A mitokondrium szerepe a neurodegenerációban és a neuroprotekcióban

Átírás

1 A mitokondrium szerepe a neurodegenerációban és a neuroprotekcióban Doktori tézisek Gál Anikó Semmelweis Egyetem Szentágothai János Doktori Iskola Témavezetők: Prof. Dr. Nagy Zoltán, egyetemi tanár Dr. med. habil. Molnár Mária Judit, tud. főmunkatárs Hivatalos bírálók: Dr. Jávorszky Eszter PhD., tud. munkatárs Dr. Boczán Judit PhD., egyetemi adjunktus Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Sasvári Mária, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Báthori György PhD., tud. főmunkatárs Dr. Farkas Viktor PhD., tud. főmunkatárs Budapest 2009

2 1. BEVEZETÉS A mitokondrium a sejt energiaközpontja, minden eukarióta sejtben megtalálható, intracelluláris organellum, mely az ősi bíborbaktérium endocitózisával keletkezett. Önálló DNS-sel rendelkezik, amely a prokariótákra jellemző cirkuláris molekula. Az emberi sejtben a mtdns az egyetlen extrakromoszómális DNS, amely mind a nukleáris, mind a mitokondriális genom szabályozása alatt áll. A mitokondriumban a duplaszálú DNS több kópiában (2-10) van jelen. A humán bp nagyságú mtdns 22 trns-t, 2 rrns-t és 13 polipeptidet kódol. A mitokondrium működészavara következtében alakulnak ki a mitokondriális betegségek. A mitokondrium hibás működéséért mind az mtdns mind a nukleáris DNS hibái felelősek lehetnek. A klinikai tünetek elsősorban a nagy energia igényű szövetek funkciózavara képében jelentkeznek, melyek leginkább neurológiai, pszichiátriai, endokrinológiai, szemészeti és belgyógyászati örökletes betegségeket eredményeznek. A monogénes betegségek mellett számos neurodegeneratív betegség, az ischaemiás stroke, a szívinfarktus és a rák kialakulásában is fontos szerepet játszanak a mitokondriumok. A mitokondriális betegségek a neurológiában 3 csoportba sorolhatók : 1) a mitokondriális genom mutációihoz kapcsolt betegségek (pl. MELAS, MERRF, Leigh szindróma), 2) olyan kórképek, amelyek hátterében a nukleáris DNS mitokondrium működéséért felelős génjeinek mutációi állnak (pl. Friedreich-ataxia - frataxin, Parkinson-kór - parkin), 3) azon folyamatok, amikor a mitokondrium működése, szignalizációja másodlagosan károsodik (pl. egyes neurodegeneratív kórképek - ALS, Huntington-kór, stroke). Ez utóbbi csoportban a mitokondrium működésének javítása (pl. apoptózis gátló molekulák aktiválása, a 1

3 megnövekedett ROS szint eliminálása, a légzési transzportlánc működésének fokozása) hatékony terápiás lehetőséget jelenthet. 2. CÉLKITŰZÉSEK Kutatásunk céljaként tűztük ki, 1. Az egyes mtdns eltérések patogenetikai szerepének valamint a klinikai fenotípusra gyakorolt hatásának elemzése 2. Az együttesen előforduló mtdns eltérések szinergizmusának elemzése 3. A leggyakoribb A3243G mtdns mutáció genetikai epidemiológiai elemzése 4. Az anti-apoptotikus Bcl-2 és Bcl-XL génekkel történő transzdukció hatás elemzése hypoxiás PC12 sejteken 5. Az anti-apoptotikus gének fokozott expressziójának hatáselemzése az agyi plaszticitásban szerepet játszó GAP-43, nestin, synapsin-1 és c-fos expresszióra 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Mitokondriális DNS mutációk vizsgálata során alkalmazott módszerek Vizsgált betegek Az mtdns trns Lys mutációkat elemző vizsgálatainkban 470 (279 nő és 191 férfi) beteg és 150 kontroll személy DNS mintáját elemeztük. A trns Leu (UUR) A3243G szubsztitúcióját 631 (361 nő és 270 férfi) betegen 2

4 vizsgáltuk. A vizsgálatba Baranya, Borsod-Abaúj-Zemplén, Hajdú-Bihar, Szabolcs-Szatmár-Bereg megye valamint Budapest ismeretlen etiológiájú ischaemiás stroke, ataxia, maternálisan öröklődő sensorineuralis hallásvesztés, myopathia, vagy hypotonia miatt vizsgálatra küldött betegeket vontuk be, akiknél a multiszisztémás tünetegyüttes, a családi anamnézis és egyes laboratóriumi értékek felvetették a mitokondriális betegség lehetőségét DNS izolálás A DNS-t vérből, illetve 50 beteg esetében posztmitotikus szövetekből (vázizomszövet, vizelet laphámsejt) izoláltuk Qiagen Blood (Qiagen) valamint Qiagen Tissue Kit segítségével, a gyártó által megadott instrukciók szerint PCR-RFLP vizsgálat Az mtdns leggyakoribb mutációit (A3243G, A8344G, A8356G, A8993G, A8993C) PCR-RFLP módszerrel határoztuk meg mtdns trns Lys gén bidirekcionális szekvenálása A szekvenáló reakciót a PCR termék tisztítását követően 3.1. Big Dye Terminator enzimmel (Big Dye Terminator v 3.1 cycle sequencing RR-24, Applied Biosystems) végeztük a gyártó által ajánlott módszerrel. A kérdéses régió szekvenálása ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer szekvenátorral történt. 3

5 3.2. In vitro kísérletekben használt metodikák PC12 sejttenyészet Vizsgálatainkat neuralis növekedési faktorral (NGF) (SIGMA, St. Louis, MO, USA) differenciáltatott patkány pheochromocytoma (PC12) (ATCC, Manassas, VA, USA) sejteken végeztük Vírus konstruktok és transzdukció A kísérleteinkben használt adenovírus vektor csirke β-aktin promotert, Cytomegalovírus korai enhancert, a célgének cdns szekvenciáit (riporter génként használt β-galactosidase-lacz, vagy Bcl-2, vagy Bcl-XL), valamint egy poliadenilált nyúl β-globulin szekvenciát tartalmazott. A transzdukciónál PFU/sejt víruskoncentrációt alkalmaztunk In vitro hypoxia és re-oxigenizáció A hypoxiát argon gáz kezeléssel idéztük elő 37 o C-on hypoxiás kamrában, (1-2 óra) ezt követően a sejteket további 2-48 órára re-oxigenizáltatás céljából normál körülmények közé (5%-os CO 2 -t tartalmazó, 37 o C-os termosztátba) helyeztük vissza. A kontroll sejtek folyamatosan normál oxigén szint mellett voltak a termosztátban (normoxiás sejtek) X-gal festés A LacZ transzfekció (-galaktozidáz aktivitás) kimutatására a sejteket X- gal reagenssel festettük (MBI Fermentas, Germany). 4

6 Annexin V- propidium jodid kettős festés Az apoptotikus és nekrotikus sejtek számát annexin (V R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK) propidium - jodid (SIGMA) kettős festéssel határoztuk meg. A kiértékelést konfokális laser scanning mikroszkóppal (MRC 1024 Confocal System installed on NIKON Epithet inverted microscope, Bio-Rad Corp. Hertfordshire, England) végeztük Mitokondriális membránpotenciál vizsgálata A mitokondrium membránműködés vizsgálatakor feszültség függő tetramethyl-rhodamine-ethylester (TMRE) (SIGMA) fluoreszcens festéket alkalmaztunk. A mérést konfokális laser scanning mikroszkóppal végeztük. A fluoreszcens szignál intenzitást LaserSharp 2000 software (Bio-Rad) használatával értékeltük RNS izolálás és reverz transzkripció Az RNS izolálást ABIPrims 6100 nukleinsav izoláló automata segítségével végeztük a cég által ajánlott protokoll szerint (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA). A reverz transzkripcióhoz Hight Sensitive cdna reverz transkriptáz kittet (Applied Biosystems) alkalmaztunk a gyártó által megadott instrukciók alapján A génexpresszió mérése real-time PCR-rel Az egyes gének expressziójának (Bcl-2, Bcl-XL, bax, nestin, synapsin-1 és beta-actin) változását TaqMan génexpressziós assay-k (Applied Biosystems) segítségével real-time PCR-rel végeztük. A génexpresszió mértékét ddct módszer alapján kvantifikáltuk. 5

7 Western blot analízis A vizsgált fehérjéket 8-12%-os SDS poliakrilamid gélen szeparáltuk, majd PVDF (polyvinil-difluorid) membránra (Bio-Rad) transzferáltuk. Blokkolást, valamint az elsődleges és másodlagos ellenanyagokkal való kezelést követően a kérdéses fehérjéket ECL Plus protein detection kit (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK) segítségével vizualizáltuk. A kapott jelek denzitását Quantity One Analysis Software (Bio-Rad) segítségével határoztuk meg Statisztikai analízis A kísérleteinket 4-8 alkalommal, független sejttenyészetekből végeztük el. Az egyes kísérletek eredményét átlagoltuk, valamint szórást és SEM-et számoltunk. A szignifikanciát Student s t-test segítségével számítottuk. 4. EREDMÉNYEK 4.1. A mitokondriális trns Lys gén polimorfizmusok jelentősége a hazai mitokondriális betegek differenciáldiagnosztikájában A mtdns leggyakoribb mutációinak analízise során az A8344G szubsztitúcióra jellegzetes RFLP hasítási mintán kívül 5 egyéb különböző hasítási mintázatot is észleltünk. Ezeket a fenti nukleotidot is magában foglaló trns Lys gén és határoló régiók szekvenálásával vizsgáltuk tovább. A szekvencia analízis során összesen 54 esetben 10 különböző mtdns variációt találtunk, a talált mtdns SNP-ket és azok klinikai jelentőségét az alábbiakban ismertetjük (Molnár és mtsai, 2009). 6

8 Az irodalomból ismert, bizonyítottan patogén mitokondriális trns Lys gén mutációk jelenléte A klasszikus MERRF szindrómára tipikus A8344G mutációt a vizsgálataink során 9 esetben találtuk meg. A mutáció izolált előfordulását 5 esetben igazoltuk, valamint egy család (3 fő) esetében az A8344G nukleotid szubsztitúció mellett a vizsgált régióban további két mtdns SNP (G8251A, A8347C) is kimutatható volt. Az A8344G mutációt hordozó betegek klinikai tünetei változatos képet mutattak, a myoclonus epilepsia mellett jelen volt a myopathia, nagyothallás, progresszív ophthalmoplegia externa, fiatalkori ischaemiás stroke és mentális hanyatlás (Molnár és mtsai, 2009). Egy egypetéjű ikerpár esetében eltérő kórlefolyást észleltünk, ami epigenetikai változásokat jelez Az általunk patogénnek feltételezett, az irodalomban eddig még le nem írt nukleotid szubsztitúciók Egy 16 éves, súlyos dystoniában szenvedő fiú szekvencia analízise során a trns Lys génben heteroplazmikus formában A8332G nukleotid csere igazolódott. A mutáció a trns antikodon karjában helyezkedik el. Emellett a vizsgált régióban 16 szubsztitúció igazolódott, melyek közül 4 nemszinonimnak minősült. A családi szegregációs vizsgálat során a beteg édesanyjánál és idősebbik testvérénél is megtaláltuk a fenti eltéréseket. Az érintett család mitokondriális haplotípusa alapján a kelet-ázsiai populációra jellemző B haplocsoportba sorolható. Az A8332G mutáció az irodalomból nem ismert, a 150 kontroll személy vizsgálatakor ezt a szubsztitúciót nem tudtuk kimutatni, így ennek alapján ezt patogénnek feltételezzük (Gál és mtsai, 2008; Molnár és mtsai, 2009). Súlyos pszichiátriai tünetegyüttessel rendelkező (bipoláris hangulatzavar, fóbiás szorongás, pánik szindróma) nőbeteg A8344G mutáció PCR-RFLP- 7

9 vizsgálata során nehezen elkülöníthető mintázatot találtunk, amelynek hátterében a szekvencia analízis során az mtdns trns Lys génben három nukleotid cserét találtunk. A dihidrouridin karban heteroplazmikus formában a 8310 nt. pozícióban T G és közvetlen mellette a 8311 nt. pozícióban T A szubsztitúciók igazolódtak. Mivel mindkét szubsztitúció a betegekben heteroplazmikus formában van jelen, feltételezzük, hogy a gélképen látott eltérések a normál trns-ek melletti degradált fragmensek. A szegregációs vizsgálat során a családban további 4 esetben tudtuk kimutatni a fenti mutációkat. Az érintett családtagok mindegyike rendelkezett klinikai tünetekkel, melyek változó súlyosságúak voltak. A fenti mutációk mellett a család minden érintett tagjában homoplazmikus formában az A8347C SNP is jelen volt. A T8310G és a T8311A mutációk az irodalomból nem ismertek, a kontroll személyek vizsgálatakor ezek jelenlétét egy esetben sem tudtuk kimutatni, így ennek alapján patogénnek feltételezzük (Molnár és mtsai, 2009; Inczédy-Farkas és mtsai, 2009) Az irodalomból ismert neurodegeneratív betegségekre hajlamosító SNP A szekvencia analízis során a trns Lys T-loopjában lokalizálódó A8347C szubsztitúciót 19 esetben találtuk meg. Ebből izoláltan négy esetben, a G8251A polimorfizmussal kombinálva három esetben, míg további 11 esetben egyéb patogén mutációkkal együtt fordult elő. Az mtdns 8347 nt. pozíciójában Coon és mtsai Alzheimer-kóros betegekben szignifikánsabban nagyobb arányban találtak szubsztitúciót, mint az egészséges kontroll egyénekben. Az általunk vizsgált betegek körében ezen mutáció meglétét nem gondoljuk patogénnek, de nem zárjuk ki annak lehetőségét, hogy egyéb gének mutációival együttesen előfordulva degeneratív központi 8

10 idegrendszeri valamint izombetegségekre hajlamosíthat (Molnár és mtsai, 2009) Az irodalomból ismert polimorfizmusok jelenléte Az mtdns nt közötti szakaszában a COII és trns Lys gének között - 9 bp-os deléciót találtunk öt betegben (3 család), amely minden esetben a C8270T szubsztitúcióval társult. A COII terminális szakaszában lokalizálódó G8251A szubsztitúciót 19 esetben találtuk meg. Ez az SNP az irodalomból polimorfizmusként ismert, az ősi L és N haplocsoportokra jellemző eltérés. A szubsztitúció 13 esetben izoláltan, 3 esetben az A8344G és A8347C mutációkkal együtt, míg újabb 3 esetben csak az A8347C mutációval kombináltan fordult elő. A kontroll szekvenciák vizsgálata során ezt a polimorfizmust három esetben találtuk meg. A COII/tRNS Lys régió szekvenálása során a G8269A szubsztitúció egy beteg és egy kontroll személy esetében volt kimutatható. Ez az SNP az irodalomból polimorfizmusként ismert, előfordulása a nyugat-európai H4a és J1b haplocsoportokban gyakori. A trns Lys gén szekvencia analízise során a mtdns C8270T mutációját három család 5 tagjában találtuk meg. Ez az SNP az irodalomból polimorfizmusként ismert. Az SNP a citokróm oxidáz-c 2. alegysége (COII) és a trns Lys közti hipervariábilis intergénikus régióban lokalizálódik. A mutáció minden esetben a 9-bp-os delécióval és a A8347C szubsztitúcióval társulva homoplazmikus formában volt jelen. Három beteg vizsgálatakor a szekvencia analízis során G8292A szubsztitúció igazolódott, amely a trns Lys és a COII közti intergénikus régióban helyezkedik el. Ezt a szubsztitúciót 3 betegnél találtuk meg mind homo-, mind heteroplazmikus formában. Két esetben volt lehetőség családi 9

11 szegregációs vizsgálatra, amelynek során további 5 esetben tudtuk kimutatni a kérdéses mtdns alterációt. Mindkét családban maternális halmozódású migrént találtunk. Az irodalomból ez a szubsztitúció polimorfizmusként ismert, amely az R0 haplocsoportot határozza meg Egészséges kontroll egyének trns Lys génjének vizsgálata Az irodalomból nem ismert újonnan talált mtdns alterációk patogenitásának vizsgálatára az adott régió szekvenálását 150 kontroll személyen végeztük el (65 férfi és 85 nő). Ezen csoport átlagéletkora 43,7 év volt (férfiak: 41,1 év, nők: 45,7 év). Az egészséges kontroll csoport szekvenciáit összehasonlítottuk a cambridge-i referencia szekvenciával, majd a betegek szekvenciáival. A G8251A polimorfizmust 4 esetben, míg a G8269A SNP-t 2 személynél tudtuk kimutatni. A kontroll csoportban a szekvencia analízissel egyéb mtdns eltérés nem volt detektálható (Molnár és mtsai, 2009) Az mtdns trns Leu (UUR) gén A3243G mutáció genetikai epidemiológiai vizsgálata A Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Orvosi Genetikai és Gyermekfejlődéstani Intézetével közösen összesen 631 beteg (361 nő és 270 férfi) DNS mintáját analizáltuk. A vizsgált betegekből mindössze 5 nő és 1 férfi betegnél igazolódott az A3243G mutáció. A betegek családtagjainak szűrése során további 8 esetben derült fény az A3243G mutációra. Minden érintett családtagnál a klinikai vizsgálat a mitokondriális betegségekre jellemző tüneteket talált. Az A3243G mutáció frekvenciája a vizsgált időszakban 2,22 % volt (Gál és mtsai, 2009). 10

12 4.1. Adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL antiapoptózis génterápia in vitro PC12 hypoxiás modellben A kísérleti körülményeink optimalizálása Az β-galaktozidáz riporter gént tartalmazó adenovírus konstruktum bevitelét követően 50 PFU/sejt koncentrációtól szinte valamennyi sejt felvette a LacZ-t tartalmazó adenovírus vektort és ennek jelenléte a sejtekben tartósan kimutatható volt. Normoxiás kondíciók mellett a Bcl-2 vagy Bcl-XL gént tartalmazó vektor hatására a bejuttatott vektorok által kódolt gének és fehérjék expressziója emelkedett. A különböző idejű argon gáz okozta hypoxia (1 és 2 óra) valamint reoxigenizáció (0-48 óra) hatásának vizsgálatakor az optimális kezelést az apoptotikus és a nekrotikus sejtek százalékos arányának alapján 1 óra hypoxia és 24 óra re-oxigenizációs időkben határoztuk meg. A kezelésekhez használt víruskoncentráció a dózisfüggés alapján 100 PFU/sejt, míg transzdukció időpontja a hypoxia után 1 órával bizonyult a legmegfelelőbbnek Anti-apoptotikus géntranszfer eredményezte cytoprotekció A sejteket 1 órás argon gáz hypoxia és a transzdukció után 4, 24 és 48 óráig re-oxigenizáltattuk. Az apoptotikus és a nekrotikus sejtek ill. a teljes sejtpusztulás százalékos arányát annexinv PI kettősfestéssel vizsgáltuk. A teljes sejtpusztulás (apoptózis és nekrózis) a Bcl-2 és a Bcl-XL génbevitelt követően minden vizsgált időpontban szignifikánsan csökkent. LacZ bevitel hatására a nekrotikus sejtek száma minden vizsgált időpontban szignifikáns emelkedést mutatott. Az anti-apoptózis gének bevitele az apoptotikus sejtek számát szignifikánsan csökkentette, míg a LacZ 11

13 transzdukciót követően az apoptózis mértéke nem változott (Gál és mtsai, 2009). A TMRE fluoreszcens szignál intenzitását, amely a mitokondriális membránpotenciál változását jelzi, a kezelést követően 24 és 48 órával mértük. A hypoxia hatására a TMRE fluoreszcenciája szignifikánsan csökkent. A Bcl-2 és a Bcl-XL gén bevitel kivédte a hypoxia által okozott mitokondrium depolarizációt (Gál és mtsai, 2008) Bcl-2 fehérje család pro- és anti-apoptotikus tagjainak expresszió változása a transzdukciót követően Bcl-2 transzdukciót követően a sejtekben jelentős mértékű Bcl-2 expresszió emelkedés tapasztalható, míg a Bcl-XL vektor bevitele nem változtatta meg a Bcl-2 mrns szintet. Bcl-XL génbevitel hatására a Bcl-XL génexpresszió szignifikáns növekedést mutatott. Emellett a Bcl-XL szignifikáns emelkedését Bcl-2 kezelés után is detektáltuk. Argon gáz hypoxiát követően a pro-apoptotikus Bax gén expressziója a nem kezelt és LacZ transzdukált sejteken szignifikánsan nőtt (p<0.05), míg a Bcl-2 és Bcl-XL gének bevitele ezt a hatást kivédte (Gál és mtsai, 2008, 2009) Agyi plaszticitásban szerepet játszó gének és proteinek expresszió változása Normoxiában és argon gáz hypoxia hatására a GAP-43 fehérje expressziója a Bcl-2 és Bcl-XL transzdukciót követően a kezeletlen kontrollhoz képest szignifikáns emelkedést mutatott (p<0.05) (Gál és mtsai, 2008). A nestin protein és génexpresszió Bcl-2 transzdukció után mind normoxiás, mind hypoxiás körülmények között szignifikáns emelkedést mutatott, míg a Bcl- XL génbevitel hatására expresszió fokozódást csak hypoxiában tapasztaltunk. 12

14 Normoxiában a synapsin-1 gén és protein expresszió a Bcl-2 és Bcl-XL konstruktok bevitelét követően emelkedést mutatott, de szignifikáns változás csak a Bcl-XL kezelés után mért génexpressziós értékben mutatható ki. Hypoxiát követően a c-fos mrns és protein szint szignifikánsan csökkent a nem kezelt hypoxiás kontrollban és a LacZ kezelt sejtekben. Ezt az expresszió csökkenést az anti-apoptózis gének kivédték (Gál és mtsai, 2009). 5. KÖVETKEZTETÉSEK A kapott eredményekből az alábbi következtetések vonhatók le: Az általunk vizsgált populációban a mtdns trns Lys és a megelőző hipervariábilis intergénikus szakasz genetikai variabilitása igen nagy. A vizsgált kohortban 9 különböző nukleotid szubsztitúciót és egy 9-bp-os deléciót találtunk a fenti régióban. A talált nukleotid szubsztitúciók közül 4 patogén mutáció. A patogén mutációk közül hármat az irodalomban elsőként írtunk le. A kelet-ázsiai antropológiai markert (9-bp-os deléció) elsőként találtuk meg a magyar populációban. A vizsgált magyar család az ősi B haplocsoporttal rendelkezik, amely szintén a kelet-ázsiai populációra jellemző. Ezen haplocsoport jelenléte a magyar populációban magyarázható a magyarság történelmével, de nem zárható ki ritka rekurrens mutáció kialakulásának lehetősége sem. Az mtdns A3243G mutáció epidemiológiai vizsgálata során a vizsgált kohortban a mutáció 2,22 %-os előfordulási gyakorisága jól korrelál más európai országok eredményeivel. A genetikai 13

15 epidemiológiai vizsgálat eredménye nagyban függ a vizsgált betegek beválasztási kritériumától. PC12 sejteken in vitro hypoxiás modellben az adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL vektorok bevitele 1. kivédte az argon gáz hypoxia által okozott sejtpusztulást, 2. normalizálta a mitokondriális membrán potenciál értékét, 3. az agyi plaszticitásban szerepet játszó GAP-43, nestin és c-fos expresszióját fokozta, amely arra enged következtetni, hogy a Bcl-2 és Bcl-XL bevitelt követően a neuro- és axonogenesis fokozódik. Az általunk használt hypoxiás modell alapján feltételezzük, hogy az anti-apoptózis és a neuro és az axonogenesis útvonal összeköttetésben állhat, de a két szignalizáció közötti kapcsolat jelenleg pontosan még nem ismert. 14

16 6. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 6.1. Az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Gal A, Szilagyi G, Wappler E, Safrany G, Nagy Z. (2008) Bcl-2 or Bcl-XL gene therapy reduces apoptosis and increases plasticity protein GAP-43 in PC12 cells. Brain Res Bull. 76: Gal A, Pentelenyi K, Remenyi V, Wappler EA, Safrany G, Skopal J, Nagy Z. (2009) Bcl-2 or bcl-xl gene therapy increases neural plasticity proteins nestin and c-fos expression in PC12 cells. Neurochem Int. 55: Gál A, Szabó A, Pentelényi K, Pál Z. (2008) Maternálisan öröklődő diabetes mellitus, nagyothallás, krónikus ophthalmoplegia externa és myopathia mint az mtdns A3243G mutáció következménye. Orvosi Hetilap. 149: Gal A, Komlosi K, Maasz A, Pentelenyi K, Remenyi V, Ovary C, Valikovics A, Dioszeghy P, Bereczki D, Melegh B, Molnár MJ. Analysis of the mtdna A3243G mutation frequency in Hungary, Cntral European Journal of Medicine, in Press 6.2. Az értekezés témájában megjelent idézhető absztraktok 1. Gal A, Szilagyi G, Wappler E, L. Denes L, Nagy Z: Adenovirus contaning Bcl-2 or Bcl-XL antiapoptosis genes reduce cell loss after hypoxia in PC12 cell culture (2006) Europen Stroke Congress, Brussels, Cerebrovascular Diseases, Vol. 21, Suppl. 4:

17 2. Gál A, Szilágyi G,. Wappler EA, Bori Z, Skopál J, Nagy Z. (2007) Bcl-2 and Bcl-XL genes therapy increases plasticity and cell cycle genes expression after hypoxia in PC12 cells. 16th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases. 23, Suppl. 2: Gal A., Pentelenyi K, Remenyi V, Csanyi B, Tomory G, Rasko I, Molnar MJ. (2008) The coexistence of an East-Asian mitochondrial antropological marker and the C8270T, A8332C, and A8347G mtdna mutations in a Hungarian family with dystonia and juvenile stroke syndrome. (2008) Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 16 Suppl. 2, Inczedy - Farkas G, Gal A, Pentelenyi K, Remenyi V, Balla P, Andrejkovics M, Molnar MJ. (2009) Familial depression associated with two novel T8310G and T8311A mtdna mutations, 9th World Congress of Biological Psychiatry, 28 June - 02 July, Paris, France. World Federation of Societies of Biological Psychitary, DOI /wfsbp , Molnar MJ, Pentelenyi K, Remenyi V, Pal Z, Bereznai B, Gal A. (2009) The clincal importance of variability of trna Lys and its neighbouring mtdna sequence. Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 17 Suppl. 2:

18 6.3. Nem az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Gal A, Siska E, Nagy Z, Karpati G, Molnar MJ: Challenges for the genetic screening in dysferlin deficiency - report of an instructive case. (2008) Clinical Neuropathology. 27: Gál A, Nagy Z. (2005) A génterápia, mint a neuroprotekció új lehetősége. Agyérbetegségek. 11: Denes L, Szilágyi G, Gál A, Nagy Z. (2006) Talampanel a noncompetetive AMPA antagonist attenuates Caspase-3 dependent apoptosis in mouse brain after transient focal cerebralbischemia, Brain Res Bull, 70: Denes L, Szilagyi G, Gal A, Bori Z, Nagy Z. (2006) Cytoprotective effect of two synthetic enhancer substances, (-)- BPAP and (-)-Deprenyl, on human brain capillary endothelial cells and rat PC12 cells, Life Sci., 2006; 79: Nagy Z, Bori Z, Gál A, Wappler E. (2007) Új célok az agyi ischaemia gyógyszeres kezelésében, Orvosképzés, LXXXII évf. 1. szám Wappler EA, Szilagyi G, Gal A, Skopal J, Nyakas C, Nagy Z, Felszeghy K. (2009) Adopted cognitive tests for gerbils: Validation by studying ageing and ischemiaadopted cognitive tests for gerbils: Validation by studying ageing and ischemia, Physiology & Behavior, 97: Pál Z, Kiss E, Gál A, Csépány T, Lengyel A, Molnar MJ. Genetically determined neuropathy (CMT 1A) accompanied by immune dysfunction: a case report. Inflamm Res Mar 10 - DOI /s Vannay A, Fekete A, Langer R, Tóth T, Sziksz E, Vásárhelyi B, Szabó AJ, Losonczy G, Adori C, Gál A, Tulassay T, Szabó A. 17

19 (2009) Dehydroepiandrosterone pre-treatment alters the ischemia / reperfusion induced VEGF, IL-1 and IL-6 gene expression in acute renal failure, Kidney & Blood Pressure Research, 32: Pal Z, Gal A, Remenyi V, Tordai A, Molnar MJ. Oestrogen receptor alpha gene intronic polymorphisms and autoimmune myasthenia gravis in Caucasian women, Neuromuscular Disorders, in Press 6.4. Nem az értekezés témájában megjelent idézhető absztraktok 1. Denes L, Szilágyi G, Gal A, Nagy Z. (2006) Talampanel, a noncompetitive AMPA antagonist attenuates Caspase-3 dependent apoptosis in mouse brain after transient focal cerebral ischemia. 15th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases, Vol. 21, Suppl. 4: Dénes L, Gál A, Szilágyi G, Bori Z, Miklya I, Nagy Z. (2006) Pharmacological attenuation of apoptosis of human brain capillary endothelial cell by (-)BAP in a model of hypoxia / reoxygenation. 15th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases. 21, Suppl. 4: Dénes L, Bori Z, Szilágyi G, Gál A, Nagy Z. (2005) A new neuroprotective drug candidate prevents cell injury induced by hypoxia/reoxygenation (by Benzofuran- propilaminopentan / BPAP), 14th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases, 19, Suppl Wappler EA, Gal A, Szilagyi G, Vajda J, Skopal J, Felszeghy K, Nyakas C, Nagy Z. (2007) Effect of high-dose oestrogen therapy on cerebral plasticity after transient forebrain ischaemia in gerbil. 18

20 16th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases. 23, Suppl. 2: Molnar MJ, Gilbert R, Gal A, Karpati G. (2009) Sonoporation of human biceps muscle as preparation for plasmid-based dystrophin gene transfer. American Academy of Neurology, AAN 61st Annual Meeting Neurology. 72 (Suppl. 3): Pal Z, Gal A, Remenyi V, Pentelenyi K, Molnar MJ. (2009) No association of oestrogen receptor dene polymorphisms with myasthenia gravis. Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 17 Suppl. 2: Gal A, Mede K, Remenyi V, Wiess S, Goelnitz U, Molnar MJ. (2009) Synergistic effect of spastin gene mutations in a Hungarian patient with hereditary spastic paraplegia (HSP). Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 17 Suppl. 2: Pentelenyi K, Gal A, Wiess S, Friday D, Molnar MJ. (2009) Novel point mutations in the senotaxin gene of three patient with ataxia and oculomotor apraxia type 2 (AOA2). Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 17 Suppl. 2: