Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei. Dr. Bártfai Zoltán. Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Pulmonológiai Klinika

Átírás

1 Újabb tenyésztésen, valamint nukleinsav amplifikációs módszereken alapuló technikák alkalmazása a Mycobacterium tuberculosis primér izolálására és rifampicin rezisztenciájának meghatározására Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Dr. Bártfai Zoltán Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Pulmonológiai Klinika Témavezető: Dr. Somoskövi Ákos Budapest, 2003

2 1.Bevezetés A tuberkulózis továbbra is jelentős népegészségügyi kihívást jelent a Föld minden pontján. Ismételt fellángolásában elsősorban gazdasági és szociális tényezők, a humán immundeficiencia vírus (HIV) és a tuberkulózis közötti szinergizmus, valamint a XX. század végén újabb komoly fenyegetésként megjelent rezisztens és multidrog rezisztens tuberkulózis terjedése játszik kiemelkedő szerepet. Magyarországon 20 év csökkenés után a pulmonalis tuberkulózis incidenciája 1990 és 1999 (a vizsgálatra került törzsek izolálásának éve) között 18,1%-kal növekedett (31,0-ről 36,6 per lakosra nőtt). Ezen belül Kelet- Magyarország területén Borsod-Abaúj-Zemplén, Hajdú-Bihar és Szabolcs-Szatmár-Bereg megyékben a legnagyobb a tuberkulózis incidenciája (38,7, 51,5, illetve 56,7 per lakos), illetve a drog-rezisztens tuberkulózis előfordulása. A mycobacteriumok izolálására használt talán legismertebb táptalaj a tojás alapú, szilárd Löwenstein-Jensen (LJ) táptalaj. Azonban a LJ táptalajon a Mycobacterium tuberculosis complex telepei ritkán jelennek meg korábban mint 6-8 hét. Az izolálást követő identifikálás, majd rezisztencia meghatározás további 3-6 héttel növelheti ezt az amúgy is tetemes tenyésztési időt. Mindemellett a LJ táptalajon való tenyésztés érzékenysége nem haladja meg a 70-80%-ot. Ezzel szemben folyékony táptalajon tenyésztve a tenyésztési idő a minta mycobacterium tartalmától függően 1-3 hétre lerövidíthető, emellett a folyékony táptalajok szenzitivitása 90% feletti. A Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) egyre gyakoribb, és komoly problémákat okozó antituberkulotikumokkal szembeni rezisztenciájának kialakulásában az eddigi genetikai vizsgálatok szerint vagy a gyógyszer támadáspontját kódoló génekben, vagy a gyógyszer aktiválásáért felelős enzimeket kódoló génekben kialakuló spontán pontmutációk a felelősek. A rezisztenciával kapcsolatos pontmutációk, deléciók és inzerciók az összes elsővonalbeli szernél (isonicid (INH), rifampicin (RMP), pyrazinamid (PZA), ethambutol (EMB) és streptomycin (SM)) és már néhány másodvonalbeli újabb szernél (ethionamid, fluorokinolonok, makrolidek, nitroimidazopirin) is felismerésre kerültek. Miután az RMP az egyik legfontosabb antituberkulotikum, az RMP-rezisztencia minél gyorsabb és pontosabb kimutatása nagy jelentőséggel bír. Az RMP-rezisztens M. tuberculosis törzsek több mint 96%-ában találhatók olyan mutációk a ribonukleinsav (RNS) polimeráz -alegység (rpob) gén 81 bázispárnyi (bp) core régiójában, melyek aminosav cseréhez vezetnek. Mindezek miatt fontos szem előtt tartani a Center for Disease Control and Prevention jelenlegi ajánlását, miszerint a Mycobacterium tuberculosis complex izolálása, identifikálása 2

3 valamint az ezt követő rezisztencia vizsgálatok lehetőleg a mintavétel időpontjától számított 2-3 (izolálás, identifikálás) illetve 2-5 (rezisztencia meghatározás) héten belül történjenek meg. Ahhoz, hogy ez az ajánlás a gyakorlatban is megvalósítható legyen, nélkülözhetetlen egyrészt az újabb folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszerű alkalmazása, másrészt az antituberkulotikum- és ezek közül is az egyik legfontosabb, a rifampicin-rezisztencia minél gyorsabb és pontosabb kimutatása. 2. Célkitűzések A teljesen automatizált Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) 960 folyékony táptalaj alapú rendszer magyarországi bevezetése a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikáján. A teljesen automatizált MGIT 960 folyékony táptalaj alapú rendszer értékelése az érzékenység és az átlagos tenyésztési idő vonatkozásában a Bactec 460TB rendszerrel valamint a hagyományos LJ táptalajon végzett tenyésztéssel összevetve a M. tuberculosis primer izolálását illetően. Magyarországon izolált RMP-rezisztens M. tuberculosis izolátum rezisztencia profiljának meghatározása az első vonalbeli antituberkulotikumokra (INH, RMP, EMB és SM). Magyarországon izolált RMP-rezisztens M. tuberculosis izolátum RMP rezisztenciával összefüggésbe hozható, az rpob génen jelenlévő mutációk kimutatása és karakterizálása. 3. Módszer és eszközök 3.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein- Jensen táptalajon való tenyésztéssel Betegek, minták A vizsgálatok a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikájának Mycobacteriológiai Laboratóriumában történtek. A 243 betegből származó 377 klinikai minta (288 köpet, 51 bronchoalveolaris lavage vagy bronchialis váladék aspirátum, 32 gyomormosó 3

4 folyadék, és 6 pleuralis fluidum) március 29. és május 31. között került levételre. Valamennyi beteg HIV negatív volt A minták előkészítése Minden klinikai minta a Kent és Kubica által leírt N-acetyl-L-cystein-NaOH metodikának megfelelő emésztésen és dúsításon esett át. A dekontaminációt és dúsítást követően mikroszkópos vizsgálat céljából a minták koncentrált üledékből keneteket készíttettünk, melyeket Ziehl-Neelsen (ZN) szerint festettünk meg Leoltás A feldolgozott mintából 0,5 ml-t injektáltunk a BACTEC MGIT 960 csőbe, 0,5 ml-t a BACTEC 12B palackba, és 0,2-0,2 ml-t 2 LJ táptalajra. Minden leoltott táptalajt 37 0 C-on inkubáltuk. A BACTEC MGIT 960 csöveket a gyártó cég utasításainak megfelelően helyeztük el a BACTEC MGIT 960 automatába és teszteltük mindaddig, amíg pozitívnak nem mutatkozott, vagy egyébként 6 hétig, amelynek végén negatívként adtuk ki a mintát. A BACTEC 12B csöveket az első két héten hetente két alkalommal mértük le a BACTEC 460 TB műszerrel, majd további 4 héten át hetente egy alkalommal. Amikor a BACTEC 12B cső növekedési indexe elérte a 10 mértéket, a csövet naponta ellenőriztük mindaddig, amíg a növekedési index el nem érte a 100 értéket, amikor is a mintát pozitívnek tekintettük. Amennyiben 6 hét elteltével sem sikerült 14 CO 2 termelést kimutatni, a BACTEC 12B csőben levő mintát negatívnak tartottuk. A LJ táptalajt 8 héten át hetente vizsgáltuk mycobacterium telepek megjelenését keresve. Mind a folyékony, mind a szilárd táptalajon észlelt mycobacterialis növekedés esetén továbbiakban a párhuzamos táptalajokon naponta végeztünk leolvasást. A detektálás napján minden pozitív folyékony vagy szilárd táptalajt ZN festéssel vizsgáltunk meg a saválló baktérium jelenlétének megerősítése céljából. A kontamináció kizárása céljából Columbia agarra is leoltottuk (bio-merieux Microbiology Systems, Marcy l Etoile, France). A mikroszkóppal pozitívnak talált tenyészetet AccuProbe nukleinsav hibridizációs teszt (Gen- Probe, San Diego, Calif.) és hagyományos biokémiai tesztek segítségével identifikáltuk Magyarországról származó Mycobacterium turberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével Betegek, klinikai minták 4

5 A vizsgálat során elemzett 29 RMP-rezisztens törzs Borsod-Abaúj-Zemplén, Hajdú- Bihar és Szabolcs-Szatmár-Bereg megyék megyékből származó 29 esetből került izolálásra 1999 során. A vizsgált betegek közül kettőt tuberkulózis miatt korábban még nem kezeltek, 27 beteg előzőleg már állt kezelés alatt tuberkulózis miatt Kontrollok és identifikálás Kontrollként H37Rv American Type Culture Collection M. tuberculosis referencia törzset és hat olyan klinikai M. tuberculosis izolátumot használtunk, melyek mind a négy elsővonalbeli antituberkulotikumra érzékenyek voltak Hagyományos rezisztencia meghatározás A 36 izolátum INH, RMP, EMB, valamint SM érzékenységét a proporciós módszerrel határoztuk meg LJ táptalajon, Canetti és munkatársai közlése szerint DNS szekvenálás Vizsgálataink során két molekuláris tesztet alkalmaztunk. Először két, a RMPrezisztenciával összefüggő rpob régiót amplifikáltunk polimeráz láncreakcióval (PCR-rel), majd szekvenálással meghatároztuk az amplifikált dezoxiribonukleinsav (DNS) szakasz bázissorrendjét. Ezután a DNS szekvenálás eredményét összehasonlítottuk a kereskedelemben kapható gyors teszt, a PCR-alapú reverz hibridizációs line-probe teszt (Inno-LiPA Rif. TB Test (LiPA); Innogenetics N.V., Ghent, Belgium) eredményeivel. Rpo95 (5 -CCACCCAGGACGTGGAGGCGATCACACCG-31) és rpo397 (5 - GTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACG-3 ) primérek segítségével, melyek az rpob 81 bp-nyi core régióját fogják közre, a 36 izolátum mindegyikéből egy 329 bp-nyi terméket állítottunk elő PCR alkalmazásával. Ugyanezekkel a primérekkel történt az amplifikált DNS szakasz mindkét szálának szekvencia analízise is, automata Applied Biosystems 377 DNS szekvenáló segítségével (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Ismert tény, hogy néhány olyan RMP-rezisztens törzsben, ahol a 81 bp régióban mutáció nem észlelhető (vad-típus), egy V146F mutáció található az N-terminális régióban. Ennek a mutációnak a kimutatására a Tb176-f (5 -CTTCTCCGGGTCGATGTCGTTG-3 ) és Tb176-r (51-CGCGCTTGTCGACGTCAAACTC-3 ) primérekkel végeztünk amplifikációt és szekvenálást. 5

6 Line Probe Assay A Line Probe Assay (LiPA) teszttel, a gyártó utasításainak megfelelően egy biotinnal jelölt 256 bp-nyi rpob gén fragmentumot amplifikáltunk a hővel elölt mintákból. A biotinnal jelölt PCR terméket denaturálást követően 10 specifikus oligonukleotid próbával hibridizáltuk (19-23 bázis hosszú). Az első próba a M. tuberculosis komplexre specifikus, további öt (S1- S5) pedig egymást részlegesen átfedve a vad-típusra (RMP érzékeny) jellemző DNS szakasz komplementere az rpob gén es aminosavakat kódoló régiójának megfelelően. A négy másik próba az rpob génen belül előforduló leggyakoribb mutációkra specifikus: D516V, H526Y, H526D és S531L, (R2, R4a, R4b és R5 próbák). 4. Eredmények 4.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein- Jensen táptalajon való tenyésztéssel 1.táblázat. A BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalaj érzékenysége a mycobacteriumok és a M. tuberculosis izolálását illetően, valamint a kontaminált tenyészetek aránya az egyes táptalajokra vonatkoztatva. Az izolált törzsek száma (%) a Táptalaj Minden mycobacterium M. tuberculosis NTM Kontaminált (%) b (MTB+NTM) BACTEC MGIT (96,5) 53 (96,4) 2 (100) 14 (3,7) BACTEC 12B 53 (93,0) 51 (92,7) 2 (100) 11 (2,9) LJ 46 (80,7) 45 (81,8) 1 (50) 4 (1,2) a Az izolált mycobacteriumok teljes száma 57 volt, ebből 55 M. tuberculosis, 2 NTM volt. Emellett 17 tenyészet kontaminált volt. A chi négyzet teszt az egyes táptalaj típusok érzékenysége közötti különbségekre vonatkoztatva a mycobacteriumok izolálását illetően: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj: 6

