A mitokondrium szerepe a neurodegenerációban és a neuroprotekcióban

Átírás

1 A mitokondrium szerepe a neurodegenerációban és a neuroprotekcióban Doktori értekezés Gál Anikó Semmelweis Egyetem Szentágothai János Doktori Iskola Témavezetők: Prof. Dr. Nagy Zoltán egyetemi tanár Dr. med. habil. Molnár Mária Judit, tud. főmunkatárs Hivatalos bírálók: Dr. Jávorszky Eszter PhD., tud. munkatárs Dr. Boczán Judit PhD., egyetemi adjunktus Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Sasvári Mária, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Báthori György Ph.D., tud. főmunkatárs Dr. Farkas Viktor Ph.D., tud. főmunkatárs Budapest 2009

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. Rövidítések jegyzéke 5 2. Bevezetés A mitokondriumok szerepe egyes betegségek kialakulásában Mitokondriális betegségek általános jellemzői, pervalenciája mtdns hez kapcsolt betegségek mtdns trns-asszociált betegségek mtdns rrns-asszociált betegségek mtdns protein kódoló génekhez kapcsolt betegségek Nukleáris genom mutációkhoz kapcsolt betegségek Neurodegenerativ kórképek másodlagos mitokondriális rendellenességekkel A mitokondrium szerepe a prpgramozott sejthalálban A mitokondrium szerepe az agyi ischaemiás folyamatokban Az agyi ischaemia kezelésének lehetőségei Az agyi plaszticitás Célkitűzések Anyagok és mószerek Mitokondriális DNS mutációk vizsgálata során alkalmazott módszerek Vizsgált betegek DNS izolálás PCR-RFLP vizsgálat mtdns trns Lys gén bidirekcionális szekvenálása In vitro kísérletekben használt metodikák PC-12 sejttenyészet Vírus konstruktok és transzdukció In vitro hypoxia és re-oxigenizáció X-gal festés Annexin V- propidium jodid kettős festés TMRE festés - Mitokondriális membránpotenciál vizsgálata RNS izolálás és reverz transzkripció

3 A génexpresszió mérése real-time PCR-rel Western blot analízis Statisztikai analízis Eredmények A mitokondriális trns Lys gén polimorfizmusok jelentősége a hazai mitokondriális betegek differenciáldiagnosztikájában Az irodalomból ismert bizonyítottan patogén mutációk mtdns A8344G szubsztitúció Az általunk patogénnek feltételezett, az irodalomban eddig még le nem írt nukleotid szubsztitúciók mtdns A8332G szubsztitúció mtdns T8310G és T8311A szubsztitúciók Az irodalomból neurodegeneratív betegségekre hajlamosító szuszceptabilitási SNP mtdns A8347C szubsztitúció Az irodalomból ismert polimorfizmusok jelenléte bázispár deléció (del ) mtdns G8251A szubsztitúció mtdns G8269A szubsztitúció mtdns C8270T szubsztitúció mtdns G8292A szubsztitúció Egészséges kontroll egyének trns Lys génjének vizsgálata trns Lys és határoló régióinak vizsgálatakor talált eltérések összefoglalása Az mtdns trns Leu(UUR) gén A3243G mutáció genetikai epidemiológiai vizsgálata Adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL anti-apoptózis génterápia in vitro PC12 hypoxiás modellben A kísérleti körülmények optimalizálása Adenovírus alapú vektor bevitel hatékonyságának vizsgálata.53 3

4 Bcl-2 és Bcl-XL protein expresszió változása a transzdukciót követően Hypoxia/re-oxigenizáció hatása a sejtpusztulásra A hatékony víruskoncentráció mérése Anti-apoptotikus géntranszfer eredményezte cytoprotekció Az argon gáz hypoxia által okozott sejtpusztulás elleni védelem a Bcl-2 és a Bcl-XL gének által A mitokondriális membránkárosodás elleni védelem az anti-apoptózis gének által Bcl-2 fehérje család pro- és anti-apopototikus tagjainak expresszió változása a transzdukciót követően Agyi plaszticitásban szerepet játszó gének és proteinek expesszió változása A GAP-43 fehérje expresszió változása A nestin expresszió változása A synapsin-1 expresszió változása A c-fos expresszió változása Megbeszélés A mitokondriális trns Lys gén és határoló régióiban talált eltérések jelentősége Az mtdns A3243G mutáció genetikai epidemiológiai vizsgálata Az apoptózist gátló génterápia in vitro PC12 hypoxiás modelljében talált eredmények értelmezése Következtetések Összefoglalás Summary Irodalomjegyzék Saját publikációk jegyzéke Köszönetnyilvánítás

5 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AIF apoptosis inducing factor ALS amyotrophias lateralsclerosis ANT1 adenin nuckleotid transzlokátor APAF1 - apoptotic protease activating factor 1 ATP adenozin trifoszfát ATP7A - ATPase, Cu(2+)-transporting, alpha polypeptide AV annexin V BCS1L S. Cerevisiae, homolog-like BDNF - brain-derived neurotrophic factor bfgf basic fibroblast growth factor CaBP Ca - binding protein CBF cerebral blood flow CGRP - calcitonin gene-related peptide CO - citokróm oxidáz COX citokróm oxidáz CPEO progresszív opthalamoplegia externa CRK2 - Cdc2-related protein kinase DCAR D-karnitin DCMA dilatatív cardiomyopathia és ataxia DDP1 - deafness/dystonia peptide 1 dgk deoxi-guanozin kináz DGUOK - deoxyguanosine kinase DISC death inducing signal complex DJ1 - Parkinson's disease protein DM diabetes mellitus DMEM - Dulbecco s modified Eagle s medium DNAJC19 - translocase of inner mitochondrial membrane 14 ecsod - Extracellular superoxide dismutase EEG - electroencephalogram EMG - electromyography 5

6 ENG - electroneurography enos endotheliális nitrogén oxid szintáz FXN - frataxin GAP-43 growth associated protein 43 GLUT1 glükóz transzporter-1 HADHA - hydroxyacyl-coa dehydrogenase/3-ketoacyl-coa thiolase/enoyl-coa hydratase, alpha subunit HIF - hypoxia inducable factor HMC-CoA-lyase - 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase HMGCS2-3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 2 HSPs hősokk proteinek HSV1 - hipervariábilis régió 1 IL interleukin IOSCA - infantile-onset spinocerebellar ataxia KGDHC α-ketoglutarát-dehidrogenáz KIF5A - kinesin family member 5A KSS - Kearns-Sayre szindróma LHON Leber féle optikus neiropathia LRPPRC - Leucine-Rich PPR Motif-Containing Protein MAP2 - microtubule-associated protein 2 MCAO middle cerebral artery occlusion MELAS mitokondriális enchephalopathia laktacidózis stroke szerű tünetekkel MERRF - Myoclonusos Epilepsia Ragged-Red rostokkal MI myocardiális infarctus MIDD - maternally inherited diabetes and deafness MIRAS mitokondriális recesszív ataxia szindróma MNF2 - mitofuzin MNGIE - mitokondriális neurogastrointestinalis encephalopathia szindróma mtdns mitokondriális DNS NAD Nikotinamid adenin dinkleotid NARP Neuropathia Ataxia és Retinitis Pigmentosa ND NADH dehidrogenáz 6

7 ndns nukleáris DNS NDUFS - NADH-ubiquitin oxidoreduktáz Fe-S protein NDUFV - NADH-ubiquitin oxidoreduktáz flavoprotein NFkB - nuclear-factor-kappa-b NGF neural growth factor NMDA - N-metil-D-aszparaginsav OPA - opticus athrophia OXPHOS oxidatív foszforiláció PCR polimeráz láncreakció PDHC piruvát dehidrogenáz- komplex PFU plakkformáló egység PI propidium jodid PINK1 - PTEN-induced putative kinase 1 PINK1 - PTEN-induced kinase 1 POLG. polimeráz- γ PVDF - polyvinil-difluorid RFLP restrikciós fragmenthossz polimorfizmus RNR1 riboszómális RNS1 RNR2 riboszómális RNS2 ROS reaktív oxigén species rtpa szöveti plazminogén aktivátor SAG apoptózis szenzitív gén SAH subarachnoidális hemorrhagia SANDO - sensory ataxic neuropathy, dysarthria, and ophthalmoparesis SCO1 - S. Cerevisiae, homolog OF, Citokróm oxidáz deficiencia 1 SCO2 - S. Cerevisiae, homolog OF, Citokróm oxidáz deficiencia 2 SDH A-C szukcinát-dehidrogenáz komplex SDS - sodium dodecyl sulfate SMA spinalis muscularis atrophia SNP single nukleoid polimorfizmus SOD1 Cu/Zn szuperoxid diszmutáz SPG7 - spasticus paraplegia 7 7

8 SURF1 - Surfeit 1 TGF-β - transforming growth factor-beta TIA transient ischaemic attack TIMM8A - translocase of inner mitochondrial membrane 8 TK timidin kináz TMRE - tetramethyl-rhodamine-ethylester TP timidin foszforiláz trns transzfer RNS VDAC - voltage-dependent anion channel VGEF - vascular endothelial growth factor WFS1 - Wolfram szindróma 1 8

9 2. BEVEZETÉS A mitokondrium a sejt energiaközpontja, minden eukarióta sejtben megtalálható. Az ősi bíborbaktérium endocitózisával keletkezett, sejtenkénti száma a sejtek energiaszükségletétől függ. A mitokondrium önálló DNS-sel rendelkezik, amely a prokariótákra jellegzetes cirkuláris molekula. Az emberi sejtben az mtdns az egyetlen extrakromoszómális DNS, amely mind a nukleáris, mind a mitokondriális genom szabályozása alatt áll. A mitokondriumokban a duplaszálú DNS több kópiában (2-10) van jelen (Dimauro és Davidzon, 2005). A humán mtdns a nukleáris genomtól eltérően csaknem kizárólag anyai öröklődést mutat. Egér fajok keresztezésekor a paternális átadódás igen alacsony szintjét mutatták ki, ami azonban fajon belül nem jelent meg, és a következő generációnak nem adódott tovább (Gyllensten és mtsai, 1991). Humán megfigyelések is találtak paternális öröklődést, de ezek száma elenyésző (Schwartz és Vissing, 2003). A mitokondriális genom mérete bp, amely meglehetősen kicsi a 3,3 milliárd bázispárnyi nukleáris genomhoz képest. Az mtdns 22 trns-t, 2 rrns-t és 13 polipeptidet kódol, amelyek a légzési lánc egyes alegységei. A légzési lánc komplexeinek további alegységeit (54 polipeptid) és az mtdns fenntartásához szükséges fehérjéket az ndns kódolja, a citoplazmában lévő riboszómákon szintetizálódnak és onnan transzporter segítségével szállítódnak a mitokondriumba (Dimauro és Davidzon, 2005). A mitokondriális genom sok tekintetben eltér a magi DNS-től (2.1. táblázat). A humán mtdns-ben nincsenek intronok, így a kódoló DNS aránya rendkívül magas, míg az egyes gének között csak néhány rövid (néhány bázisból álló), nem kódoló régió és átfedő szekvenciák is találhatók. A mitokondriális genomban nincsenek hisztonok. Az átíródás során a kodon-használat a mitokondrium esetében eltér az élővilágban általánosan használt univerzális kodonétól. Jellemző továbbá a splicing és az exonukleáz-aktivitás hiánya is, így a hibajavító mechanizmus hiánya miatt a mtdns mutációs rátája a ndns-hez képest kb. 10-szeres, ezért a mtdns mutációi nagy számban felelnek az öröklődő betegségek kialakulásáért (Taylor és Turnbull, 2005). 9

