PÁL ILDIKÓ. Témavezetők: Zsély István Gyula és Turányi Tamás Kémiai Intézet

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat PÁL ILDIKÓ Egy általános sejtciklus-modell vizsgálata érzékenységanalízissel Témavezetők: Zsély István Gyula és Turányi Tamás Kémiai Intézet Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2008

2 Tartalomjegyzék. Bevezetés Irodalmi áttekintés A sejtciklus és modelljei Az általános sejtciklus modell alapvetések Az általános sejtciklus modell a matematikai modell Célkitűzések Programok a sejtciklus modellezésére és a modellek vizsgálatára Eredmények A számított koncentráció idő görbék A modell robosztusságának vizsgálata a paraméterek egyenkénti változtatásának hatása A modell robosztusságának vizsgálata Monte Carlo analízissel Lokális érzékenységanalízis Az érzékenységi függvények alakja Az érzékenységi függvények periodikussá tétele Az érzékenységi függvények csoportosítása Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék

3 . Bevezetés Az ELTE Fizikai Kémiai Tanszékén évek óta foglalkoznak új matematikai és informatikai eszközök kifejlesztésével reakciókinetikai modellek vizsgálatára. Vizsgálták a troposzférában, valamint robbanásokban, lángokban, halogénlámpában és légköri nyomású plazmakisülésben lejátszódó folyamatok kémiai kinetikai modelljeit. Ezekben a folyamatokban közös, hogy a modelljük sokváltozós, csatolt, közönséges vagy parciális differenciálegyenlet-rendszer, esetleg algebrai egyenletekből álló részmodellel. A kifejlesztett módszerek alkalmasak élőlények sejtciklusa enzimkinetikai modelljeinek vizsgálatára is, hiszen ezek a modellek is differenciál-algebrai egyenletrendszereken alapulnak. Az elmúlt években Lovrics Anna a diákköri munkája (Lovrics, 2005), majd a diplomamunkája (Lovrics, 2006) során a sarjadzó élesztő (Saccharomyces cerevisie) sejtciklusának egy modelljét vizsgálta. Ezekről az eredményekről folyóiratcikkeket is közöltek (Lovrics és munkatársai, 2006), (Lovrics és munkatársai, 2008). TDK munkám Lovrics Anna vizsgálatainak egyfajta folytatása. Csikász-Nagy Attila, Dorjsjuren Battogtokh, Katherine C. Chen, Novák Béla és John J. Tyson 2006-ban a Biophysical Journal című folyóiratban közöltek egy általános sejtciklus modellt (Csikász-Nagy és munkatársai, 2006). Ez a modell már négy élőlény sejtciklusát képes leírni. Ebben a TDK dolgozatban beszámolunk arról, hogy milyen eredményeket hozott a sarjadzó élesztőre kifejlesztett módszerek alkalmazása erre az általános sejtciklus-modellre. 3

4 2. Irodalmi áttekintés 2.. A sejtciklus és modelljei A sejtciklus azok az események együttese, amelyek a sejtosztódás kezdetétől (mitózis) a következő sejtosztódásig lejátszódnak. A sejtciklus alapvetően két szakaszra osztható az interfázisra és az osztódásra. A maganyag kettéosztódását (mitózis) a citoplazma kettéválása (citokinézis) követi. A folyamat eredményeként két utódsejt, más szóval leánysejt képződik. A sejtosztódás fiziológiájának kutatása az ötvenes években kezdődött a rákbetegségek mélyebb megértésének problémájával. Az. ábrán egy osztódó sejt látható, melynek mikrotubulusait és DNS-ét fluoreszcens módszerrel tették láthatóvá. A kép a honlapról tölthető le.. ábra. Az ábra egy teljes osztódási ciklust mutat be. A sejt sejtmagi DNS-e kék színű, míg az osztódásban részt vevő mikrotubulusok zöld színűek. A sejtciklust G, S, G2, és M szakaszokra oszthatjuk fel, valamint nem osztódó sejteknél megkülönböztethetünk G0 fázist is. A G fázisban a kromoszómák egy DNS-molekulából állnak, amelyek az S (szintézis) fázisban duplikálódnak. Az S fázist a G2 fázis követi, majd a sejt a mitózisba lép. A G az angol gap (rés) szóból származik, és azt jelzi, hogy az S és M fázisokat időintervallum választja el egymástól. Az M fázisban (mitózisban) történik a megkettőződött DNS-láncok szétválása, majd a kromoszómák szegregációja és a sejt kettéosztódása. A mitózis során az utódsejtek tömege nem minden esetben egyezik meg a kiindulási sejtével, vagyis nem mindig osztódik equalisan. A kisebb méretű utódsejtnek ezért 4

5 növelnie kell a tömegét, mielőtt újra osztódhat; ez különösen az élesztőfajokra jellemző. Tehát ezek az úgynevezett gap szakaszok az osztódást segítik elő és felkészítik a sejtet. Nem minden sejt hajtja végre következetesen az összes fázist, például a sarjadzó élesztőben kimarad a G2-es fázis. Az egyes fázisok határán ún. ellenőrzési pontok ( checkpoint ) vannak, amelyek a továbblépést csak akkor engedélyezik, ha a sejt az adott fázisra jellemző részfolyamatokat már végrehajtotta. Például csak akkor léphet a sejt a mitózis fázisba, ha a DNS már replikálódott, tehát megelőzte az M fázist. (Kovács János, 999; Csaba György, 990) A 2. ábra a sejtciklus fázisait és azok történéseit mutatja be szemléletesen. Az ábra a következő honlapról letölthető: 2. ábra. Az ábra a sejtciklus fázisait és történéseit mutatja be. A rózsaszín körök a sejtek sejtmagját, a bennük található fekete vonalak, pedig a DNS-állományt jelképezik. A növekedési és osztódási folyamatok összehangolását molekuláris szabályozók végzik. A legfontosabb folyamatokban a ciklin-dependens kinázok (CDK) játszanak főszerepet. A ciklin és a ciklin-dependens kinázok területén tett felfedezéseikért Leland H. Hartwell, R. Timothy Hunt és Paul M. Nurse 200-ben orvostudományi Nobel-díjat kaptak (Nurse, 992). A ciklindependens kinázok heterodimert alkotnak a ciklinekkel (regulációs alegység), aktivitásuk a ciklinek függvénye. A ciklin a katalitikus alegység, mivel a CDK csak ennek jelenlétében aktív. A CDK/ciklin-komplexek más fehérjék foszforilezése révén fejtik ki hatásukat és fontos szerepet játszanak a DNS-replikáció és a mitózis elindításában. Alacsonyabb rendű 5

6 eukariótákban csak egyféle CDK-alegység fordul elő, míg magasabb rendűekben többféle CDK is jelen van. A ciklinekre jellemző, hogy míg az élesztőben a CDK/ciklin-B komplex indítja el a DNS-replikációt és a mitózist is, addig a többsejtű szervezetekben A, D, E jelű ciklinek is megtalálhatók, amelyek különféle CDK-kal kapcsolódva más-más folyamatot befolyásolnak. A ciklin D a G fázisban aktív, a ciklin E az S fázis indításában kap igen fontos szerepet, míg a ciklin A az S fázis lezárásáért felelős és egészen az M fázis megindulásáig jelen van. A CDK/ciklin komplexek közül a CDK-nek a B jelű ciklinnel alkotott komplexe (CycB M vagy M-fázist segítő faktor, röviden MPF) talán a legősibb, mivel ez a mitózis és a DNS-replikáció elindítását együttesen képes elvégezni (csak élesztő fajok esetén). Mivel a DNS-replikáció megelőzi az M-fázist, ezért ennek kisebb kell hogy legyen a CDK/ciklin aktivitási igénye. A két folyamat elkülönüléséhez szükséges, hogy az MPF mennyisége kis és nagy értékek között változzon a sejtciklus alatt. Az MPF nemcsak serkentő, hanem gátló hatású is. Gátolja a DNS-replikációja után annak újramásolását: foszforilezi az ún. engedélyfehérjéket (licencing factor). Ezek a fehérjék a DNS azon szakaszaira kötődnek, ahol a következő S-fázisban megindul a replikáció, majd azt követően ubikvitinálódnak és a proteoszómákon lebomlanak. Tehát léteznie kell egy olyan szakasznak, amelyben az MPF aktivitása kicsi és az engedélyfehérjék képesek képződni. Ez a G-fázisban következik be. Az MPF aktivitásának megszüntetésében fontos szerepet játszik az anafázist serkentő faktor (APC). Az APC bizonyos fehérjék ubikvitinezését végzi, amelyek így lebontódnak. Az APCnek fontos szerepe van: a kromoszómákat összeragasztó fehérjék lebontása és az MPF aktivitásának megszüntetése az osztódás befejeztével. Az MPF aktivitását további ellenségmolekulák szabályozzák, ezek különböző módokon gátolják az MPF protein kináz aktivitását. Az MPF viszont képes ellenségmolekulái inaktiválására, ezért antagonisztikus versengés indul meg közöttük. Az MPF egy másik ellenségmolekulája a sztöchiometrikus CDK inhibitor (CKI). A CKI sztöchiometrikusan kötődik az MPF-hez és gátolja annak kináz aktivitását. Az MPF viszont képes foszforilezni a CKI-t, ami szintén ubikvitineződik és lebomlik. Egy következő szabályozási lehetőség az MPF katalitikus alegységének a CDK-nak foszforilezése illetve defoszforilezése, amely a G2 szakasz hosszát határozza meg. Az MPF és ellenségmolekulái közötti kölcsönhatás pozitív visszacsatolási kört eredményez. Az MPF és ellenségmolekulái nem lehetnek egyszerre jelen, hiszen akkor a sejt bizonyos fázisokban megrekedne, ezért az egyes fázisátmenetekhez segédmolekulák szükségesek. A Start átmenet segédmolekulái a CDK/ciklin komplexek, melyek nem érzékenyek az MPF ellenségmolekuláira. Élesztőkben ezek ugyanazon CDK molekulák Cln típusú ciklinnel alkotott komplexei. Úgy segítik az MPF megjelenését a Startnál, hogy foszforilezik a CKI-t és 6

7 ezáltal serkentik annak bomlását. A Befejezés segédmolekulája az APC Cdc20 nevű komponense, amely az MPF ellenségeinek megjelenését segíti elő és ezt az MPF általi foszforilezés nem gátolja, hanem aktiválja. A Startot és a Befejezést segítő molekulák termelődését ellenőrzési és negatív visszacsatolási útvonalak szabályozzák. Miután elvégezték feladatukat, gátlón hatnak a következő folyamatban szereplő molekulára. Például a CDK/Cln a CKI gátlásával elősegíti az MPF megjelenését, ami viszont gátolja a Cln szintézisét. A sejtciklusban több ilyen negatív, illetve pozitív visszacsatolási kört találunk (Novák és Tyson, 2000) A fenti séma egy rendkívül bonyolult és időben nagyon pontosan szabályozott rendszert eredményez. Az ilyen típusú rendszerek leírására jól használható a molekuláris biokémiai reakciókinetikai modell. A modell létrehozása során a sejtet homogén reaktornak tekintették. A molekuláris mechanizmus minden egyes lépéséhez egy reakciósebességi egyenletet rendeltek és így a komponensek koncentrációjának időbeli változását egy-egy csatolt differenciálegyenlettel írják le. Ezen kívül egyes folyamatokat algebrai egyenletek segítségével írtak le. Ezt a módszert John J. Tyson használta először (99), majd számos hasonló modellt dolgoztak ki, közte sejtciklus modelleket a hasadó élesztő (Novák és Tyson, 995), az afrikai karmos béka embriója (Novák és Tyson, 993), a sarjadzó élesztő (Tyson, 2004), és az emlős sejtek (Qu és Weiss, 2003) sejtszaporodásának leírására. Elsőként Paul Nurse tételezte fel (Nurse, 990), és később számos tapasztalati eredmény is alátámasztotta (Tyres, 2004), hogy a sejtekben a DNS megkettőződését és osztódást közös elvek szerint egymásra ható fehérjék szabályozzák. Ennek ellenére minden organizmus nagyon specifikusnak tűnik. Az osztódások jellegében és a szakaszok hosszában is jelentős eltérések vannak. A sarjadzó élesztő esetében az S/M fázisok átlapolódnak és szinte teljesen kiesik a G2-es fázis, míg a hasadó élesztő esetében éppen a G2 fázis hossza jelentős. Az eltérés a szakaszok jellegében az osztódás mechanizmusában való különbségekkel magyarázhatók. Csikász-Nagy Attila és munkatársai elkészítettek egy olyan általános sejtciklus modellt, amely több élőlény sejtciklusának leírására is alkalmas. A modell minden élőlény esetén ugyanazt a differenciál-algebrai egyenletrendszert használja és az egyes élőlények különbözőségét a modell a változók kezdeti értékének és a modell paramétereinek eltérő értékével veszi figyelembe. 7

8 2.2. Az általános sejtciklus modell alapvetések Csikász-Nagy és munkatársai megalkottak egy általános kölcsönhatási sémát, amely a legfontosabb fehérjék kölcsönhatásait mutatja be (Csikász-Nagy és munkatársai, 2006). A molekuláris hálózatot a 3. ábra mutatja be. Ezt a hálózatot 3 szabályozómodulra osztották, amelyek egy-egy molekula kölcsönhatásait követik nyomon. A hálózat a négy fő ciklincsaládot követi nyomon (CycE, CycD, CycA, CycB) és azokat a fehérjéket, amik szabályozzák őket a G/S, G2/M és a M/G átmeneteknél. A modulok csoportosítása: a 4,, 3, számú modulok a ciklin A, B és E szintézisét követik nyomon. A ciklin E elsődlegesen a G/S átmenetnél aktív, a ciklin A az S fázistól a korai M fázisig, míg a ciklin B a mitózishoz nélkülözhetetlen. az. és 2. modulok az anafázist elősegítő faktor (APC, a modellben IEP ként szerepel) szabályozását írják le. Az APC ebben az esetben a Cdc20-hoz és a Cdh-hez kötődve ubikvitinálja a ciklin B-t és ezzel megjelöli a proteaszómákon való lebomlásra. A mitotikus ciklin B komplex az APC-t foszforizálja, mielőtt az a Cdc20-hoz köt, de erre nincs szükség a Cdh esetében. A Cdh viszont inaktiválódhat a ciklin dependes kináz aktivitásától. A Cdc4 foszfatáz a CDK ellen munkál, mivel defoszforilálja a Cdh-et, ami így aktiválódik. a 8. modul a ciklin-dependens kináz inhibitor (CKI) szintézisét és degradációját írja le. Ezt a molekulát a ciklin-dependes kinázok jelölik ki lebomlásra és azt a Cdc4 gátolja. a 6., 9. és 2. modulokban a CDK reverzibilisen köt a CDK/ciklin komplexekhez, ami sztöchiometrikus gátlás útján egy katalitikusan inaktív trimert eredményez. a 3., 7. és. modulokban a transzkripciós faktorok szabályozása jelenik meg amelyek a ciklinek és a CKI expresszálását vezérlik. A TFB-t a ciklindependens kináz B aktiválja. A TFE-t bizonyos ciklin-dependens kinázok aktiválják bizonyosak, pedig gátolják. TFI-t a ciklin B dependens kináz gátolja és a Cdc4 foszfatáz aktiválja. az 5. modul a ciklin B dependens kináz szabályozása a tirozin foszforilációja és defoszforilációja által (pontosabban Wee kináz és a Cdc25 foszfatáz által). A 8

9 tirozinon foszforilált formája kevésbé aktív, mint a defoszforilált. A ciklin B dependens kináz egyaránt foszforilálja a Wee-t (inaktiválja azt) és a Cdc25-t (aktiválja) a Cdc4 pedig ezeknek a foszforilációknak éppen a fordítottját végzi a két enzimen. A modell modulokra osztása nem jelenti, hogy a fent felsorolt folyamatok között éles határvonalak lennének. Az egyes modulok közt jelentős átfedések lehetségesek. A modulok és azok csoportosítása inkább csak az információ feldolgozását könnyíti meg. A modellben (ahogy a létrehozása során felhasználtakban is) több negatív és pozitív visszacsatolási útvonal van. A folyamatok ilyen részletes leírása ellenére is elhanyagol fontos szabályozási útvonalakat (pl. a retinablasztóma protein az egysejtűekben, a mitotikus orsó ellenőrzési pontjait vagy a Mad2 által szabályozott mitotikus orsó ellenőrzési pontot), illetve a modell nem foglalkozik a sejten kívüli növekedési szignálok hatásaival sem. A modell létrehozói ezt a későbbiekben pótolni tervezik. A fentiekben leírt modulokhoz illesztették a differenciálegyenleteket, és vezették be a paramétereket. A modellben jelentős szerepet tulajdonítanak a tömegnek, mivel meghatározhatja az osztódás sebességét (Fantes és Nurse, 977; Johnston és Erhardt, 979). Különösen az olyan alacsonyabb rendű eukariótákra igaz ez, mint amilyenek az élesztők. Az élesztősejtekben és a sejtkivonatokban a CDK aktivitása az elérhető ciklin B mennyiségétől függ. Ezért feltételezik, hogy a többi ciklin szintézise is függ a tömegtől. A feltételezés hátterében az áll, hogy a ciklinek a citoplazma riboszómáin szintetizálódnak és ezek mennyisége a sejt tömegével növekszik. Megemlítendő, hogy vannak a tömegszabályozási tényezőt kétlő kutatók is (Yang és munkatársai, 2006). A ciklinek ezután egy CDK partnerhez kötődnek és a sejtmagba vándorolnak, ahol ellátják a rájuk jellemző funkciót. Tehát a működő ciklin-dependens kinázok mennyisége nő a sejt növekedésével. A többi proteinre jelenlegi tudásunk szerint ez nem jellemző. Az egyszerűség kedvért a modellben feltételezték, hogy a sejt exponenciálisan növekszik és tömege éppen a felére csökken az osztódást követően. Az általános sémát a következő négy élőlényre alkalmazták: a hasadó élesztőre (Schizosaccharomyces pombe) a sarjadzó élesztőre (Saccharomyces cerevisie), az afrikai karmosbéka embrióra (Xenophus laevis) és az osztódó emlős sejtekre. A négy élőlényben eltérő modulok működnek és ezekben a változók nevei sem minden esetben egyeznek meg a 3. ábrán feltüntetettel. A modellben használt és az egyes élőlényekre vonatkozó megnevezések hozzárendelését az. táblázatban közöljük. Az élesztők és emlős sejtek esetében kétszeres genetikai információtartalommal rendelkező úgynevezett testi sejteket 9

10 vizsgáltak. Az afrikai karmosbéka (Xenophus laevis) egy különleges eset, mivel itt nem testi sejtek osztódását vizsgálták, hanem a megtermékenyítés után lévő állapotot, vagyis a zigótát. A zigótában nincs transzkripció a megtermékenyítést követő időszakban, tehát az utódsejtek össztömege az anyasejtével egyezik meg. Ezen körülmények között a Xenophus embrió nem hasonlítható össze a többi organizmussal, ezért vizsgálataink során csak a három testi sejt modelljével foglalkoztunk. 3. ábra. Az ábra bemutatja az általános sejtciklus modellben található általános molekuláris kölcsönhatásokat és a moduláris felosztást. Részleteket lásd a szövegben. A 3. ábrán a modulokat különböző színű háttérrel különítették el. A sima vonalak kémiai kölcsönhatást, a szaggatott vonalak szabályozó hatást jelölnek. Ha valamilyen fehérje található a nyilakon, az azt jelzi, hogy a reakció enzim által katalizált folyamat. A számok a következő modulokat jelentik: az M modul végződése, 2 Cdh modul, 3 CycB transzkripciós faktor, 4 CycB degradációja és szintézise, 5 G2 modul, 6 CycB gátlása a CKI által, 7 CKI transzkripciós faktora, 8 CKI szintézise és degradációja, 9 A CycE gátlása a CKI által, CycE szintézise és gátlása, Cyc E/A transzkripciós faktor, 2 CycA gátlása a CKI

11 által, 3 CycA szintézise és degradációja. A nyitott szájú figura a szabályozó fehérje aktív alakját jelképezi, a szürke téglalapok a ciklinek mögött a CDK partnerüket jelzik. Feltételezések szerint a CDK mindig nagy feleslegben van jelen. Az ábrán szereplő megnevezések Saccharomyces cerevisie Schizosaccharomyces pombe Xenophus laevis emlős sejtek CycB Cdc28/Clb, 2 Cdc2/Cdc3 Cdc2/CycB Cdc2/CycB Funkciója Mitotikus CDK/ciklin komplex CycA Cdc28/Clb 5, 6 Cdc2/Cig 2 CDK,2/CycA CDK,2/CycA S-fázis CDK/ciklin komplex G/S átmenetet indukáló CycE Cdc28/Cln, 2 - CDK2/CycE CDK2/CycE CDK/ciklin CycD Cdc28/Cln 3 Cdc2/Puc CDK4/CycD CDK4/CycD Kezdő CDK/ciklin komplex CKI Sic Rum Xic p27kip CDK/ciklin szöchiometrikus gátló faktor Cdh Cdh Ste 9 Fzr hcdh A ciklin B lebontását szabályozza az APC segítségével Wee Swe Wee Xwee hwee CDK/ciklin B gátló kináz Cdc25 Mih Cdc25 XCdc25 Cdc25C CDK/ ciklin B aktiváló foszfatáz Cdc20 Cdc20 Slp Fizzy p55cdc A ciklin B, ciklin A lebontását szabályozza az APC segítségével Cdc4 Cdc4 Clp/ Flp XCdc4 hcdc4 A CDK-kat foszforiláló ellenségmolekula TFB Mcm - - Mcm CycB transzkripciós faktor Swi4 /Swi6 Mbp Cyc E/A transzkripciós TFE /Swi6 Cdc/Res XE2F E2F faktor TFI Swi5 APC APC APC Anafázist elősegítő faktor Aktív modulok, 2, 3, 4, 5*, 6, 7, 8,,, 2, 3,, 2, 4, 5, 6, 8,, 2, 3, 4, 5, 2, 3, 4, 5*, 6, 8, 9,,, 2, 3 Azok a hálózati ábrán bemutatott modulok, amelyek az adott élőlényben működnek. táblázat. A táblázat megmutatja, hogy a molekuláris hálózatban feltüntetett általános nevek milyen konkrét anyagnak felelnek meg az adott élőlényben. A csillaggal jelzett 5. modul nem szerepelt a korábbi sejtciklus modellekben.

12 2.3. Az általános sejtciklus modell a matematikai modell A modellt megadó differenciál-algebrai egyenletrendszert a 4. ábra, a paramétereket a 2. táblázat, a változók kezdeti értékeit pedig a 3. táblázat tartalmazza. Az egyes változók a sejt tömegének és az egyes fehérjék koncentrációja értékének felelnek meg. A differenciálegyenlet-rendszer leírja az enzimkinetikai reakciók (szintézis, degradáció, aktiváció, inhibíció, kötődés és szétválás) hatását. A modell elkészítésekor alkalmazták a kvázistacionárius közelítést. Emiatt a modell paraméterei reakciósebességi állandók mellett tartalmaznak Michaelis- és Goldbeter Koshland-állandókat is. Az egyenletrendszer önmagában nem tudja a sejt osztódását szimulálni, ezért azt külön feltételként építették be. Minden egyes élőlénynél megszabtak egy osztódási határt. Ha ezen érték alá csökken az actmpf (aktív MPF) koncentrációja, akkor a sejt osztódik. Ez a határ a sarjadzó élesztőre 0,2, a hasadó élesztőre, az emlős sejtekre 0,3 érték volt. 2

13 4. ábra. A differenciál-algebrai egyenletrendszer. 3

14 * ** Paraméter értéke a különböző élőlényekben Sarjadzó élesztő Emlős sejtek Hasadó élesztő Paraméter jellege J20 0,05 Michaelis-állandó 2 Ja20 0,005 0,00 Michaelis-állandó 3 Ja ,0 Michaelis-állandó 4 Jafb 88 Michaelis-állandó 5 Jafi Michaelis-állandó 6 Jah 0,03 0,0 0,0 Michaelis-állandó 7 Jaie 0,0 0,00 Michaelis-állandó 8 Jatf 0,0 0,0 0,0 Michaelis-állandó 9 Jawee 0, ,0 Michaelis-állandó Ji20 0,005 0,00 Michaelis-állandó Ji ,0 Michaelis-állandó 2 Jifb 88 Michaelis-állandó 3 Jifi Michaelis-állandó 4 Jih 0,03 0,0 0,0 Michaelis-állandó 5 Jiie 0,0 0,00 Michaelis-állandó 6 Jitf 0,0 0,0 0,0 Michaelis-állandó 7 Jiwee 0, ,0 Michaelis-állandó 8 k4di sebességi együttható 9 k25p 0,5 0 0,00 sebességi együttható 20 k25pp 5 0 sebességi együttható 2 ka20 0,5 0,2 sebességi együttható 22 ka25 88 Goldbeter-Koshland-paraméter 23 kafb 88 Goldbeter-Koshland-paraméter 24 kafi Goldbeter-Koshland-paraméter 25 kahp 0,0 0,75 5 sebességi együttható 26 kahpp 0, sebességi együttható 27 kaie 0,07 0,2 sebességi együttható 28 kasa sebességi együttható 29 kasb sebességi együttható 30 kase 0 0 sebességi együttható 3 katfp 0 0,5 kináz hatékonysági együttható 32 katfpp 0,76 0,3 0 kináz hatékonysági együttható 33 katfppp 0,76 0,5 0 kináz hatékonysági együttható 34 katfpppp 3,8 0,33 0 kináz hatékonysági együttható 35 kaweep 0,3 88 0,25 Goldbeter-Koshland-paraméter 36 kaweepp ,25 Goldbeter-Koshland-paraméter 37 kd20 0,05 5 sebességi együttható 38 kdap 0,0 0,002 0,0 kináz hatékonysági együttható 39 kdapp kináz hatékonysági együttható 40 kdappp 0 0 0,02 kináz hatékonysági együttható 4 kdbp 0,003 0,005 0,02 kináz hatékonysági együttható 42 kdbpp 0,4 2 0,75 kináz hatékonysági együttható 43 kdbppp 5,5 kináz hatékonysági együttható 44 kdep 2 0,0 0 kináz hatékonysági együttható 45 kdepp 0 0 kináz hatékonysági együttható 46 kdeppp 0 0 kináz hatékonysági együttható 47 kdepppp 0 0 kináz hatékonysági együttható 4

15 48 kdia 0,06 sebességi együttható 49 kdib 0,05 0 sebességi együttható 50 kdie 0 0 sebességi együttható 5 kdip 0,02 kináz hatékonysági együttható 52 kdipp 0,2 5 2 kináz hatékonysági együttható 53 kdippp 0,9 kináz hatékonysági együttható 54 kdipppp kináz hatékonysági együttható 55 kdippppp 0,66 0 kináz hatékonysági együttható 56 ki20 0,05 0,25 0,05 sebességi együttható 57 ki25p 0,3 88 0,25 Goldbeter-Koshland-paraméter 58 ki25pp ,25 Goldbeter-Koshland-paraméter 59 kifb 5 88 Goldbeter-Koshland-paraméter 60 kifip 0, Goldbeter-Koshland-paraméter 6 kifipp 0, Goldbeter-Koshland-paraméter 62 kihp 0,00 0 kináz hatékonysági együttható 63 kihpp 0,64,2 40 kináz hatékonysági együttható 64 kihppp 4 40 kináz hatékonysági együttható 65 kihpppp 0, kináz hatékonysági együttható 66 kihppppp 0, kináz hatékonysági együttható 67 kiie 5 8 0,08 sebességi együttható 68 kitfp 0,6 0,25 Goldbeter-Koshland-paraméter 69 kitfpp 8 0 Goldbeter-Koshland-paraméter 70 kitfppp 0 Goldbeter-Koshland-paraméter 7 kiwee 88 Goldbeter-Koshland-paraméter 72 ks20p 0,00 0 0,005 sebességi együttható 73 ks20pp 5 sebességi együttható 74 ksap 0, sebességi együttható 75 ksapp 0,005 0,025 0,02 sebességi együttható 76 ksbp 0,004 0,0 0,02 sebességi együttható 77 ksbpp 0,04 0,03 0 sebességi együttható 78 ksep 0 0,008 0 sebességi együttható 79 ksepp 5 0,3 0 sebességi együttható 80 ksip 0, ,3 sebességi együttható 8 ksipp 0, sebességi együttható 82 kweep 0 0 0,05 sebességi együttható 83 kweepp 0 0 0,5 sebességi együttható 84 mu 0, , , táplálékfelvételi együttható 85 n20 4 Hill-koefficiens 86 SK 08 0,5 0,05 CycD koncentrácó * paraméter neve ** paraméter sorszáma 2. táblázat. A paraméterek értékei az általunk vizsgált élőlényekben. 5

16 Változók neve Változók kezdeti értékei Hasadó élesztő Sarjadzó élesztő Emlős actcyca 2,244e-004,875e-004,744692e000 actmpf 6,7e-005 3,09e-005 3, e000 Cdc20A 2,24478e-00,6482e-00 2,35730e-00 Cdc20T 5,583894e-00 7,824746e-00 3,08248e000 Cdh 9,960288e-00 9,90390e-00 3,3443e-003 CKI, e000 3,508766e000 4,88755e-002 CycE 0, e000, e000,94508e-00 actcyce 0, e000, e000,64273e-00 CycB 3,5862e-002,27927e-002 3, e000 CycA 6,43997e-002,69784e-00,20892e000 IEP 3,9652e-00,9e-006 6,95082e-00 prempf,05e-002 0, e000 0, e000 TriB 3,523e-002,2767e-002 0, e000 m,80740e000, e000 2,04982e táblázat. A változók kezdeti értékei egy stacionárius sejtciklusból. Az egyenletek, a paraméterkészletek és a kezdeti értékek letölthetők a honlapról. Meg kell jegyezni, hogy az egyes élőlényekben bizonyos reakcióutak nem működnek. Ezt a modell alkotói úgy vették figyelembe, hogy egyes paraméterek 0 vagy 88 értéket kapnak. Az ilyen paramétereket később inaktív paramétereknek hívjuk. Azok az inaktív paraméterek, amelyek 88-as értéket kaptak a modellben, egy tört nevezőjében szerepelnek. Így érték el, hogy a differenciál-algebrai egyenletrendszer numerikus megoldása során ne történjen 0-val való osztás. 6

17 3. Célkitűzések Az élőlények sejtciklusa enzimkinetikai modelljeinek létrehozása során nehézséget okoz, hogy kísérletileg nem tudnak abszolút koncentrációkat mérni és sebességi állandókat közvetlenül meghatározni, csak relatív koncentrációváltozásokat lehet kimutatni. A sejt életében fontos anyagok, illetve ezek szerepe elég jól ismert, és ez az egyes reakcióutakat alapvetően meghatározza. A modellek paramétereinek értékét úgy választották meg, hogy a modell viselkedése a tapasztalati adatokkal összhangban álljon. Fontos kérdés, hogy az egyes paraméterek értéke pontosan meghatározott, vagy pedig gyakorlatilag tetszőlegesen megválasztható. Ezért elsődleges célunk a modellek robosztusságának vizsgálata volt. Ezt olyan módon vizsgáltuk, hogy megszabtunk a sejtekre egy életfeltételt és egyenként változtatva a paramétereket, megkerestük azok határértékét, ameddig a sejt életképes marad. Ez a fajta vizsgálat nem ad információt a paraméterek egyszerre változtatásának hatásáról. Monte Carlo-analízissel vizsgáltuk meg, hogy mi történik akkor, ha az összes paramétert egyszerre változtatjuk meg. A fenti számítások a globális érzékenységanalízis területére esnek és a paraméterek nagy megváltoztatásának hatását vizsgálták. Lokális érzékenységanalízissel azt lehet vizsgálni, hogy mi a paraméterek nagyon kicsi megváltoztatásának hatása. Kiszámítottuk a modell paramétereinek érzékenységi függvényeit, majd ezeket a függvényeket átalakítottuk, és az így kapott görbéket csoportosítottuk az alakjuk hasonlósága alapján. Ezzel a módszerrel a modell robosztusságára lehetett következtetéseket levonni. 7

18 4. Programok a sejtciklus modellezésére és a modellek vizsgálatára Csikász-Nagy és munkatársai az általános sejtciklus modell létrehozása során a WINPP nevű, Windows operációs rendszer alatt működő, dinamikai rendszereket leíró egyenletek megoldására kifejlesztett programot használták (WINPP, 2006). Ez a program csak lefordított, futtatható formában áll rendelkezésre, így nem módosítható, és ezért a tervezett vizsgálatokra nem alkalmas. Turányi Tamás KINAL néven (Turányi, 990) kifejlesztett egy Fortran nyelvű programcsomagot tömeghatás-kinetikai szimulációkhoz. Ez a programcsomag képezte a kiindulópontját Lovrics Anna munkájának (2005). Az általa továbbfejlesztett programba illesztettük be az általános sejtciklus modellt. Tekintettel arra, hogy ez a modell több élőlény sejtciklusának leírására is alkalmas, a Lovrics Anna által használt programot jelentős mértékben át kellett alakítanunk. A KINAL programcsomag így az általunk használt továbbfejlesztett változat is a ROW4A nevű szemiimplicit negyedrendű Runge-Kutta algoritmuson alapuló szubrutint használja a merev kinetikai egyenletrendszer megoldására. A differenciál-algebrai egyenletrendszert a FUN nevű szubrutinban kellett megadni. Az egyes élőlényekre eltérő paraméter és kezdeti értékeket a PARAMETER_SETS nevű szubrutin tartalmazza. Az általános sejtciklus modell helyes működését úgy ellenőriztük, hogy az egyes élőlények esetén számított koncentráció idő függvényeket összehasonlítottuk a WINPP programmal számítottakkal. Az összehasonlítás alapján megállapítottuk, hogy a modell adaptálása a saját Fortran programunkba sikeres volt. Sok paraméter együttes változtatásának egyik egyszerű módja a latinhiper-kocka elrendezés szerinti változtatás. A latinhiper-kocka elrendezésnek megfelelő szorzótényező vektorok előállítására a Zádor Judit által írt LHS programot használtuk. A Monte Carlo szimuláció eredményeit saját készítésű MATLAB programmal ábrázoltuk. Munkánk során a MATLAB 7.3-as verzióját használtuk. A lokális érzékenységi függvényeket a DASAC nevű programmal számítottuk (Caracotsios és Stewart, 985). Az érzékenységi függvények periodikussá tételét Sipos-Szabó Eszter végezte el a Mathematica nevű programmal (Sipos- Szabó, 2008). Az érzékenységi függvények alakjainak csoportosítását a T-REX klaszterező programmal oldottuk meg (Marenkov, 200). 8

19 Fortran programok létrehozására, nyomon követésére, és hibajavítására a Compaq Visual Fortran Compilert alkalmaztam (Professional Edition ). Az eredményeink ábrázolására és értékelésére az Origin (Origin ) és az MS Excel programokat használtam. Az folyamatábrákat a Corel Draw nevű szoftverrel készítettem. 9

20 5. Eredmények 5.. A számított koncentráció idő görbék A különböző sejtekre kapott koncentráció idő görbéket az 5-3. ábrák tartalmazzák. A görbék a sejtek első ciklusát írják le. Minden esetben olyan kezdeti értékekről indítottuk a ciklust, amely egy stacionárius sejtciklusból származott. Minden ábrán két teljes ciklus látható, és az első ciklus végét függőleges fekete vonal jelzi. relatív koncentrációk 2,4 2,2 2,0,8,6,4,2,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0-0,2 actcyce CycB CycE actmpf TriB CycA actcyca prempf t / perc 5. ábra. A sarjadzó élesztőre kapott görbék: a CycB, az actmpf, prempf, TriB, CycA, actcyca, CycE és az actcyce koncentrációjának változása. 20

21 4,0 3,5 3,0 relatív koncentrációk 2,5 2,0,5,0 Cdc20T Cdc20A Cdh CKI 0,5 0,0 IEP t / perc 6. ábra. A sarjadzó élesztőre kapott görbék: a Cdc20T, a Cdc20A, CKI, Cdh, IEP, koncentrációjának változása. relatív tömeg 2,5 2,4 2,3 2,2 2, 2,0,9,8,7,6,5,4,3,2,, t / perc 7. ábra. A sarjadzó élesztőre kapott görbék: a sejt relatív tömegének változása. 2

22 4,0 3,5 CycB actmpf relatív koncentrációk 3,0 2,5 2,0,5,0 0,5 actcyce CycA CycE actcyca 0,0-0,5 prempf TriB t / óra 8. ábra. Az emlős sejtekre kapott görbék: a CycB, az actmpf, prempf, TriB, CycA, actcyca, CycE és az actcyce koncentrációjának változása. 3,5 3,0 Cdc20T 2,5 relatív koncentrációk 2,0,5,0 0,5 IEP Cdc20A CKI Cdh 0, t / óra 9. ábra. Az emlős sejtekre kapott görbék: a Cdc20T, a Cdc20A, CKI, Cdh, IEP, koncentrációjának változása. 22

23 relatív tömeg 2,2 2, 2,0,9,8,7,6,5,4,3,2,,0 0,9 0, t / óra. ábra. Az emlős sejtekre kapott görbék: a sejt relatív tömegének változása. 2,2 2,0,8,6 CycB actmpf prempf relatív koncentrációk,4,2,0 0,8 0,6 0,4 0,2 CycA actcyca CycE actcyce 0,0-0,2 TriB t / perc. ábra. A hasadó élesztőre kapott görbék: a CycB, az actmpf, prempf, TriB, CycA, actcyca, CycE és az actcyce koncentrációjának változása. 23

24 relatív koncentrációk,7,6,5,4,3,2,,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,0 - -0,2 CKI Cdc20T IEP Cdc20A Cdh t / perc 2. ábra. A hasadó élesztőre kapott görbék: a Cdc20T, a Cdc20A, CKI, Cdh, IEP, koncentrációjának változása. relatív tömeg 3,5 3,4 3,3 3,2 3, 3,0 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 2,4 2,3 2,2 2, 2,0,9,8,7,6, t / perc 3. ábra. A hasadó élesztőre kapott görbék: a sejt relatív tömegének változása. 24

25 5.2. A modell robosztusságának vizsgálat a paraméterek egyenkénti változtatásának hatása A modell az egyes paraméterek értékét részben a korábban kifejlesztett modellekből veszi át, részben úgy állapítja meg, hogy az a sejt működését lehetővé tegye, ezért a paraméterek nagy része önkényes, vagy csak néhány mérési adattal alátámasztott. A vizsgálat során az egyes paraméterek értékét egyenként változtatva megkerestük azt a legkisebb és legnagyobb értéket, amellyel a sejt még élt. A számítások során élőnek tekintettük az adott paraméterkészlethez tartozó sejtet, ha az 3000 perces szimuláció során legalább az első 500 percben osztódott (a vad sejt ennyi idő alatt 25-szor osztódik) és az osztódás ez alatt nem állt le (konkrétan: az utolsó 280 percben is történt osztódás). További követelmény volt, hogy az actmpf koncentrációja ne haladja meg a -et. Az osztódást az jelzi, hogy a tömeg és emiatt az actmpf koncentrációja periodikusan változik. Minden egyes paraméter esetén a következő módon jártunk el: Külön vizsgáltuk a paraméter növelésének és csökkentésének hatását. Először az eredeti paraméterkészlettel futattuk le a szimulációt, természetesen ekkor biztosan életben maradt a sejt. Ezután mindig csak a vizsgálandó paraméter értékét változtattuk, míg a többi paramétert az eredeti értékén rögzítettük. Megvizsgáltuk, hogy a megváltoztatott paraméterkészlettel életben marad-e a sejt. A paraméter növelésénél mindig megkétszereztük az adott paraméter értékét egészen addig, amíg a változtatás után a sejt már nem maradt életben. Ha elértük ezt a határt, akkor a paraméter értékét az utolsó élő, illetve halott sejthez tartozó paraméter átlagának vettük (intervallumfelezés). Az intervallumfelezést lépésben folytattuk, így pontosítva az eredményt. Ha a sejt 4 lépés, azaz az adott paraméter értékének 2 4 =6384-szeresére növelése után is életben maradt, akkor tovább már nem növeltük a paramétert. A paraméterek csökkentésekor a fenti módszerhez hasonló módon dolgoztunk. Az egyes élőlényeknél az inaktív paramétereket nem vizsgáltuk, mivel ezek értékei nem befolyásolják az adott sejt változóinak értékét. A paraméterváltoztatások hatásának eredményét az 4-6. ábrák mutatják be. Az ábrákon minden egyes paraméter esetén kék oszlopok mutatják azt a tartományt, amelyen belül változtatva az adott paramétert a sejt életben maradt. A vízszintes tengely a paraméterek sorszáma a 2. táblázatnak megfelelően. 25

26 4. ábra. A sarjadzó élesztő paramétereinek változtatási határai. 5. ábra. Az emlős sejtek paramétereinek változtatási határai. 26

27 6. ábra. A hasadó élesztő paramétereinek változtatási határai. A fenti ábrákon látható, hogy az egyes paraméterek az egyenkénti változtatás szempontjából csoportokba sorolhatók. Bizonyos paraméterek esetén a paraméter értékét négy nagyságrenddel növelve és csökkentve is életben marad a sejt. A paraméter pontos értéke akkor nem kritikus, ha nem alapvetően fontos változó értékére van hatással. Ilyen például a kdap (38), amely az aktív ciklin A bomlását szabályozza. Ha ennek értékét növeljük, akkor csökken az aktív ciklin A mennyisége, akár nullához közeli értékre is, de a sejt életben marad, mert feladatát egy másik enzim veszi át. Ha értékét csökkentjük, az aktív ciklin A bomlása lelassul és közel állandó aktív ciklin A koncentráció alakul ki, ami szintén nem befolyásolja károsan a sejtet. A paraméterek egy másik csoportja, amelyek értéke négy nagyságrenddel csökkenthető a sejt elpusztulása nélkül, de jelentős növelése során a sejt elpusztul. Ebbe a csoportba olyan paraméterek tartozhatnak, amelyek egy háttérreakcióban vesznek részt. Ilyen eset az, amikor van egy enzim által regulált lépés, és emellett feltételezünk egy enzim nélküli lassú reakciót is. Ha az enzim nélküli reakcióban termelődött anyag kevés, az a sejt szempontjából nem hátrányos, viszont ha e reakció sebességét növeljük az enzim által regulált folyamathoz képest, akkor előfordulhat, hogy a folyamat során túl sok termék képződik szabályozatlanul, 27

28 és ez hibát okozhat a sejtciklusban. Például ilyen a kdbp (4), amely a Cdh egyenletében szerepel. A paraméterek következő csoportjába azok a paraméterek tartoznak, amelyek értéke négy nagyságrenddel növelhető, ám nem csökkenthető ilyen mértékben. Az ilyen paraméterek olyan fehérjék termelődésében játszhatnak szerepet, amelyek jelenléte fontos a sejt számára, de feleslegének nincs gátló hatása. Ezek értéke azonban pontosan szabályozott, ezért képes a sejt a nagy felesleggel is életben maradni. Például ilyen a ks20pp (73), amely a Cdc20T szintézisében játszik szerepet, amely a rendszerben található összes Cdc20-t jelenti. Ha csökkentjük a Cdc20 összes mennyiségét az aktív forma mennyisége is csökken. A paraméterek talán legérdekesebb csoportja, amelyhez tartozó paraméterek csak szűk intervallumban változtathatók mindkét irányban. Ezek a paraméterek azokra a reakciókra hatnak, amelyek alapvetően fontosak a sejt életben maradásához. Ilyen például a ka20 (2), amely a Cdc20A termeléséhez fontos reakciósebességi állandó. A 4. táblázat megadja, hogy e csoportosítás szerint az adott élőlényekben az egyes paraméterek mely csoportba tartoznak. A mu (84) paramétert nem változtattuk a számolások során, mivel ez a táplálékfelvételi együttható a sejt növekedését szabályozza. * ** sarjadzó élesztő emlős sejt hasadó élesztő J20 3, ,E-05 6, ,E-05 33,6875 6,E-05 Ja ,625 6,E ,625 6,E ,E-05 Ja ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 Jafb 4 2,0625 6,E ,E-05 inaktív paraméter Jafi ,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter Jah , ,875 0, , Jaie 7 45,4375 6,E-05 20, ,E ,E-05 Jatf ,E ,E ,E-05 Jawee ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 Ji ,E ,E ,E-05 Ji ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 Jifb ,E ,E-05 inaktív paraméter Jifi ,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter Jih 4 647,5 6,E-05 43,625 6,E-05 93,875 6,E-05 Jiie ,E ,E ,75 6,E-05 Jitf ,E ,E ,E-05 Jiwee ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 k4di ,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter k25p ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 k25pp ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 ka ,72E , ,25 0, ka ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 kafb ,2E ,E-05 inaktív paraméter kafi ,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter kahp 25 83,875 6,E-05 49,7875 6,E-05 8, ,E-05 28

29 kahpp ,E-05 32,5 0, ,E-05 kaie , , kasa ,E ,E ,E-05 kasb ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 kase 30 inaktív paraméter ,E-05 inaktív paraméter katfp 3 inaktív paraméter inaktív paraméter ,E-05 katfpp ,E ,E-05 inaktív paraméter katfppp ,E ,E-05 inaktív paraméter katfpppp ,E ,E-05 inaktív paraméter kaweep ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 kaweepp 36 inaktív paraméter inaktív paraméter ,E-05 kd , , ,E-05 7, ,E-05 kdap ,E ,E ,E-05 kdapp ,E ,29E ,E-05 kdappp 40 inaktív paraméter inaktív paraméter ,E-05 kdbp 4 62, ,E-05 36,5325 6,E-05 9, ,E-05 kdbpp ,5 6,E-05 20, ,E-05 kdbppp ,E-05 49,25 6,E ,4528E-03 kdep ,E-05 inaktív paraméter kdepp 45 inaktív paraméter ,E-05 inaktív paraméter kdeppp 46 inaktív paraméter ,E-05 inaktív paraméter kdepppp 47 inaktív paraméter ,E-05 inaktív paraméter kdia ,E ,E ,E-05 kdib ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 kdie 50 inaktív paraméter ,E-05 inaktív paraméter kdip ,E ,E ,E-05 kdipp ,E ,E ,E-05 kdippp ,E ,E ,E-05 kdipppp ,E ,E-05 inaktív paraméter kdippppp ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 ki ,875 6,E-05, ,E-05 3, ,E-05 ki25p ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 ki25pp 58 inaktív paraméter inaktív paraméter ,E-05 kifb 59 3, ,E ,E-05 inaktív paraméter kifip ,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter kifipp ,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter kihp ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 kihpp ,E ,E ,E-05 kihppp ,E-05 3,3282 6,E ,E-05 kihpppp ,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter kihpppp ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 kiie 67 4,9375 6,E-05 2, ,E-05 3, ,E-05 kitfp ,E ,E ,E-05 kitfpp ,E ,E-05 inaktív paraméter kitfppp 70 inaktív paraméter ,E ,E-05 kiwee ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 ks20p ,E-05 inaktív paraméter ,E-05 ks20pp ,82E ,5E-02 ksap 74 84,25 6,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter ksapp 75 93,875 6,E ,5 6,E ,E-05 ksbp 76 82,5 6,E-05 26, ,E-05 7, ,78E-02 ksbpp 77 37, , ,E-05 inaktív paraméter 29

30 ksep 78 inaktív paraméter ,E-05 inaktív paraméter ksepp 79 7, ,E ,E-05 inaktív paraméter ksip ,E ,E-05 34,5 6,E-05 ksipp ,E-05 inaktív paraméter inaktív paraméter kweep 82 inaktív paraméter inaktív paraméter 7,375 6,E-05 kweepp 83 inaktív paraméter inaktív paraméter 2, ,E-05 mu nem 84 változtattuk nem változtattuk nem változtattuk n20 85, ,E-05, ,E-05 62,5625 6,E-05 SK 86 33,2875 0, ,E ,E-05 * paraméter neve ** paraméter sorszáma 4. táblázat. A táblázatban látható az egyes paraméterek viselkedése a különféle élőlények esetén. Minden egyes élőlény neve alatt két oszlop található: az első a paraméter felső, a második az alsó határértéket adja meg, amelynél a sejt még élt. Az inaktív paraméter felirat azt jelenti, hogy az adott paraméter ki van kapcsolva. A színek az egyes csoportokat jelölik. A piros szín a négy nagyságrenddel növelhető és csökkenthető paramétereket jelzik, a kék a négy nagyságrenddel növelhetőket, a zöld pedig a csak csökkenthetőket. A fekete számok jelzik a szűk intervallumon belül változtatható paramétereket. Sárga háttérrel jelöltük azokat a paramétereket, amelyek mindhárom élőlénynél aktívak, viszont különböző csoportba tartoznak. A táblázatból látható, hogy a paraméterek nagy többsége (a három élőlényben átlagosan mintegy 44%-a) a négy nagyságrenddel növelhető és a négy nagyságrenddel csökkenthető paraméterek közé tartozik. Ez a legbővebb csoport. A következő csoport a négy nagyságrenddel csökkenthető paraméterek, amelyek részesedése 9%. A fennmaradó részen pedig a négy nagyságrenddel növelhető (5%) és a szűk intervallumon belül változtatható (3%) paraméterek osztoznak. Megkülönböztetett figyelmet érdemelnek a szűk intervallumon belül változtatható paraméterek. Ezek a paraméterek ezen vizsgálat szerint igen markáns hatást gyakorolnak a rendszer stabilitására. A valamely élőlény esetében korlátosan változtatható vagy kritikus paraméterek a következők: Jah (6), kahpp (26) Cdh egyenletében szerepel, ka20 (2), kd20 (37), ami a Cdc20A egyenletében szerepel, kdbpp (42), kdbppp (43), ksbp (76), ksbpp (77) ezek a paraméterek közvetve szabályozzák a mitotikus ciklin aktivitását, és végül az SK (86), amely paraméter a CycD hatását jelképezi a modellben. Az SK paraméternek négy változó kivételével mindegyik változóra van közvetlen vagy közvetett hatása. A fenti vizsgálatok alapján a modellt robosztusnak tekinthetjük a megadott életfeltételek mellett, mivel a paraméterek változtatásának jelentős mennyiségével szemben toleráns. 30

31 A paraméterek jelentős hányada a különböző élőlényekben ugyanúgy viselkedett, de voltak eltérő viselkedésű paraméterek is. Mi ezek közül csak azoknak szenteltünk figyelmet, amelyek mindhárom élőlényben aktívak voltak. Ezek a következők: Jah(6), kahpp (26), kihpp (63), kihppp (64), SK (86), amelyek a Cdh szintézisében, illetve degradációjában játszanak szerepet, ka20 (2) és a kd20 (37), amelyek a Cdc20 A egyenletében szerepelnek, a kdbpp (42), kdbppp(43), ksbp (76), amelyek a actmpf egyenletében szerepelnek, a kdapp (39), amely a actcyca termelésében fontos, a ksapp (75), amely a CycA egyenletében szerepel, a ksip (80), ami közvetlenül játszik szerepet a CKI mennyiségének szabályozásában és a Jiie (5) ami az IEP más néven az APC egyenletében szerepel. Érdekes számomra, hogy a szűk intervallumon belül változtatható paraméterek és az eltérően viselkedő paraméterek között igen nagy az átfedés. Ezek a pontok jelentik a fő különbséget az egyes élőlények sejtciklus-dinamikájában. Nagyon érdekes, hogy a változók közül csak a Cdh, a Cdc20A, az actmpf, az actcyca, a CycA, az IEP és a CKI egyenletében szerepelnek ilyen paraméterek, míg a többi hat változóéban nem. Ezek a változók azokat az enzimeket jelképezik, amelyek működése, sőt szerkezete is jelentős különbségeket mutathat az egyes élőlények között. A továbbiakban tervezzük, hogy összehasonlítjuk ezeknek a fehérjéknek a szekvenciáját és a szerkezetét. A többi változó hasonlóképpen viselkedik a különböző élőlényekben. A Jah (6), kdapp (39), kdbpp (42), kihpp (63), kihppp (64), ksip (80) paraméterek esetén a két élesztőmodell hasonlóan viselkedik, míg az emlős sejt ettől eltérően. A ka20 (2), kd20 (37) és a SK (86) paraméterek esetében az emlős és a hasadó élesztő esetében viselkedik hasonlóan, míg a sarjadzó élesztő eltér. A Jiie (5), kdbppp (43) ksapp (75), ksbp (76), paramétereknél, pedig a sarjadzó élesztő és az emlős esetén viselkedik azonosan, a hasadó élesztő tér el. A kahpp (26) mindhárom élőlénynél másképpen viselkedett. Előzetes elképzelésem az volt, hogy ha lesznek olyan paraméterek, amelyek viselkedése eltér az egyes élőlények esetén, akkor az úgy fog bekövetkezni, hogy a két élesztőben a viselkedés hasonlít, míg az emlős sejtben a viselkedésük eltérő. Ezt abból gondoltam, hogy a két élesztő sejtes szerveződésű, míg az emlős egy jóval bonyolultabba felépítésű organizmus. Az eredmények ezt csak részben igazolták: hat esetben tapasztaltunk az előzetes elvárásoknak megfelelő viselkedést, nyolc esetben pedig a két élesztő nem hasonlított egymásra, miközben valamelyik az emlőshöz hasonlóan viselkedett. Négy paraméter esetén a sarjadzó élesztő, három esetében pedig a hasadó élesztő mutatott ugyanolyan jellegű viselkedést. Egy paraméter esetén mindhárom élőlény eltérően viselkedett. Ezen adatok alapján azt a 3

32 következtetést vonhatjuk le, hogy az emlős sejt sejtciklusa jobban hasonlít a sarjadzó élesztő sejtciklusára. A fent leírt információk nehezen áttekinthetők, ezért azokat egy ábrasorozaton összegeztem (ld. a ábrákat). Ezek segítségével könnyebben nyomon követhetjük, hogy az adott paraméter hol játszik szerepet a sejtciklusban, illetve az egyes élőlények sejtciklusának összehasonlítását is megkönnyíti. Az ábrák alapja a sejtciklus-modell leírásában közölt folyamatábra. A folyamatábrára ráhelyeztem azokat a paramétereket, amik az adott reakcióban szerepet játszanak és a táblázatban leírt színkódot alkalmaztam rájuk. Az egyes élőlényeknél különböző csoportba sorolható paramétereket bekarikáztam, így jól elkülöníthetővé váltak. Az inaktív vegyületeket, illetve paramétereket szürke színnel jelöltem, míg az aktív molekulák lila színűek, a ciklinek CDK partnerét szürke hátterük jelzi. Más jelölések megegyeznek a bevezetőben leírt folyamatábra jelöléseivel. 7. ábra : A sarjadzó élesztő folyamatábrája. 32

33 8. ábra: Az emlős sejtek folyamatábrája. 9. ábra : A hasadó élesztő folyamatábrája. 33

34 5.3. A modell robosztusságának vizsgálata Monte Carlo analízissel A modell robosztusságának vizsgálatában a következő lépésként az egyes paramétereket nem egyenként változtatjuk, hanem egyszerre. Erre a feladatra jól használható a Monte-Carlo analízis latinhiper-kocka mintavétellel (Saltelli és munkatársai, 2000). A Monte-Carlo-módszer lényege, hogy sok, jellemzően több tízezer paraméterkészletet jelölnek ki véletlenszerűen a modell paramétereinek közös valószínűségi sűrűségfüggvényének megfelelően. A szimulációkat végrehajtják minden egyes paraméterkészlettel, és statisztikai módszerekkel jellemzik a számítások eredményeit. A Monte-Carlo-módszer előnye, hogy a szimulációk számának növelésével a módszer pontossága növelhető, és a módszer alkalmazható akkor is, ha a paraméterek bizonytalansága nagy és azok erősen korreláltak. Hátránya, hogy sok paraméter esetén nagyon sok szimulációt kell végrehajtani. A módszer nem hatékony, mert a véletlenszerűen kiválasztott paraméterkészletek nagyon közel lehetnek egymáshoz, így gyakran feleslegesen hajtunk végre nagyon hasonló szimulációkat. A Monte-Carlo-módszer egy fejlettebb változata a latinhiperkocka-elrendezésű mintavételt alkalmazza a paraméterkészletek kiválasztására. Ennél a mintavételi eljárásnál minden paraméter tartományát egyenlő valószínűségi sávokra osztják fel. Ezek után a paraméterkészleteket véletlenszerűen, a paraméterek valószínűségi sűrűségfüggvényeinek megfelelően választják ki, azzal a megkötéssel, hogy egy sávból csak egyszer választanak ki paraméterértéket. Ez az eljárás biztosítja, hogy ne sorsoljunk ki egymáshoz közeli paraméterkészleteket, vagy más megfogalmazásban, hogy viszonylag kevés szimuláció esetén is hatékonyan vizsgáljuk a modell viselkedését a teljes paramétertérben. A latinhiperkockamintavételű Monte-Carlo-analízis módszerét elterjedten használják légkörkémiai és égéskémiai reakciókinetikai modellek vizsgálatára (Moore és Londergan, 200; Zádor és munkatársai, 2005; Zádor és munkatársai, 2006). Ennél a vizsgálatnál a bekapcsolt modulokon belül változtattuk az egyes paramétereket, de a modulokat nem kapcsoljuk ki vagy be. Munkánk során minden egyes sejttípus esetén 000 paraméterkészletet állítottunk elő latinhiper-kocka mintavétellel. A paramétertartományok határai minden paraméter esetén megegyeztek az egyszeres paraméterváltoztatás során kapott alsó és felső életképességi határokkal. A névleges paraméterértékeket mindig a megfelelő szorzótényezővel szoroztuk meg. Az egyszeres paraméterváltoztatásnál alkalmazott módszernek megfelelően a legnagyobb szorzótényező

35 =6384 volt. A latinhiperkocka-módszernél logaritmikus skálán egyenletes eloszlást használtunk a paraméterek szorzófaktora értékére. Így több nagyságrend tartományában is hatékonyan meg tudtuk vizsgálni a lehetséges szorzófaktorok értékét. A kapott paraméterkészletekkel szimuláltuk a modellt és megvizsgáltuk, hogy a modellezett sejt életben marad-e? A 000 paraméterkészletből átlagosan a sejtek %-a maradt életben. A sarjadzó élesztőnél 439, az emlős sejteknél 365, míg hasadó élesztőnél 268 olyan paraméterkészletet találtunk, amely osztódó sejtet szimulált. Ez igen kis érték, és távolról sem mutatja olyan robosztusnak a modellt, mint az egyszeres paraméterváltoztatás. Ezek után elkészítettük az életben maradó sejtekhez tartozó paraméterkészletek szorzótényezőinek korrelációs mátrixát. A paramétervektorhoz tartozó szorzótényezők tízes alapú logaritmusát egy mátrixba rendeztük oly módon, hogy minden sor egy élő sejtnek és minden oszlop egy paraméternek felelt meg. Ezek után egy-egy oszlopvektor korrelációját számítottuk az Excell program CORREL függvénye segítségével. A korrelációs értékek igen kicsik voltak, szinte alig kaptunk 0,2-nél nagyobb értéket. Ezért arra gyanakodtunk, hogy a modellt másod vagy magasabbrendű korrelációk jellemzik. Ezen korrelációk minden bizonnyal valamilyen mintázatot fognak eredményezni az élő sejtekhez tartozó szorzófaktorok eloszlásában. A korrelációk pontosabb felderítésére az életben maradt sejtek paramétereinek szorzófaktorait páronként ábrázoltuk logaritmikus skálán az általunk készített Matlab program segítségével és az így készült ábrákat végignéztük. Az esetek jelentős többségében a pontok egyenletes eloszlású véletlen elrendeződést mutattak (lásd pl. 20. ábra). 20. ábra: A Monte Carlo szimuláció eredménye a sarjadzó élesztő esetében. Az itt látható pontokat az élő sejtek paramétereihez tartozó szorzófaktorok jelölik ki. Az x tengelyen a J20 (), az y tengelyen a Ja20 (2) paraméter szorzófaktorait ábrázoltuk logaritmikus skálán. 35

36 Bizonyos paraméterpároknál sajátos mintázatot láttunk. Erre jó példa a 2. ábra. 2. ábra: A Monte Carlo szimuláció eredményei sarjadzó élesztő esetén. Az x tengelyen az Jiie (5), az y tengelyen a kiie (67) paraméter szorzófaktorait ábrázoltuk logaritmikus skálán. A 2. ábrán jól látható, hogy az élő sejteket jelölő + jelek a bal felső sarokban sűrűsödnek. Az ilyenfajta elrendeződés kialakulásáért több tényező is felelős lehet. Az egyik az, hogy az egyszeres paraméterváltoztatás által kijelölt határok nem megfelelőek a többszörös paraméterváltoztatás esetén, mert a modell másképp viselkedik, ha csak egy paraméterét változtatjuk, mintha az összest egyszerre. Kíváncsiak voltunk arra, hogy ha nagyobb tartományban dolgozunk, akkor is ugyanezt a mintázatot fogjuk-e látni? Az is felmerült bennem, hogy ha több paramétert változtatunk egyszerre, a különböző irányú hatások esetleg kiolthatják egymást. A következő vizsgálatban mindhárom élőlénynél végeztünk - Monte-Carlo-szimulációt azokra a paraméter-párokra, amiknél jellegzetes mintázatot láttunk, viszont ezúttal az egyszeres paraméterváltoztatás teljes tartományában változtattuk a kérdéses paramétereket. A többi paramétert a névleges értéken tartottuk. Összesen 36 paraméterpárt vizsgáltunk meg a három élőlénynél. Eredményeinket a ábrák mutatják. Az ábrákon a korábbi Monte-Carlo-szimuláció eredményeit fekete háromszögek jelölik. Az újabb szimulációk esetén a piros körök jelölik az élő sejteket, míg a zöld négyszögek a halott sejteket. Fekete vonallal megjelöltük az egyszeres szorzófaktort, ami a névleges paraméterértéknek felel meg. Annak, hogy ez esetben ábrázoltuk a halott sejteket is, több oka volt. Ezek közül az egyik, hogy meg akartuk nézni, hogy mennyire éles 36