7 p < 0,05 (szignifikáns). A chi négyzet teszt az egyes táptalaj típusok érzékenysége közötti különbségekre vonatkoztatva a M. tuberculosis izolálását illetően: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj: p < 0,05 (szignifikáns). b Az összes leoltásra került mintaszám százalékában megadva. MTB: Mycobacterium tuberculosis, NTM: nem tuberculosist okozó mycobacteriumok. 2. táblázat. Az átlagos tenyésztési idők az összes mycobacteriumokra és M. tuberculosisra vonatkoztatva. A kimutatás napjainak átlaga napokban (tartomány) a M. tuberculosis Táptalaj Mycobacterium Mikroszkóposan pozitív Mikroszkóposan negatív BACTEC MGIT ,2 (6-24) 12,6 (8-18) 15,8 (6-24) BACTEC 12B 16,8 (8-23) 13,8 (8-23) 17,7 (9-23) LJ 36,2 (14-58) 20,1 (14-27) 42,2 (18-58) a ANOVA, p < 0,001. Newman-Keuls teszt a mycobacteriumok és a M. tuberculosis átlagos tenyésztési idejét illetően az egyes táptalaj típusokon: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj, p < 0,001 (szignifikáns), BACTEC 12B versus LJ táptalaj, p < 0,001 (szignifikáns). 4.2.Magyarországról származó Mycobacterium turberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével A 29 RMP-rezisztens izolátumból csupán két (6,95%) olyan törzs volt, amely csak RMP-re mutatott rezisztenciát. Huszonhat (89,7%) törzs a RMP-rezisztencia mellett INH-ra is (így multidrog rezisztensnek minősült), 18 (62,1%) EMB-ra is, és 9 (31,0%) SM-re is rezisztens volt. A vizsgált 29 törzsből összesen 20 olyan izolátum fordult elő (70,0%), amely legalább három elsővonalbeli szerre rezisztens volt. A korábbi közleményekkel ellentétben a mutációk előfordulási gyakorisága eltérő volt az általunk vizsgált kelet-magyarországi izolátumokban, mivel 11 (37,95%) izolátumban a kevésbé gyakori D516V mutáció volt kimutatható. Kilenc izolátumban (31,05%) az S531L mutációt észleltük, míg kettőben (6,95%) a H526D mutációt. Ezeket a mutációkat a LiPA 7

8 teszttel is azonosítani tudtuk. Emellett a DNS szekvenálás során egy eddig az irodalomban még nem szereplő kettős mutációt (S509T és D516V), valamint egy deléciót ( deléció) is sikerült kimutatnunk. Ebben a két esetben a LiPA a mutáció pontos típusát nem volt képes azonosítani, de genetikai eltérés jelenlétét jelezte. Emellett azonban a LiPA teszt két további törzs esetében sem volt képes azonosítani két további ritkán előforduló mutáció típusát (Q513K és Q513P). Ráadásul a teszt álrezisztenciát jelzett az egyik teljesen érzékeny kontroll törzs néma mutációja esetében (R529R). Vizsgálatunkban a LiPA a 29 RMP-rezisztens törzs közül 26 (89,7%) esetben jelezte genetikai eltérés jelenlétét, de csak 22 esetben volt képes a mutáció típusát is meghatározni (75,9%). A LiPA ugyanis a mutáció típusát csak a négy leggyakoribb rpob gén mutációjának esetében képes azonosítani (S531L, H526Y, H526D és D516V), míg az egyéb mutációk esetében csak a genetikai eltérés jelenlétét mutatja. 5. Megbeszélés 5.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein- Jensen táptalajon való tenyésztéssel A 377 leoltásra került klinika mintából 57 (15,1%) esetében észleltük mycobacterium növekedését. Az 57 mycobacterium pozitív mintából 14 (24,6%) mikroszkóposan saválló baktérium pozitív, 43 (75,4%) pedig mikroszkóposan negatív volt. A mycobacterium fajok közül M. tuberculosis (n=55), M. avium complex (n=1), és M. xenopi (n=1) volt identifikálható. A BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalajon izolált mycobacteriumok száma az 1. táblázatban került megadásra. A BACTEC MGIT 960 az 55 M. tuberculosis izolátumból 53 (96,4%), a BACTEC 12B 51 (92,7%), míg a LJ táptalajon történő tenyésztés 45 (81,8%) esetben észlelte a kórokozó jelenlétét. A BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj között statisztikailag szignifikáns különbség volt kimutatható (p < 0,05), míg a BACTEC 12B és LJ, valamint a két folyékony táptalaj közötti különbség nem volt szignifikáns. A 14 mikroszkóposan pozitív törzs mindhárom táptalajtípuson növekedést mutatott, és a törzsek mindegyike M. tuberculosis-nak bizonyult az identifikálást követően. A mikroszkóposan negatív M. tuberculosis-t tartalmazó minták esetében a tenyésztés 8

9 szenzitivitása 95,1% (39/41) volt a BACTEC MGIT 960, 90,2% (37/41) a BACTEC 12B, és 75,6% (31/41) a LJ táptalajon (1. táblázat). Ismét statisztikailag szignifikáns különbség volt kimutatható a BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj között (p < 0,005). A BACTEC 12B és LJ, valamint a két folyékony táptalaj közötti különbség nem volt szignifikáns. A NTM száma a jelen vizsgálatban túl alacsony volt megbízható statisztikai számítások végzéséhez. A szenzitivitást meghatároztuk a két folyékony táptalaj és a LJ táptalaj kombinációjára vonatkoztatva is, amely a M. tuberculosis-ra vetítve 96,4% (53/55) volt a BACTEC MGIT 960 és LJ táptalaj, illetve 92,7% (51/55) volt a BACTEC 12B és LJ táptalaj kombinációja esetében. A statisztikai analízis nem mutatott szignifikáns különbséget a két kombináció között. Az egyes táptalaj típusokon észlelt kontamináció mértéke (az összes leoltásra került mintaszám százalékában megadva) a BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalaj esetén 3,7%, 2,9% illetve 1,2% volt (1. táblázat). A M. tuberculosis t illető átlagos izolálási idő BACTEC MGIT 960 esetén 14,3 (6-24) nap, BACTEC 12B esetén 16,6 (8-23) nap, LJ táptalaj esetén pedig 35,8 (14-58) nap volt. Az ANOVA és a Newman-Keuls teszt statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott a BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj, valamint a BACTEC 12B és a LJ táptalaj tenyésztési idejei között (p < 0,001 mindkét esetben). A két folyékony táptalaj tenyésztési idejei között nem volt szignifikáns különbség. A mycobacteriumok és a M. tuberculosis növekedésének észlelhetőségéig eltelt átlagos tenyésztési idők a mikroszkópos vizsgálat eredményét is tekintetbe véve a 2. táblázatban kerültek összefoglalásra. A M. tuberculosis izolálási ideje a mikroszkóposan pozitív törzsek esetén hasonló volt a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 és a BACTEC 12B (12,6 versus 13,8 nap) esetében. Vizsgálatunkban a mikroszkóposan negatív törzsek esetén a M. tuberculosis átlagos tenyésztési ideje a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 esetén minimálisan volt csak rövidebb mint a BACTEC 12B-vel (15,8 versus 17,2 nap) Magyarországról származó Mycobacterium turberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével Eredményeink azt jelzik, hogy az olyan földrajzi területeken, mint amilyen a vizsgált Kelet-Magyarország is, ahol az rpob gén ritka mutációi, illetve korábban még nem ismert mutáció típusok gyakrabban fordulnak elő, a LiPA teszt eredményének értékelése bonyolultabb és nagyobb körültekintést igényel. Ebben a környezetben elengedhetetlen a 9

10 mutáció pontos típusának (és a következményes aminosavcserének) DNS szekvenálással való azonosítása, mivel az álpozitív RMP-rezisztencia eredmény csak így kerülhető el. Bár az esetek döntő többségében (96%) a mutációk a 81 bp-nyi centrális régiót is tartalmazó ú.n. I. cluster-ban ( aminosav régió) fordulnak elő, RMP rezisztenciát eredményező ritkább mutációkat találtak az rpob N-terminális (kodon 174 és 381) aminosav szakaszán, valamint a II. ( aminosav régió) és III. (kodon 679 és 687) cluster-okban is. Vizsgálatunk során három olyan RMP-rezisztens izolátumot találtunk, ahol sem a 81 bp régió DNS szekvenálása, sem a LiPA vizsgálat nem mutatott mutációt. Ugyanakkor a fenti három izolátum egyikénél a ritka N-terminális V146F mutáció volt kimutatható a DNS szekvenálással. A többi vizsgált törzs esetében ebben a régióban a RMP-érzékeny törzsekre jellemző vad allélt lehetett kimutatni. Az a két izolátum, ahol egyik régió (N-terminális vagy 81 bp régió) vizsgálata sem mutatott mutációt, arra utal, hogy a molekuláris vizsgálatok eredményeinek hagyományos tesztekkel való megerősítése továbbra is szükséges. Mivel a rutinszerűen használt DNS szekvenálási módok során általában csak az rpob gén 81 bp régióját elemzik, javasoljuk, hogy azokban az esetekben, ahol a hagyományos érzékenységi vizsgálat alapján rezisztencia igazolódik, de a 81 bp régióban nincs kimutatható mutáció, a V146F mutáció szűrővizsgálatát is végezzék el. 6. Záró következtetések Eredményeink összefoglalása alapján elmondható, hogy a nemzetközileg a közelmúltban, Magyarországon pedig elsőként a laboratóriumunkban bevezetésre került, teljesen automatizált 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszer megbízható alternatívája lehet a félautomata és jelenleg standard módszernek tekintett radiometriás BACTEC 460TB rendszernek a M. tuberculosis gyorsabb és érzékenyebb izolálására, és ezáltal a tuberkulózis definitív diagnózisának mihamarabbi felállításában. A 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszernek köszönhetően a hagyományos LJ táptalajnál gyorsabb izolálás révén a klinikus számára szükséges rezisztencia vizsgálatok is lényegesen hamarabb rendelkezésre állnak. A BACTEC 460TB rendszerrel ellentétben a BACTEC MGIT 960 módszer nem radiometriás, nincs szükség injekciós tűkre a minta leoltásához, ezáltal kevésbé balesetveszélyes is. A teljesen automatizált 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszer használatakor nem szükséges a mérési napokon a mérő automata feltöltése a vizsgálandó tenyészetekkel, és a leolvasási és mérési időpontok előjegyzése sem, úgy mint a manuális vagy félautomatizált BACTEC 10

11 460TB rendszer esetén. Ezen felül a BACTEC MGIT 960 a teljes automatizáltság miatt kevesebb laboratóriumi munkát igényel, amely által többlet időt biztosít a laboratórium dolgozóinak az egyéb feladatok elvégzésére. Az antituberkulotikum rezisztencia molekuláris mechanizmusainak megismerése és ezen keresztül a molekuláris biológiai módszereknek az antituberkulotikum rezisztencia rutin kimutatásában való alkalmazása jelentős áttörést eredményezett a klinikai mycobacteriológiában. Magyarországon elsőként alkalmazva nukleinsav amplifikációs módszert antituberkulotikum rezisztencia kimutatására arra a felismerésre jutottunk, hogy a kelet-magyarországi RMP-rezisztens M. tuberculosis törzsek mutációinak gyakorisága különbözik az egyéb földrajzi területekről származó törzsek mutációinak gyakoriságától (Afrika, Ázsia, Ausztrália, Brazília, Németország, Görögország, Olaszország, Amerikai Egyesült Államok). Az rpob gén két szakaszának DNS szekvenálása 27 (93.1%) törzsnél mutatott ki mutációt a 29 rezisztens törzsből, míg a LiPA teszttel 26 izolátumnál sikerült azonosítani a mutációt (89.7%). Eredményeink azt jelzik, hogy a RMP-rezisztencia kimutatására használt molekuláris tesztek DNS szekvencia analízissel történő validálása, valamint a különböző mutáció típusok egyes földrajzi területekre jellemző gyakoriságának meghatározása, az adott teszt rutin klinikai gyakorlatba történő bevezetését megelőzően elengedhetetlen. A megfelelően bevezetett és alkalmazott RMP-rezisztencia molekuláris tesztek viszont gyors segítséget jelenthetnek a klinikus számára a MDR tuberkulózis korai felismerésében. 11

12 7. Köszönetnyílvánítás Ezúton is szeretnék köszönetet mondani minden munkatársamnak, kollégámnak, akikkel együtt dolgozhattam a Ph.D. értekezés elkészültéhez vezető úton: Dr. Somoskövi Ákosnak Prof. Dr. Magyar Pál Prof. Dr. Hutás Imre Dr. Linda M. Parsons Dr. Max Salfinger Ködmön Csaba Dr. Mester Judit Dr. Szabó Nóra Dr. Faragó Eszter Dr. Puskás Erzsébet Kosztolányi Lászlóné Gulyás Katalin Szilágyi Zsuzsanna Dombai Ágnes SE Pulmonológiai Klinika minden dolgozója 12

13 8. Az értekezés témájával összefüggő közlemények I. Somoskövi Á., Ködmön Cs., Lantos Á., Bártfai Z., Tamási L., Füzy J., Magyar P.: Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and Löwenstein-Jensen Medium. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: IF: 3,965 II. Bártfai Z., Somoskövi Á., Hutás I.: A tuberculosis járványtana, terjedése, patológiája, diagnosztikája és klinikai megjelenési formái. Családorvosi Fórum 2001; január: III. Bártfai Z., Somoskövi Á., Hutás I.: A tuberculosis elleni küzdelem, a betegség gyógykezelése, a betegek gondozása, Családorvosi Fórum, 2001; január: IV. Bártfai Z., Somoskövi Á.: Néhány gondolat a tuberculosis gyógyszeres kezeléséről. Családorvosi Fórum, 2001; január:20. V. Bártfai Z., Somoskövi Á., Ködmön CS., Szabó N., Puskás E., Kosztolányi L., Faragó E., Mester J., Parsons L.M., Salfinger M.: Molecular characterization of rifampin-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the Line Probe Assay. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: IF: 3,965 VI. Somoskövi Á., Bártfai Z., Ködmön Cs., Hutás I.: A Mycobacterium tuberculosis komplex direkt kimutatására szolgáló polimeráz láncreakción alapuló gyorsteszt rutinszerű alkalmazása magyarországi betegpopuláción, Orvosi Hetilap, 2001; 38: VII. Mester J., Vadász I., Bártfai Z., Ködmön Cs., Somoskövi Á.: A Mycobacterium tuberculosis antituberkulotikum-rezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis 2002; 55: VIII. Bártfai Z., Somoskövi Á., Ködmön Cs., Szabó N., Puskás E., Kosztolányi L., Faragó E., Mester J., Parsons L.M., Magyar P., Salfinger M.: Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicin - rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével, Medicina Thoracalis, 2002; 55: