Orvosi Genomika. 1. Trendek a modern orvostudományban. 2. Genomika és modern orvostudomány

Átírás

1 1 1. ORVOSI GENOMIKA Orvosi Genomika 1. Trendek a modern orvostudományban DIA 1 Az emberi genom megfejtése óta eltelt 10 évben rendkívül gyors fejlődés ment végbe a genomikai technikákban, ill. a genomikai módszereket alkalmazó tudományterületeken, pl. az orvostudományban. Sok új ismeretet szereztünk az emberi genom változékonyságáról és működéséről. Sokan úgy vélik, hogy annak a lehetőségnek a kapujában állunk, hogy megismerjük a komplex (multifaktoriális, poligénes) betegségek genetikai hajlamosító tényezőit, s ezen ismeretek birtokában, személyre-szabott terápiával gyógyítsuk a betegeket. Az orvostudomány és a gyógyítás fordulóponthoz érkezett. A molekuláris genetika és a genomika legújabb eredményeinek alkalmazása először a betegségek diagnózisában és prognózisában, majd a megelőzésben, s végül a terápiában teremt alapvetően új lehetőségeket. DIA 2 Három nagy technika csoport verseng egymással, a DNS chipek, a real-time PCR és az újgenerációs szekvenátorok. A jelenlegi állás szerint, a szekvenátorok állnak nyerésre, az idén jelent meg az első kereskedelmi forgalomban kapható 3. generációs szekvenátor (Pacific Biosciences, SMRT technológián alapuló berendezése; 1 órán belül, 100 dollártól kevesebb költséggel szekvenál meg egy teljes emberi genomot), s hamarosan követik majd újabb, más (pl. ún. nanopórusos) elveken működő berendezések. Ezek a szekvenátorok már nem csupán a DNS szerkezetének megállapítására alkalmasak, hanem az RNS-ek kópiaszámát (közvetlenül RNS-t, vagy cdns-t szekvenálnak) is képesek meghatározni; sőt, a DNS metilációs mintázatának vizsgálatára is alkalmasak. A készülék béta verziója jelent meg: sok labor tesztelésre kapta meg, egyelőre csupán néhány méreg drága készüléket vásároltak meg. DIA 3 A modern biológián alapuló orvostudomány fejlődése a humán genom megfejtésétől a betegágyig a következő, időben átfedő, szakaszokból áll: (1) a genom szerkezetének megismerése; (2) a genom funkciójának megértése; (3) a betegségek biológiájának megértése; (4) az orvostudomány fejlődése; (5) a gyógyítás hatékonyságának javítása. Az idő haladtával egy folyamatos eltolódás figyelhető meg az (1)-től az (5) fázis felé. FOGALMAK DIA Genomika és modern orvostudomány Az evidencia-alapú orvostudomány célja a tudományos eredményekből nyert ismeretek, tények (evidenciák) alkalmazása a klinikai döntések során. Az alternatív medicina nem ezen az elven működik. A transzlációs medicina (TM) fő feladata az utóbbi években felhalmozott alapkutatásból (molekuláris genetikai és genomika) származó ismeretek átültetése (transzlációja = lefordítása) az orvosi gyakorlatba. Sokan a TM-et az evidencia-alapú medicina XXI. századi megfelelőjeként definiálják. Orvosi genomika (genomikai medicina) genomika információkat és technikákat használ a genetikai betegségek és a betegségre való hajlamok diagnosztikájára és prognózisára. DIA 5 A személyre-szabott gyógyászat (personalized medicine) a molekuláris genetikai és genomikai ismeretek felhasználása a diagnózisban, a prognózisban és a terápiában. Szemben a jelen és múltbeli tömeg szemléletű gyógyítási paradigmával, a személyre-szabott gyógyítás a pácienseket egyénekként kezeli; a terápiát az egyén genetikai profiljának ismeretében határozza

2 2 1. ORVOSI GENOMIKA meg. A személyre-szabott gyógyítás két különböző terápiás eljárást is jelent: (1) egyrészt, a klasszikus gyógyszerek egyénre-szabott tesztelését, melynek alapját a páciens ismert genom profilja képezi; (2) másrészt, új típusú gyógyszerek (őssejtek, valamint a szekvencia-specifikus gyógyszerek: DNS, RNS, fehérje, antitest, stb.) alkalmazását. Ezeket az új típusú gyógyszereket specifikusan egy adott páciens gyógyítására fejlesztik ki. DIA 6 A prediktív medicina az orvostudomány gyorsan fejlődő ága, amely a betegségek előrejelzésével (predikciójával) foglalkozik, azért, hogy ezáltal megakadályozzuk a betegségek kialakulását. A teljes genom vizsgálata (mikrochipekkel és DNS szekvenálással) lehetővé teszi a genetikai betegségekre való fogékonyság előrejelzését évekkel a betegség megjelenése előtt, s így az adott betegségre hajlamos egyént életmódtanácsokkal láthatjuk el és/vagy gyógyszeres kezelést és szorosabb orvosi felügyeletet javasolhatunk. Tudjuk, pl. hogy a BRCA1 gén mutációját hordozó egyéneknél nagyon magas a mellrák esélye. Az érintett egyén számára gyakori vizsgálatot javasolhatunk. A Faktor V gén bizonyos allélvariánsa vérrögök kialakítására, tehát mélyvénás trombózisra való hajlamot határoz meg. A beteg allél jelenléte esetén prevenciós célú kezelést javasolhatunk (antikoaguláns terápia). A genetikai tesztek jóval hamarabb lesznek kaphatóak a piacon, mint a gyógyszerek, melynek oka az utóbbiak hosszantartó és drága előállítása, valamint a 10 évnél is hosszabb tesztelési ideje. Ezen a helyzeten radikálisan változtatni kell a jövőben, különben a modern terápiás módszerek elbuknak mielőtt alkalmazni lehetne őket. A prediktív medicina paradigmaváltást fog előidézni a gyógyításban, a jelen reaktív (reagáló) megközelítések helyett proaktív (megelőző) technikákat fog alkalmazni. Más szavakkal, a prediktív medicina a betegség gyógyításától a betegségek megelőzése felé tereli a gyógyítást, amely várhatóan jelentősen csökkenti majd a megbetegedéseket. A prediktív medicina a komplex betegségeket csupán valószínűsíteni képes, igaz egyeseket közel 100%-os megbízhatósággal. Eltérően sok preventív beavatkozástól, melyek embercsoportokat céloznak meg (pl. immunizációs programok), a prediktív orvoslás egyedileg kezeli a pácienseket. Jelenleg a prediktív medicina metodikái, mint pl. a genetikai tesztek, főként az egygénes (pl. cisztás fibrózis) és a kromoszóma rendellenességeken alapuló betegségeket (pl. Down kór) diagnosztizálják. A prediktív medicina jelen korlátai (1) A genetikai adatok alapján való predikciók egyik problémája az, hogy egy kódoló régióban történő mutáció, még ha az aminosav változással is jár, nem biztos, hogy számottevően megváltoztatja a fehérje funkcióját, amely ezért nem okoz betegséget. Tehát, egy új mutáció esetén nem tudjuk pontosan, hogy kialakul-e a betegség vagy sem. (2) A gyakori komplex betegségek több gén által meghatározottak, s jelenleg még nem ismerjük részvevő gének teljes körét, s az egyes gének szerepét. (3) Nem ismerjük a genetikai szabályozó elemekben történő mutációk hatásait az egészségre. Márpedig a szabályozási mutációk jóval gyakoribbak, mint a kódoló régióban történő mutációk. (4) Nem ismerjük az epigenetikai variációk szerepét sem. (5) A komplex betegségek kialakulásának van egy környezeti és életmódbeli (dohányzás, étkezés, stb.) tényezője, amit nem tartalmaznak a genetikai adatok, pedig gyakran fontosabbak lehetnek azoktól. (6) A genetikai alapon megállapított kockázatok ismerete lelki teherként nehezedhet a páciensekre. A genetikai tesztelés típusai DIA 7 1. Az újszülöttek genetikai szűrése közvetlenül a születés után történik azért, hogy az esetleges genetikai hibákat kezelhessük. Az USA-ban fenilketonúria (PKU) és hipotiroidizmus (tiroxin alultermelődés) betegségekre végzik az újszülöttek szűrését. Ezekre a betegségekre ugyanis létezik hatékony terápia (diéta, ill. tiroxin pótlás), ami elejét veheti a betegség kialakulásának. 2. A prenatális tesztelés (születés előtti diagnózis = fogantatás utáni diagnózis = prekoncepcionális diagnózis) a magzat, ill. embrió genetikai tesztelését foglalja magában. Ez a teszt olyan pároknak ajánlatos, akik bizonyos genetikai vagy kromoszómális rendellenességre magas rizikóval rendelkeznek. A prenatális teszt eredményének ismeretében a szülők dönthetnek az abortusz mellett. A prenatális tesztelés lehet invazív, vagy nem-invazív. A nem-invazív technikák, mint pl. az ultrahangos vizsgálat, vagy a szérum teszt, nem tudják teljes bizonyossággal megállapítani egy betegség meglétét vagy hiányát. Az invazív technikák kockázatosabbak a magzat számára, mert egy tűvel veszünk mintát az amnion folyadékból (amniocentézis), a köldökzsinórból (chordocentézis = köldökzsinórvér biopszia/punkció), vagy a méhlepényből (chorion boholy mintavétel; CVS).

3 3 1. ORVOSI GENOMIKA 3. A preimplantációs genetikai tesztelés (beültetés előtti) módszerét mesterséges megtermékenyítés (in vitro fertilizáció; IVF) esetén alkalmazzuk, s két különböző technikát foglal magában. (1) A preimplantációs (genetikai) diagnózis (PGD) technikát abban az esetben alkalmazzák, amikor az egyik vagy mindkét szülő ismert genetikai rendellenességgel rendelkezik. (2) A preimplantációs genetikai szűrés (PGS) egy olyan vizsgálati módszer, melynek során egészséges szülőktől származó embriókat tesztelnek aneupoidiára. Mindkét technika azon alapul, hogy a 8 sejtes embrió sejtjei totipotensek, s így egyikük eltávolítása nem problémát az embriogenezisben, mert a többi sejt pótolja a hiányt. A preimplantációs technikák egy alternatívát jelentenek a fogantatás utáni technikákkal szemben. Az előzőnél a probléma az IVF maga, a másiknál pedig a beavatkozás veszélyei, és betegség esetén a döntés a megtartás vagy az abortusz között. A preimplantációs technikák a génterápia alternatívái is. 4. A hordozó tesztelés módszerével genetikai betegséget hordozó, de nem beteg (heterozigóta) egyedeket tudunk azonosítani. Ez a teszt olyanok számára ajánlott, akiknek a családfájában előfordul az adott betegség, vagy ha az illető olyan etnikai csoport tagja, amelyben gyakori egy genetikai rendellenesség (ld. BRCA1 gén mutációja az askenázi zsidóknál). Mindkét szülő tesztelése esetén megállapítható, hogy a leendő gyermek milyen kockázattal fogja hordozni a hibás allélt, ill. lesz beteg. 5. A fogantatás előtti tesztelést az egyik vagy mindkét szülőn végzik el. Itt nem egy konkrét betegségre szűrnek, hanem az ismert betegségekre és rizikófaktorokra. A technika alkalmazható az ismert genetikai hátterű fenotípusos (anatómiai, viselkedésbeli) nem beteg sajátságokra való tesztelést is. Egyes cégek már elkezdték alkalmazni ezt a technikát sperma bankok és adományozott petesejtek vizsgálatára. Az Existence Genetics nevű cég egy új, fogantatás előtti tesztelésen alapuló tanácsadással foglalkozik, amely a két potenciális szülő DNS-ének ismeretében, bioinformatikai módszerek alkalmazásával, jóslásokat ad egy leendő gyermek gyakori és ritka betegségekre való kockázatait illetően, ill. megjósolják egyéb specifikus jellegek kialakulásának esélyét is. GENOMIKÁK DIA 8 Molekuláris biológia: a DNS, az RNS és a fehérjék szerkezetének és funkciójának tanulmányozása molekuláris szinten. Molekuláris genetika: a DNS és az RNS szerkezetének és funkciójának tanulmányozása molekuláris szinten. Genomika: A DNS szerkezetét (bázissorrend, SNP-ek és egyéb markerek elhelyezkedése) és funkcióját vizsgáló tudományterület. A molekuláris genetikától úgy szokás elkülöníteni, hogy míg az előbbi az egyedi géneket tanulmányozza, addig a genomika össz-genom szinten vizsgálódik. A genomika ágai: 1. A strukturális genomika a DNS szerkezetét vizsgáló tudományterület. 2. A funkcionális genomika a génexpressziót vizsgálja. 2a. Transzkriptomika Egy sejt, szövet, vagy szervezet össz-rns tartalmát vizsgáló tudományterület. Az RNS-ek mennyiségéből és egymáshoz való arányukból a sejtben végbemenő folyamatokra, valamint a sejt funkciójára következtethetünk. 2b. Proteomika Egy sejt, szövet, vagy szervezet össz-fehérje tartalmát vizsgáló tudományterület. Az RNS-ek mennyiségéből és egymáshoz való arányukból a sejtben végbemenő folyamatokra, valamint a sejt funkciójára következtethetünk. 3. Integratív genomika 3a. Összehasonlító (komparatív) genomika különböző fajok DNS-ének és fehérjéinek az összehasonlításával foglalkozó tudományterület. 3b. Metabolomika a kismolekulájú anyagcseretermékekkel (metabolitokkal) foglalkozó tudományterület. A metabolom egy sejt vagy egy szövet teljes anyagcsere produktumainak az összessége. 3c. In silico genomika = bioinformatika: a genomikai adatok matematikai és számítástechnikai módszerekkel való értékelése 3d. Farmakogenomika a genetikai variancia és a gyógyszerek hatása közötti összefüggéseket kutató tudományterület. Gyakran a személyre-szabott gyógyászattal azonosítják.

4 4 1. ORVOSI GENOMIKA 3e. Nutrigenomika a táplálkozás hatása a genomműködésre, s ezáltal az egészségre. A genotípus szerepe a táplálkozás élettani hatásait illetően. 4. Epigenomika - A kromatin módosulások (DNS metiláció és hiszton módosulások) variabilitását vizsgálja össz-genom szinten. DIA 9 Farmakogenomika: külön lapon DIA Táplálkozástudomány Nutrigenomika: külön lapon DIA Epigenomika: külön lapon DIA 18 Filomedicina evolúciós genomikai medicina: külön lapon DIA 19 Rendszerbiológia: külön lapon HapMap DIA 20 A Nemzetközi HapMap Project célja az emberi genom haplotípus (ld. később) térképének (HapMap; haplotype map) megszerkesztése, melynek segítségével katalogizálni tudjuk az ember genetikai variabilitásának gyakori mintázatait. A HapMap-et egy nagyon fontos leltárnak tekintik, mivel tartalmazza azokat a genetikai variációkat (SNP-k), amelyek felelősek a betegségek kialakulásáért, vagy betegséget hajlamosító tényezők, és/vagy markerként jelzik a betegséget. A nemzetközi HapMap Projekt az ember genetikai variációjáról egy genomszintű adatbázist készített. DIA 21 Genom-szintű asszociációs vizsgálatok (GWA vagy GWAS; genome-wide association studies), - melyet másképpen teljes-genom asszociációs vizsgálatoknak (whole-genome association studies; WGAS vagy WGA) is neveznek, - a genom genetikai varianciájának a vizsgálatát jelenti több százezer SNP meghatározásával, DNS chipek felhasználásával. A projekt célja az SNP mintázatok és a fenotípusos jellegek közötti korreláció keresése. Ezek a vizsgálatok különösen fontosak azoknak a genetikai variánsoknak az azonosításában, amelyek a gyakori komplex betegségek kialakulásában játszanak szerepet (pl. az asztma, rák, diabetes, szív- és érrendszeri betegségek, mentális rendellenességek: szkizofrénia, depresszió, öngyilkosság, stb.) A témáról 350 publikációban 1640 olyan SNP-t közöltek le, amelyek 80 betegséggel, ill. jelleggel kapcsolatosak. 18 régiót hoztak kapcsolatba több betegséggel is. Ezek a régiók közös etiológiai folyamatokat irányítnak, pl. az MHC-t kódoló DNS szakaszt 10 különböző betegséggel hozták kapcsolatba, az autoimmun betegségtől a tüdőrákig. 3. Mendeli jellegek genetikai térképezése Az emberi genom általános szerkezete ismert, tudjuk, hogy az egyes gének hol helyezkednek el az egyes kromoszómákon. Ha azonban egy betegség (vagy egy normál jelleg) genetikai hátterét akarjuk megállapítani, akkor ehhez magának a genomnak ismerete nem elegendő, kísérletesen ki kell derítenünk, hogy annak melyik része, milyen gén, vagy gének, ill. DNS lokuszok felelősek az adott betegségért. Ehhez genetikai térképezést kell végeznünk. DIA 22 3/1. Bevezetés A genetikai térképezés egy fenotípusos jelleget vagy egy betegséget okozó DNS szakasz (gén) meghatározása genetikai markerek segítségével. A genetikai térképezés célja annak megállapítása, hogy két adott lokusz milyen gyakorisággal válik el egymástól a meiotikus rekombináció során. Ha a két lokusz két különböző kromoszómán helyezkedik el, akkor nem kapcsoltak. Ha a két lokusz ugyanazon kromoszóma két különböző végén helyezkedik el, akkor nagy eséllyel válnak el egymástól a rekombinációban résztvevő kromatid szálon (csak az egyik kromatid rekombinál), ha viszont nagyon közel van a két lokusz egymáshoz, akkor ezek sok generáción keresztül együtt öröklődnek (kapcsoltság). A lokuszok sorsát akkor tudjuk nyomon követni, ha valamilyen fenotípusosan megjelenő sajátságot kódolnak, vagy könnyen azonosítható genetikai elemeket (SNP-k, mikroszatellitek, restrikciós hasító helyek, stb.) tartalmaznak, - ezeket

5 5 1. ORVOSI GENOMIKA nevezzük markernek, melyek tehát lehetnek fenotípusos- vagy genetikai markerek. Ha egy ismeretlen, Mendeli módon öröklődő jelleg vagy betegség genetikai tényezőjének a pontos helyét szeretnénk megállapítani a kromoszómán, akkor azt kell vizsgálnunk, hogy az ismert markerekhez képest kapcsoltan öröklődik-e az adott jelleg, s ha igen milyen mértékű a kapcsoltság. Ha egy betegség egy adott markerrel rendszerint együtt fordul elő, akkor ahhoz közel van, ha pedig véletlenszerűen fordulnak elő együtt, akkor különböző kromoszómán, vagy ugyanazon a kromoszómán, de egymástól távol helyezkednek el. Egy marker lehet egy monogénes betegség is, de mivel ezek ritkák, rendszerint normális fenotípusos jellegeket használunk markerekként. A pontos térképezéshez olyan markereket célszerű használni, amelyekből sokat ismerünk, azaz sűrűn helyezkednek el a genomon (pl. SNP-k). A genetikai és fizikai térkép nem ugyanazok a fogalmak. A fizikai térkép abszolút arányos a távolsággal, hiszen ennek mértékegysége a bázispár (pár, mivel a DNS kétszálú). A genetikai térképét a rekombinációs gyakoriságok alapján szerkesztik meg, s mértegysége a centi Morgan (50cM a távolság 2 különböző kromoszómán elhelyezkedő gén vagy marker között). A rekombinációs gyakoriság viszont nem lineárisan arányos a távolsággal, lehetnek pl. rekombinációs forró pontok, ahol az átlagtól magasabb a rekombinációs gyakoriság. Állatok esetében keresztezéseket tudunk végezni, ami rövid generációs idejű fajok esetében (E. coli, ecetmuslica, egér) megkönnyíti a térképezést. Az emberrel nem lehet kísérletezni, ezért családfákat kell elemeznünk. A spermiumok vizsgálata ennél jóval finomabb térképet produkál, de itt nem ismerjük a fenotípusos jegyeket. A komplex jellegek és betegségek genetikai térképezése jóval nehezebb, mint a Mendeli jellegeké. DIA 23 3/2. A genetikai rekombináció (crossing over) a meiotikus sejtosztódás normális velejárója, funkciója az anyai és apai kromoszómák közötti DNS csere által új genetikai kombinációk létrehozása. Az első meiotikus osztódás profázisában a homológ kromoszómák összekapcsolódnak, s a két pár 1-1 apai és anyai kromatinja között DNS csere megy végbe, a másik két kromatin között viszont nem (ilyenkor a sejt 4szeres DNS mennyiséget tartalmaz). A rekombináció egy reciprok folyamat, az egyik kromatida az elveszett szakasza helyett ugyanannyi DNS-t kap vissza a másik kromatidától, tehát, normális esetben, nincs nettó DNS vesztés vagy nyerés. Ha az apai kromatida az A és B gén A1B1 alléljait, az anyai kromatida A2B2 alléljait tartalmazza, akkor rekombináció esetén: A1B2 és A2B1 konfigurációkat kapunk az ivarsejtekben (plusz 50%-ban nem rekombinánsokat: A1B1 és A2B2 genotípusú ivarsejteket). Nem úgy az ún. gén konverzió esetében, ahol a csere nem reciprok módon, hanem egy irányban megy végbe. Az előzővel megegyező kiindulás esetén gén konverziónál pl. a következő genotípusokat kaphatjuk: A1B1 és A1B2. Génkonverzió esetén sincs nettó DNS vesztés, csupán az egyik allél (itt A2) helyett lesz a másik allélból (A1) kettő (a mechanizmust nem ismertetjük). Crossing over esetén a rekombináns egyedek alkotják az ún. rekombináns frakciót. A rekombinációt normálisan az utódok genotipizálása által figyelhetjük meg, s így rekombináns vagy nem-rekombináns egyénről beszélhetünk, - bár több kutató ivarsejteket analizál ún. ultraszenzitív PCR segítségével. Rekombináció és neokombináció: korábban a kromoszómák rekombináció nélküli keveredését neokombinációnak nevezték. Ezt a kifejezést már csak ritkán használják, melynek oka az, hogy mindig történik rekombináció, ezért nincs értelme a szülői kromoszómák keveredéséről beszélni (a kromoszómák mozaikosak). DIA 24 A genetikai rekombináció haszna A tankönyvi magyarázatok szerint a genetikai rekombináció (ivaros szaporodás) értelme a populáció nagyobb genetikai variabilitásának biztosítása. Valójában ez azt jelenti, hogy a különböző egyedekben keletkező hasznos mutációk egyetlen egyedben egyesülhetnek, s később együtt terjedhetnek el a populációban. Tehát, szemben az aszexuális (ivartalanul szaporodó) fajokkal, ahol az egyedek genetikai változékonysága egymástól függetlenül alakul ki, az ivarosan szaporodó fajoknál az egész populáció együtt gyűjti a hasznos mutációkat.

6 6 1. ORVOSI GENOMIKA DIA 25 A rekombináns frakció azoknak az egyedeknek a száma, amelyek az egyik vizsgált jellegüket az egyik szülőtől, a másikat a másiktól örökölték (rekombinánsok). Ha 2 lokusz különböző kromoszómán helyezkedik el, akkor egymástól függetlenül fognak öröklődni. Vegyük F egyed spermatogenezisét (heterozigóta). 50% az esély arra, hogy a meiózis végén a spermium az A gén nagyapai (vörös) A1 allélját kapja, s újabb 50%, hogy a B gén a nagymamától (kék) származik (B2 allél). Hasonlóan kalkulálható a többi kombináció is. Tehát, a gyerekek 50%-a lesz rekombináns, 50%-a nem-rekombinás, azaz a rekombináns frakció 0,5. F egyed női partnere L, homozigóta, de mindkét génből egy 3. féle allélt tartalmaz. A jobboldali ábrán látható pedigré szintenikus, azaz, a két lokusz ugyanazon a kromoszómán helyezkedik el. Ha nem lenne crossing over, minden gaméta ugyanazt az allél kombinációt hordozná, mint a szülői kromoszómák. Mivel, a crossing over a meiózis elválaszthatatlan jellemzője, mindig van lehetőség a két szinténikus lokusz elválására. Tehát, az utódok bizonyos %-a rekombináns lesz, s ez a szám annál nagyobb minél messzebb helyezkednek el egymástól a kromoszómán. Az ábrán a rekombináns frakció 0,1. A rekombináns frakció, - tehát a 2 lokusz közötti genetikai távolság mértéke, - esetünkben 10 cm, ami 10%-os rekombinációs gyakoriságot jelent. A crossing overt megelőzően a DNS már replikálódott, és minden kromoszóma 2 leány kromatidát tartalmaz. A 4 leány kromatida közül csupán 2 vesz részt a rekombinációban. A közeli lokuszok ritkán válnak szét, ehelyett együtt, egyfajta blokk-ként öröklődnek. Ezeket az allél blokkokat nevezzük haplotípusnak. Egy haplotípus egy nem-rekombinálódó kromoszóma szegmenst jellemez, melyet nyomon követhetünk egy populáció egyedei között vagy a rokonok közötti öröklődés során. *A haplotípus fogalmát újabban egy SNP-ket tartalmazó kromoszómális szegmensként definiálják 3/3. Egy betegség lokusz térképezése A genetikai térképezés célja egy jelleg vagy egy betegség genetikai tényezőinek DNS-en való lokalizációja. Az emberi betegségek térképezéséhez találnunk kell olyan családokat, akiknél az adott betegség gyakran előfordul. Továbbá, szükségünk van egy (de inkább több) Mendeli módon öröklődő jellegre, mint markerre (a Mendeli betegségek ritkák, ezért kicsi a valószínűsége annak, hogy a vizsgált családban még más ilyen betegségek is előforduljanak), ami alapján az egyéneket rekombinánsokra és nem-rekombinánsokra oszthatunk. Mind a vizsgált, mind a markerként használt jellegnek Mendeli, lehetőleg kodomináns, módon kell öröklődniük azért, hogy a fenotípusból egyértelműen következtetni tudjunk a genotípusra. Továbbá, a vizsgált jelleget meghatározó lokusznak magas polimorfizmust kell mutatnia, azért hogy a heterozigóták populációban való előfordulása gyakori legyen (beteg családoknál ez a helyzet fennáll). A molekuláris markerek közül eleinte könnyen vizsgálható protein markereket használtak (pl. vércsoportok), de ezeket mára kiszorították a DNS markerek (pl. mikroszatellitek, SNP-k). 3/4 A kapcsoltsági analízis vizsgálati módszerei DIA 26 (1) Az első DNS-alapú kapcsoltsági vizsgálatok RFLP (restriction fragment length polymorphism, restrikciós fragmens hossz-polimorfizmus) analízist használtak. Ez a módszer a Southern blot technikán alapul, s így össz-genom analízisre való használata rendkívül munkaigényes. (2) DIA 27 A mikroszatellit markerek (STR markerek; short tandem repeats) használata jelentős előrelépést jelentett, mivel az RFLP-től jóval egyszerűbb kivitelezni, valamint rengeteg allél elkülönítését teszi lehetővé. Eleinte minden mikroszatellitet egyedileg amplifikáltak PCR-el, majd egyedileg futtattak gélen. Később, több mikroszatellit markert egyetlen reakcióban amplifikáltak (multiplex PCR), majd a kapott amplikonokat egyetlen gélen futtatták. Az STR-ek különböző fluoreszcens színekkel való jelölése 10 vagy több marker egyidejű gélen való futtatását, ill. szekvenálását tette lehetővé. Eleinte CA dinukleotidokat használtak markerekként, majd ezeket felváltották a trinukleotid és tetranukleotid markerek, mivel jobban értékelhető eredményeket adtak.

7 7 1. ORVOSI GENOMIKA (3) A DNS chipek elterjedésével SNP-ket kezdtek markerként alkalmazni, mivel ezek jóval gyakoribbak, mint a mikroszatellitek. Egyetlen DNS chip vizsgálattal több, mint 500,000 SNP-t lehet vizsgálni, ami rendkívül nagy felbontású térképezést tesz lehetővé, s nagyon gyors is. (4) A 3. generációs szekvenálási technikák elterjedésével nem szükséges a markerek használata, mivel a teljes genom minden egyes bázisának helyzetét meg tudjuk állapítani. DIA 28 Spermiumok térképezése A térképezés felbontása attól függ, hogy hány meiózist vizsgálunk. Az emberi családok, a kevés utódszám miatt, nem túl jók a térképezésre. Az egyik megoldás erre a problémára a spermiumok vizsgálata, mivel az ivarsejtek milliószámra termelődnek. A spermiumok vizsgálatával lehetőség nyílik egy rövid (néhány kilobázisnyi) DNS szakaszon is rekombinánsokat találni. A rekombináns frakció aránya az összes vizsgált spermiumhoz adja meg a genetikai távolságot. Sajnos ezzel a módszerrel betegségeket nem lehet térképezni, mivel a betegség fenotípusos tünetei nem jelennek meg a hímivarsejteken, viszont a genetikai markerek rendkívül finom térképezését lehet elvégezni vele. 4. Komplex betegségekre hajlamosító gének térképezése DIA 29 A gyakran előforduló betegségek rendszerint multifaktoriális meghatározottságúak, különböző genetikai és környezeti tényezők együttesen hatva csökkentik vagy növelik egy egyén betegségre való hajlamát (bár, több ilyen betegségnek létezik ritkán előforduló monogénes változatai is). A jelen kutatások célja ezeknek a tényezőknek az azonosítása. Sok komplex betegség esetén a genetikai faktorok szerepét családok, ikrek és adoptált emberek vizsgálatával állapították meg. E vizsgálatok során az egyik nehézséget az okozza, hogy nem könnyű elkülöníteni a genetikai tényezőket a közös családi környezet hatásaitól. A komplex betegségek térképezéséhez nem használható hagyományos genetikai analízis, mivel a hajlamosító tényezők bizonyos paramétereit (pl. az öröklődés módja, géngyakoriságok, penetrancia, stb.) nem lehetséges meghatározni. A Mendeli jellegeknél alkalmazott ún. parametrikus módszerek (markereket alkalmazó kapcsoltsági vizsgálatok) helyett, nem-parametrikus módszereket alkalmazunk; ezeknél nem szükséges a részletes genetikai modell megadása. (1) Beteg családok vizsgálata (nem-parametrikus kapcsoltsági vizsgálatok). A nem-parametrikus módszerek egyik típusánál olyan kromoszómális szegmenseket keresünk, amelyek a véletlentől nagyobb arányban fordulnak elő a beteg rokonainál. A kromoszómális szegmenseket kromoszómális markerek (ma SNP-k) alapján azonosítják. (2) Populációk vizsgálata (asszociációs vizsgálatok) Egy alternatív nem-parametrikus módszer a hajlamosító gének azonosítására populációs szintű statisztikai kapcsolatokat keresni bizonyos genotípus és betegség között. Ezek a statisztikai kapcsolatok azért létezhetnek, mert a populáció tagjainak a közös ősei hordozták ezeket a hajlamosító tényezőket, s lévén közel egymáshoz, nem választotta szét őket a rekombináció. A Nemzetközi Hapmap Projekt 4 emberi populációban meghatározta az ősi kromoszómális szegmenseket, és katalogizálta a markereket (SNP-k), melyek alapján ezek azonosíthatóak. A közös ősi kromoszóma szegmensek nagyon kicsik (rendszerint néhány kilobázis méretűek). Az asszociációs módszerek alkalmazása egy populáció vizsgálatára azon a feltételezésen alapul, hogy a komplex betegségek hajlamosító faktorai ősi kromoszómális szegmenseken helyezkednek el, melyeket a genetikai rekombináció nem választott el, ezért minden betegségre hajlamos egyénben változatlan formában vannak jelen (adott haplotípusokként definiálhatók). Ez a gyakori variáns hipotézis. Ennek alternatívája a ritka variáns hipotézis (másként a mutáció-szelekció hipotézis), mely azt feltételezi, hogy a hajlamosító genetikai tényezők nagyon heterogének, mivel új mutációk hozták őket létre (rendszerint nem a beteg egyénben alakult ki a mutáció, hanem valamilyen távoli rokonában, de nem olyan régen, mint azt a gyakori variáns hipotézis feltételezi). Ha ez utóbbi hipotézis a helyes, akkor a genetikai térképezés markerekkel (SNP) való vizsgálata értelmetlen, ehelyett teljes genom szekvenálást kellene végezni.

8 8 1. ORVOSI GENOMIKA DIA 30 Relatív kockázat (λ) A relatív kockázat matematikailag azt fejezi ki, hogy egy még nem beteg személy (vagy egy még meg sem fogant magzat) betegségre való rizikója hányszorosa a populáció egy átlagos egyedéhez képest. A λ értéket úgy számítjuk ki, hogy az érintett rokonok kockázatát elosztjuk a teljes populáció betegségre való kockázatával. Az érintett rokonok kockázata a beteg és a nem beteg rokonok számának hányadosa; a betegség populációban való kockázatát pedig úgy számítjuk ki, hogy a betegek számát elosztjuk a populáció nem-beteg egyedeinek számával. A számlálóban a betegek nem-beteg rokonokhoz való viszonyításának az az értelme, hogy a betegség kialakulásához több gén szükséges, s ezek a rokonokban halmozottan vannak jelen. A monogénes betegségek rizikója rendszerint magas (a cisztás fibrózis esetében λ = 500), míg a komplex betegségeknél egy adott allélvariáns kockázata a betegség kialakítására alacsony (I. típusú diabétesz: λ = 15; magas vérnyomás: λ = 1-4 körüli érték). A magas λ érték arra utal, hogy a betegségnek van egy fő génje, akár egyedül is kialakíthatja a betegséget. Egy adott gén különböző mutációja azonban különféle súlyosságú betegségeket okozhat. Lehetséges, hogy ugyanazon gén egyik allélvariánsa magas λ értéket, egy másik pedig alacsony λ értéket produkál. DIA 31 Haplotípusok Egy haplotípus közeli allélok csoportja, amelyek együtt öröklődnek a haplotípusok kitűnően alkalmasak a betegség gének pontos térképezésére. Az anyai és apai kromoszómapárok ugyanazokat a géneket ugyanazon kromoszóma, ugyanazon lokuszán tartalmazzák, a szekvenciák azonban nem feltétlenül azonosak (például, átlagosan 1000 nukleotidonként SNP-ket tartalmaznak). Az SNP-k segítésével lehetséges az apai és anyai allélvariánsok megkülönböztetése az utódokban, s ez lehetőséget ad a genetikai betegség gének térképezésére kapcsoltsági analízis (linkage analysis) alkalmazásával. Az ivarsejteket produkáló csírasejtekben az anyai és apai kromoszómák párba állnak és kicserélik DNS szegmenseket (crossing over). A távoli DNS szekvenciák között gyakori a rekombináció, a közeliek között ritka. Ezért a betegség gén és a DNS markerek közötti rekombinációs gyakoriság ismeretében, meghatározhatjuk a betegség gén DNS-en való helyzetét. Egy kromoszómán a közeli DNS szakaszok (pl. markerek) több generáción keresztül együtt öröklődnek, ezt nevezzük kapcsoltsági egyensúlytalanságnak (linkage disequillibrium; LD). Az egyensúlyt az jelentené, ha teljesen függetlenül öröklődnének (tehát, más kromoszómán helyezkednének el). Azokat az allélcsoportokat, amelyeket ritkán választ szét a rekombináció, - tehát, együtt öröklődnek - haplotípusoknak nevezzük. Az emberi genomban a haplotípusok hozzávetőlegesen 60,000 bázispárnyi (bp) szakaszon helyezkednek el, tehát kb. 60 SNP-t tartalmaznak (az ábrán 20 SNP-t tartalmazó haplotípusok vannak). Az SNP-n alapuló haplotípusokat a genetikai betegségek finomtérképezésére lehet használni. Kapcsoltsági egyensúlytalanság (linkage disequilibrium; LD): két vagy több allél nem-véletlenszerű együttelőfordulása, melynek oka az, hogy közel helyezkednek el a kromoszómán egymáshoz, s így a rekombináció hosszú ideig nem választja el őket (genetikai kapcsoltság). Ez a helyzet azt eredményezi, hogy az adott DNS szegmenseken lévő markerek alapján megállapítható a betegségre való hajlam (nem kell ismerni a teljes szekvenciát). DIA 32 Ősi haplotípus Az ősi TATCAT haplotípust tartalmazó DNS szakaszon egy mutáció (X) keletkezik a 3. és a 4. SNP között, s ezáltal betegséget okoz, vagy növeli egy betegség kockázatát (a térképezés előtt nem tudjuk, hogy a 3. és 4. SNP között van). Sok generáción belül az ősi haplotípus profil erodálódik a genetikai rekombináció miatt (pirossal jelölve a változásokat), pl. a jelen haplotípus-1 egy 1. és 2. SNP közötti rekombináció a T-t C-re cseréli. Azonban a legrövidebb konzervált haplotípus profil az összes páciensnél tartalmazza a mutációt: TXC. Ezzel a technikával egy kb. 10,000 bp-os szakaszra lehet lokalizálni a betegséget (rövidebb, mint egy gén). Megjegyzés: egy adott betegség hajlamosító tényezőit úgy vizsgáljuk, hogy egyetlen genomi lokuszra fókuszálunk. Az adott lokusz kiválasztásának különféle szempontjai lehetnek. Például, köztudott, hogy a viselkedésünket monoamin neurotranszmitterekkel kommunikáló idegsejtek irányítják, ezért azokat a géneket vizsgáljuk meg, amelyek a monoaminok előállításában, ezek hatásának közvetítésében, ill. a homeosztázisukban játszanak szerepet. Egy adott gén vagy genomi