(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: A61K 39/2 (06.01) C12N 7/00 (06.01) C12N /00 (06.01) C12N /16 (06.01) C12N 7/02 (06.01) C07K 14/0 (06.01) C12N /8 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/EP 03/ () Elsõbbségi adatok: EP (72) Feltalálók: OSTERRIEDER, Nikolaus, Benningen (DE); SCHUMACHER, Daniel, Ithaca, NY 1480 (US) (73) Jogosult: Lohmann Animal Health GmbH & Co. KG, 2744 Cuxhaven (DE) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Folyamatos sejtvonal vakcinák elõállítására HU T2 A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány az immunológia és biotechnológia területére vonatkozik. Közelebbrõl a találmány tárgya olyan sejtvonal elõállítása, amely alkalmas herpeszvírusok, elõnyösebben alfaherpeszvírusok által okozott állati betegségek, elõnyösen madárbetegségek elleni vakcina termelésére. A találmány tárgya olyan sejtvonal elõállítása is, amely alkalmas létezõ és felbukkanó alfaherpeszvírusok, mint például avirulens, virulens és nagyon virulens (vagy hipervirulens) Marek-betegség vírustörzsek izolálására. A Marek-betegség (MD) egy pusztító rendellenesség, amely világszerte érinti a csirkéket. A Marek-betegséget vírus (MDV) okozza, amely egy alphaherpesvirus, és T¹sejt-limfóma, polineuritisz, általános immunszuppresszió és ritkán atheroszklerózis jellemzi. Három MDV szerotípust azonosítottak, amelyek közül csak az l¹es szerotípus (MDV¹1) patogén. míg az MDV 2¹es szerotípus (MDV¹2) és MDV 3¹as szerotípus (pulykaherpeszvírus, HVT) nem okoz MD¹t. Az MDVfertõzés latens fertõzést eredményez, amely gyakori az alphaherpesvirinae esetében, azonban az MDV egyedi jellegzetességekkel rendelkezik, amikor összehasonlítjuk ezen vírus alcsalád más tagjaival, mert képes daganatokat okozni és integrálódni a gazdasejt genomjába 11, 12. Az MD¹t kontrollálhatjuk immunizálással, de a vakcinázás ellenére egyre több patogén MDV-törzs evolválódott 4. Ezeket a törzseket úgynevezett virulens (v), nagyon virulens (vv) vagy nagyon virulens plusz (vv+) törzsekként osztályozták 28, 3. A HVT alkalmazásával végzett vakcinázás képes volt a csirkék megvédésére a vmdv-vel történõ megfertõzõdés ellen, de nem volt sikeres az 1970¹es évek második felében újonnan felbukkanó vvmdv ellen 38. Az MDV¹2 törzseket vagy HVT és MDV¹2 kombinációit tartalmazó vakcinákat sikeresen alkalmaztak az 1980¹as években 6, 34, 37, 39,de néhány éven belül újabb vv+ MDV¹1 törzseket, mint például a 648A és 84A izoláltak, amelyek képesek feltörni a bivalens vakcinázást, és akut tranziens paralízist okozhatnak, valamint a mortalitás szignifikáns növekedését a fertõzés utáni két héten belül, 37. A vv+mdv megjelenése az Egyesült Államokban a CVI988/Rispens vakcina bevezetését eredményezte, amelyet Európában már az 1970¹es évek óta alkalmaztak 21, 22, 36,. Beszámoltak a vakcinázott állományokból származó erõsen virulens új törzsek izolálásáról nemcsak az Egyesült Államokban, hanem Európában is. Beszámoltak a klinikai tünetek megváltozásáról és celluláris tropizmusról a C12/1 törzs esetében 3. Az MDV-virulencia egyenletes növekedésének a kiváltó mechanizmusa és az MD akutabb idegi formájának a megjelenése továbbra is rejtély marad, de a vakcinakiszerelések és alkalmazási formák befolyásolhatják ezeket a jelenségeket 38. Az MDV magas celluláris tapadást mutat in vitro és az MD vakcinák, kivéve néhány HVT kiszerelést, élõ csirkesejteket jelentenek, amelyekben az ágens folyékony nitrogénben eltartható az alkalmazásig. Az MDV in vitro tenyésztése rendkívül unalmas, munkaigényes és nehézen standardizálható. Felismerték, hogy bizonyos glikoproteinek esszenciálisak tenyésztett sejtekben a vírus növekedéséhez, azaz a ge¹re vagy gl¹re depletált vírus például egyáltalán nem terjed tenyészetben (Shumaccher et al, J. Virol. 7: old., 01). Az MDV-fertõzés és MD házi csirkékben való megelõzésére szolgáló vakcinák termelésének fontos költségfaktora a sejttenyészetek alkalmazása. Mindmáig az MDV hatékony tenyésztése csak elsõdleges csirke- vagy kacsasejteken lehetséges. Általában az MDV-vakcinák termelésére a kiválasztott sejttenyészet a csirkeembrió-fibroblasztsejtek (CEF) 38. Ezek a CEF sejteket alkalmazzák klinikai esetekbõl származó MDV izolálására is perifériás vérsejtek (PBC) formájában vagy litikus MDV-replikáció indukálása után transzformált daganatos T¹sejtekbõl. Más megoldásképpen a virulens és sejttenyészethez nem adaptálódott vírustörzsek izolálásához csirkevesesejteket (CKC) vagy kacsaembrió-fibroblasztokat (DEF) alkalmazhatunk. Ezek a sejtek jobbak a CEF-nél MDV klinikai mintákból történõ izolálására. Az MDV növekedését támogató minden ismert rendszer elsõdleges sejttenyészetek elõállításán alapszik, amelyeket folyamatosan elõ kell állítani embriót tartalmazó tojásokból vagy akár kikelt madarakból a CKC esetében. Az elsõdleges sejtek elõállításának az eljárása nemcsak munkaigényes, hanem nagy költségeket is okoz. Ezt tükrözi az a tény is, hogy a vakcina elõállítási költéségének megközelítõleg %¹a a csirkeembrió-fibroblasztok elõállításának a költsége. A vakcinatermelés nagyon függ a meghatározott patogénmentes (SPF) állományokból származó termékeny tojások folyamatos és megbízható ellátottságától. Az SPF-állományokat specifikus körülmények között nevelik, és rendszeresen demonstrálni kell, hogy mentesek patogénektõl. A termékeny SPF-tojások ellátásának bármilyen megzavarása megzavarná az MDV-vakcinák termelését. Még ha a virulens és izolált MDV-törzseket sikeresen szaporítottuk és izoláltuk is csirkevese- (CKC) vagy kacsaembrió-fibroblasztsejteken, MDV-vakcina vagy virulens törzsek csak az adaptálás után növekednek hatékonyan CEF-sejteken. Számos próbálkozás volt sikertelen MDV-törzs szaporítására madár vagy emlõs eredetû folyamatos sejtvonalakon. A kudarcokat a vírus fontos tulajdonságainak a heterológ sejteken való tenyésztése utáni elvesztése vagy az a tény okozta, hogy csak abortív fertõzéseket sikerült demonstrálni. Az utóbbi évtizedben azonban beszámoltak MDVvel konstitutíven fertõzött sejtvonalak létrehozásáról. Például Abujoub és mtsai. (Acta Virologica 43: , 1999 és EP számú európai szabadalmi irat) kimutatták, hogy a CHCC¹OU2 sejtek, amelyek CEF-sejtek állandó leszármazottai, latensen fertõzöttek lehetnek virulens vagy avirulens MDV-törzsekkel. Azonban az MDV sejttenyésztõ rendszerhez való adaptációjának hosszabb idõszakára volt szükség, amely alatt bekövetkezhettek változások az egyedi vírusok genetikai vagy antigenikus összetételében. A CHCC¹OU2 sejtvonallal 4 hetes tenyésztésre volt szükség mielõtt MDV-specifikus plakkok voltak láthatók. A kapott OU2.1 és OU2.2 CEF sejtvonalak virulens 2

3 és daganatindukáló MDV¹t tartalmaztak, ameddig a sejtek nem váltak konfluenssé. A latensrõl a litikus fertõzésre való átváltás azonnal indukálódott, amint kialakultak a sejt-sejt kontaktusok a tenyészetben. A sejtek csak egy törzzsel vannak latensen megfertõzve, és a konfluencia elérésekor és valamilyen senki által nem ismert mechanizmus miatt a litikus replikációs ciklus bekapcsolódik. Összefoglalva, ebben a rendszerben speciális sejtvonalra van szükség minden egyes vírus szaporításához, hosszú idõre van szükség az adaptációhoz és sejteket nehéz tenyészteni. Emellett a OU¹OCL2 sejtvonalon tenyésztett virulens Md11-törzs még mindig képes volt daganatot indukálni érzékeny csirkevonalakban. Mostanában egy folyamatos Vero sejtvonalat teszteltek az MDV tenyésztésére való érzékenységére. Arról számoltak be, hogy számos vak passzálás és 3 hét adaptálás után az MDV 1¹es szerotípus (MDV¹1) és 3¹as szerotípus (MDV¹3) nagyon alacsony titereit (azaz a fertõzõ vírus alacsony szintjét) sikerült elérni. Amint korábban körvonalaztuk, a sejttenyésztõ rendszerekhez való hosszú adaptáció hajlamos nemkívánatos genetikai változások eredményezésére, amelyek azután például a vakcinák kudarcát okozzák, amikor a vakcinatörzsek adaptálódnak ezekhez a sejtekhez. A baromfiipar felismerte az olyan folyamatos sejtvonalak szükségességét, amelyek alkalmazhatók Marek-betegség elleni vakcinák termelésére. Habár számos madár- és emlõssejtvonalat kifejlesztettek (lásd például EP és EP számú európai szabadalmi iratok), a jelen találmányig nem volt kifejlesztve olyan folyamatos sejtvonal, amely hatékonyan helyettesíthette volna a csirkeembrió-fibroblaszt (CEF) sejteket a vakcinatermelésben. Az ezen folyamatos sejtvonalakból kinyerhetõ MDV-vírus maximális titere nem volt képes megfelelni az elsõdleges sejtvonalakból kinyert vírus titerének. Emellett számos hipervirulens és virulens MDVtörzset nem lehetett szaporítani a korábban kifejlesztett folyamatos sejtvonalakon, sem az elsõdleges sejtvonalakon. A találmány tárgya eljárás olyan folyamatos sejtvonal elõállítására, amely lényegében mentes emlõsvagy madárvírustól és képes támogatni herpeszvírustörzsek szaporodását, amely eljárás magában foglalja sejt megfertõzését vagy transzfektálását olyan vektorral, amely herpeszvírusból, elõnyösen alfaherpeszvírusból származó nukleinsavfragmenst tartalmaz, és a megfertõzött vagy transzfektált sejt vagy utódja tenyésztését olyan körülmények között, amelyek alkalmasak a nukleinsav expresszáltatására, és a sejt vagy utódja szaporítását. Figyelembe véve, hogy a sejtvonal lényegében vírusmentes, elõfeltétel, hogy az ilyen nukleinsav nem kódolja magát a replikálódó herpeszvírust, hogy lehetõvé tegyük a késõbbi fertõzést a szaporítandó herpeszvírussal. Tehát a találmány szerinti folyamatos sejtvonal önmagában nem (latens) vírustermelõ, hanem herpeszvírus vakcinatermeléshez megfelelõ titerre történõ tenyésztésére vagy növesztésére alkalmazható az azzal történõ beoltás után. Például elegendõ, ha a herpeszvírus nukleinsav vagy annak fragmense szerkezeti fehérjét vagy glikoproteint vagy azok részét kódoló nukleinsavat tartalmaz. A herpeszvírusok példái közé tartozik a Varicella Zoster vírus, citomegalovírus, Epstein Barr-vírus, herpes simplex vírus stb. Ily módon a találmány tárgya többek között olyan folyamatos sejtvonal, amely támogatja herpeszvírusok növekedését, beleértve hipervirulens, virulens vagy avirulens MDV-törzsekét a törzsek vakcinatermeléshez való adaptációjának szükségessége nélkül. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgya olyan vektorral megfertõzött vagy transzfektált sejt alkalmazása, amely glikoprotein E (ge) gén vagy annak funkcionális fragmense nukleinsavát vagy fragmensét tartalmazza. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a leírás tárgya olyan nukleinsav, ahol a nukleinsav Marekbetegség vírus glikoprotein ge gént vagy annak funkcionális fragmensét vagy glikoprotein ge gén ekvivalenst tartalmaz. Elõnyösen a glikoprotein ge gén alfaherpeszvírusból származik. A leírás szerint a funkcionális fragmense kifejezés alatt olyan gén/nukleinsav fragmenst értünk, amelynek az expressziós terméke megtartja a vírusnövekedés, elõnyösen herpeszvírusnövekedés támogatásának/fenntartásnak tulajdonságát a folyamatos sejtvonalban. A leírás szerint a glikoprotein ge gén ekvivalense kifejezés alatt bármilyen hasonló gént (azaz funkcionális ekvivalenst), például más herpeszvírusból, mint például alfaherpeszvírusból származó glikoprotein ge gén értünk, amelynek az expressziós terméke megtartja a vírusnövekedés támogatásának/fenntartásnak tulajdonságát a folyamatos sejtvonalban. Egy másik elõnyös megvalósítási mód szerint a leírás tárgya olyan nukleinsav, ahol a nukleinsav Marek-betegség vírus glikoprotein gl gént vagy annak funkcionális fragmensét vagy glikoprotein gl gén ekvivalenst tartalmaz. Elõnyösen a glikoprotein gl gén alfaherpeszvírusból származik. A leírás szerint a funkcionális fragmense kifejezés alatt olyan gén/nukleinsav fragmenst értünk, amelynek az expressziós terméke megtartja a vírusnövekedés, elõnyösen herpeszvírus-növekedés támogatásának/fenntartásnak tulajdonságát a folyamatos sejtvonalban. A leírás szerint a glikoprotein gl gén ekvivalense kifejezés alatt bármilyen hasonló gént (azaz funkcionális ekvivalenst), például más herpeszvírusból, mint például alfaherpeszvírusból származó glikoprotein gl gén értünk, amelynek az expressziós terméke megtartja a vírusnövekedés támogatásának/fenntartásnak tulajdonságát a folyamatos sejtvonalban. Egy másik elõnyös megvalósítási mód szerint a leírás tárgya olyan nukleinsav, ahol a nukleinsav Marek-betegség vírus glikoprotein gi gént vagy annak funkcionális fragmensét vagy glikoprotein gi gén ekvivalenst tartalmaz. Elõnyösen a glikoprotein gi gén alfaherpeszvírusból származik. A leírás szerint a funkcionális fragmense kifejezés alatt olyan gén/nukleinsav fragmenst értünk, amelynek az expressziós terméke megtartja a vírusnövekedés, elõnyösen herpeszvírus-növekedés támogatásának/fenntartásnak tulajdonságát a folyamatos sejtvonalban. A leírás szerint a glikoprotein gi gén ekvivalense kifejezés alatt bármilyen hasonló gént (azaz 3

4 funkcionális ekvivalenst), például más herpeszvírusból, mint például alfaherpeszvírusból származó glikoprotein gi gén értünk, amelynek az expressziós terméke megtartja a vírusnövekedés támogatásának/fenntartásnak tulajdonságát a folyamatos sejtvonalban. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás olyan folyamatos sejtvonal elõállítására, amely képes támogatni Marek-betegség-vírustörzs szaporodását, amely eljárás magában foglalja sejt megfertõzését vagy transzfektálását olyan vektorral, amely Marek-betegség-vírustörzsbõl származó nukleinsavat vagy annak fragmensét tartalmazza, és a megfertõzött vagy transzfektált sejt vagy utódja tenyésztését olyan körülmények között, amelyek alkalmasak a nukleinsav expresszáltatására, és a sejt vagy utódja szaporítását. Elõfeltétel, hogy az ilyen nukleinsav nem kódolja magát a replikálódó Marek-betegség-vírust, hogy lehetõvé tegyük a késõbbi fertõzést a szaporítandó herpeszvírustörzzsel. A leírás szerint alkalmazott folyamatos sejtvonal egy megállapodott/fenntartható sejtvonal, amely korlátozások nélkül tenyészthetõ és legalább passzáláson átmehet. Ismételten, kívánatos, hogy a folyamatos sejtvonal habár herpeszvírusból származó nukleinsavfragmenst tartalmaz mentes legyen emlõs- és madárvírusoktól, ami egyébként nem így volt a QT¹3 fürjvonal esetében, amelyrõl kiderült, hogy latensen meg volt fertõzve MDV-vel. A sejt vagy utódja kifejezés alatt azt értjük, hogy a sejt tenyészthetõ és felszaporítható egyetlen sejtbõl sejtvonallá kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ tenyésztõ tápközegek alkalmazásával madársejtek szaporítására alkalmas ismert körülmények között. A fertõzés vagy transzfektálás kifejezés alatt vírus vagy annak fragmense (i) DNS-transzferét értjük madár- vagy emlõssejtekbe. Gének sejtekbe történõ transzferére szolgáló eljárások ismertek a szakember számára. Például a transzfekciós eljárás DNS-nek sejtekbe történõ transzferálására szolgáló ismert módszereket foglalhat magában, mint például kalcium-foszfát foszfátos kicsapás, polybrene, DEAE-dextrán, LIPOFECTIN, elektroporáció vagy protoplasztfúzió. A leírás szerinti vektor bármilyen olyan génbejuttatási eszközt tartalmazhat, amely képes nukleinsavnak a sejtbe történõ bejuttatására, mint például plazmidvektort (pcdna3, Invitrogen). A találmány szerint alkalmazott nukleinsav alatt herpeszvírus, elõnyösen alfaherpeszvírus, és még elõnyösebben Marek-betegségvírus nukleinsavszekvenciáját értjük, mint például alfaherpeszvírusok glikoprotein E (ge) génekvivalensét vagy annak fragmensét. Az elõnyös Marek-betegségvírustörzs a Marek-betegség-vírus onkogén 1¹es szerotípus (MDV¹1) és/vagy nem onkogén 2¹es szerotípus (MDV¹2) és/vagy nem-onkogén 3¹as szerotípus (pulykaherpeszvírus, HVT) közül van kiválasztva. Az ilyen nukleinsav konstitutíven vagy tranziensen expresszálódhat a sejt saját szabályozóelemei vagy heterológ szabályozóelemek (azaz konstitutíven aktív szabályozóelemek vagy indukálható szabályozóelemek) szabályozása alatt. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a nukleinsav expresszált termékének a funkcionális tulajdonsága vírus, elõnyösen madárvírus [például Marekbetegség-vírus, Varicella Zoster vírus, Newcaster Disease Vírus (NDV), Fertõzõ Burzális Betegség Vírus (IBDV), Fertõzõ Bronchitis Vírus (IBV), Csirke Anaemia Vírus (CAV), Fertõzõ Laryngotracheitis Vírus (ILV), Madár Leukózis Vírus (ALV), Retikuloendoteliózis Vírus (REV) és Madár Influenza Vírus (AIV) stb.] szaporodásának támogatása/fenntartása a folyamatos sejtvonalban. A szakember a sejtvonal különféle tenyésztési körülményeit beleértve tápközeg-kiszerelések specifikus tápanyagait, oxigén¹, nyomás¹, szén-dioxid- és csökkentett szérumszintek választhatja meg vagy optimalizálhatja azokat. Elõnyösen a találmány szerinti fertõzött vagy transzfektált sejtek gerincessejtek. Még elõnyösebben a fertõzött vagy transzfektált sejtek madársejtek. Például a sejtek izomszövetbõl, azaz izom mioblaszt sejtekbõl származhatnak. Bármilyen izom mioblaszt sejtet alkalmazhatunk a találmány szerint, például az izom mioblaszt sejteket humán, fõemlõs¹, csirke¹, fürj¹, pulyka¹, liba¹, galamb¹, fácán¹, fogolyizomszövetbõl nyerhetjük. Az izomsejtvonalakat ismert gerincessejt-tenyésztési módszerek alkalmazásával tenyészthetjük és tarthatjuk fenn. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a mioblasztsejtet fogolyból nyerjük, mint például a QM sejt. Egy elõnyös QM sejt a QM7 sejt, amely az ATCC CRL-1632 szám alatt van letétbe helyezve. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a leírás tárgya olyan nukleinsav, ahol a nukleinsav Marek-betegség-vírus glikoprotein ge gént vagy annak funkcionális fragmensét vagy glikoprotein ge gén ekvivalenst tartalmaz. Elõnyösen a glikoprotein ge gén a Marek-betegség-vírus 1¹es szerotípusából és/vagy 2¹es szerotípusából és/vagy 3¹as szerotípusából származik. A leírás szerint a funkcionális fragmense kifejezés alatt olyan gén/nukleinsav fragmenst értünk, amelynek az expressziós terméke megtartja a vírusnövekedés, elõnyösen Marek-betegség-vírusnövekedés támogatásának/fenntartásnak tulajdonságát a folyamatos sejtvonalban. A leírás szerint a glikoprotein ge gén ekvivalense kifejezés alatt bármilyen hasonló gént (azaz funkcionális ekvivalenst), például más herpeszvírusból, mint például alfaherpeszvírusból származó glikoprotein ge gén értünk, amelynek az expressziós terméke megtartja a vírusnövekedés támogatásának/fenntartásnak tulajdonságát a folyamatos sejtvonalban. Egy másik elõnyös megvalósítási mód szerint a Marek-betegségvírus avirulens Marek-betegség-vírustörzs, mint például a Rispens CVI988 törzs. A találmány tárgykörébe tartozik az összes olyan legyengített Marek-betegségvírus/vakcina törzs, amely képes replikálódni a folyamatos sejtvonalban. A találmány tárgya eljárás olyan folyamatos sejtvonal elõállítására, amely képes támogatni Marek-betegség-vírustörzs szaporodását, amely eljárás magában foglalja sejt megfertõzését vagy transzfektálását olyan vektorral, amely Marek-betegség-vírusból származó nukleinsavat vagy annak fragmensét tartalmazza, és a megfertõzött vagy transzfektált sejt vagy utódja tenyésztését olyan körülmények 4

5 között, amelyek alkalmasak a nukleinsav expresszáltatására, és a sejt vagy utódja szaporítását, ahol a folyamatos sejtvonal képes a Marek-betegség-vírustörzs adaptáció nélküli növekedésének támogatására. Az adaptáció nélkül kifejezés alatt azt értjük, hogy a találmány szerinti folyamatos (azaz állandó/fenntartható) sejtvonal képes Marek-betegség-vírus növekedésének és produktív fertõzésének támogatására, magas titerrel (azaz az elsõdleges sejtvonal, például csirkeembrió-fibroblasztsejtekkel összehasonlítható vagy annál magasabb szinten) 1 vagy 2 passzálás után. Egy még további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya a találmány szerinti eljárással elõállítható sejt vagy annak utóda. Ezenfelül a találmány tárgya a találmány szerinti sejtbõl vagy utódjából elõállított sejtkészítmény. Elõnyösen a sejt vagy annak utódja vagy sejtlizátum Marek-betegség-vírus 1¹es szerotípus legyengített törzzsel van megfertõzve vagy transzfektálva. A találmány tárgya olyan vektorral megfertõzött vagy transzfektált sejt alkalmazása, amely találmány szerinti Marek-betegség-vírustörzs nukleinsavát vagy annak fragmensét és/vagy abból származó készítményt tartalmaz, olyan vakcina elõállítására, amely képes a betegség elleni védettség bizonyos mértékû indukálására (azaz immunitás létrehozására) gerincesben, elõnyösen madárfajban. A találmány tárgya továbbá eljárás Marek-betegség-vírus vakcinázási célokra alkalmas mennyiségben történõ elõállítására. A találmány tárgya eljárás betegség elleni immunválasz gerincesben, elõnyösen madárfajban történõ indukálására képes vakcina elõállítására, amely eljárás magában foglalja találmány szerinti sejt tenyésztését és abból sejttenyészet-komponensek begyûjtését. Nyilvánvaló, hogy a Marek-betegség-vírustörzset nem litikus vagy litikus fertõzésben tarthatjuk fenn a sejtvonalban (azaz a SOgE sejtvonalban), és a találmány szerinti sejtvonal képes gerincesek, elõnyösen madárfaj megfertõzésére in vivo, hogy Marek-betegség elleni immunvédelmet hozzon létre. Ezenfelül a bejelentés tárgya eljárás monovalens és multivalens vakcinák elõállítására gerincesek, elõnyösen madárfaj megvédésére betegséget okozó ágensek ellen, azaz a Marek-betegség-vírus mellett. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti sejtvonal (azaz SOgE) olyan vektorral lehet megfertõzve vagy transzfektálva, mint például Marek-betegség-vírusvektorral, amely tartalmazza a Marek-betegség-vírus genomját vagy annak részleteit, beleértve egy vagy több heterológ fehérjét vagy polipeptidet (azaz antigenikus peptideket vagy betegségeket okozó ágenseket) kódoló géneket, amelyek hasznosak a Marek-betegség-vírustól eltérõ gerinces betegségeket okozó ágensek ellen. Vakcinák elõállítására hasznos betegséget okozó ágensek példái közé tartozik a Newcastle Disease Vírus (NDV), Fertõzõ Burzális Betegség Vírus (IBDV), Fertõzõ Bronchitis Vírus (IBV), Csirke Anaemia Vírus (CAV), Fertõzõ Laryngotracheitis Vírus (ILV), Madár Leukózis Vírus (ALV), Retikuloendoteliózis Vírus (REV) és Madár Influenza Vírus (AIV). Nyilvánvaló, hogy gyakorlatilag bármilyen heterológ génszekvenciát létrehozhatunk a nukleinsavakat tartalmazó vektorban vakcinák, azaz multivalens vakcinák elõállítására. Elõnyös, ha az ilyen heterológ génszekvencia olyan génterméket foglal magában, amely a gazda celluláris és/vagy humorális immunválaszát növeli vagy aktiválja vagy olyan génterméket, amely olyan epitópot kódol, amely védekezõ immunválaszt indukál különféle kórokozók (elõnyösen gerinces¹, még elõnyösebben madárkórokozók) ellen vagy olyan antigéneket, amelyek semlegesítõ ellenanyagokhoz kötõdnek. Például a Marek-betegség-vírus egy vagy több szerotípusának antigenikus peptidjeit kódoló géneket vagy génfragmenseket. Az ilyen antigenikus peptideket gerincesnek beadandó multivalens vakcinában alkalmazhatjuk, hogy teljes védõ hatást biztosítsunk a Marek-betegség-vírussal való fertõzés ellen. A találmány tárgyát képezi továbbá vakcina, amely a találmány szerinti eljárással állítható elõ. Az ilyen vakcinákat a vakcinák elõállításában járatos szakember számára jól ismert eljárásokkal állíthatjuk elõ. A vakcinák lehetnek olyan vektorral megfertõzött vagy transzfektált sejtvonal szuszpenziói, amely Marek-betegség-vírustörzs nukleinsavát vagy annak fragmensét tartalmazza, amely Marek-betegség-vírus, elõnyösen 1¹es szerotípus és/vagy 2¹es szerotípus és/vagy 3¹as szerotípus vakcinatörzs/legyengített törzzsel van megfertõzve vagy transzfektálva, és támogatja annak produktív replikációját (azaz egyedi vagy multivalens vakcinák) vagy ezek kombinációja (azaz multivalens vakcinák), és/vagy más vírusokkal, mint például herpeszvírusokkal. Ezenfelül a találmány szerinti vakcina elõállítható szonikált sejtekbõl, például SogE sejtekbõl készült sejtmentes szuszpenziókból, és/vagy olyan sejtlizátumokból vagy lizátumok komponenseibõl, amelyek Marek-betegség-vírus, elõnyösen 1¹es szerotípus és/vagy 2¹es szerotípus és/vagy 3¹as szerotípus vakcina-törzs/legyengített törzzsel vannak megfertõzve vagy transzfektálva, és támogatják annak produktív replikációját (azaz egyedi vagy multivalens vakcinák), és/vagy más vírusokkal, mint például herpeszvírusokkal. Nyilvánvaló, hogy a leírás szerinti vektor megkonstruálható a szakember számára ismert rekombináns módszerekkel, hogy olyan heterológ fehérjéket kódoljon, amelyek ismert módon növelik a gerinces immunválaszát (azaz képesek 1¹es vagy 2¹es osztályba tartozó fõ hisztokompatibilitási komplex molekula prezentálására), ily módon fokozzák a beadott vakcina általános védõ hatását. A találmány tárgya olyan vektorral megfertõzött vagy transzfektált sejt alkalmazása, amely Marek-betegségvírustörzs nukleinsavát vagy annak fragmensét tartalmazza, herpeszvírus, elõnyösen alfaherpeszvírus létrehozására és/vagy fenntartására és/vagy izolálására. A herpeszvírusok példái közé tartozik a Varicella Zoster vírus, citomegalovírus, Epstein Barr-vírus, herpes simplex vírus stb. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgya olyan vektorral megfertõzött vagy transzfektált sejt alkalmazása, amely Marek-betegségvírustörzs nukleinsavát vagy annak fragmensét tartalmazza, Marek-betegség-vírustörzs létrehozására

6 és/vagy fenntartására és/vagy izolálására. Ilyen sejtet alkalmas szubsztrátként alkalmazhatunk hipervirulens törzsek, mint például az EU1, 648A és 84A törzs és/vagy virulens törzsek, mint például az RB1B törzs és/vagy avirulens törzsek, mint például az 84Ap80C és CVI988 szaporítására. A találmány tárgykörébe tartozik az összes Marek-betegség-vírustörzs, amely az 1¹es szerotípus, 2¹es szerotípus, 3¹as szerotípus alkotta csoportból van kiválasztva. Az 1¹es szerotípus magában foglalja az összes patogén törzset és azok legyengített származékait. A 2¹es szerotípus a természetesen avirulens csirkevírusokból áll, míg a 3¹as szerotípus, amelyet pulykaherpeszvírusként ( Herpesvirus of Turkeys, HVT) is ismernek, avirulens pulykavírusokat foglal magában, amelyek képesek csirkében replikálódni. Nyilvánvaló, hogy a Marek-betegség-vírustörzs természetes vagy genetikailag módosított törzset is magában foglalhat. A találmány tárgykörébe tartozik eljárás nagyon virulens (vv), nagyon virulens plusz (vv+), hipervirulens és/vagy virulens és/vagy avirulens Marek-betegség-vírustörzs létrehozására és/vagy izolálására és/vagy fenntartására, amely eljárás magában foglalja Marekbetegség-vírustörzs növekedésének támogatására képes sejt megfertõzését herpeszvírussal, és a sejt tenyésztését olyan körülmények között, amely alkalmas a sejt szaporítására és a herpeszvírus létrehozására, fenntartására és izolálására. A leírás tárgyát képezi továbbá herpeszvírus is, amely a találmány szerinti eljárással állítható elõ. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás nagyon virulens (vv), nagyon virulens plusz (vv+), hipervirulens és/vagy virulens és/vagy avirulens Marek-betegség-vírustörzs létrehozására és/vagy izolálására és/vagy fenntartására, amely eljárás magában foglalja Marek-betegség-vírustörzs növekedésének támogatására képes sejt megfertõzését nagyon virulens (vv), nagyon virulens plusz (vv+), hipervirulens és/vagy virulens és/vagy avirulens Marek-betegség-vírustörzzsel, és a sejt tenyésztését olyan körülmények között, amely alkalmas a sejt szaporítására és a nagyon virulens (vv), nagyon virulens plusz (vv+), hipervirulens és/vagy virulens és/vagy avirulens Marekbetegség-vírustörzs létrehozására, fenntartására és izolálására. A gerinces/madársejtek tenyésztésére alkalmas körülmények ismertek a szakterületen. A leírás tárgya továbbá nagyon virulens (vv), nagyon virulens plusz (vv+), hipervirulens és/vagy virulens és/vagy avirulens Marek-betegség-vírustörzs is, amely a találmány szerinti eljárással állítható elõ. Ezenfelül elõnyös, ha a Marek-betegség-vírustörzs növekedésének támogatására képes sejtet geneticin (G¹418) vagy annak analógja vagy származéka vagy bármely más olyan drog jelenlétében tenyésztjük, amely nem toxikus a neomicin rezisztenciagén jelenlétében és szelekcióra alkalmazható. A leírás szerinti értelemben a G¹418 származéka a G¹418-ból származó, hasonló tulajdonságú anyag. A leírás szerint alkalmazott G¹418 analóg olyan anyag, amely a G¹418-éhoz (Gibco, Life Technologies) hasonló kémiai szerkezettel és kémiai tulajdonságokkal rendelkezik A találmány tárgyát képezi továbbá találmány szerinti Marek-betegség-vírustörzs növekedésének támogatására képes sejt alkalmazása herpeszvírus, elõnyösen alfaherpeszvírus, még elõnyösebben Marek-betegség-vírus diagnosztikus antigénjének elõállítására. Nyilvánvaló, hogy gyakorlatilag bármilyen heterológ génszekvenciát létrehozhatunk a nukleinsavakat tartalmazó vektorban diagnosztikus antigének elõállítására. Például a Marek-betegség-vírus egy vagy több szerotípusának nem közönséges antigenikus peptidjeit kódoló géneket vagy génfragmenseket vagy más herpeszvírusok specifikus antigénjeit kódoló géneket vagy génfragmenseket. Ilyen specifikus virális antigéneket alkalmazhatunk specifikus virális fertõzés diagnosztizálására madárban, és hasznosak vakcina termelésére is. Ezenfelül a találmány tárgya eljárás Marek-betegségvírus diagnosztikai antigénjének elõállítására, amely magában foglalja olyan találmány szerinti sejt biztosítását, amely meg van fertõzve és képes Marek-betegség-vírustörzs növekedésének támogatására, és abból komponensek izolálását. A találmány tárgyát képezi továbbá találmány szerinti vakcina, gerincesbetegség megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. Elõnyösen a gerincesbetegség madárbetegség, még elõnyösebben Marek-betegség-vírussal kapcsolatos betegség. Gyógyszer számára alkalmas alapok ismertek a szakterületen. A találmány magában foglalja a profilaktikus és terápiás vakcinákat is. A leírás tárgyát képezi továbbá eljárás gerinces megvédésére betegség ellen, amely eljárás magában foglalja a gerincesnek találmány szerinti vakcina beadását gyógyászatilag elfogadható hordozóval megfelelõ recipiensnek. A leírás tárgyát képezi továbbá eljárás gerinces (például állat, ember, baromfi) immunizálására fertõzõ herpeszvírus ellen, amely eljárás magában foglalja gerincesnek találmány szerinti vakcina hatásos immunizáló dózisának a beadását. Akár élõ rekombináns virális vakcinát, akár inaktivált rekombináns virális vakcinát is készíthetünk. Az élõvírus-vakcina kiszerelések elõállítása elérhetõ hagyományos eljárások alkalmazásával, amelyek a vírus szaporítását foglalják magukban a találmány szerinti sejtvonalban, majd annak gyógyszerként történõ beadását gerincesnek. Vakcinákat gerincesnek a szakember számára ismert bármilyen módszerrel beadhatunk, például intramuszkuláris, szubkután, intraabdominális, intravénás vagy in ovo injekcióval. Elõnyös a vírus vakcinakiszerelésnek azon kórokozó fertõzésének természetes útján történõ beadása, amelyre a vakcina tervezve van. Más megoldásképpen ilyen vakcinát okulonazálisan vagy orálisan adhatunk be. Az inaktivált vakcinák elõállítása érdekében a vírust tenyészthetjük találmány szerinti sejtvonalban, inaktiválhatjuk például formaldehiddel vagy béta-propiolaktonnal. Az inaktivált vírusokat alkalmas adjuvánssal szerelhetjük ki, hogy fokozzuk az immunválaszt. Az ilyen adjuvánsok nem korlátozó példái közé tartoznak ásványi gélek, például alumínium-hidroxid; felületaktív anyagok, mint például lizolecitin, pluron-poliolok, polianionok; peptidek; olajos emulziók; és potenciálisan hasznos adjuvánsok, mint 6

7 például BCG és Corynebacterium parvum. Gyógyászatilag elfogadható hordozók jól ismertek a szakterületen, és nem korlátozó példáik közé tartoznak sóoldat, pufferelt sóoldat, dextróz, víz, glicerin, steril izotóniás vizes puffer, és ezek kombinációi. Ilyen elfogadható hordozó egy példája fiziológiásan kiegyenlített tenyésztõ tápközeg, amely egy vagy több stabilizálószert, mint például stabilizált, hidrolizált fehérjéket, laktózt, dimetilszulfoxidot stb. tartalmaz. A hordozó elõnyösebben steril. Az alkalmas recipiens gerinces, elõnyösen madárfaj. 1. példa Állatok. Kiválasztott leghorn White Lohmann csirkéket (LSL) (Lohmann, Cuxhaven, Germany) alkalmaztunk, amelyeket a kikelésük napján a szárnyukon megjelöltünk. A madarakat ketrecekben tartottuk, és ad libitum kaptak tápot és vizet. Sejtek és vírusok. Csirkeembrió-fibroblasztsejteket (CEF) állítottunk elõ, amint korábban ismertették (Schumacher és mtsai., 00). Fürj QM7 izomsejteket (ATCC sejtszáma CRL 1632) alkalmaztunk az állandó sejtvonal elõállításához. Az alkalmazott MDV-törzsek a CVI988 (MarekVac forte, Lohmann, Cuxhaven, Germany), 84Ap80C 37, RB1B (Dr. T. F. Davison, Compton, UK ajándéka) és EU1 voltak. A 84Ap80C törzset vagy annak US2-negatív BAC vírusszármazékát, amely MDV fertõzõ BAC klónjából van származtatva (Schumacher és mtsai., 00) CEF¹en szaporítottuk 29. Az EU1 MDV-törzs egy 1992-ben, egy olaszországi, HVT vakcinával immunizált állományból izolált vírus. Az EU1-rõl PCR¹el kimutatták, hogy mentes fertõzõ csirkeanémia-vírustól, madárleukózis és retikuloendoteliózisvírustól és fertõzõ burzális betegség vírusától, és nem szaporítható CEF¹en. A vírus elõállításához az EU1 törzset intramuszkulárisan (im.) beinjektáltuk csirkébe. nappal a fertõzés után, perifériás vért (PBMC) és lép mononukleáris sejteket gyûjtöttünk be a fertõzött madaraktól Histopaque sûrûségcentrifugálással (Sigma, Munich, Germany), és folyékony nitrogénben tároltuk azokat. Plazmid. A glikoprotein E nyílt leolvasási fázist, a Rispens CVI988 MDV vakcinatörzs US8 homológ 17,33¹as génjét polimeráz-láncreakcióval (PCR) amplifikáltuk 0-0 pmol ¹CATAAGCATGCGAGT- CAGCGTCATAATGTG¹3 ¹láncindítóval és az ¹CAAGGGCCCATCAGTGGTATAAATCTAAGC¹3 3 ¹láncindítók alkalmazásával. A kapott 1,4 kbp méretû fragmenst elhasítottuk a BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázokkal, és beklónoztuk a pcdna3 vektor (Invitrogen) ugyanazon helyeire, ami a pcmge rekombináns vektorhoz vezetett. PCR elemzés. Az egyik PCR-reakció a ge nyílt leolvasási fázist (lásd fent) célozta, a fertõzött sejteken végrehajtott másik PCR-reakció az MDV gb génjét célozta (Lee és mtsai., 00). Az MDV gb gént 17, 33 célzó PCR-reakciót pmol elülsõ ¹GCATAT- CAGCCTGTTCTATC¹3 ) és reverz ( -AACCAATG- GTCGGCTATAAC¹3 ) láncindítóval végeztük. Mindkét protokollban a megfelelõ láncindítókat összekevertük a DNS-sel, és 3 ciklust (9 C s, 0 C s, 72 C s) futtattunk le. A PCR-termékek specifitását Southern-blottal igazoltuk, Digoxigenin-jelzett gb vagy ge szekvenciák próbaként történõ alkalmazásával 29. Indirekt immunfluoreszcens elemzés. Az indirekt immunfluoreszcencia-elemzésekhez (IIF) a sejteket 6 mérõhelyes lemezeken (Greiner) vagy üveg fedõlemezeken tenyésztettük. A sejteket rögzítettük 90% acetonnal a fertõzés után különbözõ idõkkel, az IIF¹et pontosan az ismertetett módon végeztük el, és a mintákat hagyományos fluoreszcens mikroszkópiával elemeztük (29,). Az alkalmazott ellenanyag a 2K11 monoklonális ellenanyag (mab) volt; (Dr. J¹F. Vautherot, INRA, Nouzilly, France ajándéka) vagy MDV-1-gyel megfertõzött lábadozó csirkék széruma (anti-mdvi) 29. ELISA eljárás az MDV¹1 ellenanyagok meghatározására A plazmában található MDV-1-specifikus ellenanyagokat enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárással (ELISA) határoztuk meg. Az antigén 7 BAC¹al megfertõzött CEF-NEK a fertõzés után nappal fagyasztás-olvasztással begyûjtött lizátuma volt. A lizátumot ( ml PBS-ben) 60 másodpercen keresztül szonikáltuk 60 W¹on, és a sejttörmeléket eltávolítottuk centrifugálással ( 000 g, perc, 4 C). 7 fertõzetlen CEF lizátumát alkalmaztuk negatív kontrollként. ELISA lemezeket (Nunc) vontunk be 0 l lizátummal (végkoncentráció: l lizátum/ml) 16 órán keresztül 4 C¹on. A plazmamintákat meghígítottuk log 2 lépésekben 1:0 hígítástól kezdve, és hozzáadtuk a lemezekhez 60 percre 2 C¹on, miután blokkoltunk 2% fölözött tejjel. PBS-sel végzett alapos mosás után 0 l anticsirke IgG peroxidáz konjugátumot (Sigma) adtunk a lemezre percre 2 C¹on. PBS-sel végzett végsõ mosás után 0 l TMB szubsztrátoldatot (Sigma) adtunk a lemezre percre, mielõtt a reakciót leállítottuk2mh 2 SO 4 -val. Leolvastuk a nm¹es abszorbanciát (A ) (TecanSPECTRA, Crailsheim, Germany), és a végponti ellenanyagtitereket meghatároztuk, amint korábban ismertették. 2. példa: A CVI988 MDV vakcinatörzs glikoprotein- E-jét konstitutívan expresszáló sejtvonal létrehozása QM7 sejteket transzfektáltunk a korábban ismertetett kalcium-foszfát-kicsapásos eljárással 29. A QM7 sejteket 6 mérõhelyes lemezeken tenyésztettük, amíg megközelítõleg 70% konfluenciát értünk el, és transzfektáltunk g pcmge rekombináns plazmiddal. A transzfektált sejtekre % FCS¹t és 00 g/ml G¹418¹at (Gibco-BRL) tartalmazó DMEM tápközeget rétegeztünk. Az antibiotikum jelenlétében végzett két hét sejttenyésztés után egysejtes klónokat szedtünk fel 96 mérõhelyes lemezekre. Miután a sejtklónok konfluenciáig felnõttek a 96 mérõhelyes lemezeken, azokat elosztottuk 1:2 arányban, és a lábadozó MDVI-szérum alkalmazásával IIF¹t hajtottunk végre a sejtklónokon. Azonosítottunk egy olyan sejtklónt, amelyben gyakorlatilag az összes sejt expresszálta az MDV ge¹t (2. ábra), 7

8 és azt SOgE-nek neveztük el. A SOgE sejteket felszaporítottuk, és ellenõriztük ge expresszióra hetes idõközökkel. G¹418 jelenlétében az expresszió stabilnak bizonyult több mint héten keresztül. A drog hiányában a ge expressziót maximum hétig detektáltuk a SOgE sejtekben. Az MDV ge DNS jelenlétét SOgE sejtekben, és hiányukat QM7 sejtekben 1 7 sejtbõl izolált DNS PCR-elemzésével igazoltuk (3. ábra). 3. példa: A SOgE sejtek funkcionális MDV ge¹t expresszálnak Azt a kérdést, hogy a létrehozott sejtvonal expresszál¹e funkcionális MDV ge¹t, ge¹negatív MDV SOgE sejteken történõ növekedésének elemzésével válaszoltuk meg. A glikoprotein-e-rõl kimutatták, hogy esszenciális az MDV in vitro növekedéséhez. Tehát ge¹negatív BAC vírust kódoló ge DNS¹t (Schumacher és mtsai., 00) transzfektáltunk SOgE vagy QM7 sejtekbe, és monitoroztuk a plakkok kialakulását. Míga ge plakkok könnyedén megfigyelhetõk voltak az SOgE sejteken IIF után anti¹gb mab 2K11 alkalmazásával, csak egyedi fertõzött sejteket tudtunk láthatóvá tenni mab-bal a szülõi QM7 sejteken (4. ábra). Ezek az eredmények megerõsítették, hogy a SOgE sejtek funkcionális ge¹t termeltek, amely képes volt transzkomplementálni az esszenciális MDV¹1 ge¹t ge¹deficiens vírusban példa: A SOgE sejtek támogatják számos MDV¹1 törzs növekedését A ge plakkok mérete az SOgE sejteken sokkal nagyobbnak tûnt, mint a BAC vírusé QM7 sejteken vagy gb¹negatív vírus mutánsé gb¹t expresszáló QM7 sejteken 29. Ezt a váratlan megfigyelést további kísérletekben elemeztük. Az avirulens 84Ap80C és CVI988 MDV¹1 törzseket, valamint a virulens RB1B és hipervirulens törzset vizsgáltunk CEF, QM7 és SOgE sejteken. Ezt fertõzött CEF vagy PBMC (EU1) sejteknek a megfelelõ sejtekkel való együttes beoltásával végeztük el. Képesek voltunk demonstrálni, hogy a SOgE sejtek együttes beoltása 84Ap80C, CVI988 vagy RB1B által megfertõzött CEF sejtekkel alacsony fertõzési értéknél (MOI=0,0001; azaz 0 PFU per 1 6 sejt) plakkok kialakulásához vezetett (. ábra). A plakkok mérete összemérhetõ volt a CEF sejteken lévõkével (. ábra). Emellett lehetséges volt közvetlenül visszaállítani a fertõzõ MDV-1¹et virális DNS-bõl vagy Escherichia coli eredetû klónozott virális DNS-bõl (BAC) 29 a SOgE sejtek transzfektálása után (. ábra). Ily módon lehetséges az MDV direkt adaptálása SOgE sejtekhez hosszadalmas tenyésztési passzálások nélkül, ami jelentõs elõny mind a vakcinatermelésben, mind a virulens és hipervirulens MDV¹1 törzsek állatkísérletekhez való izolálása és létrehozása területén. A fent ismertetett kísérletek arra utaltak, hogy a SOgE sejtek állandó sejtszubsztrátot képviselnek mind az avirulens (vakcina) MDV-törzsek, mind a virulens, nagyon virulens és hipervirulens MDV¹1 törzsek számára. Mivel különösen az MD vakcinák elõállítását segítheti elõ az MDV-vakcinatörzsek szaporítására szolgáló állandó sejtvonal, vakcinatörzseket, CVI988 DNS¹t transzfektáltunk CEF, QM7 vagy SOgE sejtekbe. A transzfektálás utáni 6. napon, amikor a vírusplakkok már láthatók voltak, a sejteket begyûjtöttük és 1 3 fertõzött sejtet együtt beoltottunk az azonos sejttípus 1 7 fertõzetlen sejtjével. A nagyszámú sejt megfertõzése után. napon a fertõzött sejteket tripszinizáltuk és megtitráltuk ¹szeres hígításokban frissen elõállított CEF, QM7 vagy SOgE sejteken. A titrálás utáni 4. napon a sejteket rögzítettük és meghatároztuk a vírusplakkok számát IIF festéssel a 2K11 anti¹gb mab ellenanyag alkalmazásával. Kimutattuk, hogy az átlagos CVI988 titer SOgE sejteken elérte az 1,8 6 PFU értéket, míg a titerek csak 3,2 3 voltak QM7 sejteken. A titerek gyakorlatilag azonosak voltak SOgE sejteken az elsõdleges CEF sejtekéivel. A plakkméret-meghatározások és a titrálási kísérletek eredményébõl arra a következtetésre jutottunk, hogy a virulens és avirulens MDV-vakcinatörzsek szaporítása olyan SOgE sejteken, amelyek konstitutíven expresszálják a CVI988 ge törzset, ugyanolyan hatékony vagy még jobb volt, mint az elsõdleges CEF sejteken való szaporítás.. példa: A SOgE sejtek nem okoznak daganatot 1 napos csirkékben Az a tény, hogy a SOgE sejtek kémiailag indukált fürjdaganatból származtak, felvetette annak a csekély lehetõségét, hogy daganatokat okozhat csirkékben a teljes sejtes készítmény szisztémás beadása után. Ezen fontos kérdés megválaszolására összesen 18 csirkét oltottunk be vagy SOgE sejtekkel (12 csirke) vagy szülõi QM7 sejtekkel (6 csirke). Mindegyik csirke 1 6 sejtet kapott intramuszkuláris és 1 6 sejtet intraabdominális útvonalon (1. táblázat). A beoltott csirkék sorsát összesen 12 héten keresztül követtük, amikor postmortem vizsgálatot végeztünk. Egyik csirke sem mutatott semmilyen klinikai tünetet a kísérlet folyamán. Ezenfelül mindegyik csirke jóltápláltságot mutatott és semmilyen jelét nem mutatta daganat kialakulásának a postmortem vizsgálatban. Ezekbõl az eredményekbõl arra következtettünk, hogy a rekombináns MDV ge¹t expresszáló SOgE sejtek, valamint a szülõi QM7 sejtek nem okoznak daganatokat csirkékben, még akkor sem, ha megközelítõleg 0 00-szer több sejtet adunk be, mint ami a vakcinadózisban található. Tehát a SOgE sejteket biztonságosnak találtuk MDV- vagy kombinált vakcinák elõállítására. 6. példa: Csirkék megvédése Marek-betegség ellen SOgE sejtekkel elõállított vakcina alkalmazásával A SOgE sejteken szaporított Rispens CVI988 vakcinatörzs védõképességének hagyományosan CEF sejteken elõállítottéval való összehasonlításához állatkísérleteket hajtottunk végre. Egynapos csirkéknek 1 6 SOgE sejtet (1. csoport, 2. táblázat), 1 6 szülõi QM7 sejtet (4. csoport, 2. táblázat) vagy SOgE sejteken (2. csoport, 2. táblázat) vagy CEF sejteken (3. csoport, 2. táblázat) elõállított 1 3 plakkalkotó egységnyi CVI9884 adtunk. A keresztszennyezõdés elke- 8

9 rülésére a vakcinavírust azután állítottuk elõ, hogy a CEF sejtekbõl izolált CVI988 DNS¹t transzfektáltuk SOgE vagy CEF sejtekbe. A transzfektált sejteket együtt beoltottuk friss fertõzetlen sejtekkel és vakcinavírust gyûjtöttünk be a fertõzés utáni. napon, amikor kialakult a komplett citopatikus hatás. Az immunizált madarakat kísérletesen megfertõztük az EU1 hipervirulens MDV¹1 törzzsel az immunizálás utáni 12. napon. A hamisan immunizált állatokban (QM7 sejtek, 4. csoport) a csirkék MD¹ben szenvedtek már a fertõzés utáni 7. napon, és két madár elpusztult a 9. és. napon. 37 nappal a fertõzés után az összes madár elpusztult a fertõzés következtében (2. táblázat). Az SOgE-immunizált állatokban 4 csirke pusztult el a fertõzés következtében, de 3 madár túlélt a kísérlet fertõzés után 70. napon való befejezéséig (2. táblázat). Azonban a 3 túlélõ madár MD tüneteit mutatta, amint azt a kórbonctani értékelés és a belsõ szervekben a daganatok detektálása kimutatta (2. táblázat). Ezzel éles ellentétben a CVI988-cal immunizált csirkék, amelyeket akár SOgE, akár CEF sejteken állítottunk elõ, nem pusztultak el MD következtében a kísérlet befejezéséig (2. táblázat). A 2. és 3. csoportban azonban 1¹1 madárban azonban azonosítottuk MD tüneteit kórbonctanilag (2. táblázat). Az immunizált és megfertõzött madarak szerológiai és anti-mdv¹1 válaszait ELISA teszteléssel követtük. Képesek voltunk demonstrálni, hogy a védett madarak olyan ELISA ellenanyagot mutattak, amely fokozatosan emelkedett a fertõzés után idõben, míg a SOgE vagy QM7 sejtekkel beoltott csirkékben nem alakult ki magas ellenanyagtiter. Inkább a titerek csökkentek a fertõzés utáni késõbbi idõben vagy gyakorlatilag állandóak maradtak (6. ábra). Az eredményekbõl arra a következtetésre jutottunk, hogy az állandó SOgE sejteken elõállított MD CVI988 vakcina ugyanolyan jó védelmet nyújtott, mint a hagyományosan CEF sejteken elõállított. Ezenfelül az MD elleni védelem egybeesett a fokozatosan emelkedõ anti-mdv¹1 ellenanyagokkal, ami a csirke immunrendszerének állandó erõsítésére utalhat, akár litikusan replikálódó vírus által, akár az EU1 alacsony replikációs szintje miatt, ami szabályozható a vakcinavírus jelenlétével, és elõfeltétele a daganatkeltõ MD elleni védelemnek. Hivatkozások 1. Adler, H., M. Messerle, M. Wagner, and U. H. Koszinowski. 00. Cloning and mutagenesis of the murine gammaherpesvirus 68 genome as an infectious bacterial artificial chromosome. J. Virol. 74: Adler, H. E. and A. J. DaMassa Toxicity of endotoxin to chicks. Avian Dis. 23: Barrow, A. and K. Venugopal Molecular characteristics of very virulent European MDV isolates. Acta Virol. 43: Benton, W. J. and M. S. Cover The increased incidence of visceral lymphomatosis in broiler and replacement birds. Avian Dis. 1: Calnek, B. W. 01. Pathogenesis of Marek s disease virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2: Calnek, B. W., K. A. Schat, M. C. Peckham, and J. Fabricant Field trials with a bivalent vaccine (HVT and SB¹1) against Marek s disease. Avian Dis. 27: Cui, Z., A. Quin, L. F. Lee, P. Wu, and H. J. Kung Construction and characterization of a H19 epitope point mutant of MDV CVI988/Rispens strain: Acta Virol. 43: Cui, Z. Z., D. Yan, and L. F. Lee Marek s disease virus gene clones encoding virus-specific phosphorylated polypeptides and serological characterization of fusion proteins. Virus Genes 3: Davis, H. L. and M. J. McCluskie DNA vaccines for viral diseases. Microbes. Infect. 1: Davis, H. L., M. L. Michel, M. Mancini, M. Schleef, and R. G. Whalen Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis B virus surface antigen. Vaccine 12: Delecluse, H. J. and W. Hammerschmidt Status of Marek s disease virus in established rymphoma cell lines: herpesvirus integration is common. J. Virol. 67: Delecluse, H. J., S. Schuller, and W. Hammerschmidt Latent Marek s disease virus can be activated from its chromosomally integrated state in herpesvirus-transformed lymphoma cells. EMBO J. 12: Fynan, E. F, R. G. Webster, D. H. Fuller, J. R. Haynes, J. C. Santoro, and H. L. Robinson DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene- gun inoculations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 90: Fynan, E. F., R. G. Webster, D. H. Fuller, J. R. Haynes, J. C. Santoro, and H. L. Robinson DNA vaccines: a novel approach to immunization. Int. J. Immunopharmacol. 17: Gimeno, I. M., R. L. Witter, and W. M. Reed Four distinct neurologic syndromes in Marek s disease: effect of viral strain and pathotype. Avian Dis. 43: Krishnan, B. R. 00. Current status of DNA vaccines in veterinary medicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 43: Lee, L. F., P. Wu, D. Sui, D. Ren, J. Kamii, H. J. Kung, and R. L. Witter. 00. The complete unique long sequence and the overall genomic organization of the GA strain of Marek s disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 97: Messerle, M., I. Crnkovic, W. Hammerschmidt, H. Ziegler, and U. H. Koszinowski Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94: Morgan, R. W., J. L. Cantello, and C. H. McDermott Transfection of chicken embryo fibroblasts with Marek s disease virus DNA. Avian Dis. 34: Osterrieder, N., R. Wagner, C. Brandmuller, P. Schmidt, H. Wolf, and O. R. Kaaden Protection 9

10 against EHV¹1 challenge infection in the murine model after vaccination with various formulations of recombinant glycoprotein gp14 (gb). Virology 8: Rispens, B. H., H. van Vloten, N. Mastenbroek, H. J. Maas, and K. A. Schat Control of Marek s disease in the Netherlands. I. Isolation of an avirulent Marek s disease virus (strain CVI 988) and its use in laboratory vaccination trials. Avian Dis. 16: Rispens, B. H., H. van Vloten, N. Mastenbroek, J. L. Maas, and K. A. Schat Control of Marek s disease in the Netherlands. II. Field trials on vaccination with an avirulent strain (CVI 988) of Marek s disease virus. Avian Dis. 16: Robinson, H. L. and C. A. Torres DNA vaccines. Semin. Immunol. 9: Roy, K., H. Q. Mao, S. K. Huang, and K. W. Leong Oral gene delivery with chitosan-dna nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy. Nat. Med. : Saiki, R. K., T. L. Bugawan, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA¹DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes. Nature 324: Sambrook, J. and D. F. Fritsch and T. Maniatis Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y. 27. SAS Institute Inc SAS/STAT User s Guide, Version 6. SAS Institute Inc., Cary NC. 28. Schat, K. A., B. W. Calnek, and J. Fabricant Characterisation of two highly oncogenic strains of Marek s disease virus. Avian Pathol. 11: Schumacher, D., B. K. Tischer, W. Fuchs, and N. Osterrieder. 00. Reconstitution of Marek s disease virus serotype 1 (MDV¹1) from DNA cloned as a bacterial artificial chromosome and characterization of a glycoprotein B¹negative MDV¹1 mutant. J. Virol. 74: Sharma, J. M In vitro cell association of Marek s disease herpesvirus. Am. J. Vet. Res. 32: Stokes, M. E., C. S. Davis, and G. G. Koch. 00. Categorical Data Analysis Using the SAS System. SAS Institute Inc., Cary NC. 32. Suter, M., A. M. Lew, P. Grob, G. J. Adema, M. Ackermann, K. Shortman, and C. Fraefel BAC- VAC, a novel generation of (DNA) vaccines: A bacterial artificial chromosome (BAC) containing a replicationcompetent, packaging- defective virus genome induces protective immunity against herpes simplex virus 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96: Tulman, E. R., C. L. Afonso, Z. Lu, L. Zsak, D. L. Rock, and G. F. Kutish. 00. The genome of a very virulent Marek s disease virus. J. Virol. 74: Witter, R. L Protection by attenuated and polyvalent vaccines against highly virulent strains of Marek s disease virus. Avian Pathol. 11: Witter, R. L Characteristics of Marek s disease viruses isolated from vaccinated commercial chicken flocks: association of viral pathotype with lymphoma frequency. Avian Dis. 27: Witter, R. L Safety and comparative efficacy of the CVI988/Rispens vaccine strain, p World s Poultry Science Assoc, Amsterdam. 37. Witter, R. L Increased virulence of Marek s disease virus field isolates. Avian Dis. 41: Witter, R. L. 01. Protective efficacy of Marek s disease vaccines. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2: Witter, R. L. and L. F. Lee Polyvalent Marek s disease vaccines: safety, efficacy and protective synergism in chicken with maternal antibodies. Avian Pathol. 13: Witter, R. L, L. F. Lee, and A. M. Fadly Characteristics of CVI988/Rispens and R2/23, two prototype vaccine strains of serotype 1 Marek s disease virus. Avian Dis. 39: Yokoyama, H., R. C. Peralta, S. Sendo, Y. Ikemori, and Y. Kodama Detection of passage and absorption of chicken egg yolk immunoglobulins in the gastrointestinal tract of pigs by use of enzyme-linked immunosorbent assay and fluorescent antibody testing. Am. J. Vet. Res. 4: táblázat Daganatok kialakulásának tesztelése csirkékben QM7 és SOgE sejtek alkalmazása után Daganatos állatok száma Hetek a fertõzés után Csoport Állatok (n) Összesen SOgE 6 0 0/6 QM /6

11 2. táblázat Marek-betegség SOgE sejteken elõállított CVI988 vakcinatörzzsel immunizált és EU1 hipervirulens törzzsel megfertõzött csirkékben Marek-betegségben szenvedõ állatok száma Hetek a fertõzés után Csoport Állatok (n) Összesen 1: SOgE 7 1* /7 2: CVI988-SOgE 8 1 1/8 3: CVI988-CEF 8 1 1/8 4:QM /6 *Az állatok száma a 0 9. héten EU1-fertõzés miatt elpusztultként, a csirkék száma a. héten post mortem vizsgálattal MD¹t mutatóként van megadva. Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat. 1. ábra: Az MDV¹1 genom sematikus reprezentálása és a ge nyílt leolvasási fázis elhelyezkedése az egyedi rövid régióban (unique short region, Us). Bemutatjuk a megközelítõleg 180 kbp méretû MDV¹1 genom szervezõdését és a BamHl restrikciós térképet. A ge nyílt leolvasási fázist PCR-rel amplifikáltuk és pcdna3 vektorba klónoztuk a humán citomegalovírus közvetlen korai promotere/enhanszere szabályozása alatt. A mértékegységeket kbp vagy bp egységekben adjuk meg. 2. ábra: A SOgE sejtek ge¹expressziójának detektálása IIFfel nyúl poliklonális ge specifikus antiszérum alkalmazásával. Míg a SOgE sejtek reaktivitása az ellenanyaggal könnyen detektálható volt, nem figyeltünk meg a ge¹specifikus szérum reaktivitását QM7 sejtekkel. Az egyedi nézetek m méretûek. 3. ábra: SOgE sejtek polimeráz-láncreakciója. SOgE sejteket fertõzetlenül hagytunk vagy megfertõztünk 84Ap80C, CVI988 vagy RB1B MDV¹1 törzsekkel. Míg a ge¹specifikus szekvenciákat detektáltuk az összes fertõzött és nem fertõzött SOgE sejtben, gb¹specifikus amplifikációs terméket csak a megfertõzött sejtekben kaptunk. A QM7 sejtekben sem a gb, sem a ge nem volt detektálható. Megadjuk az amplifikációs termékek méreteit. Az amplifikált termékek specifitását Digoxigenin-jelzett gb vagy ge szekvenciák próbaként történõ alkalmazásával igazoltuk. A DNS-DNS hibridek detektálását CSPD (Roche Biochemicals) és fokozott kemiluminiszcencia alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint. 4. ábra: ge-negatív és BAC vírus tenyésztése ge¹t expresszáló SOgE sejteken vagy QM7 sejteken. A ge vagy BAC DNS megfelelõ sejtekbe történõ transzfektálása után (Schumacher és mtsai., 00, 01) ge plakkok kialakulása volt látható a transzfektálás utáni naptól SOgE sejtekben, QM7 sejtekben pedig nem. A QM7 sejtekben csak egyedi fertõzött sejteket figyeltünk meg plakk kialakulása nélkül a ge vírus esetében. A BAC vírus nagyon kis plakkokat okozott QM7 sejtekben, de nagy plakkokat okozott a rekombináns SOgE sejtekben. Az egyedi nézetek m méretûek (alsó részek) vagy 0 0 m méretûek (felsõ részek).. ábra: A 84Ap80C, RB1B és CVI988 MDV¹1 törzsek plakkjai CEF és SOgE sejteken. A 84Ap80C, CVI988 vakcinatörzsek és a virulens RB1B MDV¹1 törzs által indukált plakkok könnyen megfigyelhetõk voltak SOgE sejtekre történõ szélesztés után. Megfigyeltük vírusplakkok kialakulását CEF sejteken is az 84Ap80C, CVI988 és RB1B esetében. A bemutatott plakkokat rögzítettük 1 6 sejtnek a jelzett vírusokból 0 PFU-val történõ megfertõzése utáni 4. napon. Az egyedi nézetek m méretûek. 6. ábra: Rekombináns SOgE vagy CEF sejteken termelt CVI988¹al immunizált csirkék ELISA titerei. A 12. nap az immunizálás napja, a 0. napon az állatokat megfertõztük az EU1 hipervirulens MDV¹1 törzzsel. Az MDV- 1-specifikus ellenanyag titerei a plazmában. Az egyes csoportok összes madarától vért vettünk a megjelölt napokon, és két madár plazmamintáit összeöntöttük. A plazmát meghígítottuk log 2 lépésekben az 1:0 hígítástól kezdve. A titereket azzal a hígítással adjuk meg, amelyben az A nm érték a az MDV-fertõzött sejtlizátumokban 3¹szoros szórásnyival meghaladta a fertõzetlen sejtlizátumok értékét. Az egyes csoportok jelei a megadottak. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás olyan folyamatos sejtvonal elõállítására, amely képes támogatni sejthez kapcsolódó alfaherpeszvírus növekedését, amely eljárás magában foglal- 11

12 ja sejt megfertõzését vagy transzfektálását herpeszvírus rekombináns nukleinsavával, és a megfertõzött vagy transzfektált sejt vagy utódja tenyésztését olyan körülmények között, amelyek alkalmasak a nukleinsav expresszáltatására, és a sejt vagy utódja szaporítását, ahol a sejt vagy utódja mentes emlõs- vagy madárvírustól, és ahol a nukleinsav tartalmazza a herpeszvírus glikoprotein ge gént vagy annak funkcionális fragmensét. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a megfertõzött vagy transzfektált sejt gerincessejt. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a megfertõzött vagy transzfektált sejt madársejt. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a megfertõzött vagy transzfektált sejt izom-mioblasztsejt.. A 4. igénypont szerinti eljárás, ahol az izommioblasztsejt QM7 sejt. 6. Az. igénypont szerinti eljárás, ahol a QM7 sejt az ATCC CRL 1632 letéti számú sejt származéka. 7. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a herpeszvírus Marek-betegség-vírus, elõnyösen 1., 2. vagy 3. szerotípusú. 8. A 7. igénypont szerinti eljárása, ahol a Marek-betegség-vírus avirulens Marek-betegség-vírus. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol az avirulens törzs a Rispens CVI988.. Az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a folyamatos sejtvonal képes a Marek-betegségvírustörzs növekedésének támogatására a vírus adaptálása nélkül. 11. Folyamatos sejtvonal sejtje vagy annak utódja, amely mentes emlõs- vagy madárvírustól, és amely képes olyan sejtasszociált alfaherpeszvírus növekedésének támogatására, amely herpeszvírus rekombináns nukleinsavát tartalmazza, ahol a nukleinsav herpeszvírus glikoprotein ge gént vagy annak funkcionális fragmensét tartalmazza. 12. Sejtkészítmény, amely 11. igénypont szerinti sejtbõl vagy utódjából állítható elõ. 13. A 11. igénypont szerinti sejt és/vagy 12. igénypont szerinti készítmény alkalmazása betegség elleni védettség gerincesben történõ indukálására képes vakcina elõállítására. 14. A 13. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gerinces madár.. A 11. igénypont szerinti sejt alkalmazása hipervirulens és/vagy nagyon virulens plusz, és/vagy nagyon virulens törzs, és/vagy virulens és/vagy avirulens Marek-betegség-vírustörzs létrehozására és/vagy fenntartására és/vagy izolálására. 16. A. igénypont szerinti alkalmazás, amely magában foglalja a sejt vírussal történõ tenyésztését is geneticin jelenlétében A. vagy 16. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a Marek-betegség-vírustörzs Marek-betegség-vírus 1¹es szerotípus. 18. A 17. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a Marek-betegség-vírustörzs EU1 vagy RB1B vagy 84Ap80C vagy CVI A 18. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a Marek-betegség-vírustörzs természetes vagy genetikailag módosított törzs.. A 11. igénypont szerinti sejt alkalmazása Marek-betegség-vírus diagnosztikai antigénjének elõállítására. 21. Eljárás Marek-betegség-vírustörzs létrehozására és/vagy izolálására és/vagy fenntartására, amely eljárás magában foglalja 11. igénypont szerinti sejt megfertõzését és a sejt tenyésztését olyan körülmények között, amelyek alkalmasak a sejt szaporítására és Marek-betegség-vírus létrehozására, fenntartására és izolálására. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, amely magában foglalja a sejt vírussal történõ tenyésztését geneticin jelenlétében. 23. A 21. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, ahol a Marek-betegség-vírustörzs Marek-betegség-vírus 1¹es szerotípus, 2¹es szerotípus vagy 3¹as szerotípus. 24. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a Marek-betegség-vírustörzs az EU1 vagy RB1B vagy 84Ap80C vagy CVI A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a Marek-betegség-vírustörzs vakcinatörzs. 26. Eljárás Marek-betegség-vírus diagnosztikai antigénjének az elõállítására, amely eljárás magában foglalja 11. igénypont szerinti sejt biztosítását és abból az antigén izolálását. 27. Eljárás betegség elleni védettség gerincesben történõ kiváltására képes vakcina elõállítására, amely eljárás magában foglalja 11. igénypont szerinti sejt tenyésztését és abból sejtek vagy vírusartalmú komponensek begyûjtését. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, ahol a gerinces madár. 29. Vakcina, amely képes betegség elleni védettség gerincesben történõ indukálásra, ahol a vakcina 11. igénypont szerinti tenyésztett sejt begyûjtött sejtkomponenseit tartalmazza.. A 29. igénypont szerinti eljárás, ahol a gerinces madár. 31. A 29. igénypont szerinti vakcina alkalmazása herpeszvírus által indukált betegség megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 32. A 31. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a betegség Marek-betegség-vírussal kapcsolatos betegség. 33. A 31. vagy 32. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gerinces madár. 12

13 HU T2 Int. Cl.: A61K 39/2 13

14 HU T2 Int. Cl.: A61K 39/2 14

15 HU T2 Int. Cl.: A61K 39/2

16 HU T2 Int. Cl.: A61K 39/2 16

17 HU T2 Int. Cl.: A61K 39/2 17