében kimutatott oocisztaszám azt jelzi, hogy ezek a madarak súlyosan fertõzöttek voltak, de az elváltozási nem növekedett a beoltott dózis nagyságával. 2. táblázat: Patogenitás a harmadik ciklust követõen Dózis (oociszta/ madár) n= A3C2A2 izolátum (g) ürülék ( 3 )* (g) ürülék ( 3 )* 3 nem mértük 1,0 270 nem mértük 1,2 1 4 nem mértük 1,6 7 nem mértük 2, nem mértük 1,0 nem mértük 3, nem mértük 1,2 960 nem mértük 3, 9 * a 4 7. napokon gyûjtve Immunogenitás Meghatároztuk a 3. ciklust követõen betakarított oociszták immunogenitását. Az eredményeket a 3. táblázatban foglaljuk össze. A 3 oociszta/madár dózissal beoltott csoportban megfigyelhetõ volt néhány elváltozás. E csoport ürülékében oocisztákat is találtunk. Az izolált törzs nagyobb dózisaival beoltott csoportokban elváltozásokat, illetve ürülékükben oocisztákat nem találtunk. A madaranként 4 oociszta vagy nagyobb dózissal beoltott csoportok mindegyike védett volt az eredeti törzzsel végzett újraoltással szemben. Ezzel ellentétesek a kontrollcsoport eredményei (a jobb oldalon), melynek újraoltását az eredeti törzzsel végzett beoltást követõen ugyancsak az eredeti törzzsel hajtottuk végre. 3. táblázat Immunogenitás a harmadik ciklust követõen Dózis (oociszta/ madár) n= Eimeria acervulina törzsek immunogenitása újraoltás után A3C2A2 izolátum (g)* ürülék ( 3 )** (g)* ürülék ( 3 )** ,

10 3. táblázat (folytatás) Dózis (oociszta/ madár) n= Eimeria acervulina törzsek immunogenitása újraoltás után A3C2A2 izolátum (g)* ürülék ( 3 )** (g)* ürülék ( 3 )** * újraoltás után; ** a 4 6. napokon gyûjtve Eredmények megbeszélése Az elsõ ciklus után az A2 csoportból izolált oocisztákkal kezelt madarak ürülékében lévõ oociszták a felszaporítást követõen összezsugorodtak és életképességük nem volt egyértelmû. Ez valószínûleg az oociszták tisztítása során telített sóoldatban eltelt idõnek tudható be. A szaporítás elõtt az oociszták eltérését nem tapasztaltuk. Az Eimeria acervulina extraintestinalis oocisztáinak elsõ ciklusa az A3 csoporttal sikeres volt, de az izolált oociszták reprodukálhatósága és patogenitása nem különbözött az eredeti Eimeria acervulina törzsétõl. Az izolált törzs 3. ciklusának nagyobb dózisaival kezelt madarak ürülékében lévõ oociszták száma azt jelezte, hogy ezek a madarak súlyosan fertõzöttek voltak, ennek ellenére az elváltozási nem növekedett a beadott dózissal. Amennyiben az elváltozási jó paramétere a törzs patogenitásának, úgy az izolált A3C2A2-törzs lényegesen kevésbé patogén, mint az eredeti Eimeria acervulina törzs. Az eredeti törzzsel végzett újraoltást követõen az izolált A3C2A2-törzsbõl származó oocisztákkal 3 /madár dózisban beoltott madarakban találtunk néhány elváltozást, és e csoport ürülékében oociszták voltak kimutathatók. Az izolált A3C2A2-törzsbõl származó oociszták 4 /madár vagy nagyobb dózisával beoltott madarak védettek voltak az eredeti törzzsel végzett újraoltással szemben. Táblázatok A1 táblázat Donor madarak ürülékében és vérrel beoltott madarak ürülékében lévõ oociszták az 1. ciklust követõen Az ürülékben lévõ oociszták számlálócellánkénti száma a megadott oltás utáni napon 3. nap 4. nap. nap 6. nap D A1 neg. neg. neg. neg. neg. poz. neg. neg. poz. A2 neg. neg. neg. poz. poz. poz. poz. poz. poz. neg. neg. poz. A3 neg. neg. neg. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. B1 neg. neg. neg. neg. 1 1 neg. neg. neg neg. neg. neg. B2 neg. neg. neg. poz. poz. poz. neg. neg. poz. neg. neg. neg. B3 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. A2 táblázat Donor madarak ürülékében és vérrel beoltott madarak ürülékében lévõ oociszták a 2. ciklust követõen Csoport Csoport Az ürülékben lévõ oociszták számlálócellánkénti száma a megadott oltás utáni napon 3. nap 4. nap. nap 6. nap 7. nap D neg. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. A neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. poz. neg. neg. neg. neg. neg. neg. B neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. C neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. poz. neg. neg. poz. neg. neg. neg.

11 HU T2 A3 táblázat Donor madarak ürülékében és vérrel beoltott madarak ürülékében lévõ oociszták a 3. ciklust követõen Csoport Az ürülékben lévõ oociszták számlálócellánkénti száma a megadott oltás utáni napon 3. nap 4. nap. nap 6. nap 7. nap D nem mértük poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. poz. A nem mértük neg. neg. neg. neg. neg. poz. neg. neg. neg. neg. neg. neg. B nem mértük neg. neg. poz. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. C nem mértük neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. A4 táblázat A patogenitás meghatározásának egyéni eredményei az elsõ ciklust követõen Csoport/madár A3 csoportból izolált Testtömeg (g) Elváltozási Testtömeg (g) Elváltozási

12 nem mértük 1,00 nem mértük 1, nem mértük 2,00 nem mértük 4,00 1 nem mértük 1,00 nem mértük 4,00 HU T2 A4 táblázat (folytatás) Csoport/madár A3 csoportból izolált Testtömeg (g) Elváltozási Testtömeg (g) Elváltozási A táblázat A patogenitás meghatározásának egyéni eredményei a harmadik ciklust követõen Csoport/madár A3C2A2-izolátum Testtömeg (g) Elváltozási Testtömeg (g) Elváltozási 2 1,00 1,00 3 1,00 2,00 4 1,00 1,00 1,00 1,00 2 2,00 3,00 3 1,00 2,00 4 2,00 2,00 1,00 2,00 2 1,00 3,00 3 1,00 4,00 4 1,00 3,00 1,00 2,00 12

13 6 1 nem mértük 1,00 nem mértük 4, , , , , , , , ,00 HU T2 A táblázat (folytatás) Csoport/madár A3C2A2-izolátum Testtömeg (g) Elváltozási Testtömeg (g) Elváltozási 2 1,00 4,00 3 1,00 3,00 4 2,00 3,00 1,00 nem mértük A6 táblázat Az immunitás meghatározásának egyéni eredményei a harmadik ciklust követõen Csoport/madár A3C2A2-izolátum Testtömeg (g) Elváltozási Testtömeg (g) Elváltozási Újraoltás elõtt Újraoltás után 6 nappal Újraoltás elõtt Újraoltás után 6 nappal , , , , , ,00 nem mértük nem mértük nem mértük , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,00 13

14 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás Eimeria faj nem patogén oocisztáinak elõállítására, amelyek baromfiban coccidiosis elleni immunreakció indukálására képesek, ahol az említett eljárás magában foglalja egy Eimeria faj törzsének SPFmadarakban legalább kilenc egymást követõ átoltással történõ legyengítését, mely eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: (i) legalább egy, specifikus patogéntõl mentes (SPF) madár beoltása Eimeria oocisztákkal; (ii) vér gyûjtése az (i) lépés szerinti madárból; (iii) legalább egy második SPF-madár beoltása a (ii) lépésbõl származó vérrel; (iv) Eimeria oociszták gyûjtése egy (iii) lépés szerinti madárból; (v) a (iv) lépésben gyûjtött oociszták legalább egy további SPF-madárban történõ szaporítása és abból oociszták gyûjtése; ahol az (i) (v) lépések egy ciklust képeznek, amely legalább három alkalommal kerül ismétlésre, oly módon, hogy az egyes ciklusok (v) lépésében begyûjtött oociszták a következõ ciklus (i) beoltási lépésében kerülnek felhasználásra. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az Eimeria törzs az Eimeria acervulina fajból van kiválasztva. 3. Eljárás vakcina elõállítására, mely eljárás magában foglalja oociszták 1. vagy 2. igénypont szerinti elõállítását és azok gyógyászatilag elfogadható hordozóval történõ formulázását. 4. Eimeria acervulina A3C2A2-törzs, amely az Európai Sejttenyészet Gyûjteménynél ( European Collection of Cell Cultures 0911 nyilvántartási számon lett letétbe helyezve.. A 4. igénypont szerinti törzs oocisztáinak alkalmazása baromfiakban coccidiosis elleni védettség kialakítására szolgáló vakcina elõállítására. 6. Az. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a védettség kialakítására szolgáló eljárás magában foglalja legalább 4 darab 4. igénypont szerinti oociszta beadását. Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest