MOLEKULÁRIS GENETIKA A LABORATÓRIUMI MEDICINÁBAN. Laboratóriumi Medicina Intézet 2017.

Átírás

1 MOLEKULÁRIS GENETIKA A LABORATÓRIUMI MEDICINÁBAN Laboratóriumi Medicina Intézet

2 Történeti áttekintés

3 Humán genom projekt gén azonosítása 1,800 betegséghez köthető gén 1000 genetikai teszt 350 biotechnológiai eszköz Egyéni tulajdonságok meghatározása; populációs haplotípus meghatározás: HapMaps (haplotype map) Etikai és törvényi szabályozás (ELSI) 3

4 A jelenleg folyó kutatások Gének pontos lokalizációja és funkciómeghatározása DNS szekvencia elrendeződése Kromoszómális struktúra és elrendeződés Nemkódoló DNS szakaszok típusa, mérete, megoszlása, információtartalma és funkciója A génkifejeződés szabályozása, fehérjeszintézis és poszt transzlációs események SNP összefüggése különböző betegségekkel (egyéni érzékenység) Multigénes alacsony penetranciájú megbetegedések Összetett rendszerbiológia mikrobiális konzorciumok környezeti célokra Fejlődésgenetika,-genomika

5 Genomika Strukturális genomika Komparatív genomika Funkcionális genomika

6 A genomika vizsgálómódszerei DNS Szekvenciaanalízis: Southern blot Restrikciós térképezés Sanger-féle lánctermináció DNS microarray NGS újgenerációs szekvenálás Amplifikálás In vivo: DNS-klónozás In vitro: PCR, real time-pcr RNS Minőségi meghatározás: Elektroforézis Northern blot Dot blot in situ hibridizáció Expressziós microarray mrns, mirns, lnc-rns Amplifikálás: Egy ill. kétlépcsős reverz transzkripciós real time PCR

7 Molekuláris hibridizációs technikák: Microarray Egy kisméretű (1-2 cm 2 ) szilárd hordozó (pl. szilikon, üveg) felületére szabályos elrendezésben több 10000, eltérő szekvenciájú DNS próbát rögzítenek. A próbák nukleotid hosszúságúak, génekre vagy cdns-ekre specifikus oligonukleotidok vagy in vitro szintetizált DNSfragmentumok. Az eljárás lényege, hogy mikroszkóp segítségével detektálják azokat a próbákat a chipen, amelyekkel komplementer DNS vagy RNS jelen van a mintában. Ennél a módszernél a mintát kell fluoreszcens módon jelölni. A klasszikus hibridizációs módszerekhez képest a chip technológiánál megfordult a próba és a minta viszonya: itt a próbát, míg az előző módszereknél a mintát immobilizálják.

8 Molekuláris hibridizációs technikák: Linear Array HPV genotipizáló teszt 1. HPV target DNS és humán genomiális DNS kinyerése 2. Target szekvencia amplifikáció (PCR): szelektív amplifikálás 37 HPV genotípusból származó DNS-hez és a humán β-globin génhez alkalmazott biotinilált primerekkel 3. Hibridizáció: Linear Array HPV genotipizáló csík a HPV és β-globin próbákkal fedve 4. Kimutatási reakció: sztreptavidintormaperoxidáz konjugátum és tetrametilbenzidin szubsztrátoldat 37 anogenitális HPV genotípus azonosítására alkalmas: 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39, CP6108

9 Amplifikálás, valós idejű detekció: PCR A PCR-t a DNS-szál egy rövid, jól definiált szakaszának amplifikálására használják: egyetlen gén, génrészlet Az élő szervezetekkel ellentétben a PCR-folyamat csak kis DNS-szakaszok másolására képes, ezek hossza általában legfeljebb 10 kbp=1000 bázispár. A PCR reakció komponensei: 1.DNS-templát ez tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját 2.Primerpár amely meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét (forward, reverse primer) 3. 4.DNS-polimeráz amely lemásolja az amplifikálandó szakaszt 5.Nukleotidok amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t 6.Puffer amely biztosítja a DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet

10 Amplifikálás, valós idejű detekció: PCR A Real-Time PCR során a DNS mennyiségének mérése fluoreszcens detektáláson alapul, amihez kettős szálú DNS-hez kötődő fluoreszcens festékeket vagy fluoreszcensen jelölt szekvenciaspecifikus próbákat használnak. A Q-PCR mérés alapvető feltétele, hogy a fluoreszcens jel erőssége egyenesen arányos legyen az amplikon mennyiségével.

11 Kvantitatív valós idejű PCR: kvantitatív HBV DNS kimutatás HBV GeneProof HBV kvantitatív in vitro diagnosztikai teszt Kiindulási minta: serum Metodika 1. A minta előkészítése (dekontaminálás, DNS izolálás) 2. A kiválasztott target DNS amplifikálása PCR reakció során 3. Az amplifikációs termékek hibridizációja target specifikus oligonukleotid próbákhoz LightCycler A hibridizált termékek detektálása kolorimetriás módszerrel

12 A betegségek genetikai és genomikai szerepének vizsgálata szegregációs analízis: Az adott genetikai eltérés öröklődésének (monogénes: autoszomális domináns, recesszív, X kromoszómához kötött, mitokondriális DNS-hez kapcsolt illetve poligénes), penetranciájának és kifejeződésének(kisfokú, enyhe, erős) vizsgálata. linkage analízis(kapcsoltsági vizsgálat): A betegség kialakításában résztvevő gén vagy gének egymással illetve más génekkel történő együttes öröklődésének meghatározása. asszociációs vizsgálatok(társulás elemzés): Azonosítja, milyen allélvariánsok szerepelnek hajlamosító tényezőként az egyes betegségekben. A család alapú asszociációs vizsgálatok a transzmissziós diszequilibrium tesztek. A populációs alapon szervezett vizsgálatok pedig allélcsoportok illetve haplocsoportok vizsgálata alapján történik. A legújabb kutatási irányvonal a teljes genom asszociációs vizsgálat(genome-wide association studies, GWAS).

13 Monogénes öröklődésű megbetegedések Leggyakrabban mendeli öröklésmenet Alacsony prevalencia 1:2000 Magas penetrancia A környezeti és életmódbeli hatások szerepe a betegség megjelenésére kisfokú A Genomikai Medicina és Ritka Betegségek Intézete (GRI) diagnosztizálja azokat a betegségeket, melyek kialakulásában az egyes gének rendellenességei szerepet játszanak, illetve a humán genom bizonyos variációi ismeretében becsli a gyakori, komplex betegségek kialakulásának valószínűségét genetikai tanácsadás, családtervezést, bizonyos betegségek és gyógyszer mellékhatások megelőzését

14 OMIM adatbázis

15 Mi a különbség mutáció és polimorfizmus között? Egy nukleotidot érintő polimorfizmus (SNP) vs. mutáció Több generáción keresztül történő szekvenciát érintő változás Time A mutáció véletlenszerű esemény csupán néhánynak van hatása a következő generációkban A szekvenciák összehasonlítása az evolúciógenetika alapja Összehasonlítás s 1 és s 2 s 1 : s 2 : A C A G A G T A A C A C A TA T A GA C szubsztitúció deléció inzerció

16 Genetikai tesztek Prevenciós tesztek: preimplantációs tesztek Prediktív tesztek: preszimptómás tesztek Diagnosztikus tesztek: prenatális és újszülöttkori diagnosztikus tesztek A teszteknek analitikai és klinikai validitáson kell átesniük széles körű felhasználásuk előtt! Genetikai tesztelés Genetikai szűrés

17

18 Kiválasztott gének célzott vizsgálata SNP fókuszált vizsgálata LD (linkage disequilibrium) vizsgálat Génkifejeződés mennyiségi vizsgálata Hipotézis indukálta célzott genetikai vizsgálatok nagy gén nagy hatás APC, RET, BRCA, BRAF, p53 Jelátviteli útvonal vizsgálata EGFR, VEGF, TLR (receptoriális) MAPK, JNK, RTK (kináz gátlás) NfKB, Wnt (transzkripciós faktor)

19 Új generációs szekvenálás (NGS) Az új generációs szekvenálási technikák segítségével, különböző módszerekkel gyorsan, nagy mennyiségű szekvencia adathoz juthatunk bármilyen eredetű nukleinsav mintából Az új generációs szekvenálás felhasználási területei: a genom, a célzott(pl. EXOM) és az RNS szekvenálás A új generációs szekvenálás alkalmas transzkripciós faktor kötőhelyek karakterizálására személyre szabható diagnosztika és terápia technologia/ch05s02.html

20 Genome wide analysis studies (GWAS) A humán genom teljes hosszában azonosítják az SNP-ket Jelenleg folyamatban van a HapMap projekt, mely az emberi genom 3.1 millió SNP-re vonatkozó térképét tartalmazza rekombinációs forrópontokra, LD blokkokra és az SNP előfordulás alapvető összefüggéseire vonatkozóan. A HapMap négy, földrajzilag és etnikailag eltérő népcsoportból származó 270 egyén teljes genom szekvenálásából származik. Eddig a vizsgált során az azonos népcsoportba tartozó személyeknél körülbelül 25-30%-os SNP átfedést azonosítottak. Kimutatták, hogy a rekombinációs arány szisztematikusan különbözik az egyes gének vonatkozásában illetve eltérő funkciójú gének között, valamint azonosítottak a populációs természetes szelekcióban szerepet játszó allél polimorfizmusokat.

21 Genome wide association studies Manhattan plot: minden pont egy SNP-t jelöl, az x-tengelyen a lokalizáció az y-tengelyen az asszociáció szorossága látható. Jelen vizsgálat egy mikrocirkulációs rendellenességeket vizsgáló tanulmány része, melyben a kisérszűkülettel összefüggő SNP variánsok ábrázolódnak Ikram MK et al (2010) Four Novel Loci (19q13, 6q24, 12q24, and 5q14) Influence the Microcirculation In Vivo. PLoS Genet (10):e

22 Poligénes és multifaktoriális betegségek Több gén, génkomplexumok és környezeti hatások interferenciája befolyásolja a kialakulást Populációs szinten magas prevalenciájú betegségek Gének penetranciája változó, széles skálán mozog Családi halmozódást mutathat a betegség és a génkomplexumok mutathatnak hasonlóságokat a családon belül, de többnyire nem figyelhető meg a családi öröklődési mintázat Csupán a genetikai vizsgálattal nehéz egy személy lehetséges érintettségét pontosan meghatározni!!! Hypertonia Stroke Sporadikus daganatok Diabetes mellitus Asthma Epilepszia Ritkán néhány veleszületett rendellenesség: Szájpadhasadék Velőcső defektusok

23 Genom-környezet interferencia Gének Magas vagy alacsony penetranciájú Környezet Külső fizikai kémyiai biológiai társadalmi

24 Epigenetika Örökölhető sejtfenotípus és génkifejeződés eltérések, melyek a DNS szekvenciától függetlenek: Kromoszomális remodelling Hiszton módosulás DNS metilációs mintázat Fehérjét nem kódoló RNS szakaszok: mirns

25

26 A genomika hatásai Molekuláris medicina diagnosztika, prevenció betegségek genetikai pediszpozíciójának meghatározása molekuláris alapú egyénre szabott gyógyszerelés molekuláris célzott terápia donor-recipiens egyezőség meghatározása transzplantációs programban Mikrobiológia patogének gyors azonosítása és célzott kezelése új energiatermelési eljárások (bioüzemanyag) környezeti szennyezők monitorozása a toxikus anyagok biztonságos lebontása, megsemmisítése

27 A genomika hatásai Kockázatbecslés az egészségügyi kockázat meghatározása fizikai és kémiai környezeti expozíció során, daganatkockázat DNS azonosítás (Igazságügyi orvostan) áldozatok és elkövetők azonosítása apasági és családi eredet meghatározás biológiai szennyezők azonosítása Bioarchaeológia, Antropológia, Evolúció- és Migrációkutatás a csírasejtes mutációk tanulmányozása mitokondriális DNS, Y kromoszóma meghatározás

28 Elsi: etikai, jogi, és társadalmi következmények A genomikai információ személyes és megbízható kezelésebiztosító társaságok, alkalmazók, törvényhozók, oktatási intézmények, katonai intézmények és egyéb szerveket érintően. Pszichoszociális hatás, stigmatizáció, diszkriminációaz egyéni genomikai különbözőségből fakadóan. Reproduktív következményekbecslése és szabályozása a reproduktivitást érintő döntéshozatalban. Klinikai vonatkozásokbeleértve az orvosképzés, genetikai információ szolgáltatása az egészségügyi ellátó személyzet felé, a genetikailag elemzett személy ill. a népesség tájékoztatása a lehetőségekről és korlátokról, szociális kockázat, standard protokoll és minőségbiztosítás alkalmazása.

29 Hgp-n túl: mi a következő lépés? HapMap Genetikai változékonyság meghatározása a humán genomban Systems Biology Mikrobiális genom lehetőségei energiatermelés és környezeti célok felhasználására