10 A mitokondriumoknak a sejtek energiatermelése mellett fontos szerepe van a szteroid bioszintézisben, az ammónia detoxikálásban, a programozott sejthalálban, a ROS védelemben és az öregedésben (Shoubridge és Molnar, 2002). A mitokondrium működészavara kóros állapotokhoz vezethet, amelyek főként a nagy energia igényű szöveteket érintő neurológiai, endokriniológiai, kardiológai, szemészeti és belgyógyászati örökletes betegségeket eredményeznek Ezek mellett számos neurodegeneratív betegség, stroke, szívinfarktus és a rák kialakulásában játszik szerepet (Wei és Lee, 2002). A mitokondriumoknak fontos szerepe van mind a neurodegenerációban mind a neuroprotekcióban. A mitokondriális betegségek kialakulhatnak az mtdns (pl. MELAS, MERRF) és a nukleáris DNS károsodása következtében is (pl. Friedreichataxia, SPG7). Egyes neurodegeneratív betegségekben a mitokondrium károsodása másodlagos (pl. Huntington-kór, ALS). A neuroprotektív stratégiák sokszor a kóros mitokondrium működés egyes ismert láncszemét célozzák meg és annak funkcióját próbálják javítani (Beal, 2005) A mitokondriumok szerepe egyes betegségek kialakulásában A mitokondriális betegségek általános jellemzői, pervalenciája A mitokondriális betegségek klinikailag heterogén csoportot alkotnak. A kórfolyamat esetenként csak egy szervet érint, de sokszor multiszisztémás betegség formájában jelentkezik. Elsősorban a nagy energiaigényű szövetek, mint a központi idegrendszer, vázizmok, szívizom, az endokrin szervek, máj, vese és a szem érintettek. A klinikai tünetek specifikusak, de nagyon változatosak (DiMauro és Davidzon, 2005). A klinikai fenotípus hátterében leggyakrabban a mitokondriális légzési transzportlánc zavara áll. A mitokondriális betegség kialakulásához a mitokondriumok működését meghatározó maternálisan öröklődő mitokondriális DNS (mtdns), és nukleáris DNS (ndns) mutációi vezethetnek. A mitokondriális DNS mutációja lehet nukleotid-szubsztitúció, ami érinthet trns-t kódoló gént vagy stuktúr gént, valamint delécióval/duplikációval járó génátrendeződés (Shoubridge és Molnar, 2002). Estenként az mtdns depléciója okoz tüneteket. 10

11 A mitokondriális betegségek átlag prevalenciája mai ismereteink alapján 1: 5000-re becsülhető (Schaefer és mtsai, 2004). Egyes mitokondriális DNS mutációk kifejezetten gyakoriak, ezek közül kimagaslik az A3243G pontmutáció, amelynek előfordulási gyakorisága átlag felnőtt finn populációban elérheti a 16,3/ t (Majamaa és mtsai, 1998). Eddig közel 200 betegség hátterében azonosítottak mtdns mutációt, és folyamatosan nő azon kórképek száma, amelyek hátterében a nukleáris genom mitokondriumok működéséért felelős génjeinek hibái állnak ( Az mtdns hez kapcsolt betegségek A mitokondriális genomban az irodalomból eddig közel 500 patogén mutáció ismert, amelyből 321 pontmutáció (2.1. táblázat) ( A betegség hátterében álló mutációk érinthetik mind a mitokondriális RNS géneket (trns és rrns), mind a protein kódoló géneket. Mutáció lokalizációja RNS Protein kódoló gének Mutációk száma 2.1. táblázat: Patogén pontmutációk megoszlása a mitokondriális genomban ( Előfordulási gyakorisága rrns 12 4% trns % NAD 86 27% ATP 16 5% Citokróm 70 22% Az mtdns trns-asszociált betegségek Bár a trns gének csupán az mtdns 1/10-ét teszik ki, az ismert pontmutációk 42%-a mégis ebben a régióban lokalizálódik (2.1. táblázat) ( A trns gének így mutációs hot spotnak tekinthetőek. Gyakori trns-asszociált betegségek: myopathia, encephalomyopathia, cardiomyopathia, süketség, ophthalmoplegia externa, ataxia, myoclonus, demencia, depresszió, diabetes mellitus+süketség, terhelési intolerancia, myoglobinuria, Leigh szindróma, MELAS, MERRF, perifériás neuropathia, Parkinson-kór, vashiányos anaemia és diabetes mellitus. Ezek a betegségek mind a sejt energia-metabolizmusát érintik (Molnar, 2008). A mitokondriális trns mutációk az aminoaciláció zavarát okozhatják (aminosav trnshez való kötődése), ami a mitokondriumban zajló fehérjeszintézis hibás működését 11

12 eredményezheti. A mutáción átesett trns-ek mrns-hez való kötődésének hatékonysága csökkenhet, illetve a molekula konformációja megváltozhat, stabilitása csökkenhet és fragilissá válhat. Ha a mutáció evolúciósan konzervált, másodlagos, harmadlagos kötésben részt vevő nukleotidot érint. A mutáció fenotípusban való megjelenésében fontos szerepe van a mutáns trns-ek heteroplazmia-arányának. Ha a trns-ek normális funkcionális szintje 15-50%-ra csökken patológiás fenotípust kapunk (Levinger és mtsai, 2004). trns gének Patogén mutációk száma Előfordulási gyakorisága Leucin 34 24,81% Lizin 14 10,22% Izoleucin 13 9,49% Szerin 12 8,76% Fenilalanin 7 5,11% Treonin 7 5,11% Glutaminsav 6 4,38% Glicin 5 3,65% Triptofán 5 3,65% Valin 5 3,65% Aszpargin 4 2,92% Cisztein 4 2,92% Glutamin 4 2,92% Alanin 4 2,92% Hisztidin 3 2,19% Metionin 3 2,19% Tirozin 2 1,46% Arginin 2 1,46% Prolin 2 1,46% Aszparginsav 1 0,73% 2.2. táblázat: A különböző trns-ekben előforduló mutációk gyakorisága ( A trns mutációk leggyakrabban a trns Leu, trns Lys, trns Ile és a trns Ser géneket érintik (2.2. táblázat). A trns Leu gén több mint 30 patogén mutációval ismert etiológiai hot spotnak tekinthető (Moraes és mtsai, 1993). A második leggyakrabban mutációt szenvedő trns a lizin eddig 14 leírt mutációval ( A leggyakoribb mtdns szubsztitúció a trns Leu gén A3243G mutációja, amely leggyakrabban MELAS szindrómát (mitokondriális enchephalomyopathia laktát acidózis stroke szerű tünetekkel) okoz (Goto és mtsai, 1990). Ez a mutáció számos 12

13 klinikai tünetet eredményezhet, mint pl. alacsonynövés, sensoneurális hallásveszés, hypertrophiás cardiomyopathia, ataxia, ophthamoplegia externa, epilepsia és diabetes mellitus (Gál és mtsai, 2008; Finsterer, 2007). A mutáció prevalenciáját különböző beteg-beválasztási kritériumok alapján világszerte számos tanulmányban vizsgálták. A legtöbb vizsgálat diabeteses betegeken történt. Sensoneurális hallásvesztés, fiatalkori ischaemiás stroke szindróma, myopathia és ataxia hátterében a mutáció előfordulását eddig hat tanulmány vizsgálta, amelyekben a mutáció frekvenciája 0,07% és 6,5% között volt (Klemm és mtsai, 2001; Majamaa és mtsai, 1998; Salles és mtsai, 2007; Léveque és mtsai, 2007; Majammaa és mtsai, 1997; Sternberg és mtsai, 2001). A legnagyobb mutációs frekvenciát a finn népesség körében találták, ahol a vizsgált területre vonatkoztatott prevalencia 16,3: (Majamaa és mtsai, 1998). A trns Lys génben eddig 14 patogén mutációt azonosítottak, leggyakrabban az A8344G mutációt írták le, amely a leginkább a MERRF (Myoclonus Epilepsia Ragged Red rostokkal) szindróma hátterében ismert, de ezen kívül számos fenotípust is okozhat (Molnár és mtsai, 2009; Wiedemann és mtsai, 2008; Mancuso és mtsai, 2008) Az mtdns rrns-asszociált betegségek A mitokondriális genomban két gén kódolja a riboszómális RNS-ket (RNR1-12S rrns és RNR2-16S rrns ). A 12S rrns-t kódoló génben az irodalomból 13 patogén mutáció ismert, amelyek legnagyobb számban aminoglukozidáz indukálta süketséget eredményeznek, de 1-2 szubsztitúció sensoneurális hallásvesztés és egyéb nagyothallás hátterében is ismert (Bindu és Reddy, 2008). A 16S rrns-t kódoló mt RNR2 génben talált 4 különböző nukleotid csere eltérő fenotípusokat eredményez, mint cardiomyopathia, diabetes mellitus, hyperthyreosis, Rett szindróma, MELAS, Alzheimer- és Parkinson kór (Cardaioli és mtsai, 1999; Hsieh és mtsai, 2001; Shoffner és mtsai, 1993). 13

14 Az mtdns protein kódoló génekhez kapcsolt betegségei A mitokondriális légzési transzportlánc felépítésében kb. 80 fehérje vesz rész. Ezek közül a mitokondriális genomban csak 13 kódoló gén található melyek a légzési transzportlánc egyes alegységeit kódolják (Molnár, 2008). Az mtdns protein kódoló génjeiben több, kb. 200 patogén mutáció ismert ( A legtöbb mutáció a NADH dehidrogenáz (ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6) és a citokróm-c oxidáz (CO1, CO2, CO3) különböző alegységeit kódoló génekben található. Emellett kisebb számban találhatóak mutációk a citokróm oxidáz-b és az ATP-áz 6-os illeltve a 8-as alegységeit kódoló génekben is. A protein kódoló gének mutációi leggyakrabban a Leber féle optikus neuropathia (LHON), Leigh szindróma, prosztata rák, terhelési intolerancia, NARP, MELAS szindróma hátterében állhatnak (Wong, 2007). Néhány nukleotid szubsztitúciót motoneuron betegség, ataxia, Kearns-Sayre szindróma, vashiányos anaemia hátterében is leírtak (Wong, 2007; Bykhovskaya és mtsai, 2007) Nukleáris genom mutációkhoz kapcsolt mitokondriális betegségek A mitokondrium működését döntően a nukleáris genom szabályozza, hiszen az mtdnsben mindössze 13 protein kódoló gén található. A mitokondriális funkciót befolyásoló gének az alábbiak szerint csoportosíthatók: 1.) légzési transzportlánc alegységeit kódoló, 2.) az intergenomiális szignalizációban szerepet játszó, 3.) a mitokondriális dinamikát befolyásoló (hasadás és fúzió), 4.) a lipid milieu-ért felelős, valamint 5.) egyéb a mitokondrium működését befolyásoló fehérjéket kódoló gének (Molnár, 2008) (2.3. táblázat). 14

15 Légzési transzportlánc rendellenességei Intergenomiális szignál hibák Mitokondriális dinamika defektusai Komplex I betegségek Gyermekkori encephalopathia Klinikai fenotípus Encephalopathia, Cardiomyopathia Multiszisztémás komplex I deficiencia Letális neonatális komplex I deficiencia Leigh szindróma Leukodsytrophia, myoclonusos epilepsia Komplex II betegségek Leigh szindróma Öröklődő paraganglioma, pheochromocytoma Komplex III betegségek GRACILE szindróma Komplex IV betegségek Encephalomyopathia, renalis tubulopathia Infantilis cardioencephalomyopathia Hepatoketoacidotikus kóma Leigh szindróma Leigh szindróma - francia, kanadai típus Etilmakonsav encephalopathia CPEO, myopathia CPEO, myopathia, IOSCA CPEO, SANDO, ALPERS szindróma, MIRAS CPEO MNGIE SMA-szerű myopathia Hepatoencephalopathia Charcot Marie-Tooth II típus Herediter spasticus paraplegia Opticus atrophia NDUFS1 gén NDUFS2, NDUFV2 NDUFS4 NDUFS6 NDUFS3, NDUFS4 NDUFS7, NDUFS8 NDUFV1 SDHA SDHB, SDHC BCS1L COX10 COX15, SCO2 SCO1 SURF1 LRPPRC ETHE-1 ANT1 Twinkle POLG1 POLG2 TP TK dgk MNF2 KIF5A OPA1, OPA2 Lipid milieu zavarok Barth szindróma Tafazzin Egyéb ndns által determinált mitokondriális betegségek Retardált fejlődés Dilatatív cardiomyopathia és ataxia (DCMA) Epilepsia, episodikus ataxia, encephalopathia Encephalopathia, hepatomegalia Fumarate hydrolase, pyruvate carboxylase DNAJC19 Pyruvate dehydrogenase HMC-CoA-lyase Epilepsia, encephalopathia Friedreich ataxia Hepatopathia, hypotonia Herediter spasticus paraplegia Hypocarnitinaemia, hypolysinaemia Menkes betegség, occipitális-szarv szindróma Mohr-Tranebjaerg szindróma Myopathia, retinopathia, hepatomegalia HMGCS2 FXN DGUOK SPG7 DCAR ATP7A DDP1/TIMM8A HADHA Wolfram szindróma WFS1 Parkinson kór PINK1 2.3.táblázat: ndns mutációk okozta betegségek (Molnár, 2008) 15

16 Neurodegenerativ kórképek másodlagos mitokondriális rendellenességekkel A mitokondriumok központi szerepet játszanak a sok esetben multifaktoriális poligénes etiológiájú neurodegeneratív betegségek kialakulásában is, mint pl. Alzheimer-, Parkinson-, Huntington kór, valamint az amyotrophias lateral sclerosis. Ezen betegségekben jól ismertek a mitokondriumok morfológiai, biokémiai és molekuláris eltérései (Petrozzi és mtsai., 2007). Valamennyi fenti kórképben a mitokondriumok diszfunkciójának következtében csökken az ATP termelés, a Ca 2+ tárolás zavart szenved, a reaktív oxidatív szabadgyökök (ROS) mennyisége megemelkedik (Beal, 2005). A megnövekedett ROS mennyiség hatására a fokozott lipid-peroxidáció miatt a membrán sérül, illetve az mtdns-ben másodlagos hibák halmozódnak fel (szekunder de novo mutációk). A mitokondriális genom mutációinak következtében felgyorsul az öregedés, csökken az energiatermelés, amely tovább emeli a ROS termelést (Petrozzi és mtsai., 2007). A központi idegrendszer különösen érzékeny az oxidatív szabadgyökök károsító hatásával szemben, ugyanis a könnyen peroxidálható zsírsavak aránya rendkívül magas, fokozott O 2 fogyasztás, valamint az antioxidáns enzimek viszonylag alacsony szintje jellemzi (Nunomura és mtsai., 2006). A túlzott oxidatív stressz és a magas Ca 2+ szint a mitokondrium permeábilis pórusainak nyitását eredményezi, így segíti a citokróm-c kiáramlását, amely a kaszpáz-függő apoptózist indukálja (Stavrovskaya és Kristal, 2005). Az mtdns-ben a szomatikus mutációk mellett számos olyan gyakori polimorfizmus ismert, amely a mitokondriális funkciót csak minimális mértékben változtatja meg. Ezen polimorfizmusok az egyes haplocsoportokat határozzák meg (Petrozzi és mtsai., 2007), amelyek hajlamosíthatnak neurodegeneratív betegségek kialakulására is (van der Walt és mtsai., 2004) (2.1. ábra). 16

17 2.1. ábra: Neurodegeneratív betegségek és a mitokondrium kapcsolata - M. Flint Beal nyomán (Beal, 2005) Az Alzheimer-kór egy progresszív, neurodegenerítv betegség, melyben irreverzibilis neuronpusztulás következik be a kortexben és a hippocampusban, amelynek hatására a kognitív teljesítmény romlik, személyiség és viselkedési zavarok lépnek fel. Az agyban neurofibrilláris degeneráció és szenilis plakkok mutathatók ki. A neuronokban, kórosan foszforilált tau-protein filamentumokból álló aggregátumok találhatók. A szenilis plakkok főleg a hippokampuszban és az agykéregben megfigyelhető, perivaszkuláris elhelyezkedésű, béta-amiloid proteinből álló gömbök. Az Alzheimer kórnak csupán 2-3%-át teszi ki az öröklődő, familiáris forma. A mutációk leggyakrabban az amiloid 17

18 prekurzor proteint és a presenilint kódoló géneket érintik. Etiológiájában az oxidatív stressznek nagy jelentősége van. A Krebs ciklus enzimei közül, a piruvát-dehidrogenázkomplex (PDHC), az α-ketoglutarát-dehidrogenáz (KGDHC) és az izocitrátdehidrogenáz aktivitása csökkent. Emellett a mitokondriális elektron transzportlánc tagjai közül a komplex IV és az F 1 F 0 -ATPáz aktivitásának csökkenését is igazolták, amelynek következtében az ATP termelés csökken, illetve a ROS szint emelkedik. Mivel a citokróm oxidáz és a KGDHC a β-amiloid inhibitorai, ezen enzimek aktivitásának csökkenésével az Aβ protein expressziója nő. Az Aβ serkenti az mptp (mitokondriális permeábilitási tranzíciós pórus) Ca-indukálta nyitását, a citokóm-c kiáramlást és a kaszpáz aktivációt (Morais Cardoso és mtsai, 2002). A mitokondriális aktivitás csökkenés végsősoron a ROS felszaporodásához, így neurodegenerációhoz vezethet (Cecchi és mtsai, 2006). A Parkinson-kórban a dopaminerg neuronok pusztulása jellemző, amely főként a substantia nigrát érinti. Patogenezisében többek között szerepe van az oxidatív stressznek, a mitokondriális diszfunkciónak és az excitotoxicitásnak. Idiopathiás Parkinson kórban a substantia nigrában a komplex I. aktivitása 25-30%-kal csökken, amely következtében a keletkezett ATP mennyisége csökken. Az öröklődő Parkinson kór hátterében számos mtdns-hez kapcsolt eltérés (nagy átrendeződések, pontmutációk, és mikrodeléciók) és ndns által kódolt gének mutációi (α-synuklein, Parkin, DJ-1, PINK1, CRK2, HTRA2) állhatnak. Ezen ndns által kódolt gének közvetlenül vagy közvetve a mitokondriumban hatnak, így mutációik mitokondriális diszfunkcióhoz vezetnek (Petrozzi és mtsai., 2007; Schapira, 2009). Az ALS-ben a neuronok elsősorban a motoros kortexben és a gerincvelő mellsőszarvában pusztulnak el. Az ALS 90%-ban sporadikus, míg a familiáris, örökletes formák az esetek 10%-át teszik ki, amelyek kb. 20%-ban a SOD1 (Cu/Zn szuperoxid diszmutáz) mutáció áll. Az ALS-ben a Ca 2+ ionok akkumlálódnak a mitokondriumokban, amely hatására a reaktív oxigén gyökök mennyisége a motoneuronokban emelkedik (Mattiazzi és mtsai, 2002). Huntington-kórban a mutáns huntingtin fehérje a neuronális mitokondriumok külső membránjához kötődik, ami által a mitokondrium Ca 2+ felvétel csökkent. Emellett a mutáns huntingtin kötődik az apoptózisban szerepet játszó p53 fehérjéhez is, amelynek következtében a p53 aktiválódik és a mitokondriális membránpotenciál csökken 18

19 (Brustovetsky és mtsa, 2003). A Huntington-kórban szenvedő betegekben a komplex II/III aktivitásának csökkenése jellemző (Gárdián és Vécsei, 2004; Browne és Beal, 2006). Összességében elmondható, hogy a neurodegeneratív betegségek kialakulásában a különböző egymásra épülő hatások ( downstreem effektusok) következtében a mitokondriumokban megváltozik a Ca 2+ homeosztázis és fokozódik a káros oxidatív szabadgyökök felszaporodása. Ezek a tényezők együttesen járulnak hozzá a mitokondrium függő apoptózis aktivációjához A mitokondriumok szerepe a programozott sejthalálban A programozott sejthalál a szöveti homeosztázis fenntartásának nélkülözhetetlen folyamata. Az apoptózis elengedhetetlen az egyedfejlődés során a feleslegessé vált szövetek, szervek eltávolításában (pl.: ebihalak farkának, illetve az emlősök előveséjének visszafejlődésében) és az új struktúrák kialakításában (pl.: ujjak keletkezésénél a közöttük levő szövetek felszívódásában) (Raff, 1998; Putcha és Johnson, 2004). Az apoptózis mechanizmusainak hibás működése, szabályozásának zavara kórós következményekkel járhat (pl.: neurodegeneratív kórképek, daganatok, és immunológiai eredetű megbetegedések) (Hengartner, 2000). Az apoptózis indukciója, vagy gátlása az előbbiek miatt terápiás hatású lehet. Az apoptózisra erősen konzervált mechanizmusok jellemzőek, amely legfontosabb elemei faji, és szöveti különbségek ellenére megegyeznek. Az apoptózis mechanizmusában két fő útvonalat különíthetünk el, a halálreceptor mediált és a mitokondriális folyamatokat. A halálreceptor útvonal jellemzője, hogy a halálligand specifikus receptorához kapcsolódva indítja el a sejt apoptotikus programját. Így egy másik sejt által termelt ligand is adhat parancsot arra, hogy az adott sejt pusztítsa el önmagát (Ashkenazi, 2008). A halálreceptorok mellett egy fehérje komplexet találunk, a DISC-et (Death Inducing Signal Complex). Az itt aktiválódott kaszpáz-8 aktiválhatja a kaszpáz-3-at. A kaszpáz-8 a Bid hasításán keresztül a mitokondriális membrán depolarizációjában és a pórusképzésben is szerepet játszhat (Ashkenazi, 2008; Budihardjo és mtsai, 1999). 19

20 A mitokondriális útvonal jellemzője, hogy az apoptózis a mitokondrium membrán depolarizációja és az ezt követő citokróm-c kiáramlás játsza beindításában a kulcsszerepet (Finkel, 2001). Az apoptózis folyamata során a mitokondrium szerkezete megváltozik, membránja az apoptózis korai fázisában depolarizálódik, és permeábilissá válik (Kroemer, 2003; Brenner és Kroemer, 2000). A mitokondrium olyan fehérjéket tartalmaz, amelyek a citoplazmába jutva elindítói lehetnek az apoptózisnak pl.: prokaszpázok, apoptózis indukáló faktor (AIF), citokróm-c, adenilát kináz, DIABLO/SMAC (kaszpáz koaktivátorok), omi, és hősokk fehérjék (Hsp10, Hsp60). (Bernardi és mtsai, 1999; Twiddy és mtsai, 2004). Ha a mitokondriumot apoptotikus inger éri (membránpotenciál csökkenés, ROS stb.) citokróm-c jut ki a mitokondriumból. A citokróm-c kiáramlásakor ATP jelenlétében az APAF-1-hez és a prokaszpáz-9-hez kötődve létrehozza az apoptoszómát. Ez lehetővé teszi az aktív kaszpáz-9 létrejöttét, ami további effektor kaszpázok aktiválódását eredményezi, így a fő effektor kaszpázét, a kaszpáz-3-ét is (Cain, 2003). A citokróm-c, a légzési transzportlánc tagja, a mitokondrium belső membránjában helyezkedik el. Az apoptózis során bekövetkező citokróm-c kiáramlás a mitokondrium létfontosságú működését befolyásolja, energiatermelő funkcióját gátolhatja, amely a mitokondrium károsodásához vezethet. A mitokondrium károsodása nekezen mutatható ki, de méretében, denzitásában, és a sejten belüli lokalizációjában az apoptózis folyamata során különbségek figyelhetőek meg (Finkel, 2001). Nyugalmi állapotban a mitokondriumok a sejtben elszórtan helyezkednek el, a sejtben indukált apoptózis során a mitokondriumok a sejtmag köré rendeződnek. A mozgás kinezin-közvetített transzporttal megy végbe. Az apoptózis korai jelenségei közé tartozik a mitokondriumok méretének csökkenése, és a mátrixdenzitás növekedése (Finkel és mtsai, 2001). A mitokondrium apoptotikus működésének szabályozásában szerepet játszik a Bcl-2 fehérje család. A családba tartozó fehérjék két nagy csoportba sorolhatók, egyes tagok anti-apoptotikus, míg mások pro-apoptotikus hatással bírnak. A Bcl-2 fehérjét B-sejtes follikuláris lymphomákban fedezték fel (Bcl.: B cell lymphoma). A Bcl-2 fehérje család valamennyi tagjára jellemző, hogy tartalmazza a Bcl-2 homológ fehérjedoménjének (BH1-BH4) valamelyikét (Kuwana és Newmeyer, 2003; Hengartner, 2000). A Bcl-2 család anti-apoptotikus tagjai, mint a Bcl-2, Bcl-X L, Bcl -w, MCL-1, A1, CED-9, E1B19k, BHRF1, BNIP3L legalább három BH doménnel rendelkeznek. A pro- 20

21 apoptotikus tagok közül viszont a Bad, a Bik, a Bid, csak a BH3 domént tartalmazza. Mutációs vizsgálatok kiemelik a BH3 domén sejthalál indukciójában betöltött fontos szerepét (Gross és mtsai, 1999). A Bcl-2 család tagjai közül több (pl.: Bcl-2, Bcl-X L ) a különböző sejtorganellumok (mitokondrium, endoplazmatikus retikulum, sejtmag) membránjában helyezkedik el, illetve vannak olyanok, amelyek a citoplazmában találhatók és csak valamilyen jel hatására vándorolnak az organellumok (általában a mitokondrium) külső membránjába (pl.: Bax, Bid) (Sorenson, 2004). A pro- és antiapoptotikus Bcl-2-fehérjék aránya szabályozza a mitokondrium membrán permeábilitását, a citokróm-c kiáramlását. A Bcl-2 család tagjai egymással homo- és heterodimereket alkotnak. A sejtek sorsa (túlélés vagy sejthalál) a képződött homo- és heterodimerek arányától függ (Green és Reed, 1998). A Bax-Bax homodimer túlsúlya apoptózishoz vezet, amelynek képződése és membránba beépülése gátolható a Bax-Bcl- 2 fehérje heterodimerének kialakulásával. A Bax fehérje mitokondriumba szállítódása dimerizációjának vagy oligomerizációjának köszönhető: keresztkötő ágensek és Bid hatására a Bax dimereket alkot, miközben a konformációja megváltozik (Hengartner, 2000). A Bax és a tbid lipidekkel is kapcsolatba léphet olyan lipid-, vagy lipid-fehérje pórusokat hozva létre, amelyek elég nagyok ahhoz, hogy az intermembrán térből a fehérjéket a citoplazmába engedjék (Sorenson, 2004) A mitokondrium szerepe az agyi ischaemiás folyamatokban Az agyban a leggyakrabban kialakult károsodás ischaemiás / hypoxiás jellegű, ami elsősorban az idegsejtek pusztulását okozza. Minden terápiás próbálkozás végső célja az idegsejt károsodás mértékének, az agyi lézió volumenének csökkentése, a kiesési tünetek súlyosságának mérséklése, a túlélés javítása. A neuronális apoptózis nemcsak az egyedfejlődés során jelentős, hanem különböző sejtpusztulással jellemzett állapotokban is fontos tényező. A neuronokban a sejtpusztulás apoptózis, nekrózis vagy a kettő kombinációja révén alakul ki (Niizuma és mtsai, 2009; Mattson és mtsai, 2001). A leggyakoribb ischaemiás mechanizmus az egy arteria elzáródása következtében kialakuló szövetpusztulás. A szövetpusztulás az alkotó sejtelemeket egyaránt érinti, így az agyi mikroér endotheliumban, a neuronokban, különböző glia elemekben mind a nekrózis, mind az apoptózis kimutatható. Az agyi infarktus centrumában a szövetelhalás nekrotikus jellegű, amely már korán kialakul, míg a marginalis zónában, a penumbra 21

22 területén az elsősorban apoptózis jellegű neuronpusztulás később következik be. Az agyi infarktus tehát, a különböző kóros sejtbiológiai események kaszkád-szerű, egymásból következő eseményeinek időbeli és térbeli alakulása eredményeként jön létre (Broughton és mtsai, 2009). A sejtpusztulás mérséklésére irányuló kísérletek kivétel nélkül a penumbra megmentését célozzák. A penumbra nem egységes, az ischaemiát követően időben és térben több rétegét különíthetjük el (Sharp és mtsai, 2000). Az egyes rétegekben lezajló biokémiai változások sejtpusztuláshoz, vagy regenerációhoz vezetnek. A penumbra rétegeiben HSP-70, HIF, és fokozott FOS/IEGs expresszió jellemző. A penumbra és az ép agyszövet határán neurális plaszticitást szabályozó fehérjék (GAP43, MAP2) mutathatók ki. A penumbrában 4 órával az ischaemiát követően az apoptotikus sejtek száma a nekrotikus sejtekhez képest 9:1-hez, míg az ischaemia centrumában ez az arány 1:1-hez (Nagy és mtsai, 2002). Az ischaemiát követő apoptózisban főként a belső, mitokondriális útvonal jellemző, de a külső, halálreceptor útvonal szerepe is ismert (Akhtar és mtsai, 2004; Broughton és mtsai., 2009). Az ischemiás területen a Bax expressziója nő és a citoplazmából a mitokondriumokba transzlokálódik, míg a Bcl-2 és a Bcl-XL expressziója csökken, így e fehérjék nem tudják gátolni a pro-apoptotikus Bax transzlokációját (Matsushita és mtsai, 1998; Akhtar és mtsai, 2004; Love és mtsai, 2003). A külső, halálreceptor útvonalnál főként a Fas ligand kötődése a receptorához (Fas-R), amely a kaszpáz-8 és a Bid hasításán keresztül aktiválja a mitokondrium depolarizációt (Love és mtsai, 2003). A neurális apoptózis effektor folyamatában mind a kaszpáz függő, mind a kaszpáz független útvonal AIF - szerepe ismert (Ferrer és mtsai, 2003; Dubois-Dauphin és mtsai, 2001). A penumbra régióban zajló különböző biokémiai folyamatok befolyásolása lehetőséget jelent az anti-apoptotikus neuroprotektív terápia kidolgozására. 22

23 2.2. ábra: A külső apopototikus szignalizáció az agyi ischaemiát követően (Broughton és mtsai, 2009 után) 2.3. ábra: A belső apopototikus szignalizáció az agyi ischaemiát követően (Broughton és mtsai, 2009 után) Az agyi ischaemia kezelésének lehetőségei Az ischaemiás stroke kezelésének két lehetséges stratégiája a véráramlás javítása és az ischaemiás kaszkád közvetlen neuroprotektív befolyásolása. Az agyi ischaemia 23

