Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése

Átírás

1 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Doktori (Ph. D.) értekezés Kovács Mihály Témavezető: Dr. Nyitray László Külső témavezetők: Prof. Clive R. Bagshaw, Dr. Málnási-Csizmadia András ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Szerkezeti Biokémia Doktori Program Programvezető: Prof. Gráf László Budapest, 2002.

2

3 Összefoglalás Munkánk kiindulópontjául azok az alapvető problémák szolgáltak, amelyek a miozin működésének vizsgálatában az egymásnak ellentmondó szerkezeti és kinetikai eredmények kapcsán tisztázatlanul maradtak. Nem volt ismert például, hogy az ATP-áz ciklust energetikailag előrehajtó nukleotid-kötési folyamat során milyen állapotváltozásokon keresztül történik a szabadenergia akkumulációja. Az ATP-hidrolízissel egyidejűleg detektált nagy konformációváltozás és a katalitikus lépés közötti összefüggés szintén felderítetlenül maradt. E konformációs átmenetnek, amely valószínűleg a miozin erőkarjának kilengésével jár együtt, a sebességmeghatározó foszfát-felszabadulási folyamatban betöltött szerepe is tisztázatlan. E kérdések megválaszolására olyan egy-triptofános miozin motorokat terveztünk és állítottunk elő, amelyek fluoreszcencia-változásai specifikusan követik a fehérjemolekulának az enzimműködés során bekövetkező állapotváltozásait. Az ATP-kötőhelyen érzékeny szenzort tartalmazó, a kötési lépések szelektív detektálását lehetővé tevő konstrukciók segítségével azonosítottuk és jellemeztük a ligandum-indukált állapotváltozásokat, és kimutattuk, hogy a szabadenergia akkumulációja több lépésben történik az enzim és a nukleotid indukált illeszkedése során. Az ATP-hidrolízist megelőző további nagy konformáció-változásra egy, a nukleotid kötőhelytől távolabb elhelyezkedő triptofán érzékeny. E szenzort felhasználva tranziens kinetikai vizsgálatokkal közvetlenül bizonyítottuk, hogy a konformációs átmenet és az ATP-hidrolízis különálló lépések, és kinetikailag jellemeztük azok csatoltságát. Modellünkben a gyors konformációs átmenet amely aktinhoz kötött állapotban az erőkifejtő lépés lehet többször megtörténik, mielőtt az aktív helyen a hidrolízis lejátszódna. További vizsgálatainkban a konformációs egyensúlyt a miozin fej két szubdoménjének kölcsönhatási felszínébe épített pontmutációkkal szelektíven tudtuk befolyásolni, és kimutattuk, hogy ily módon az ATPhidrolízis sebessége a két lépés kapcsoltsága folytán finomhangolható. Eredményeink a miozin működési ciklusáról nyújtott dinamikus kép mellett utat nyitnak olyan további szenzorok tervezésének és konstrukciójának, amelyekkel a konformáció-változások kinetikáján keresztül a fehérjemolekulán belüli kölcsönhatások dinamikus mivoltukban vizsgálhatók. Ezek fontosságát az adja, hogy az enzimműködésről és az energiaátalakításról kizárólag a szerkezeti, kinetikai-termodinamikai, valamint molekuláris mechanikai modellek közelítésével, szintézisével kaphatunk valódi képet.

4 Doktori értekezés 4

5 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Summary In this study, we addressed several fundamental problems regarding the myosin enzymatic mechanism that were still unresolved because of the conflicting findings obtained in structural and kinetic experiments. First, changes in the enzyme during the nucleotide binding process accompanied by free energy accumulation still had to be unravelled. A large conformational change concomitant with ATP hydrolysis was detected, but it was not known how this conformational transition is coupled to the chemical step. It was also unclear whether this change, which appears to be accompanied by the movement of the lever arm of the myosin molecule, plays a role in the rate-limiting phosphate release process. To answer these questions, we designed and produced single tryptophan motors whose fluorescence changes can be used to specifically monitor the transitions occurring in the protein molecule during the enzymatic cycle. By using constructs containing sensors in the ATP binding site that allow for selective detection of the nucleotide binding steps, we identified and characterised the ligand-induced structural changes. We showed that free energy is accumulated during multiple steps of the induced fit. A tryptophan sensor located further away from the nucleotide binding pocket can be used to monitor another large conformational change preceding ATP hydrolysis. We carried out transient kinetic experiments on a construct containing this sensor to provide direct evidence that the conformational transition and ATP hydrolysis are distinct events. Our model based on kinetic analysis of the coupling between these steps shows that the fast conformational change, which can constitute the working stroke when bound to actin, takes place several times before hydrolysis occurs. Furthermore, we were able to selectively perturb the conformational equilibrium by point mutations introduced into the interface between two subdomains of the myosin head. We demostrated that this perturbation allows fine tuning of the ATP-hydrolysis rate via the coupling between the two steps. Besides the dynamic picture obtained about the myosin enzymatic cycle, these results provide a basis for the design and construction of other sensors that allow assessment of the dynamics of interactions within the protein molecule through kinetic characterisation of conformational changes. The significance of this approach is that understanding of enzyme action and energy transduction can be achieved only by converging the views and models based on structural, kinetic-thermodynamic and molecular mechanical investigations. 5

6 Doktori értekezés Tartalomjegyzék 1 Bevezetés Miért fontosak és érdekesek a molekuláris motorok? Mire voltunk kíváncsiak? A használt terminológiáról és jelölésekről 10 2 Irodalmi áttekintés Energiaátalakítás az aktomiozin rendszerben a machina carnis működésének klasszikus modelljei Mit mondanak a szerkezetek? A miozin alegység- és doménszerkezete Proteolitikus és rekombináns miozin fragmentumok A fej három ismert konformációja Motor domén szerkezetek és a nyitott-zárt konformáció-változás Többféle konformáció egyazon nukleotiddal az aktívelyen Affinitás a távozó foszfáthoz A harmadik ismert konformáció Kommunikáció az aktin és nukleotid-kötőhelyek, illetve az erőkar között a motor szubdoménjei közötti kapcsok révén Az aktin és az aktomiozin komplex szerkezete Az aktomiozin működés kinetikája A miozin ATP-áz ciklus A nukleotid-kötés és -disszociáció legalább kétlépéses folyamatok A termékfelszabadulás a sebesség-meghatározó lépés Az ATP-hidrolízis lépés az enzimen reverzibilis Aktin-aktiváció, erős és gyenge aktinkötő állapotok Az ismert szerkezetek kapcsolata a kinetikai állapotokkal kérdőjelek az erőgenerálás mechanizmusa körül 25 3 Célkitűzések Triptofán szenzorok azonosítása és dinamikája A nukleotid-kötési lépések felbontása A nyitott-zárt átmenet és az ATP-hidrolízis kapcsolata Az ATP-hidrolízis sebességének beállítása 28 4 Anyagok és módszerek A kísérleti megközelítésről DNS konstrukciók elkészítése Expressziós rendszer, fehérjepreparálás Steady-state ATP-áz aktivitás mérése Steady-state fluoreszcencia-mérések Steady-state anizotrópia-mérések Kvantumhatásfok-mérések Kioltási kísérletek Időfelbontott fluoreszcencia-mérések Megállított áramlásos mérések Relaxációs kinetikai kísérletek Hőugrás Nyomásugrás 38 6

7 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 4.9 Adatok feldolgozása és kiértékelése 39 5 Eredmények és megbeszélésük Miért éppen a motor domén? Triptofán szenzorok a motor doménben fluoreszcencia-változások, molekuláris dinamika és a jelek eredete Intrinsic próbák a miozin fejben A relé-hurok triptofán: egy természetes riporter Triptofán szenzorok a nukleotid kötőzsebben A nukleotid kötőhelynél elhelyezkedő triptofánok fluoreszcencia-változásai Változások alap- és gerjesztett állapotban, kvantumhatásfokban, oldószerkitettségben Életidő-komponensek és a triptofánok dinamikája Steady-state és időfelbontott anizotrópia A spektrális változások értelmezése a szerkezeti adatok fényében A kötéskor bekövetkező fluoreszcencia-változások eredete Konformációs szubállapotok a szenzorok környezetében A relé-hurok felolvadása statikus vagy dinamikus rendezetlenség? A nukleotid-kötési folyamat érzékeny kinetikai felbontása a kötőzseb melletti triptofánt tart almazó mutánsok segítségével Háttér A ligandum-kötési lépések tranziens kinetikai vizsgálata A kötési modell megerősítése más nukleotidokkal és szenzorokkal A kötőzseb-triptofán valóban csak a kötési lépésekre érzékeny A kötési lépések és az aktomiozin disszociáció kapcsolata A nyitott-zárt konformációs átmenet és az ATP-hidrolízis lépés kinetikai szétválasztása és kapcsoltságának vizsgálata Előzetes megfontolások A nyitott-zárt egyensúly hőmérsékletfüggésének vizsgálata a W501+ fluoreszcencia segítségével apo, ADP és ADP.AlF 4 : három különböző globális konformáció A hőmérséklet hatása a steady-state ATP-áz köztiállapotok összetételére AMP.PNP és ADP.BeF x : két globális konformáció hőmérsékletfüggő egyensúlyban A nyitott-zárt egyensúly termodinamikai paraméterei: egymást kompenzáló nagy entalpikus és entrópikus tagok A gyors kezdeti csökkenés kimutatása alacsony hőmérsékleten megállított áramlásos méréssel A konformációs átmenet kimutatása hőugrással Nyomásugrásos méréssel a nyitott-zárt átmenet és a hidrolízis közvetlenül detektálhatók A két csatolt lépés dinamikus modellje Az ATP-hidrolízis sebességének finomhangolása szubdomének közötti kölcsönhatások megváltoztatásával Szerkezeti háttér szubdomén-mozgások a miozin fejben Irányított mutációk az N-terminális és konverter szubdomének kölcsönhatási felszínén Steady-state fluoreszcencia: konformációs állapotok részaránya ATP-ben, AMP.PNP-ben, ADP.BeF x -ban A nyitott-zárt egyensúly és az ATP-hidrolízis sebesség megváltozása A mutációk hatása a foszfát felszabadulására 84 6 Konklúziók 87 7

8 Doktori értekezés 7 Perspektíva 90 8 Köszönetnyilvánítás Acknowledgements 93 9 Rövidítések jegyzéke Ábrák és táblázatok jegyzéke Az értekezés alapjául szolgáló publikációk Irodalomjegyzék Táblázatok 103 8

9 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 1 Bevezetés If my body functions as a pure mechanism, yet I am sure that I am determining its motions, then I must be the person who controls the motion of the atoms in accordance with the laws of nature. I must therefore be God. Erwin Schrödinger: What Is Life? (1944) 1.1 Miért fontosak és érdekesek a molekuláris motorok? A molekuláris motorok az enzimek azon csoportját alkotják, amelyek egy exergonikus kémiai reakcióhoz (amely leggyakrabban ATP, illetve egyéb nukleotidok hidrolízise) mechanikai funkciót, munkavégzést kapcsolnak. Ennek alapján a közelmúltban javasolták ezen fehérje-csoportnak az enzimek egy új, VII. osztályába ( energázok ) való sorolását is (1). A molekuláris motorok közé tartoznak többek között a lineáris mozgatást végző eukarióta citoszkeletális fehérjék (tubulinkinezin, tubulin-dinein illetve aktomiozin rendszer), a baktériumok forgómozgást végző flagelláris motorjai, a mitokondriális ATP-szintáz az oxidatív foszforiláció kulcsenzime, valamint a nukleinsav síneken mozgó DNS- és RNS-polimerázok, illetve a nukleinsavakat kémiailag módosító egyes enzimek is. Ahogy nincs anyag mozgás nélkül, úgy működőképes élő sejt sem képzelhető el motorfehérjék hiányában. Az aktomiozin rendszer például olyan alapvető sejtfolyamatokban játszik fontos szerepet, mint a sejtalak és -polaritás meghatározása, a kario- és citokinézis, az exoés endocitózis, a különböző sejtnyúlványok (lamellipódiumok, filopódiumok) létrehozása és mozgatása, az irányított sejtmozgás (lokomóció) illetve a kemotaxis. A molekuláris motorok kutatásának jelentősége a terület interdiszciplináris szemléletet követelő alaptudományos (sejtbiológiai, biokémiai, enzimológiai, biofizikai, mechanikai) érdekességén túl az alkalmazás irányába egyrészt az e fehérjékkel kapcsolatos főleg öröklött betegségek kialakulási mechanizmusának, illetve diagnosztikai és terápiás lehetőségeinek feltárása, másrészt a nanotechnológiában történő felhasználásuk révén mutat. 1.2 Mire voltunk kíváncsiak? Az aktomiozin rendszer központi eleme a miozin ún. motor doménje, amelynek funkcionális részei az aktin illetve a nukleotid kötőhelye, valamint a molekula erőkarja közötti kommunikáció vizsgálata képezi a motor működés megértésének kulcspontját. Munkánk során a szerkezeti kép kézzelfoghatóságát a kinetikai megközelítés dinamizmusával igyekeztünk párosítani, külön-külön megcélozva az ATP-áz ciklus lépéseit a nukleotid kötésétől az ATP- 9

10 Doktori értekezés hidrolízisen keresztül egészen a termékek felszabadulásáig mindvégig szem előtt tartva az egyes folyamatok jelentőségét az aktinnal történő együttműködés szempontjából. Miozin motor domén konstrukciók előállításával és vizsgálatával a fehérje különböző ligandum-kötött állapotai, az ATP-áz intermedierek, valamint a molekula globális és lokális konformációs átmenetei közti összefüggéseket vizsgáltuk. Kísérleteinkben génsebészeti, fehérjeexpressziós, biokémiai, spektroszkópiai, valamint steady-state és gyorskinetikai technikák alkalmazásával a következő kérdésekre kerestünk választ: (a) Milyen állapotokon keresztül, hány lépésben történik az ATP irreverzibilis kötése során a nagy szabadenergia-csökkenés? A kérdés fontosságát az adja, hogy a miozin fej nukleotidkötése során végbemenő változások energetikailag a ciklus kulcslépései, mivel a ligandum kötése szolgáltatja az aktomiozin komplex disszociációjához szükséges szabadenergiát. (b) A miozin fej ATP-hidrolízissel egyidejűleg detektált nagy konformáció-változása és a katalitikus lépés kinetikailag szétválaszthatók-e és ha igen, mennyiben kapcsoltak egymáshoz? A konformációs átmenet az erőkifejtő lépéssel áll szoros összefüggésben, ezért e kapcsoltság döntő fontosságú az erőgenerálás mechanizmusában. (c) A fenti konformációs egyensúly hogyan befolyásolható a miozin szubdoménjei közötti kölcsönhatási felszín változtatásával, illetve megváltoztatása milyen hatással van az ATPhidrolízis, valamint a foszfát-felszabadulás sebességére? A dolgozatban ismertetett kísérletekkel a miozin motor domén különböző időskálákon zajló molekuláris mozgásait követtük nyomon. Triptofán szenzorok fluoreszcencia-jelének analízise révén információt nyerhettünk az enzimmolekula dinamikájáról, az egyedi oldalláncok rotációjától ( s időskála) a fluorofór környezetében történő kisebb átrendeződéseken ( s) keresztül a fehérje globális konformációs átmeneteiig ( s) terjedő széles tartományban. E változásoknak a rendelkezésre álló szerkezeti ismeretek birtokában végzett kinetikai elemzésével alkottunk dinamikus modellt a miozin ATP-áz működéséről. 1.3 A használt terminológiáról és jelölésekről A dolgozatban igyekeztem minden lehetséges helyen magyar szakkifejezéseket használni az angolszász terminusok helyett néhány olyan esetben is, ahol az adott fogalomra csak szórványosan használt magyar megnevezés létezik, vagy még ilyet sem sikerült találnom. A félreérthetőséget elkerülendő ilyenkor megemlítem az angol változatot is. A steady-state kifejezést nem fordítottam le, mivel ez sok helyütt szokatlan vagy értelemzavaró lett volna. Gyakorlati okokból a reverzibilis és irreverzibilis kifejezéseket azok szigorúan vett termodinamikai tartalmától kissé eltérő módon használtam: irreverzibilisnek az olyan folyamatot neveztem, amelynek 10

11 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése egyensúlyi állandója olyannyira eltér az egységnyitől, hogy az egyik irányban végbemenő változás az elemzés szempontjából elhanyagolható. Szintén az egyszerűség kedvéért hőérzékenynek és nyomásérzékenynek akkor jelöltem meg egy folyamatot, ha esetében a hőmérséklet- illetve nyomásfüggés a vizsgált hőmérsékleti tartományban az elemzés szempontjából jelentős volt. Nem teljesen egységes az irodalomban az intermedier (intermediate) kifejezés tartalma sem. A dolgozatban intermediernek illetve köztiállapotnak neveztem egy reakció-útvonalon a kiindulási anyagok és a termékek között szereplő valamennyi, kísérletileg közvetlenül vagy közvetetten kimutatható állapotot. A miozin fej nukleotid-mentes konformációját (aktin távollétében) apo állapotként említem, megkülönböztetve azt az aktomiozin komplex szintén nukleotid távollétében előállítható rigor állapotától, mivel utóbbiban a miozin fej konformációja a rendelkezésre álló adatok alapján vélhetőleg eltér az apomiozinétól. Az egyes kinetikai lépések sebességi állandóit (i-edik lépés esetén) k +i -vel jelöltem a leírás szerint jobbra, k i -vel balra tartó irányban; K i az asszociációs, K di a disszociációs állandót jelöli. A különböző fluoreszcencia-intenzitású állapotok jelölésekor a * a kiindulási állapothoz képest magasabb, míg a szimbólum alacsonyabb fluoreszcenciájú állapotra utal. Pontmutáns konstrukcióink elnevezésénél eltértünk a szokásos nevezéktantól, amely minden egyes megváltoztatott pozíciónál megnevezi a vad típusú fehérjében, illetve a mutánsban található aminosavat is. Mivel a konstrukciók többsége viszonylag sok mutációt tartalmazott, a rövid nevekben csak a fehérjében meghagyott vagy újonnan bevitt triptofán pozícióját neveztük meg a + jel előtt (pl. W501+). A konstrukciókban található valamennyi pontmutáció felsorolását a 2. táblázat tartalmazza. 11

12 Doktori értekezés 2 Irodalmi áttekintés A miozin a számos sejtműködésben alapvető szerepet játszó molekuláris motorok vizsgálatának legfontosabb kísérleti objektuma. A motor működési mechanizmusával kapcsolatban a nagy mennyiségű rendelkezésre álló adat ellenére számos kérdés még tisztázásra vár, mivel az elektronmikroszkópos és kristályszerkezetek révén az elmúlt néhány évben kialakult kép és az immáron közel három évtizede felállított kinetikai séma közötti összefüggés több ponton nem egyértelmű. Jelen összefoglalóban a téma igen terjedelmes irodalmának elsősorban a kísérleti rész problémafelvetésével és értelmezésével kapcsolatos háttér-információkat tartalmazó részét tekintem át. 2.1 Energiaátalakítás az aktomiozin rendszerben a machina carnis működésének klasszikus modelljei A spiritus animalis, azaz az élőlényeket mozgató erő mibenléte már évezredekkel ezelőtt is foglalkoztatta a gondolkodókat. Eraszisztratosz (alexandriai iskola, i. e. 3. sz.) már utal arra, hogy ez az erő az izmokban rejtőzik. A rá következő hosszú időszak során többek között Galenus, Leonardo da Vinci, Vesalius és Descartes művei között találjuk meg a tőle eredeztethető pneumaelmélet különböző válfajainak kifejtését, amely szerint a pneumá-t az idegek szállítják az izmokba, ahol az duzzadást okozva fejti ki hatását (2). Az elmélet cáfolatát Swammerdam felfedezése jelentette, miszerint az izom térfogata állandó marad az összehúzódás során. Az izom kémiai energiát mechanikai munkává alakító gépezetként való termodinamikai leírását végül von Helmholtz adta meg a 19. században. Az izom fehérjekomponenseinek leírásában Kühne vizsgálatai (3) jelentették az első áttörést, a mai fogalmaink szerinti miozin azonosítása azonban Szent-Györgyi Albert szegedi kutatócsoportjához, az aktin izolálása pedig Straub F. Brúnó nevéhez fűződik (4). Az ATP-ről, amelyet Lohmann egy évtizeddel korábban fedezett fel (5), Engelhardt és Ljubimova mutatták ki, hogy az a miozin szubsztrátja és az izom üzemanyaga (6). Szent-Györgyi Albert csoportjához fűződik annak felfedezése is, hogy az ATP emellett az aktomiozin disszociációját idézi elő, amit a kemomechanikai ciklus modelljeinek megjelenéséig nehezen megmagyarázható jelenségként tartottak számon. A váz- és szívizom polarizált fénymikroszkópos struktúrájában szembeötlő harántcsíkolt szerkezet az ún. vékony, illetve vastag filamentumok periodikus, részben átfedő elhelyezkedéséből adódik. A vastag filamentumokról lelógó kereszthidak ciklikusan lépnek kölcsönhatásba a vékony filamentumokkal, és az összehúzódás a két filamentum egymáshoz képest való 12

13 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése elcsúszásából adódik ( csúszó filamentum elmélet, sliding filament theory). A vékony filamentumok fő alkotóeleme az aktin, míg a miozin molekulák a vastag filamentumokat, illetve az azokból kiinduló ún. kereszthidakat alkotják. A kereszthíd, amely magába foglalja a miozin molekula feji részét, tartalmazza az aktin és ATP kötőhelyeket (7-9). Az ATP-áz ciklus lépései az aktin és a miozin kölcsönhatásához kapcsoltak. 1. ábra: A Lymn-Taylor modell A négylépéses modell az erőgenerálást a miozin fejben az ATP-hidrolízis és termékfelszabadulás során végbemenő szerkezeti változásoknak az aktin-kölcsönhatáshoz való kapcsoltsága révén értelmezi. Az izomkontrakció kilendülő kereszthíd (swinging cross-bridge) modelljét H. E. Huxley (10), A. F. Huxley (11) és R. M. Simmons (12) alkották meg, amelynek alapja a miozin fej orientációjának megváltozása a ciklus során az aktinhoz képest. A kemomechanikai ciklus első átfogó kinetikai modelljét Lymn és Taylor (13) közölték az 1970-es évek elején. A négyütemű modellben a miozin fej ATP-kötése az aktin filamentumról való leválással 1 (detachment) jár együtt (1. ábra). Az ATP-hidrolízis során a miozin fej felhúzott állapotba kerül, és így kötődik vissza a vékony filamentumhoz. Az erőkifejtő lépés (munkaütem, power stroke) során az aktinhoz kötött miozin fej a felhúzott állapotból a lecsapott konformációba tér vissza, ezzel elhúzva a vékony filamentumot a vastag filamentumhoz képest. Ez a lépés a hidrolízistermékek felszabadulásához kapcsolt. A Lymn-Taylor modell ezek alapján a kilendülő kereszthíd teóriára (10) épül. Terhelte azonban az elméletet az a tény, hogy a kereszthíd mozgását csak nehezen lehetett kimutatni (14, 15). Ennek oka sokáig tisztázatlan maradt. Később fény derült arra, hogy a miozin fejnek csak viszonylag kis része végez jelentős elmozdulást az aktinhoz képest (lásd fejezet). A fejnek ez az elfordulást végző, az aktinhoz képest disztális része a miozin erőkarjának tekinthető. A kilendülő erőkar (swinging lever arm) elmélet szerint az aktin és a miozin közötti kölcsönhatási felületnek nem szükséges megváltoznia a munkaütem során. 1 A két fehérjekomponens mindegyike egymáshoz közel elhelyezkedő, rögzített filamentumok formájában van jelen, ezért a kölcsönhatásaikat meghatározó körülmények eltérnek a szabad fehérjék oldataitól. Emiatt szokás az aktin, illetve a vastag filamentumokról lelógó miozin fejek szétválását disszociáció helyett leválásnak nevezni. A disszociáció kifejezést általában csak különálló, filamentumot nem alkotó miozin fejek esetén használják. 13

14 Doktori értekezés Az, hogy a miozin fejnek csak az erőkarja mozog, önmagában nem ad egyértelmű magyarázatot a kilendülés kimutatásának nehézségére. A fejeknek egy időben csak kis része kötődik az aktinhoz, és az erőkarmozgásnak az ATP-hidrolízishez, illetve termékfelszabaduláshoz való közvetlen kapcsoltsága nem volt kimutatható. A jelen dolgozatban ismertetett kinetikai kísérleteinkkel e kérdéskört is vizsgáltuk, és az fejezetben új megvilágításba helyezem a problémát. 2.2 Mit mondanak a szerkezetek? Az aktomiozin rendszer vizsgálatának első és sokáig egyetlen színtere és fehérjeforrása a magasabbrendű állati szervezetek egy specializált szövettípusa, az izomszövet volt. Csak jóval később derült fény arra, hogy egy általános előfordulású, minden eukarióta sejtben esszenciális szerepet játszó ősi mozgatórendszerről van szó. A szerteágazó funkciók betöltésére a miozinoknak igen sokféle, alegység- és doménszerkezetében, kinetikai és mechanikai sajátságaiban különböző csoportja alakult ki (jelenleg 18 miozin osztályt különböztetnek meg), míg az aktin monomerekre és filamentumokra nagyfokú szekvenciabeli és térszerkezeti konzervativitás jellemző A miozin alegység- és doménszerkezete A miozin több alegységből álló fehérje, amely fej és rúd részekre osztható (2. ábra). A fej a katalitikusan aktív motor doménből, illetve az erőátvitelben, valamint egyes izoformáknál a szabályozásban szerepet 2. ábra: A konvencionális miozinok doménszerkezete játszó regulációs doménből ( nyaki A két azonos nehézlánc feji (motor domén + nyak rész ) tevődik össze. A különböző erőkar ) és farok régiókat alkot, míg a két pár könnyűlánc a molekula nyaki részéhez kötődik. miozin osztályokban a motor domén felépítése és szekvenciája viszonylag konzervatív. E domén legvariábilisabb részletei a proteolitikusan érzékeny felszíni hurokszekvenciák. A nyak a nehézlánc egy hosszú α-helikális szegmenséből és az ennek ún. IQmotívumaihoz kötődő könnyűláncokból áll. A nyak hossza és a kötött könnyűláncok száma illetve milyensége jelentős változékonyságot mutat az egyes izoformák között. A konvencionális miozinok (miozin II osztály: ebbe a csoportba tartoznak pl. a váz-, szív- és simaizom miozinok, illetve az általunk kísérleti objektumként használt Dictyostelium miozin II) nyaki régiójához 14

15 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése nehézlánconként két könnyűlánc kapcsolódik. A motor doménhez képest proximálisan az ún. esszenciális (ELC), míg disztálisan a regulációs (RLC) könnyűlánc helyezkedik el. A farok-szekvenciák illetve a farki részhez kapcsolódó, effektor funkciójú egyéb domének igen nagy változatosságot mutatnak az egyes miozin osztályok között. A konvencionális miozin nehézláncának farki része szuperhelikális (coiled-coil) szerkezetet képezve nehézlánc-dimereket hoz létre Proteolitikus és rekombináns miozin fragmentumok A konvencionális miozin farki része fiziológiás ionerősségnél filamentumokat képez, ami megnehezíti az oldatbeli vizsgálatokat. Az ilyen vizsgálatokhoz ezért legtöbbször szolubilis proteolitikus illetve rekombináns fragmentumait használják. A miozin tripszines vagy kimotripszines emésztéssel nehéz (HMM: ez a szolubilis, kétfejű fragmentum a fejeket és a farokrégió egy proximális darabját tartalmazza) és könnyű (LMM: a farok fennmaradó része) meromiozinokra hasítható. A HMM kimotripszinnel vagy papainnal tovább hasítható az ún. szubfragmentum-1-re és -2-re (S1 és S2). Az S1 (miozin fej (8, 9)) tartalmazza a globuláris, kizárólag a nehézlánc alkotta motor domént és a nehézlánc hosszú α-hélixéből, valamint a két könnyűláncból összetevődő regulációs domént (nyak). Az S1 önmagában is aktin-aktivált ATPáz aktivitást és in vitro motilitást mutat. Az S1 proteolitikusan tovább hasítható N-terminális 25 kda, középső 50 kda és C-terminális 20 kda fragmentumokra (16, 17), amelyeket először funkcionális doméneknek gondoltak. Később kiderült, hogy a hasítóhelyek inkább csak a nagyobb flexibilis hurkok helyét jelölik ki a motor doménben; a nukleotid, illetve aktin kötőhelyek kialakításához több szubdomén 2 is hozzájárul (2.2.3 fejezet). A miozin szerkezet-funkció vizsgálatában az utóbbi évtizedben egyre jelentősebb szerep jutott a rekombináns fragmentumoknak. A heterológ fehérjeexpresszió szempontjából a miozin sajnos igen nehéz objektumnak bizonyult. Prokarióta rendszerben a motor domén korrekt feltekeredéséhez esszenciális megfelelő eukarióta dajkafehérjék hiánya miatt nem állítható elő működőképes miozin fej, bár egyéb, a nyaki illetve farki részt tartalmazó fragmentumokat sikeresen termeltettek E. coli-ban (18, 19). A szerkezeti és kinetikai vizsgálatokban kulcsszerepet játszó gerinces (nyúl illetve csirke) vázizom miozint, illetve a reguláció mechanizmusának vizsgálatában fontos fésűkagyló (Argopecten irradians) miozint eleddig egyetlen heterológ rendszerben sem sikerült hatékonyan expresszálni. Széles körben befutott sikeres rendszer csak 2 A közel 800 aminosavból álló, bonyolult szerkezetű motor domén valójában négy kompakt doménből tevődik össze, amelyeket többnyire a motor szubdoménjeiként említenek az irodalomban, ezért e dolgozatban is ezt a nevezéktant használtam. 15

16 Doktori értekezés kettő említhető: egy gerinces simaizom miozin izoformát (csirke begyből származót) a bakulovírus-sf9 rovarsejt rendszerben sikerült előállítani (20, 21), míg a Dictyostelium discoideum sejtes nyálkagomba saját miozinjának illetve miozin fragmentumainak rekombináns módon történő hatékony kifejezésére alkalmas rendszernek bizonyult (22-28). A simaizom miozin motor domén fragmentumok mellett a röntgen-szerkezetvizsgálatban az ún. MDE konstrukció játszott fontos szerepet, amely a motor doménből és rövidített (egyetlen IQ-motívumot tartalmazó) nyakból, illetve ehhez fuzionáltatott esszenciális könnyűláncból áll (21). A Dictyostelium motor domén konstrukciók a teljes miozinhoz hasonló enzimatikus sajátságokkal rendelkeznek, erőkarjuk viszont hiányzik. Ehhez a doménhez mesterséges erőkart képező más fehérjedomének (α-aktinin (28, 29), fluoreszcens fehérjék (30)) fuzionáltathatók. A rekombináns Dictyostelium S1 fragmentumok szintén fontos objektumai a szerkezet-funkció vizsgálatoknak (31) A fej három ismert konformációja A miozin fej nukleotid nélküli, illetve különböző nukleotid kötőhely nukleotidokkal és nukleotidanalógokkal komplexet alkotó kristályszerkezetei ismertek (21, 29, 32-41), amelyek globális konformációjuk alapján három csoportba aktin kötőhely erőkar sorolhatók (lásd az ábra: A csirke vázizom S1 szerkezete táblázatban, amelyben a A szerkezet megoldói szerint Moby Dick, illetve ebihal alakú fragmentum N-terminális motor doménből és C-terminális nyaki diverz nevezéktan részből ( erőkar ) áll, amelyhez a könnyűláncok kötődnek. összefoglalása is található). zöld: N-terminális 25 kda szubdomén, piros: felső (az ábrán az aktin-árok felett látható) és alsó 50 kda szubdomén, kék: 20 Az első miozin kda (konverter + nyak) szubdomén, sárga: ELC, lila: RLC, sárga gömb: SO 2-4 ion a nukleotid kötőhelyen kristályszerkezet a csirke vázizom S1-é volt ((32), 3. ábra). A fehérjét nukleotid-mentes körülmények között kristályosították, kötőhelye azonban nem üres : egy szulfátiont tartalmaz a β-foszfát kötőhelyén. A molekula lizil oldalláncait metilálni kellett a kristályosíthatóság érdekében. Ezt a szerkezetet a kötött nukleotid hiánya miatt rigor-szerű (near-rigor) struktúraként említik. A szerkezet képet adott a feltételezett aktin kötőhely, a nukleotid zseb és a disztális nyaki rész térbeli elhelyezkedéséről, és a köztük lévő kommunikációs útvonalak 16

17 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése feltérképezéséhez is kiindulópontot nyújtott. A motor domén szerkezet részleteire a következő fejezetekben térünk rá Motor domén szerkezetek és a nyitott-zárt konformáció-változás A vázizom szerkezetet a Dictyostelium miozin II motor domén kristályszerkezetének meghatározása követte, számos különböző ligandummal a nukleotid kötőhelyen. A Dictyostelium szerkezetek két csoportba sorolhatók, amelyeket a nukleotid-kötőhelyet képező egyik hurok (switch-ii) 3 pozíciója alapján neveztek el. A szerkezetek egyik csoportjában (nukleotid-mentes, ADP, ATP, ADP.BeF x, AMP.PNP, ATPγS, nem-nukleotid analógok, PP i ) mind a szubdomének helyzete, mind a switch-ii pozíciója a csirke vázizom szerkezetben látottakhoz hasonló (29, 34-37, 40, 41). Ezt a konformációt, amely megfelel a rigor-szerű állapotnak, a switch-ii pozíciója alapján nyitott szerkezetnek nevezik. A szerkezetek egy másik csoportjában a switch-ii a vázizom szerkezethez képest 0,5 nm-rel a γ- foszfát felé mozdul, és hidrogénhíd jön létre a Gly457 (vázizom miozinban Gly466) peptidgerincamidcsoportja és a γ-foszfát egyik oxigénje között (33, 35). Ennek a kölcsönhatásnak fontos szerepet tulajdonítanak a hidrolízis katalízisében. Ezt a szerkezetet, amelyet ADP.P i analógokkal (ADP.AlF 4, ADP.V i ) 4 kaptak meg, ezért átmeneti állapot -nak (transition state), illetve a switch-ii pozíciója alapján zárt konformációnak nevezik. A szerkezeti modell alapján csak zárt állapotban történhet meg az ATP hidrolízise. A switch-ii huroknak a nyitott és zárt konformációk közötti elmozdulása a miozinhoz hasonlóan megtörténik a Ras p21-ben és más G-fehérjékben, valamint az F1 ATP-ázban is. A Gly547 amid és a γ-foszfát közötti hidrogénhíd-kapcsolat a miozinhoz hasonlóan a G-fehérjékben és a kinezinekben is csak a zárt konformációban jön létre (43), míg az F1 ATP-áz esetében hiányzik (44). A nyitott-zárt átalakulásban szintén fontos szerepet játszó elem az Arg236 és Glu468 (vázizom) aminosav-oldalláncok között csak zárt konformációban létrejövő sóhíd-interakció, amelynek funkciója a feltételezett támadó víz stabilizálása és polarizálása lehet (45). 3 Az elnevezés a G-fehérjék hasonló szerkezeti egységétől ered. A miozin és a kinezin nukleotid kötőhelyében elhelyezkedő hurkok nagyfokú szekvenciális és térszerkezeti hasonlóságot mutatnak a G- fehérjékhez (42). 4 Az AMP.PNP-t, amely egyetlen O-N atomcserét tartalmaz a β- és a γ-p között, illetve az ADP.BeF x komplexet ATP-analógoknak tekintik a β γ-p illetve a β-p Be távolságnak az ATP-hez való hasonlósága okán. (A BeF x komplex pontos sztöchiometriája nem ismert.) Az ADP.AlF 4 és ADP.V i komplexeket nem teljesen egységes az irodalom e tekintetben sem az átmeneti állapot vagy a hidrolízis utáni (ADP.P i ) állapot analógjainak tekintik, mivel itt jóval nagyobb a β-p Al illetve β-p V távolság, mint a megfelelő távolságok az előző esetekben, illetve a komplexek bipiramidális koordinációs geometriája (átmeneti állapot?) miatt. 17

18 Doktori értekezés A switch-ii konformáció-változása együtt jár az 50 kda fragmetumot ketté osztó, az aktin kötőhelytől kiinduló hosszú hasíték (lásd a 3. ábrán) részleges bezáródásával, valamint a C- terminális konverter szubdomén, és így a vázizom S1 koordináták felhasználásával végzett modellezés alapján a nyak felhúzott (primed, up) pozícióba való kerülésével is. (A konverter és a nyak pozíciója alapján a rigor-szerű szerkezetet lecsapott (down) szerkezetnek nevezik az irodalomban.) A nyak lecsapódása az S1 disztális végénél akár 10 nm-es elmozdulást is okozhat. E látványos elmozdulás az egyik alapköve az erőgenerálás kilendülő erőkar elméletének, amely szerint a ciklus erőkifejtő lépése az aktinhoz kötött miozin fej zárt-nyitott konformációs átalakulása. A kilendülő erőkar elmélet ezek alapján fehérjeszerkezeti alapot szolgáltat a Lymn és Taylorféle sémához Többféle konformáció egyazon nukleotiddal az aktívelyen ADP.BeF x jelenlétében érdekes módon zárt konformációban is sikerült kristályosítani a Dictyostelium motor domént ((46), a szerkezet még nem került publikálásra), ami ellentmond Smith és Rayment eredeti feltételezésének, miszerint a zárt struktúra csak a hidrolízis-reakció pentakovalens intermedierével és annak szerkezeti analógjaival (ADP.AlF 4, ADP.V i ) jön létre (33). Igaz, a zárt ADP.BeF x kristályszerkezet egy, az előzőeknél 5 aminosavval rövidebb konstrukcióról készült, így lehet, hogy a fehérje csonkolása okozta a konformáció megváltozását. Ezt a feltételezést cáfolják a simaizom MDE konstrukció (2.2.2 fejezet) kristályszerkezetei ADP.BeF x illetve ADP.AlF 4 -kötött állapotban (21), ugyanis mindkét szerkezet zárt. Ez a konformáció tehát mind normál, mind pentakovalens ATP-analógok jelenlétében létrejöhet. A zárt simaizom szerkezetek különleges jelentőségét az adja, hogy az erőkar pozíciója felhúzott állapotban itt vált először láthatóvá Affinitás a távozó foszfáthoz A zárt konformációra vélhetőleg mind a hidrolízis előtt, mind utána a γ-foszfát oxigénjeinek szoros koordinációja jellemző. A miozin az ún. hátsó ajtó (back door) mechanizmussal működő enzimek közé tartozik, amelyek esetén a termékek valamelyike más útvonalon válik le a fehérjemolekuláról, mint amelyen odakötődött. A foszfátnak a miozin hátsó ajtaján történő eltávozásához a zárt állapotban azt blokkoló switch-ii huroknak ki kell nyílnia. A zárt konformációjú motor doménnek a γ-foszfáttal létrejövő kiterjedt kölcsönhatásai miatt ADP.P i állapotban valószínűleg a zárt állapot lényegesen kedvezőbb a nyitott-nál, ezért lesz sebesség-meghatározó a miozin ATP-áz ciklusban a foszfát felszabadulása (2.3 fejezet). Az aktin vélhetőleg switch-ii nyitott állapotának kedvezőbbé tételén keresztül gyorsítja a foszfát eltávozását. 18

19 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Ezeknek a lépéseknek a szerkezeti és kinetikai alapjai felderítetlenek, és az e dolgozatban bemutatott mutánsokon végzett kísérleteinkkel erre a problémára is választ kerestünk (5.5.5 fejezet) A harmadik ismert konformáció Mindezidáig a fésűkagyló miozin S1 az egyetlen izoforma, amelyről 3 különböző konformáció kristályszerkezetét sikerült megoldani (38). A nukleotid távollétében kapott szerkezet a vázizom miozin nyitott állapotához hasonló, míg ADP.V i -tal komplexben a zárt Dictyostelium illetve simaizom szerkezeteknek megfelelő konformációt kaptak. A harmadik struktúra azonban, amelyben ADP található a nukleotid kötőhelyen, jelentősen különbözik valamennyi eddig ismert szerkezettől (39). Ebben a szerkezetben a konverter régió proximális részén, az erőkarnak a fejben található feltételezett csuklópontjánál található ún. SH1 hélix felolvadt állapotban van, ami a konverter és az erőkar nagy flexibilitását okozza. Az erőkar pozíciója is eltér mind a felhúzott, mind a lecsapott állapotoktól. A szerzők ezt a szerkezetet az enzimatikus ciklusban elfoglalt helye szerint a rigor-szerű és átmeneti állapotok közötti, stabil, aktinról levált (detached) ATP állapotként interpretálják. A kristályszerkezeti összehasonlításokból adódó fontos következtetés, hogy az erőkar mozgásaihoz szükséges flexibilis elem valószínűleg a konverter régió és az erőkar között található, így utóbbinak a pozícióját nem kizárólag a konverter határozza meg, hanem a motor más szerkezeti elemei is befolyásolhatják. Ez lehet az oka annak, hogy míg az egyes konformációkban a különböző miozin izoformák a motor szubdomének pozíciójának konzervatitivását mutatják, addig az erőkar helyzete igen változékony. Az, hogy a levált szerkezetet az egyébként minden előző esetben nyitott konformációt indukáló ADP-vel komplexben sikerült detektálni, újabb példáját adja annak a jelenségnek, hogy ugyanazon ligandum jelenlétében a miozin fej többféle konformációs állapotot foglalhat el Kommunikáció az aktin és nukleotid-kötőhelyek, illetve az erőkar között a motor szubdoménjei közötti kapcsok révén Az ismert szerkezetek alapján a viszonylag nagy és bonyolult felépítésű miozin motor domént a legcélravezetőbb négy, viszonylag rigid egységként mozgó szubdomén együtteseként felfogni. A szubdomének nevezéktana az S1 proteolitikus fragmentumain alapszik. Így megkülönböztetjük szekvenciális sorrendben a 25kDa (Dictyostelium motor doménben aminosavak 5 ), felső (207-5 A továbbiakban, ha külön nem említjük, az aminosav-pozíciók a Dictyostelium miozin II S1-re vonatkoznak. 19

20 Doktori értekezés 477) és alsó 50 kda ( ), valamint konverter ( ) szubdoméneket. Ezeket az egységeket flexibilis kapcsok kötik össze: a már említett switch-ii hurok a felső és alsó 50 kda, az ún. relé az alsó 50 kda és a konverter, az SH1 hélix pedig a 25 kda és konverter szubdoméneket közötti kölcsönhatási felszínen található (4. ábra). A motor valamennyi funkcionális régiója több szubdomén részleteiből tevődik össze. A nukleotid kötőhely kialakításában a 25 kda és felső 50 kda szubdomének vesznek részt 6. Az aktin kötőhelyet a felső és alsó 50kDa szubdomének részletei alkotják a motor doménen végighúzódó hosszú hasíték két oldalán. Az aktin kötőhely a switch-ii-n keresztül áll kapcsolatban a γ-foszfát zsebbel, amint azt a régió mutagenezise révén is 4. ábra: A szubdomének, az azokat összekötő kapcsok és a kötőhelyek elhelyezkedése a motor doménben sikerült alátámasztani (47). Az erőkar bázisát a konverter képezi, amely a szubdomének közül a legmozgékonyabb, és kiterjedt kölcsönhatási felszíne van a 25 kda és alsó 50 kda szubdoménekkel. A nukleotid kötőhely és az erőkar közötti kommunikáció révén a switch-ii 0,5 nm-nyi elmozdulása az erőkar végén 10 nm-nyire amplifikálódik Az aktin és az aktomiozin komplex szerkezete Az aktin kristályszerkezetének meghatározása csak néhány évvel előzte meg a miozinét. A G- aktin monomereket 7 DN-áz I-gyel, gelszolin szegmens 1-gyel, illetve profilinnel komplexben sikerült kristályosítani (48-50). Az aktin molekula 2 doménből tevődik össze, amelyek mindegyikéhez egy-egy ún. szubdomén kapcsolódik. Utóbbiak közül az egyik a szomszédos aktin monomerek közötti kölcsönhatási felszínhez járul hozzá, a másik a nukleotid kötőzseb egy részét képezi. A G-aktin atomi modelljének az orientált F-aktin gélek röntgendiffrakciós képébe történő illesztése nyomán (51, 52) készítették el az aktin filamentum szerkezeti modelljét. A filamentumban periódusonként 13 monomer 6 balmenetes fordulatban követi egymást 6 A switch-ii-n ( ), konszenzus szekvenciája DIXGFE) kívül még másik két, konzervatív szekvenciájú hurok hozza létre a meghatározó kölcsönhatásokat a kötött nukleotiddal: ezek az ún. P-hurok ( , GESGAGKT) és a switch-i ( , NXNSSRFG). A γ-foszfát koordinálásában a már említett Gly457 (switch-ii) mellett a kötött, az ATP-vel komplexet alkotó Mg 2+ ionnak, valamint a Lys185 és Ser181 (P-hurok) oldalláncoknak van fontos szerepe. 20

21 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése (emelkedés: 2,75 nm/alegység). Az F-aktin spirál ugyanakkor leírható 2 meredek jobbmenetes hélix együtteseként is, amelyekben a szomszédos monomerek 5,5 nm-enként követik egymást. A szomszédos aktin-monomerek közötti, a hélix tengelyére merőleges kölcsönhatási felület igen nagy (>30 nm 2 ), ami esszenciális a kontrakció során fellépő nagy (akár 1000 pn-nyi) húzóerő miatt. A poláris aktin filamentumok dinamikus polimerizációja illetve depolimerizációja (treadmilling) során alacsony ATP-áz aktivitás mérhető. A kötött nukleotidnak egyébiránt inkább strukturális szerepe van, mivel F-aktinban a két szubdomén egymás felé fordul, bezárva a nukleotidot a kötőzsebbe. Az akto-s1 komplex atomi modelljét a rendelkezésre álló kristályszerkezeteknek az ún. S1- gyel dekorált aktin filamentumok elektronmikroszkópos felvételeibe való illesztésével alkották meg ((53), 5. ábra). A modell szerint a felhúzott állapotban lévő miozin fej erőkarja 45 o -os szöget zár be az aktin filamentum tengelyével, amely szög az erőkifejtő lépés, vagyis az erőkar elfordulása után 90 o -ra változik, így 10 nm-es elmozdulást eredményezve a nyak végénél. Az erőkar ilyen 5. ábra: Az akto-s1 komplex rekonstruált szerkezete az erőkifejtő lépés előtt és után elmozdulását azonban az eddigi A felső ábrán az S1 felhúzott állapotban elektronmikroszkópos vizsgálatokban (53-59) nem kapcsolódik az aktin filamentumhoz, miközben nyaka kb. 45 o -os szöget zár be sikerült detektálni, aminek kinetikai okára az e annak tengelyével. Alul a lecsapott állapot látható, amelyben a nyak közel merőleges dolgozatban ismertetett kísérletek világítanak rá az aktin filamentumra. A két állapot között (5.4.6 fejezet). Egyes miozin izoformákon az erőkar disztális vége kb. 10 nm-nyi elmozduláson megy keresztül. kimutatták a nyak jelentős elfordulását ADP-nek a Ebben az atomi modellben az eredeti rigor komplexhez való hozzáadásakor, ez azonban kilendülő kereszthíd modellhez képest eltérő a két fehérjekomponens nem azonos a feltételezett munkaütemmel. orientációja, mivel ott a 90 o -os szög tartozott a felhúzott, míg a 45 o -os a lecsapott állapothoz (vö. 1. ábra). A következőkben az aktomiozin működés kinetikai vonatkozásait tekintjük át, majd a 2.4 fejezetben rátérünk az ismert szerkezeteknek az ATP-áz ciklus köztiállapotaival való kapcsolatára. 7 A szabad aktin monomereket G-aktinnak, a filamentumokat F-aktinnak nevezik. 21

22 Doktori értekezés 2.3 Az aktomiozin működés kinetikája A miozin ATP-áz ciklus A miozin ATP-áz kinetikai vizsgálatához az egyik leghasznosabb szignált a fehérjemolekula triptofán fluoreszcenciája nyújtja (60-65). Az első átfogó modellt Bagshaw és Trentham közölték az 1970-es évek elején 8 ((61, 66) 1. séma). A modell szerint az ATP-kötés kétlépéses, egy másodrendű ütközési lépésből és az azt követő nagy szabadenergia-csökkenéssel járó izomerizációból álló folyamat. Ez utóbbi lépéshez kapcsolódik a vázizom miozinban az ATP-vel történő kölcsönhatás során bekövetkező kétfázisú fluoreszcencia-emelkedés első fázisa (M*.ATP). A reverzibilis hidrolízis-lépést (3. lépés, K 3 = 10) további fluoreszcencia-emelkedés kíséri (M**.ADP.P i ). A ciklus sebesség-meghatározó lépése a foszfát felszabadulása (4-5. lépés). Az ADP disszociációja az ATP-kötéshez hasonlóan két lépésben megy végbe. M + ATP ADP 71 M.ADP M.ATP 6 2 M*.ADP M*.ATP + P i 3 5 M**.ADP. M*.ADP.P 24. i ábra: A W501+ k P i M 0 : statikusan kio 1. séma Az M*.ADP intermedier alacsony hőmérsékleten volt kimutatható, ahol az ADP-disszociáció sebességi állandója (21 o C-on 1.4 s 1, 5 o C-on 0.07 s 1 ) már megközelíti a sebesség-meghatározó lépését (21 o C-on s 1, 5 o C-on s 1 ). A kötési, illetve disszociációs izomerizációs lépés (k 6) hőmérsékletfüggése tehát erősebb, mint a sebesség-meghatározó lépésé (66). Utóbbi esetében valószínűleg konformáció-változásról van szó, mivel a lépés elsőrendű A nukleotid-kötés és -disszociáció legalább kétlépéses folyamatok A nyúl vázizom miozin S1-en végzett megállított áramlásos 9 (stopped-flow) triptofán fluoreszcencia vizsgálatok tanúsága szerint az ATP-kötés és ADP-disszociáció legalább két lépésből álló folyamatok. A kötéskor jelentkező fluoreszcencia-emelkedés 400 s 1 körül platót 8 Az ATP-áz ciklus lépéseinek számozásához a dolgozatban mindvégig az itt szereplő séma szolgál kiindulási alapként. 9 A gyorskinetikai mérőmódszerek rövid ismertetését a 4.7 és 4.8 fejezetek tartalmazzák. 22

23 Lépésről lépésre egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése mutatott ATP-ben és ADP-ben is (k +2 illetve k 6, 1. séma, (61)), ami arra utal, hogy a diffúziólimitált, másodrendű ütközési lépést (collision step) egy szubsztrát által indukált, nagy szabadenergiacsökkenéssel járó izomerizáció követi, amely magas nukleotid-koncentrációknál limitálja a fluoreszcencia-változás sebességét. A fluoreszcencia-emelkedés, amelynek maximális sebességi állandója a változás kis amplitúdója miatt csak bizonytalanul volt megadható, ez utóbbi lépéshez köthető A termékfelszabadulás a sebesség-meghatározó lépés Az ATP-hidrolízisnek a steady-state állapot kialakulása előtti sebessége (függetlenül attól, hogy a szubsztrát illetve a termékek fehérjéhez kötötten vagy szabadon vannak-e jelen) quench-flow kísérlettel vizsgálható. A kísérlet során a reakciót miozin S1 és ATP gyors összekeverésével indítják, majd különböző időpontokban állítják meg sav hozzáadásával. A reakció első szakaszában a steady-state ATP-áz sebességhez képest gyors ATP-hidrolízis (ún. burst fázis) tapasztalható (66). A burst amplitúdója megközelíti az S1-koncentráció értékét; jelenléte azt mutatja, hogy az ATP-kötés és -hidrolízis gyorsan megtörténik (alacsony ATP-koncentrációnál a kötés (10 6 M 1 s 1 ), magas ATP-koncentrációnál a hidrolízis (100 s 1 ) adja a kezdeti burst megfigyelt sebességi állandóját), így a termékek felszabadulása a sebesség-meghatározó lépés (0,1 s 1 ), amplitúdójából pedig a hidrolízis-lépés egyensúlyi állandója számítható ki (67). Mivel a foszfátfelszabadulás az üveg nyaka a folyamatban, az ATP-áz reakció steady-state szakaszában az M**.ADP.P i intermedier van jelen legnagyobb mennyiségben Az ATP-hidrolízis lépés az enzimen reverzibilis Az ATP-hidrolízis teljes folyamatának egyensúlyi állandója fiziológiás körülmények között igen magas érték (K eq = [ADP][P i ]/[ATP] = 10 6 M), és ezt a miozin, mint enzim, nem változtatja meg. A ciklus egyes részlépései azonban lehetnek reverzibilisek. Ha az S1 és izotóp-jelölt ATP 1:1 mólarányú összekeverésével indított (single turnover) reakciót olyan időpontban állították le, amikor a hidrolízis-lépés már egyensúlyba került az enzimen, a termékfelszabadulás azonban még nem indult el, az enzim-kötött nukleotidok aránya [ADP]/[ATP] = K hidrolízis-lépés = 9-nek adódott (66). (A quench-flow kísérletben a kezdeti burst fázis amplitúdója is hasonló értékre utalt.) Az ekkor feleslegben hozzáadott nem-jelölt ATP nem változtatja meg a jelölt ATP elbomlási sebességét, ami arra utal, hogy ha a nukleotid már kötődött az enzimhez, akkor csak a hidrolízist követően szabadulhat fel. 18 Az izotóp-kicserélési kísérletek is a hidrolízis reverzibilitását igazolják, ugyanis a H 2 O-ben végzett ATP-áz reakció során a felszabaduló foszfátba egynél több 18 O atom épülhet be (68). 23

24 Doktori értekezés Szintén erre mutat az a tény, hogy a miozinhoz nagy mennyiségben adva ADP-t és foszfátot, kimutatható mennyiségű ATP keletkezik (69). A teljes ATP-áz reakció irreverzibilitása ezek alapján a ciklus más lépéseiből (nukleotid-kötés) adódik Aktin-aktiváció, erős és gyenge aktinkötő állapotok Az F-aktin filamentumok aktiválják a miozin ATP-áz aktivitását. (A nyúl vázizom miozin S1 bazális (aktin távollétében mért) ATP-áz aktivitása 0,1 s 1 körüli érték, amely aktin jelenlétében maximálisan 20 s 1 -re emelkedik.) Az aktiváció proteolitikus fragmentumok (S1, HMM) esetében nagyobb mértékű, mint miozin filamentumoknál, aminek oka az lehet, hogy a két filamentum optimális orientációban való találkozásának csekély az esélye, míg a szolubilis fragmentumok szabadon diffundálhatnak az aktinon lévő kötőfelszínhez. Az aktomiozin kölcsönhatás erőssége, és így az aktin-aktiváció mértéke is igen erősen függ az ionerősségtől. Az ATP kötése az aktomiozin komplex gyors disszociációját okozza. A nukleotid-kötéssel együtt járó nagy szabadenergia-csökkenés az aktomiozin fehérjekomplex egyébiránt önmagában igen erősen endergonikus disszociációjához szükséges, így energetikailag ez a ciklus kulcslépése. (A szubsztrát-indukált konformáció-változás ATP esetén < 24 kj/mol, ADP esetén 14 kj/mol szabadenergia-változással jár [21 o C, ph 8, (61)].) Az ATP-hidrolízis sebessége aktin jelenlétében sem változik meg. A hidrolízis megtörténte után az aktívhelyén a hidrolízis-termékeket tartalmazó miozin fej visszakötődik az aktin filamentumhoz, amely felgyorsítja a foszfát- majd ADPfelszabadulási lépéseket. A ciklus során a miozin fej erős (K d <<1 µm: nukleotid-mentes illetve ADP-kötött állapotok) és gyenge (K d >10 µm): ATP, ADP.P i állapotok) aktinkötött állapotai váltakoznak egymással, így a folyamat a 2. sémán sötétítetten megjelölt útvonal mentén halad. k 1 k 2 k 3 A.M + ATP A.M.ATP A.M.ADP.Pi A.M + ADP + Pi k a k b k c k a k 4 k 5 k 6 M + ATP M.ATP M.ADP.Pi M + ADP + Pi 2. séma 24