24 kezelésére a rekombináns szöveti plazminogén-aktivátor (rtpa) három órán belüli alkalmazása bizonyult a leghatásosabbnak (Köhrmann és mtsai, 2007). A neuroproteiktív stratégiák támadáspontjuk alapján lehetnek: feszültségfüggő Ca 2+ - csatorna antagonisták, NMDA gátlók, excitatorikus aminosav -, szabadgyök antagonisták, nitrogén-oxid szintetáz gátlók, kaszpázgátlók, növekedési faktorok bfgf, szerotonin 1A receptor antagonisták, GABA-agonisták, gangliozidok. Ezek mellett egyéb neuroprotekciós probálkozások is ismertek, mint a hipotermia alkalmazása, ösztrogének, statinok, K + -csatorna blokkolók adása (Yuan, 2009). Korábban munkacsoportunk is vizsgált különféle neuroprotekív vegyületeket in vitro hypoxiás modellben (PC12 és primer agyi kapilláris endothel sejteken) valamint in vivo patkány MCAO és gerbil tranziens okklúziós modellben. Az általunk tesztelt molekulák: (-)-BPAP (Dénes és mtsai, 2006), (-)-deprenyl (Simon és mtsai, 2001; Simon és mtsai, 2005; Dénes és mtsai, 2006), Deprenyl-N-oxid (Szilágyi és mtsai, 2009), és talampanel (Dénes és mtsai, 2006) a vizsgált rendszerben hatásosnak bizonyultak a hypoxiás/ischaemiás történések következményeinek enyhítésére. Az agyi károsodások kezelésére különböző génterápiás próbálkozások is történtek. Az eddigi eljárások főként génhelyettesítést (gén replacement) alkalmaztak, amelyek során a génbevitel virális (pl.: retro-, adenovírus konstruktok) és plazmid vektorokkal történt (Chang és mtsai, 2007). Az apoptotikus nekrotikus kaszkád sok ponton támadható. Elméletileg az ebben szerepet játszó gének módósításával hatékony eredmény lenne elérhető az ischaemiás stroke szindrómák célzott kezelésében. Számos tanulmány említ génterápiás próbálkozásokat cerebrovascularis betegségekben is, bár ezek klinikai alkalmazása még várat magára. Az agyi ischaemiás állapotok génterápiás kezelésének a szűk terápiás ablak szab határt. Az agyi ischaemiák terápiájában a neuroprotekcióban szerepet játszó gének aktivációjának, és a korai folyamatokban aktiválódó gének gátlásának lehet jelentősége (Toyoda és mtsai, 2003). Az eddigi kísérleteket a kívánt kezelési cél és az alkalmazott terápiás géncsoportok szerint osztályozhatjuk (2.6. táblázat). A kezelési cél szerint a génterápia eddigi irányai: a) a subarachnoidális vérzés után a vasospasmus megelőzése, b) a kollaterális erek növekedésének serkentése, és c) az atheroscleroticus plakk stabilizációja, illetve a thrombosis és a restenosis gátlása (2.6. táblázat) (Yenari és mtsai, 2005). 24

25 Kezlési célpont SAH kollaterális keringés atheroscler osis agyi ischaemia Vektor Adenovírus Adenovírus Oligodeoxinukleotid Adenovírus Oligodeoxinukleotid Gén enos ecsod Antisense preproendothelin-1 Prepro-CGRP NF-kB Beviteli hely Cisterna magna Cisterna magna Cisterna magna Cisterna magna Cisterna magna Adenovírus bfgf Kamra HVJ-liposzóma komplex Hepatocyta növekedési faktor Cisterna magna Plazmid Anti-MCP1 Láb izomba Adenovírus Szöveti faktor útvonal gátló Carotis Adenovírus Hirudin Carotis Oligodeoxinukleotid Decoy of E2F Carotis Herpex simplex vírus Herpex simplex vírus Herpex simplex vírus Calbindin D28K Glukóz transzporter HSP72 Striatum Striatum Striatum Adenovírus IL1-ra Oldalkamra Adenovírus IL-10 Oldalkamra Adenovírus TGFβ1 Oldalkamra HVJ-liposzóma komplex Adeno associated virus Hepatocyta növekedési faktor bcl-2 Cisterna magna Hippocampus Adenovírus Cyclooxigenáz-1 Oldalkamra Adenovírus SAG Ischaemia helyére Irodalom Hirooka és mtsai, 2003 Yamaguchi és mtsai, 2004 Ohkuma és mtsai, 1999 Satoh és mtsai, 2002 Ono és mtsai, 1999 Ohara és mtsai, 2001 Shimamura és mtsai, 2004 Schepers és mtsai, 2006 Nishida és mtsai, 1999 Rade és mtsai, 1996 Kawauchi és mtsai, 2000 Yenari és mtsai, 2001 Lawrence és mtsai, 1996 Hoehn és mtsai, 2001 Yang és mtsai, 1997 Kumai és mtsai, 2003 Boche és mtsai, 2003 Shimamura és mtsai, 2004 Shimazaki és mtsai, 2000 Zoldhelyi és mtsai, 1996 Yang és mtsai, táblázat: Génterápiás próbálkozások az agyi ischaemia kivédésére 25

26 2.2. Az agyi plaszticitás Az idegrendszert ért sérülés után a neuronokban a kiesett funkciók helyreállítása felé irányuló folyamatok aktiválódnak. A regenerációs képesség nagymértékben függ a sérülés helyétől az idegrendszer különböző részei és neuron populációi eltérő módon reagálnak az őket ért sérülésekre és az életkortól. A regeneráció során a felnőtt idegrendszerben, az embrionális fejlődésben jól ismert fehérjéket kódoló gének újra aktiválódnak, így pl. a neuro-, axono- és szinaptogenesisben szerepet játszó proteinek (Gutiérrez és mtsai, 2009). Az ischaemiás károsodás után különböző differenciáló fehérjék (pl. NeuroD) és növekedési faktorok (bfgf, VGEF, BDNF), strukturális fehérjék (pl. nestin, MAP-2), axonogenesist indukáló (GAP-43, synapsyin-1, synaptophisin), valamint a sejtciklus szabályozásában résztvevő proteinek (p53, p53 response protein, cyclind, c-fos) aktivációjának szerepe ismert (Chopp és mtsai, 1999; Cramer és mtsai, 2000; Chae és mtsai, 2004). Így a neuroprotektív terápiák célja ezen proteinek expressziójának fokozása lehet. 26

27 3. CÉLKITŰZÉSEK Kutatásunk céljaként az alábbiakat tűztük ki: 1. Az egyes mtdns eltérések patogenetikai szerepének valamint a klinikai fenotípusra gyakorolt hatásának elemzése 2. Az együttesen előforduló mtdns eltérések szinergizmusának elemzése 3. A leggyakoribb mtdns mutáció, az A3243G nukleotid szubsztitúció genetikai epidemiológiai elemzése 4. Az antiapoptotikus Bcl-2 és Bcl-XL génekkel történő transzdukció kivédi-e a hypoxia által okozott sejtpusztulást a PC12 sejteken 5. Az anti-apoptotikus gének fokozott expressziója milyen hatással van az agyi plaszticiásban szerepet játszó GAP-43, nestin, synapsin-1 és c-fos expressziójára. 27

28 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Mitokondriális DNS mutációk vizsgálata során alkalmazott módszerek Vizsgált betegek Az mtdns trns Lys mutációkat elemző vizsgálatainkban 293 (180 nő és 113 férfi) beteg és 150 kontroll személy DNS mintáját elemeztük. A betegek átlagéletkora 39,4 év volt (nők: 40,2 év, ffi: 32,5 év). A trns Leu (UUR) A3243G szubsztitúcióját 631 (361 nő és 270 férfi) betegen vizsgáltuk. A betegek átlagéletkora 36,3 év volt (nők: 38,1 év, ffi: 34,4 év). A mintagyűjtést január és december között végeztük. A vizsgálatba Baranya-, Borsod-Abaúj-Zemplén-, Hajdú-Bihar-, Szabolcs-Szatmár-Bereg megye valamint Budapest ismeretlen etiológiájú ischaemiás stroke, ataxia, maternálisan öröklődő sensoneurialis hallásvesztés, myopathia, vagy hypotonia miatt genetikai vizsgálatra küldött betegeket vontuk be, akiknél a multiszisztémás tünetegyüttes, a családi anamnézis és egyes laboratóriumi értékek felvetették a mitokondriális betegség lehetőségét. A betegek és az egészséges kontroll személyek a vizsgálat előtt részletes felvilágosítás kaptak, amely alapján a genetikai vizsgálatba, a minták további kutatási célú megőrzésébe és az eredmények szakirodalmi megjelentetésébe beleegyeztek. A minták tárolása Európai Uniós követelményeknek megfelelően az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet Molekuláris Neurológiai Osztály, majd későbbiekben a Semmelweis Egyetem Neurológiai Klinika, Molekuláris Neurológiai Központ NEPSY bankjában történt. A vizsgálatokhoz az OPNI intézeti etikai bizottsága bocsátott ki engedélyt DNS izolálás Kísérleteink során a DNS-t vérből, illetve 50 beteg esetében posztmitotikus szövetekből (vázizomszövet, vizelet laphámsejt) izoláltuk Qiagen Blood (Qiagen) valamint Qiagen Tissue Kit segítségével a gyártó által megadott instrukciók szerint. A DNS koncentrációt UV spektrofotométer segítségével 260 nm abszorbanciánál mértük. A tisztasági fokot a 260 nm-es és a 280 nm-es abszorbancia értékek hányadosával határoztuk meg. 28

29 PCR-RFLP vizsgálat Az mtdns leggyakoribb mutációit PCR-RFLP módszerrel határoztuk meg, azaz a mitokondriális genom patogén mutációs hot spot régióit (MELAS: nt (MELAS), nt (MERRF), nt (NARP), nt (trns Lys )) PCR segítségével amplifikáltuk. A reakcióhoz a primereket (4.1. táblázat) 300 nmol/l végkoncentrációban használtuk, 100 nmol/l MgCl2-ot, és 1 unit Taq polimerázt (Immolase, Bioline GmbH, Németország) hozzáadva, a reakcióelegyet RNáz-mentes desztillált vízzel (RT-PCR grade water, AMBION) 50 µl végtérfogatra egészítettük ki. A PCR reakciók során a következő programot használtuk: kezdeti denaturáció 94 C-on 5 perc, 35 ciklus (denaturáció 94 C 30 másodperc, anelláció C 30 másodperc, szintézis 72 C 30 másodperc), majd a végső szintézis 72 C-on 7 perc. A PCR-terméket TAE pufferrel hígított 2%-os agaróz gélen futtattuk meg. A kapott terméket etídiumbromiddal vizualizáltuk és az így kapott band-ek nagyságát Quantity One Softwer (BIO-RAD) segítségével határoztuk meg. Primer Szekvencia Régió Termék- Anellációs nagyság hőmérséklet MERRF-Forward 5 GGTATACTACGGTCAATGCTCT3 MERRF-Reverz 5 TTTCACTGTAAAGAGGTGTGGG nt 213 bp 50 C MELAS-Forward 5 AGCGCCTTCCCCCGTAAATG3 MELAS-Reverz 5 AGAGGAATTGAACCTCTGAC nt 137 bp 55 C NARP-Forward 5 CCAACACCTCTTTACAGTGA3 NARP-Reverz 5 ACTATTTATACTAAAAGAGT nt bp 60 C trns Lys -Forward 5 GCAATTCCCGGACGTCTA3 trns Lys -Reverz 5 GCGAACAGATTTTCGTTCAT nt 432 bp 60 C 4.1. táblázat: A PCR során használt primerek adatai Az általunk vizsgált pontmutáció kimutatására a kapott PCR terméket 3 órán keresztül 37 C-on restrikciós endonukleázokkal (MELAS: HaeIII; MERRF: BanII; NARP: HpaII, AvaI) emésztettük (1unit/reakció). A restrikciós mintázatot 4%-os agaróz vagy 13%-os poliakrilamid gélen analizáltuk. A géleket etidium-bromiddal festettük, majd a kapott band-ek nagyságát a hasítatlan mintához viszonyítva Quantity One Software (BIO-RAD) segítségével határoztuk meg. 29

30 mtdns trns Lys gén bidirekcionális szekvenálása A szekvenálandó PCR termék tisztítását Sure Clean Plus kit (BIOLINE) segítségével végeztük el. A tisztított PCR-termékhez 1 unit 3.1. Big Dye Terminator enzimet adtunk (Big Dye Terminator v 3.1 cycle sequencing RR-24, Applied Biosystems), valamint ugyanennyi térfogat Big Dye puffert, amely a fluoreszcensen jelölt didoexinukleotidokat is tartalmazta. A szekvenáló reakciót az mtdns trns Lys -re specifikus 5' GCAATTCCCGGACGTCTA 3' forward és 5' GCGAACAGATTTTCGTTCAT 3' reverz primerekkel végeztük el. A szekvenáló reakció programja a következő: kezdeti denaturáció 95 C-on 2 perc, 25 ciklus (denaturáció 95 C 300 másodperc, anelláció 51 C 15 másodperc és szintézis 60 C 4 perc) után a végső szintézis 72 C-on 7 perc. 40 µl térfogatban 16 µl desztillált víz, 2 µl Big Dye enzim, 2 µl Big Dye Terminator puffer, 4 µl oligo (10 pmol/µl koncentrációban) és 16 µl PCR-templát. A szekvenáló PCR elvégzése után a termékek tisztítását NucleoSeq kit (BIOLINE) segítségével végeztük el. A kérdéses régió szekvenálását ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer szekvenátorral végeztük el. A kapott szekvenciákat manuálisan elemeztük, majd az NCBI Blast program ( segítségével a humán mitokondriális referencia genom nukleotid és aminosav sorrendjével hasonlítottuk össze In vitro kísérletekben használt metodikák PC12 sejttenyészet A patkány pheochromocytoma (PC12) sejtek az American Type Culture Collection-től származtak (ATCC, Manassas, VA, USA). A sejteket 37 o C-on 5% CO 2 koncentráció mellett Dulbecco s modified Eagle s mediumban (DMEM) (GIBCO, Invitrogene GmbH, Austria) tenyésztettük, amely 2 mmól/l L-glutamint, 10% lószérumot (GIBCO), 5% foetális marha szérumot (GIBCO), 0.5% Penicillin-Streptomycin-t (GIBCO) és 0.3% Fungisone-t (GIBCO) tartalmazott. A sejtek differenciáltatását 24 lyukú plate-n végeztük, amelynek felületét előzőleg kollagénnel vontuk be. A sejteket 10 5 sejt/lyuk koncentrációban ültettük ki, és DMEMet, 2% ló szérumot, 1% Penicillin-Streptomycin-t, 0.3% Fungisone-t, és 100 ng/ml 30

31 neurális növekedési faktort (NGF) (SIGMA, St. Louis, MO, USA) tartalmazó médiumban 5 napig differenciáltattuk Vírus konstruktok és transzdukció A kísérleteinkben használt adenovírus vektor csirke β-aktin promotert, Cytomegalovírus korai enhancert, a célgének cdns szekvenciáit (reportergénként használt β-galactosidase-lacz, vagy Bcl-2, vagy Bcl-XL), valamint egy poliadenilált nyúl β-globulin szekvenciát (Nakamura és mtsai, 1994; Kanegae és mtsai, 1995) tartalmazott. Valamennyi konstruktban a replilkációért felelős E1A, E1B és E3 gént cserélték ki a terápiás génekre, ezért vektorunk replikálódni képtelen (4.1. ábra). A LacZ és a Bcl-XL-t tartalmazó vektort Prof. Hirofumi Hamada, (Sapporo Egyetem, Japán), a Bcl-2-t tartalmazó vektort Prof. Duda Ernő (Szegedi Egyetem) bocsátotta rendelkezésünkre. A transzdukció során a sejteket PFU/sejt koncentrációban fertőztük a különböző gének cdns-eit tartalmazó adenovirus vektorokkal. A kezelést DMEM oldatban végeztük, majd egy órás inkubáció után a sejteken a tápfolyadékot a megfelelő térfogatra differenciáltató médiummal egészítettük ki ábra: A vizsgálataink során használt adenovírus vektor szerkezete. (CA: CMV promóter, PA: poliadenilált szekvencia) In vitro hypoxia és re-oxigenizáció A hypoxiát argon gáz kezeléssel idéztük elő 37 o C-on hypoxiás kamrában (1-2 óra). A sejtek fölé rétegzett argon gáz az oxigént elvonja (Loffler, 1987) és a kezelés hatására a tápoldatban mért ±1.15 Hgmm-es parciális oxigén nyomás 53.45±2.68 Hgmm-re csökkent, amellyel kb. 30%-os oxigén szintet értünk el. A kezelést követően az argon gázt eltávolítottuk a tenyészetről és a sejteket további 2-48 órára reoxigenizálciócéljából normál körülmények közé (5%-os CO 2 -t tartalmazó, 37 o C-os termosztátba) helyeztük vissza. A kontroll sejtek folyamatosan normál (p=165.45±1.15 Hgmm) oxigén szint mellett voltak a termosztátban (normoxiás sejtek). 31

32 X-gal festés A sejteket 80%-os metanolban -20 o C-on fixáltuk. A festésnél az X-gal reagenst (X-gal reagens: 1g X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactoside) (MBI Fermentas, Germany) 10 ml dimethyl formamidban oldva) 1:100 hígításban X-gal oldattal [5 mmól/l K 3 Fe(CN) 6, 5 mmól/l K 4 Fe(CN) 6, 2 mmól/l MgCl 2 ] hígítottuk. A sejteket 37 o C-on 4 órán át inkubáltuk. A festés után a sejteket PBS-ben mostuk, majd felszálló alkohol sorban dehidráltuk és ezt követően a sejteket tartalmazó üveglemezeket glicerin-zselatinnal fedtük Annexin V- propidium jodid kettős festés Az apoptotikus és nekrotikus sejtek számát annexin V- propidium jodid kettős festéssel határoztuk meg. A kezeléseket követően a sejteket annexin V-FITC-el (AV) (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK) és propidium jodiddal (PI) (SIGMA) jelöltük meg. A sejtekhez 1:100 koncentrációban annexinv-fitc-et adtunk és 37 o C-on sötétben inkubáltuk. Az annexinv jelölés 7. percében 5µg/mL koncentrációban rátettük PI oldatot, majd ezt követően további 3 percig inkubáltuk. A kiértékelést konfokális laser scanning mikroszkóppal (MRC 1024 Confocal System installed on NIKON Epithet inverted microscope, Bio-Rad Corp. Hertfordshire, England) végeztük. Az annexinv-fitc és PI jeleket 488 nm-en Krypton-Argon laserrel excitáltuk, majd 510 nm-en valamint 625 nm-en emisszáltattuk. A fluoreszcens szignál intenzitást LaserSharp 2000 software (Bio-Rad) használatával értékeltük. A morfometriás analízis során kezelésenként 10 random kiválasztott nem átfedő mikroszkópos képet értékeltünk. Az egyes felvételeken megszámoltuk az annexinv -, PI - pozitív, és a kettős jelölt valamint a nem festődött sejteket és ezeknek a százalékos arányát határoztuk meg (4.2. ábra). 32

33 4.2. ábra: AnneinV-propidium jodid kettősfestés TMRE festés - Mitokondriális membránpotenciál vizsgálata A mitokondrium membránműködés vizsgálatakor feszültség függő tetramethylrhodamine-ethylester (TMRE) (SIGMA) fluoreszcens festéket alkalmaztunk. A sejtekhez a kezelés végén 10 µmól/l végkoncentrációban TMRE festéket adtunk, majd 20 percig 37 o Con sötétben inkubáltuk. A mérést konfokális laser scanning mikroszkóppal végeztük. A mérés során az exitáció 488 nm-en Krypton-Argon laserrel történt, majd a sejteket 625 nm-en emisszáltattuk. A fluoreszcens szignál intenzitást LaserSharp 2000 software (Bio-Rad) használatával értékeltük. A morfometriás analízis során kezelésenként 10 random kiválasztott, nem átfedő mikroszkópos képet értékeltünk RNS izolálás és reverz transzkripció Az RNS izolálást ABIPrims 6100 nukleinsav izoláló automata segítségével végeztük a cég által ajánlott protokoll szerint (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA). A reverz transzkripciót Hight Sensitive cdna reverse transcriptase kittel (Applied Biosystems) végeztük a gyártó által megadott instrukciók alapján. A recerz transzkripciót az alábbi PCR beállítások mellett (25 C 10 perc, 37 C 120 perc, 85 C 5 másodperc) végeztük. 33

34 A génexpresszió mérése real-time PCR-rel Az egyes gének expressziójának változását TaqMan génexpressziós assay-k (Bcl-2 (Rn ), Bcl-XL (Rn ), bax (Rn ), nestin (Rn ), synapsin-1 (Rn ), c-fos (Rn ), és beta-actin (Rn ) (Applied Biosystems) segítségével real-time PCR-rel végeztük az alábbi kondíciók mellett: elő inkubáció: 50 C 2 perc, 95 C 10 perc, ciklus: 95 C 15 sec és 60 C for 1 perc 40x. A génexpresszió mértékét ddct módszer alapján kvantifikáltuk. A mérésekhez β-aktin endogen kontrollt alkalmaztunk és a változásokat a nem transzfektált normoxiás sejtekhez viszonyítva határoztuk meg Western blot analízis Protein izolálás: A sejteket 0,5 mól/l Tris (ph: 6,8), 8,7% glicerin, 10% SDS, 0,01% brómfenol-kék és komplett proteáz inhibitor-t (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) tartalmazó lízis pufferrel 3 percig 100 o C-on inkubáltuk, majd 12000g-n 3 percig 4 o C-on centrifugáltuk. A fehérje koncentrációt Bio-Rad protein assay kittel mértük. A Western blot vizsgálat során minden mintából 10µg fehérjét vittünk fel a gélre, és azt 8-12%-os SDS poliakrilamid gélen szeparáltuk. A szeparációt követően PVDF (polyvinil-difluorid) membránra (Bio-Rad) transzferáltuk. Blokkolást, valamint az elsődleges és másodlagos ellenanyagokkal való kezelést követően a kérdéses fehérjéket ECL Plus protein detection kit (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK) segítségével vizualizáltuk. A kapott jelek denzitását Quantity One analysis Software (Bio-Rad) segítségével határoztuk meg. A mérésekhez β-aktin endogen kontrollt alkalmaztunk és a változásokat a nem transzfektált normoxiás sejtekhez viszonyítva határoztuk meg Statisztikai analízis A kísérleteinket 4-8 alkalommal, független sejttenyészetekből végeztük el. Az egyes kísérletek eredményét átlagoltuk, valamint szórást és SEM-et számoltunk. A szignifikanciát Student s t-test segítségével számoltuk a normoxiás kontroll sejtekhez viszonyítva. A p értéket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha az kisebb volt mint 0,05. 34

35 5. EREDMÉNYEK 5.1. A mitokondriális trns Lys gén polimorfizmusok jelentősége a hazai mitokondriális betegek differenciáldiagnosztikájában Munkacsoportunk a leggyakoribb mtdns mutációkat perifériás vérből izolált DNS-en (MELAS A3243G, MERRF A8344G; NARP - T8993C, T8993G) PCR-RFLP módszerrel vizsgálta. Azon betegek esetén, akiknél az RFLP vizsgálatok nem mutattak eltérést, de a klinikai tünetek, a laboratóriumi eltérések, valamint az izombiopszia során látott morfológiai változások során a mitokondriális betegség alapos gyanúja továbbra is fennállt, a fenti pontmutációk és az mtdns-trns gének szekvencia analízisét posztmitotikus szövetből (vázizom) is elvégeztük. A mutációk analízise során az A8344G szubsztitúcióra jellegzetes RFLP hasítási mintán kívül 5 egyéb különböző hasítási mintázatot is észleltünk. Ezeket a fenti nukleotidot is magában foglaló trns Lys gén és határoló régiók szekvenálásával vizsgáltuk tovább. A szekvencia analízis során összesen 54 esetben 10 különböző mtdns variációt találtunk, a talált mtdns SNP-ket és azok klinikai jelentőségét az alábbiakban ismertetjük Az irodalomból ismert, bizonyítottan patogén mutációk mtdns A8344G szubsztitúció A klasszikus MERRF szindrómára tipikus A8344G mutációt (Schoffner et al 1990) a vizsgálataink során 10 esetben találtuk meg. A mutáció izolált előfordulását 7 esetben igazoltuk (5.1. ábra), valamint egy család (3fő) esetében az A8344G nukleotid szubsztitúció mellett a vizsgált régióban további két mtdns SNP (G8251A, A8347C) is kimutatható volt. Az A8344G mutációt az irodalom egyértelműen patogénnek minősíti (Shoffner és mtsai, 1990). Az A-G szubsztitúció a trns Lys T-loopjában lokalizálódik a trns 55. nt. pozíciójában (5.2. ábra). A mutációt hordozó egyéneknél a BanII restrikciós enzimnek egy plusz kötőhelye alakul ki. A hasítatlan termék 213bp hosszú, a vad 99, 73 és 41bp-os fragmentekre hasad. A mutáció miatt a 73bp-os fragment még kétfelé hasad: 52 és 21bp-ra (5.1. ábra). A PCR RFLP vizsgálattal kapott eltérést szekvencia analízissel validáltuk (5.2. ábra). Az A8344G mutációt hordozó betegek 35

36 klinikai tünetei változatos képet mutattak, a myoclonusos epilespia mellett jelen volt a myopathia, nagyothallás, progresszív ophtalamoplegia externa, fiatalkori ischaemiás stroke, és mentális hanyatlás (5.1. táblázat) ábra: A: A MERRF mutációra (A8344G) és a normál genotípusra jellegzetes RFLP mintázat (1: 8344A, 2: 8344G, 3: emésztetlen PCR termék); B: az A8344G mutáció lokalizációja a trns Lys -ben 5.2. ábra: A: normál, B: A8344G MERRF mutáció szekvencia analízis 36

37 Nem Életkor Klinikai tünetek Ffi 33 év Myoclonus epilepsia, fejtremor, enyhe dysarthria, dysphagia, izom atrophia, ataxia, kognitív funkcióromlás Izombiopszia eredménye Izombiopsziás anyagban COX negatív és ragged red rostok találhatóak Heteroplazmia aránya vérben A8344G 40% Családi anamnesis Ikertestvére enyhébb tünetekkel bír Ffi 33 év Myoclonus epilepsia, hypotrophiás izomzat, enyhe végtag tremor Nem történt biopszia 40% Ikertestvére súlyosabb tünetekkel bír Nő Ffi 59 év Tünetmentes 48 év Myopathia, cardiomyopathia, polyneuropathia, ataxia, terhelési intolerancia, mentalis hanyatlás, depresszió, szorongás Ffi 48 év Súlyos anxietas, fóbia nő Nő 68 év 51 év Depresszió. myopathia, nagyothallás, ataxia TIA, meglassult beszéd Ffi 24 év Ischaemiás stroke Ffi Ffi 45 év 45 év Ptosis, myopathia, krónikus progressziv ophtalmoplegia externa, hypothyreosis Myopathia, izomgörcsök Nem történt biopszia Myopathia, ragged red és COX negatív rostokkal, paracristallin mitokondriális inclusiokkal Minimális nem specifikus elváltozások Ragged red és COX negativ rostok, paracristallin inclusiokkal Nem történt biopszia Nem történt biopszia Myopathia, ragged red rostokkal, vakuolizációval Myopathia, COX negatív rostokkal, subsarcolemmális mitokondrium halmozódással 30% 58% 44% 46% 25% Ikerfiai: Myoclonus epilepsia Mater: súlyos myopathia, ataxia, depresszió Ikertestvér: súlyos anxietás Mater: súlyos myopathia, ataxia, depresszió Ikertestvér: depresszió, ataxia, myopathia Ikerfiai: ataxia, myopathia, depresszió, szorongás Maternalis ágon: colon tumor, diabetes mellitus csecsemőhalálozás, vesebetegség 30% Negatív 40% Negatív 35% Negatív 5.1. táblázat: A8344G MERRF mutációval rendelkező páciensek tünetei 37

38 Az általunk patogénnek feltételezett, az irodalomban eddig még le nem írt nukleotid szubsztitúciók mtdns A8332G szubsztitúció Tizenhat éves súlyos dystoniában szenvedő fiú került genetikai vizsgálatra, tünetei 9 éves korában egy súlyos infekciót követően kezdődtek. Akkor szérum laktát szintje magas volt, lumbális liquorában emelkedett fehérjeszintet találtak. Jelenleg a dystonia miatt anarthriás, a végtagokban jelentkező dystonia mozgásában súlyosan korlátozza. Neurológiai vizsgálatakor főként a nyelvre és a végtagokra kiterjedő generalizált dystoniát, bilaterális horizontális nystagmust, anarthriás beszédet, diffúz izomatrophiát, és hiányzó reflexeket találtunk. EMG vizsgálat a jobb deltoideus és tibialis anterior izmokban neurogén károsodást igazolt. Az EEG, ENG és a koponya MRI kóros eltérést nem talált. Az izombiopszia során enyhe neurogén károsodást, a rostok 6%-ban módosított SDH festéssel ragged blue, valamint COX festéssel COX negatív rostokat találtunk. Az elektronmikroszkópos vizsgálat számos izomrostban subsarcolemmális mitokondriális akkumlációt talált. Édesanyjának kisgyermekkorában stroke szerű epizódja volt, jelenleg hypoacusisa, egyensúlyzavara van és a felsővégtagjaiban enyhe dystonia látható, mely csak 40-es éveiben jelent meg. Az audiológiai vizsgálat sensorineurális hallásvesztést, az ENG axonális neuropahiát igazolt (5.3. ábra). A proband idősebb testvérének is volt gyermekkori stroke szerű tünete, amely során hemiparesist, magas laktát és ammónia szintet észleltek. Jelenleg az ő végtagjaiban is enyhe dystonia észlelhető, emellett 11 éves kora óta epilepsiás és viselkedészavara van (5.3. ábra). Az EEG vizsgálat a bal fronto-centralis régióban epileptiform jeleket talált. A család klinikai tüneteit az 5.2. táblázatban mutatjuk be. A 12 éves proband szekvencia analízise során a trns Lys génben heteroplazmikus formában a nukleotid pozícióban adenin guanin csere igazolódott (5.4. ábra). A mutáció a trns antikodon karjában helyezkedik el. Emellett a vizsgált régióban két polimorfizmus (9-bp-os deléció nt és C8270T) valamint egy részben tisztázatlan jelentőségű SNP (A8347C) is jelen volt. A trns, a proteinkódoló és a hipervariábilis régió 1 (HSV1) szekvencia analízise során további 13 SNP is igazolódott (5.3. és 5.4. táblázat). A családi szegregációs vizsgálat során a beteg édesanyjánál és az idősebbik testvérénél is megtaláltuk a fenti eltéréseket (5.3. ábra). Az 38

39 érintett család részletes haplocsoport analízisét elvégezve kiderült, hogy az anya és gyermekei a kelet-ázsiai populációra jellemző B haplocsoportba tartoznak. Az A8332G és mutáció az irodalomból nem ismert, a 150 kontroll személy vizsgálatakor ezt a szubsztitúciót nem tudtuk kimutatni, így ennek alapján ezt patogénnek feltételezzük. A NADH dehidrogenáz 6. alegységét kódoló génben talált heteroplazmikus C14520G sem ismert az irodalomban, de ezt az SNP-t az általunk vizsgált 150 kontroll közül 13 esetben is megtaláltuk, így ezt polimorfizmusnak minősítjük ábra: a vizsgált beteg családfája Nem Életkor Klinikai tünetek Nő I/1 49 év Egyensúlyzavar, hypacusis, dysarthria, anxietas, gyermekkori ischaemiás stroke Laboratóriumi eredmények Heteroplazmi a arány A8332G Anaemia 35% Ffi II/1 Ffi II/2 19 év 16 év 4 bal hemiparesis, hyperkinesisek, dystonia, IQ 81, epilepsia Infekció után járászavar, anarthria, hypotrophás izomzat, generalizált dystonia miatt járásképtelenség Magas szérum ammónia, laktát és piruvát szint, a lumbális liquor fehérje emelkedett Magas liquorfehérje, vizeletben magas glicin 17% 55% 5.2. táblázat: A8332G mutációt hordozó család tünetei 39

40 5.4. ábra: A: normális, B: heteroplazmikus A8332G mutáció szekvencia analízise, C: a mutáció lokalizációja a trns Lys -ben Gén Nt. pozíció Nt. csere A.sav csere Forma III/ 2 III/ 1 II/ 1 Minősítés Irodalom HVS T >C - Homopl HVS T >C - Homopl HVS A >C - Homopl HVS T >C - Heteropl HVS T >C - Homopl HVS C >T - Homopl HVS C >T - Homopl HVS T >C - Homopl Polimorfizmus Polimorfizmus Polimorfizmus Polimorfizmus Polimorfizmus Polimorfizmus Polimorfizmus Polimorfizmus Dirienzo és Wilson, 1991 Horai és Hayasaka, 1990 Lahermo és mtsai, 1996 Horai és Hayasaka, 1990 Horai és Hayasaka, 1990 Horai és Hayasaka, 1990 Horai és Hayasaka, 1990 Horai és Hayasaka, táblázat: A mtdns HVS1 régióban talált eltérései a vizsgált családban 40

41 Gén Nt. pozíció Nt. csere A.sav csere Forma III/ 2 III/ 1 II/ 1 Minősítés Irodalom ND T>C Tyr/His Homopl NC C>T - NC7 trns Lys trns Lys Del. nt Homopl. Homopl A>G - Heteropl 55% 17% 35% 8347 A>C - ATP G>A - trns Arg T>C - Homopl. Homopl. Homopl ND A>G - Homopl ND C>G Gly/Arg Heteropl. 40% 25% 15% Nem szinonim szubsztitúció Szinonim szubsztitúció Szinonim szubsztitúció Patogén mutáció Nem szinonim szubsztitúció Szinonim szubsztitúció Nem szinonim szubsztitúció Szinonim szubsztitúció Nem szinonim szubsztitúció Torroni és mtsai, 1999 Ruppert és mtsai, 2004 Lorenz és Smith, 1994 Coon és mtsai, 2006 Rieder és mtsai, 1998 Houshmand és mtsai, 1994 Howell és mtsai, táblázat: A mtdns trns és proteinkódoló génjeiben talált eltérései a vizsgált családban mtdns T8310G és T8311A szubsztitúciók Súlyos pszichiátriai tünetegyüttessel rendelkező (bipoláris hangulatzavar, fóbiás szorongás, pánik szidróma) nő kézremegés, szótalálási nehézség, figyelemzavar miatt került hozzánk vizsgálatra. Neuropszichológiai vizsgálata során a téri-vizuális memória és konstrukciók nagyfokú gyengeségét találtuk. Az általános intellektuális funkció az átlagos tartományban alsó határán voltak (IQ=85, PQ=81 VQ=91). A rövidtávú memória, a szekvenciális feldolgozás, a verbális memória-, valamint az exekutiv funkciók romló tendenciát mutatnak. Jobb-baltévesztés, ujjagnosia, ideomotoros és dinamikus apraxia mutatható ki. Spontán beszédben enyhe szótalálási nehézség, írásban 41

42 és olvasásban betűtévesztés jellemző. A komplexebb matematikai feladatok és nyelvtani mondatok megértése problémás. A pszichológiai vizsgálat diszharmonikus és emocionálisan instabil személyiséget talált, hisztrionikus vonásokkal. A proband esetében az A8344G mutáció elemzésekor a PCR -RFLP-vizsgálat során nehezen elkülöníthető mintázatot találtunk, ezért szekvencia analízist végeztünk (5.6. ábra). A szekvencia analízis során az mtdns trns Lys génben három nukleotid cserét találtunk. A dihidrouridin karban heteroplazmikus formában a 8310 nt. pozícióban T G és közvetlen mellette a 8311 nt. pozícióban T A szubsztitúciók igazolódtak. A mutációk a trns Lys -ben, a trns 16. és 17. nt. pozícióban található (5.7. ábra). Az egyik mutáció (T8310G) a dihidrouridin hurokban, míg a másik (T8311A) a dihidrouridin karban helyezkedik el, amely H-híd kötésben van. Az adott pozícióban lévő H-kötés felbomlásával a D-loop nagysága megnő, amelynek következtében degradált trns-ek jöhetnek létre (5.7. ábra). Mivel mindkét szubsztitúció a betegekben heteroplazmikus formában van jelen, feltételezzük, hogy a gélképen látott eltérések a normál trns-ek melletti degradált fragmensek. Az irodalomból ismert, hogy a trns-degradációval a trns mérete csökken, ezzel magyarázható a gélképen a dupla csíkok megjelenése. A szegregációs vizsgálat során a családban további 4 esetben tudtuk kimutatni a fenti mutációkat (5.5. ábra). Az érintett családtagok mindegyike rendelkezett klinikai tünetekkel, melyek változó súlyosságúak voltak. A fenti mutációk mellett család minden érintett tagjában homoplazmikus formában az A8347C SNP is jelen volt. A család klinikai tüneteinek megoszlását az 5.5. táblázatban mutatjuk be. A T8310G és a T8311A mutációk az irodalomból nem ismertek, a kontroll személyek vizsgálatakor ezek jelenlétét egy esetben sem tudtuk kimutatni, így ennek alapján patogénnek feltételezzük. 42

43 Nem Életkor Klinikai tünetek Nő I/1 Nő II/2 Ffi II/3 Ffi III/1 Nő III/2 56 év 38 év 35 év 19 év Diabetes, hypertonia, szívbetegség, anxietas Osteoid osteoma, bipoláris hangulatzavar, fóbiás szorongás, pánik szindróma, agorafobia, 2005-től kézremegés, szótalálási nehézségek, figyelemzavar, IQ 85, Súlyos depresszió, öngyilkossági kísérletek Gyerekkori hyperaktivitás, depressziós epizódok Laboreredmények Laktát terheléses vizsgálat aerób metabolizmus zavart igazolt Heteroplazmia arány 35% 45% 35% 30% 13 év Izomgörcsök 25% 5.5. táblázat: T8310G, T8311A mutációkat hordozó család tünetei 5.5. ábra: A vizsgált család családfája 5.6. ábra: A trns Lys dihidrouridin karjában található egymás melletti nt. szubsztitúciókra jellemző gélkép 43

44 5.7. ábra: A: normális szekvencia, B: T8310G és T8311A heteroplazmikus nukleotid szubsztitúciók szekvencia analízise, C: a talált eltérések lokalizációja a trns Lys -ben Az irodalomból ismert neurodegeneratív betegségekre hajlamosító szuszceptabilitási SNP mtdns A8347C szubsztitúció A szekvencia analízis során a trns Lys T-loopjában lokalizálódó A8347C szubsztitúciót (5.8. ábra)19 esetben találtuk meg. Ebből izoláltan négy esetben, a G8251A polimorfizmussal kombinálva három esetben, míg további 11 esetben egyéb patogén mutációkkal együtt fordult elő. Ezt az SNP-t Coon és mtsai Alzheimer-kóros betegekben szignifikánsabban nagyobb arányban találták meg, mint az egészséges kontroll egyénekben (Coon és mtsai, 2006). Az általunk vizsgált betegek körében ezen mutáció meglétét nem gondoljuk patogénnek, de nem zárjuk ki annak lehetőségét, hogy egyéb gének mutációival együtt előfordulva degeneratív központi idegrendszeri valamint izom betegségekre hajlamosíthat ábra: A normális és a heteroplazmikus A8347C mutáció szekvencia analízise 44

45 Az irodalomból ismert polimorfizmusok jelenléte bázispár deléció (del ) Az mtdns nt közötti szakaszában a COII és trns Lys gének között - egy 9 bp-os deléciót négy betegben találtunk meg (5.9. ábra), amely minden esetben a C8270T és az A8347C szubsztitúciókkal társult (5.10., 5.8. ábra). Az pontban ismertetett család három tagjában emellett heteroplazmikus formában az A8332G nukleotidcserét is ki tudtuk mutatni. Az általunk vizsgált beteg és kontroll kohortban ezt a 9 bp deléciót a fenti család tagjain kívül még két esetben találtuk meg. Ezen betegeknél patogén mutációt az mtdns vizsgálata során nem találtunk, és a deléció mindkét esetekben a C8270T SNP-vel társult ábra: 9bp deléció gélképe ábra: 9bp deléció és a közvetlen előtte elhelyezkedő C8270T mutáció szekvencia analízise (A: normális szekvencia, B: deletált és mutált szekvencia 45

46 mtdns G8251A szubsztitúció Vizsgálataink során a COII terminális szakaszában lokalizálódó G8251A szubsztitúciót 19 esetben találtuk meg. A restrikciós mintázatban a BanII enzim egyik felismerő helye kiesett, így a normálistól eltérő gélképet kaptunk (5.11. ábra). A mutáció pontos helyét bidirekcionális szekvenálással határoztuk meg (5.12. ábra). Ez az SNP az irodalomból polimorfizmusként ismert (Brandstätter és mtsai, 2003), az ősi L és N haplocsoportokra jellemző eltérés. A szubsztitúció 13 esetben izoláltan, 3 esetben az A8344G és A8347C mutációkkal együtt ( ban ismertetett család esetén), míg újabb 3 esetben csak az A8347C mutációval kombináltan fordult elő. A kontroll szekvenciák vizsgálata során ezt a polimorfizmust három esetben találtuk meg ábra: A G8251A polimorfizmusra jellegzetes restrikciós mintázat ábra: A normál és a G8251A polimorfizmus szekvenogramja 46