A sarjadzó élesztõ sejtciklusának matematikai modellezése

Átírás

1 BUDAPESTI MÛSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM DOKTORI ÉRTEKEZÉS A sarjadzó élesztõ sejtciklusának matematikai modellezése Készítette: Csikász-Nagy Attila okleveles biomérnök Témavezetõ: Dr. Novák Béla egyetemi tanár Mezõgazdasági Kémiai Technológia Tanszék 2000

2 Tartalom 1. BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A SEJTCIKLUS ÉS ANNAK SZABÁLYOZÓ MOLEKULÁI A SARJADZÓ ÉLESZTÕ SEJTCIKLUSA A SEJTCIKLUS MATEMATIKAI MODELLEZÉSE EREDMÉNYEK A MINIMÁLIS EUKARIÓTA SEJTCIKLUS A primitív APC-CDK szabályozó Fázissík diagram A modell numerikus szimulációja Hiszterézis A SARJADZÓ ÉLESZTÕ SEJTCIKLUSÁNAK MODELLJE A modell numerikus szimulációja A sejtosztódás és a sejtnövekedés összehangolása Sejtciklus mutánsok szimulációja Hiszterézis a sarjadzó élesztõ sejtciklusában A SARJADZÓ ÉLESZTÕ MODELL TOVÁBBFEJLESZTÉSE ÖSSZEFOGLALÁS IRODALOMJEGYZÉK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS MELLÉKLETEK (AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK KÜLÖNLENYOMATAI)

3 1. Bevezetés Az élet alapegysége a sejt. A szaporodó sejtek élete osztódástól osztódásig tart. A két osztódás között lezajló folyamatok összességét sejtciklusnak nevezzük. A reprodukcióhoz minden sejtnek szüksége van egy olyan molekuláris szabályozó rendszerre, amely a szaporodást irányítja. Értekezésemben a Saccharomyces cerevisiae (sarjadzó élesztõ) sejtciklusát szabályozó biokémiai folyamatok matematikai modellezésével foglalkozom. A sarjadzó élesztõ a molekuláris biológusok egyik kedvenc tesztorganizmusa. Ez volt az elsõ eukarióta élõlény, melynek teljes DNS szekvenciáját feltárták (Goffeau et al., 1996). A sarjadzó élesztõ iparilag is jelentõs. A kenyérkelesztéstõl az alkohol tartalmú italok elõállításáig számos területen használják, s innen származik hétköznapi elnevezése: pékélesztõ. A sejtciklust szabályozó reakcióháló számos fontos elemét ismerjük, és az egyes szabályozó fehérjék kölcsönhatásairól is sokat tudunk élesztõkben és emlõs sejtekben egyaránt (ld. Murray & Hunt, 1993) 1. Az is ismert, hogy az élesztõsejtek szabályozó enzimei nagy hasonlóságot mutatnak (mind szerkezetileg, mind funkciójukban) az emlõssejtekben megtalálható társaikhoz. Ennek következtében az élesztõsejtek szabályozási mechanizmusának felderítése elõsegítheti az emlõssejtek sejtciklusának megismerését, valamint a hibás mûködésbõl származó betegségek megértését is. Az egyik legismertebb ilyen kóros állapot a rákbetegség, amikor valamilyen rendellenesség folytán a sejtszaporodás gátlása megszûnik, s a szabályozatlan osztódás sejtburjánzáshoz, illetve rákos daganathoz vezethet (Sherr, 1996). A molekuláris biológusok kutatásai alapján ma már sokat tudunk a szabályozó rendszer elemeinek kölcsönhatásairól, de pusztán ezekbõl az eredményekbõl nehéz megjósolni egy sejt (vagy az azt leíró modell) idõbeli viselkedését. A szabályozó hálózat dinamikájának vizsgálatára a kémiai reakciókinetika azon matematikai módszereit érdemes alkalmazni, amelyeket összetett, például oszcilláló kémiai rendszerek tanulmányozására fejlesztettek ki. Egyenleteinkben biokémiai reakciók 2

4 sebességeit írjuk le, így talán módszerünk legszerencsésebb elnevezése: biokémiai reakciókinetika. Ennek megfelelõen, egy feltételezett primitív eukarióta sejt (sejt)ciklusát szabályozó rendszer reakciókinetikai (matematikai) modelljébõl (Novák et al., 1998b) kiindulva és a sarjadzó élesztõben megismert egyéb szabályozó elemeket figyelembe véve, elkészítettük a Saccharomyces cerevisiae sejtciklusát szabályozó molekuláris hálózat matematikai modelljeit (Novák et al., 1999; Chen et al., 2000). Értekezésemben e modellek vizsgálatával kapcsolatos eredményeinket foglaltam össze.. 1 Az irodalmi hivatkozások számát megpróbáltam bizonyos korlát (kb.60) alatt tartani, ezért ahol csak lehetett összefoglaló cikkekre hivatkoztam, amit a szövegben ld. jelöléssel tüntettem fel. 3

5 2. Irodalmi áttekintés 2.1. A sejtciklus és annak szabályozó molekulái A sejtosztódási ciklus egy olyan szabályozott folyamat, amely során a sejt megduplázza minden sejtalkotójának a mennyiségét, majd elosztódik két sejtté (1.a. ábra). A legtöbb sejtalkotó szintézise (növekedés) folyamatos két sejtosztódás között, és osztódáskor többé kevésbé egyenlõen oszlanak meg a két utódsejt között (1.b. ábra). A genetikai információt hordozó DNS molekulák esetében azonban más a helyzet. Minden eukarióta sejt bonyolult mechanizmust tart fenn a DNS nukleotid sorrendjének pontos lemásolására (DNS replikáció) és a másolás eredményeként keletkezett ún. leánykromatidák precíz szétválasztására (mitózis). A DNS replikáció és mitózis precizitása biztosítja, hogy a leánysejtek csak a nekik járó DNS-t kapják, se többet, se kevesebbet (ld. Alberts et al., 1994). A növekvõ sejteknek azonban össze kell hangolniuk a növekedés folyamatosságát a kromoszóma replikáció és szegregáció periodikus folyamataival is (1.b. ábra). A sejtciklus eseményeinek irányításáért egy komplikált szabályozási rendszer felelõs, amely nagyon hasonlóan mûködik valamennyi napjainkban élõ eukarióta sejtben. A sejtciklus gépezet legfontosabb tagjai: 1. egy (fejlettebb szervezetekben több) ciklin-dependens protein-kináz (Cdk) és az ezeket aktiváló ciklin molekulák 2 ; 2. kinázok és foszfatázok, melyek szabályozzák a CDK aktivitást; 3. a CDK komplexek sztöchiometrikus inhibitorai (CKI), 4. ezen szabályozó molekulák szintéziseiért felelõs transzkripciós faktorok, 5. a ciklinek és az inhibítorok lebomlásáért felelõs komplexek (SCF és APC). A ciklin és a Cdk kapcsolódása révén kialakuló aktív Cdk/ciklin komplexek képesek a sejtciklus bizonyos eseményeinek elindítására. Az esetek többségében a Cdk alegység koncentrációja nem, vagy csak keveset változik a sejtciklus folyamán. Ezzel szemben a ciklinek koncentrációja általában periodikusan változik a sejtciklus alatt, ezért is kapták a ciklizáló fehérje (ciklin) elnevezést. 2 Ezek után CDK-val jelölöm a Cdk/ciklin komplexeket. 4

6 a., sejtosztódás mitózis (M fázis) G1 G2 b., 2 sejttömeg növekedés DNS replikáció (S fázis) sejtosztódás 1 2 DNS sejtmag DNS szintézis mitózis 1 G1 S G2 M 1. ábra: A sejtosztódási ciklus a, A sejtciklus fázisai. A DNS megduplázódása a sejtciklus S fázisa, míg a leánykromatidák szétválasztása az M fázis (sejtmagosztódás vagy mitózis) alatt történik. Az S és M fázisok közé általában szünetek (G1 és G2 fázisok) ékelõdnek. b, A sejteknek el kell érniük egy bizonyos kritikus sejttömeget mind a DNS replikáció mind a mitózis megindításához. A nyilak jellel a végüknél a sejtméretnek a DNS szintézis és a mitózis indítására gyakorolt pozitív hatását reprezentálják 3. 3 A jellel ellátott nyilak a dolgozatban késõbb is arra utalnak, hogy a nyíl kiinduló pontjánál levõ komponens a nyíl fejénél levõ komponens aktivitására pozitív hatással van. A - jellel ellátott nyilak pedig gátló (negatív) hatásra utalnak. 5

7 Mivel a ciklin kapcsolódása elengedhetetlenül szükséges a Cdk aktiválódásához, ezért a ciklin mennyiségének (koncentrációjának) szabályozásával a Cdk/ciklin (CDK) aktivitás befolyásolható (ld. Murray & Hunt, 1993). A ciklin fehérje koncentrációja pedig mind képzõdésének (szintézis), mind lebomlásának (degradáció) sebességével szabályozható (2. ábra). Az egyes ciklinek szintézise különbözõ transzkripciós faktorok aktivitásától függ. A transzkripciós faktorok többsége állandóan jelen van a sejtciklus folyamán, aktivitásuk viszont csak a sejtciklus egy adott szakaszán figyelhetõ meg. Ha egy adott ciklin transzkripciós faktora aktiválódik, akkor elkezdõdik az adott ciklin szintézise és a képzõdõ ciklin molekula a Cdk-val kapcsolódik (ld. Futcher, 1996). A képzõdött komplex felelõs lehet mind a DNS replikáció mind a mitózis megindításáért. A DNS replikáció eredményeként képzõdõ leánykromatidákat az ún. ragasztófehérjék (kohézinek) tartják össze a mitózis anafázisáig. Az anafázis elején azonban ezek a kohézin molekulák hirtelen lebomlanak és ennek eredményeként a leánykromatidák a sejt ellentétes pólusai felé mozognak (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999). A ragasztófehérjék lebontására azonban csak akkor kerülhet sor, ha az összes kromoszóma hozzákapcsolódott már a húzóerõt kifejtõ mitózisos orsóhoz. A ragasztófehérjéket a szeparin nevû proteáz bontja szét, amit sarjadzó élesztõben Esp1-nek hívnak (3. ábra). Az Esp1-t azonban a Pds1 nevû szekurin inaktívan tartja az egész ciklus alatt egészen az anafázisig. Az anafázis kezdetén a Pds1 hirtelen lebomlik, amit ubikvitinezése okoz. Eukarióta sejtekben az ubikvitinezett fehérjéket a proteaszóma bontja le és a folyamat sebességmeghatározó lépése az ubikvitin (pontosabban poliubikvitin) hozzákapcsolása a lebontásra ítélt fehérjéhez. A Pds1 ubikvitinezéséért és ezáltal az anafázis megkezdéséért az Anafázis Serkentõ Komplex (APC = Anaphase Promoting Complex (Irniger et al., 1995)) felelõs. Az APC egy nagyon bonyolult fehérjekomplex, amelynek komponensei (alegységei) ugyancsak konzerváltak az evolúció során (Kramer et al., 1998). Az APC szubsztrátjainak (pl. Pds1) felismeréséhez segédmolekulákat igényel, sarjadzó élesztõben a Pds1 felismerését a Cdc20 fehérje segíti elõ (Shirayama et al., 1999). 6

8 aminosavak TRANSZKRIPCIÓS FAKTOROK Cdk ciklin APC lebomlott ciklin P inaktív Cdk ciklin kináz foszfatáz Cdk ciklin aktív CKI CKI Cdk ciklin inaktív 2. ábra: A Cdk/ciklin komplex aktivitásának szabályozása. A Cdk/ciklin komplex aktivitása a ciklin alegység szintézisével (transzkripciós faktorokkal) és lebomlásával (B-típusú ciklinek esetén APC-vel) szabályozódik. A Cdk/ciklin komplex aktivitását CKI sztöchiometrikus kapcsolódása vagy gátló foszforilezés is megszüntetheti. 3.ábra: Az anafázis lépései. Zachariae & Nasmyth (1999) 3.ábrájából. Az APC a Cdc20 segítségével felismeri a Pds1 fehérjét (szekurin) és poliubikvitinezi, így azt a proteaszóma (kékes szürke komplex az ábrán) gyorsan lebontja. Ezáltal szabaddá válik az Esp1 (szeparin), amely szétbontja a kromoszómákat összetartó ragasztófehérjéket (kohézin). 7

9 Eukarióta sejtekben többfajta ciklin molekula is létezik, ezek közül a B-típusúak lebontásáért ugyancsak az APC felelõs, ezért az APC-t szokás cikloszómának is nevezni. A B-típusú ciklinek felismeréséhez azonban az APC-nek egyéb segédfehérjékre van szüksége és sarjadzó élesztõben ezek közül a Hct1 (más néven Cdh1) a legfontosabb (Schwab et al., 1997). Késõbb látni fogjuk annak jelentõségét, hogy ugyanaz az enzimkomplex (APC) felelõs a leánykromatidák elválasztásáért és a ciklin lebontás révén a CDK inaktiválásáért (4.ábra) (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999). kromoszóma szegregáció Cdc20 APC szegregációs apparátushoz nem tapadt kromoszómák Cdk ciklin ciklin lebontás Hct1 Cdk 4. ábra: Az Anafázis Serkentõ Faktor (APC) kettõs szerepe a mitózisban. Az APC elindítja mind a kromoszómákat összetartó ragasztó fehérjék (közvetve) mind a mitózisos ciklinek (közvetlenül) ubikvitinezését és ezáltal gyors lebomlásra készteti azokat. A kromoszómák szétválasztásához a Cdc20 segédfehérjének, míg a ciklin lebontáshoz a Hct1 segédfehérjének kell aktiválódnia. Egyik folyamat sem játszódhat le addig, amíg a kromoszómák nem álltak fel a metafázisos síkra. Ekkor ugyanis megszûnik a gátló hatás, ami a nem felállt kromoszómáktól származik. Más ciklinek lebontása ugyancsak ubikvitinezéssel történik, ezeket azonban egy másik enzimkomplex (az ún. SCF) ubikvitinezi (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999). A sejtek tehát egyrészt a CDK regulációs alegység (ciklin) koncentrációjának változtatásával tudják szabályozni a Cdk/ciklin komplex mennyiségét (2. ábra). A Cdk és a ciklin kapcsolódása révén kialakuló komplex azonban nem feltétlenül aktív, mert a sejtek képesek a komplex aktivitásának szabályozására is. A Cdk/ciklin komplex (CDK) átmenetileg inaktiválható a katalitikus alegység (Cdk) 8

10 foszforilezésével annak aktív centrumában 4 (Gould & Nurse, 1989; Novák et al., 1998a), valamint gátló (inhibitor) fehérje kapcsolódásával is (2.ábra). Ezek az utóbbi években felfedezett ún. Ciklin dependens Kináz Inhibitorok (CKI) (Moreno & Nurse, 1994) a Cdk/ciklin komplexhez történõ kapcsolódásuk révén gátolják annak kináz aktivitását. 4 Mivel a sarjadzó élesztõ sejtciklusában a Cdk/ciklin komplex foszforilezésének nincs nagy szerepe, így erre itt nem térek ki részletesen. 9

11 2.2. A sarjadzó élesztõ sejtciklusa A S. cerevisiae vagy más néven sarjadzó élesztõ, amint azt a neve is mutatja, sarjadzással szaporodik (5. ábra). Az osztódás révén született kisméretû leánysejtek folyamatosan növelik a méretüket, ha a környezeti körülmények megfelelõek, vagyis elegendõ tápanyag áll rendelkezésükre. A sejtciklus G1 fázisában a sejtek a ciklus nem-sarjadzó szakaszában vannak. Amikor ezek a növekvõ sejtek elérnek egy kritikus méretet akkor megjelenik rajtuk egy sarjkezdemény, és ezzel egyidõben megkezdik a DNS replikációt is (S fázis). A sarjadzás és a DNS replikáció egyidejû megkezdését szokás a sarjadzó élesztõ sejtciklusának Start eseményének is nevezni. Nagyon fontos, hogy a sarj megjelenése után minden növekedés a sarjra koncentrálódik és az anyasejt már nem növeli a méretét. A DNS replikációt követõen a sejtmag az anya és a leánysejt közötti nyak -ba vándorol. Ezt követi a mitózis (M fázis). A leánykromatidák a mitózis anafázisa során válnak szét, amit a maganyag megduplázódásából és magosztódásból álló ciklus befejezõ lépésének ( Finis ) lehet tekinteni. Ezután a sarj leválik az anyasejtrõl és a sejtosztódás után pedig az egész folyamat kezdõdik elölrõl. Fontos észrevenni, hogy az osztódással keletkezõ sejtek nem egyformák, vagyis az osztódás aszimmetrikus: a sarjból keletkezõ leánysejt kisebb mint az anyasejt (ld. Murray & Hunt, 1993). mag vándorlás DNS replikáció kromoszómák elválása, magosztódás sarj megjelenése sejtosztódás Növekedés 5. ábra: A sarjadzó élesztõ sejtciklusának legfontosabb eseményei. 10

12 A sarjadzó élesztõben kétféle ciklin csoportot (ld. Futcher, 1996) lehet megkülönböztetni (6. ábra). Az egyik a Cln típusú ciklinek, amelyek közé három különbözõ ciklin molekula is tartozik (Cln1-3). A Cdk1 (a sarjadzó élesztõ egyetlen Cdk-ja, amit gyakran Cdc28-nak is neveznek) ezen ciklinekkel alkotott komplexei felelõsek több transzkripciós faktor aktiválásáért, valamint a sarjnövekedés elindításáért. A ciklinek másik csoportja a B-típusú ciklinek, vagy röviden Clb-ek amelyekbõl összesen hatféle van a sarjadzó élesztõ sejtekben (Clb1-6) 5. A Clb-ek ugyanúgy a Cdk1-gyel alkotnak komplexet és ezek a Cdk1/Clb komplexek felelõsek a kromoszómás ciklus egyes eseményeinek (S és M fázis) meghatározott sorrendben történõ bekövetkezéséért. Konkrétan a Cdk1/Clb5 és a Cdk1/Clb6 a DNS replikáció indításáért, a Cdk1/Clb3-4 a magorsófonalak kialakulásáért, míg a Cdk1/Clb1-2 a mitózis egyéb eseményeinek lejátszódásáért felelõs. szintézis transzkripciós faktorok szintézis Cdk1 Cln Cdk1 Clb DNS replikáció sarjadzás lebomlás lebomlás mitózis 6. ábra: A sarjadzó élesztõ sejtciklusának Cdk/ciklin szabályozói. A S. cerevisiae egyetlen Cdk-ja (Cdk1) két különbözõ típusú ciklinnel kapcsolódhat. A Cln-ekkel alkotott komplexe a sarjadzás elindításáért, a Clb-ekkel alkotott pedig a DNS replikáció és a mitózis elindításáért felelõs. Mindkét fajta ciklin szintje a szintézis és a lebomlás sebességével szabályozható. 5 Érdemes megjegyezni, hogy a ciklinek számára vonatkozó adatok a sarjadzó élesztõ esetében a teljes genom szekvenciájának ismeretében teljesen pontosak. 11

13 A sarjadzó élesztõ Clb-jei redundánsak, ami azt jelenti, hogy 1. a fenti párokban (pl. Clb5-6) a két ciklinnek ugyanaz a funkciója, tehát csak az egyik gén jelenléte elég a szükséges folyamatok elindításához; 2. továbbá a fenti párok bizonyos mértékben egymás helyettesítésére is képesek: így pl. Clb5-6 hiányában a DNS replikációt a Clb1-4 indítja el. A Cdk/Clb komplexek is képesek transzkripciós faktorokat aktiválni. A Cdk1 (Cdc28) szintje többé-kevésbé állandó a sarjadzó élesztõ sejtciklusa alatt, és koncentrációja sokkal nagyobb mint a ciklinek koncentrációinak összege, vagyis a Cdk1 mennyisége nem limitáló. Ezzel szemben mind a Cln-ek mind a Clb-ek koncentrációja jellegzetesen változik a sejtciklus alatt, ami szintézisük és lebomlásuk szabályozásával magyarázható (6.ábra). 12

14 2.3. A sejtciklus matematikai modellezése A sejtciklust szabályozó molekuláris hálózat bonyolultsága felveti azt a kérdést, hogy a szabályozó molekulák kölcsönhatásainak ismeretében miként lehetne megjósolni egy sejt viselkedését. Más szavakkal megfogalmazva: hogyan lehetne ellenõrizni azt, hogy molekuláris ismereteink összhangban állnak-e a fiziológiai kísérletek eredményeivel? Ennek megválaszolásában a biokémiai reakciókinetika lehet segítségünkre. A módszer alapja az, hogy a molekuláris mechanizmus minden egyes lépéséhez reakciósebességi egyenletet rendelünk, s így a komponensek koncentrációjának idõbeli változását egy-egy differenciálegyenlettel írjuk le ben John Tyson (1991) használta elõször ezt a módszert a sejtciklus leírására. Késõbb témavezetõmmel együttmûködve számos újabb sejtciklus modellt dolgoztak ki a biokémiai reakciókinetika alapjainak felhasználásával és ezek dinamikai tulajdonságait a nemlineáris rendszerek elméletével vizsgálták (Novák & Tyson, 1993; Novák & Tyson, 1997; Tyson et al., 1996). Doktori témámmal ebbe a kutatómunkába kapcsolódtam be én is. Az alábbiakban egy egyszerû példán mutatom be a reakciókinetika alkalmazását a sejtciklus szabályozási hálózat leírására (7. ábra). A sarjadzó élesztõ egyik fontos szabályozó fehérjéje a Cln2 ciklin. A Cln2 szintéziséért az SBF nevû transzkripciós faktor felelõs. Ha az SBF aktív, a Cln2 mrns szintézise gyors, ha viszont inaktív, akkor a Cln2 szintézise lassú. (ld. Nasmyth, 1996) A Cln2 mrns és fehérje, valamint a Cdk1/Cln2 komplex koncentrációjának idõbeni változását leírhatjuk az alábbi differenciálegyenletekkel: d [mrns] dt = k 1 k 1 [SBF] k 5 [mrns] (1) d [Cln2] = k dt 2 [mrns] k 3 [Cdk1] [Cln2] k 4 [Cln2] (2) d [Cdk1/Cln2] dt = k 3 [Cdk1] [Cln2] k 4 [Cdk1/Cln2] (3) A mrns képzõdésében megkülönböztettünk egy SBF koncentrációtól független (k 1 ), és egy attól függõ (k 1 ) tagot. Továbbá feltételeztük, hogy a Cln2 egyforma sebességi 13

15 együtthatóval bomlik szabad és komplex formából egyaránt. Mivel a fehérjeszintézis (transzláció) szabályozásáról semmit nem tudni, ezért feltételezzük, hogy a fehérje koncentrációja jól követi a mrns-ét. Ez könnyen belátható, ha feltételezzük, hogy az mrns a rövid felezésideje (k 5 nagy) miatt gyorsan követi az SBF változását, ekkor: [mrns] k = ' 1 " k1 [SBF] k 5 Ha bevezetjük a [Cln2 T ] = [Cln2] [Cdk1/Cln2] változót (összeadjuk a 2. és 3. egyenletet) és az mrns fenti kifejezését ebbe behelyettesítjük, akkor a: d[cln2 dt T ] = k 2 k ' 1 " k1 [SBF] k k d 4 [Cln2 T ] egyenlet fogja leírni a Cln2 fehérje összkoncentrációjának idõbeli változását. Mivel a Cdk1 feleslegben van jelen a ciklinekhez képest és gyorsan kapcsolódik azokkal, ezért a Cln2 szabad forma koncentrációja közel nulla lesz és szinte minden Cln2 (Cln2 T ) komplex formában (Cdk1/Cln2) lesz jelen, vagyis a fenti egyenlet a Cln2 kináz aktivitás változását is leírja. DNS SBF (5) Cln2 Cdk1 Cdk1 Cln2 mrns (1) (2) (3) (4) transzkripció riboszóma (4) transzláció komplex képzés 7.ábra: A Cln2 koncentrációját szabályozó hálózat. Az SBF transzkripciós faktor aktivitásától függõ sebességgel képzõdik a Cln2 mrns a DNS-en levõ génjérõl (1). A Cln2 fehérje a riboszómákon képzõdik az mrns felhasználásával (2), és a Cln2 fehérje a Cdk1-gyel gyorsan komplexet képez (3). A Cln2 mind szabad, mind kötött formájából azonos sebességi állandóval bomlik (4). Feltételezzük, hogy a Cdk1/Cln2 képzõdésének sebesség-meghatározó lépése a transzkripció. 14

16 Mivel az egyszerû levezetés bármelyik ciklinre alkalmazható, ezért a továbbiakban a ciklin nevével nemcsak annak koncentrációjára, hanem Cdk1-gyel alkotott komplexére is fogok utalni. Mivel egyenleteinket egy sejtre vonatkoztatjuk, vagyis az egyes fehérjék sejten belüli koncentrációjára írjuk fel azokat és ez gyakran igen kis értékû lehet, így felmerülhet a sztochasztikus modellezés igénye. Tekintve azonban, hogy a sztochasztikus modellek várható értékei a determinisztikus modell eredményeit szolgáltatják (Nyeste et al., 1978), valamint vizsgálódásainkban a szabályozási rendszer viselkedését akartuk megérteni, nem pedig a sztochasztikus fluktuációk okozta változásokat, így eltekintettünk a sztochasztikus modellezéstõl. Tehát modelljeink az átlagsejt viselkedését írják le. Az egyes szabályozó fehérjék egy sejtre vonatkozó koncentrációiról nincsenek irodalmi adatok, így modelljeinkben dimenziómentes koncentrációkat használtunk. Ebbõl adódóan az összes sebességi állandónk dimenziója min -1 lett. (A sebességi állandók meghatározásának részletei a 2. melléklet Appendix A fejezetében ( oldal) találhatóak.) A sejttömeg és a sejtciklus egyes eseményei között eltelt idõ vizsgálódásaink fõ célpontjai voltak. Ezért az idõt nem dimenziómentesítettük, a sejttömeg dimenziója önkényes, szimulációs egység, melyet a sarjadzó élesztõ mutánsok vizsgálatakor, a vad típusú sejtekre normálva, átváltottunk femtoliterre. Ha egy komplex szabályozóhálózat minden elemére felírunk a fentiekhez hasonló egyenletet, akkor egy zárt differenciálegyenlet rendszert kapunk. Ennek analitikus megoldása két változó fölött már igen bonyolult, sõt általában lehetetlen, ezért az ilyen egyenletrendszerek számítógép segítségével numerikusan oldhatóak meg. Ilyen numerikus szimulációkkal vizsgáltam több eukarióta organizmus sejtciklus modelljét (Chen et al., 2000; Novák et al., 1998a; Novák et al., 1998b; Novák et al., 1999; Sveiczer et al., 2000) 15

17 3. Eredmények 3.1. A minimális eukarióta sejtciklus Az eukarióta sejtek a DNS állományukat több helyrõl (replikációs origó) kezdik el másolni. Minden egyes DNS szakasznak azonban csak egyszer szabad lemásolódnia két egymást követõ mitózis között, de ez az egy másolás mindenképpen be kell, hogy következzen. Tehát minden replikációs origó legfeljebb csak egyszer aktiválódhat egy sejtciklus alatt (pontosabban a Start és a Finis között). A replikációs origók aktiválódásának szabályozásáért eukarióta sejtekben az ún. Licensing Factor -ok (LF), vagy engedély fehérjék, felelõsek (ld. Blow, 1993). A replikációs origók aktiválódásának szükséges feltétele, hogy elõzetesen LF-ok kapcsolódjanak hozzájuk. Erre a sejtciklus G1 fázisában kerül sor, amikor a sejtekben nincs illetve nagyon kicsi a Cdk/ciklin (CDK) aktivitás. Ennek az a magyarázata, hogy a CDK foszforilezi a LFokat és ezáltal serkenti a ubikvitinezéses lebontásukat 6, ezért a LF-ok csak akkor vannak számottevõ mennyiségben jelen amikor a CDK aktivitás kicsi (G1 fázis). Amint azt már korábban említettem, a DNS szintézis megkezdéséhez a CDK aktivitás megjelenésére van szükség. A CDK aktivitás megjelenése a sejtciklus Start eseményénél következik be, és a replikációs apparátus bizonyos fehérjéinek foszforilezésével indítja el a DNS replikáció folyamatát. De a CDK a DNS szintézis elindításán túlmenõen megindítja a LF molekulák ubikvitinezéses lebontását is (ld. fentebb). Így mindaddig, amíg a CDK aktivitás jelen van a sejtben, a replikációs origók nem képesek még egyszer aktiválódni. Amikor minden kromoszóma teljesen megduplázódott és a mitózisos orsóhoz kapcsolódott, aktiválódik az APC (Anafázis Serkentõ Komplex) és lejátszódik a sejtciklus Finis eseménye: a leánykromatidákat összetartó ragasztófehérjék és a Cdk/ciklin komplexek ciklin alegységeinek lebontása. Az APC-t a Cdc20 illetve a Hct1 segédfehérjéi teszik alkalmassá az elsõ illetve a második folyamat elindítására. A leánykromatidák szétválásával egyidõben lecsökken a CDK aktivitás a sejtben, így a replikációs origókon újra megjelennek a LF molekulák, engedélyt adva ezzel egy következõ DNS replikációra. Ahhoz azonban, hogy a következõ Start esemény 6 A foszforilezett LF molekulákat ugyanaz az SCF ismeri fel és ubikvitinezi, amelyik a CKI és a Cln-ek ubikvitenézéért felelõs. 16

18 bekövetkezzen, a ciklin-lebontó APC aktivitást ki kell kapcsolni, hogy a CDK aktivitás újra megjelenhessen. Ez az APC segédfehérjéinek (Cdc20 és Hct1) lebontásával, illetve inaktiválásával történik meg. Növekedés Start G1 S/M APC Cdk APC Cdk ciklin 8. ábra: A sejtciklus szíve, az APC-CDK antagonizmus A növekedés hatására a CDK feldúsul a sejtmagban, ahol foszforilezéssel inaktiválja az APC segédfehérjéjét (Hct1), valamint foszforilezi a replikációs komplexeket és ezzel elindítja a DNS szintézist. A foszforilezett replikációs komplexek replikációkor inaktiválódnak és amíg CDK aktivitás van jelen, nem tudnak újra képzõdni. Amikor a kromoszómák felálltak a metafázisos síkra, az APC aktiválódik, és elindítja a kromoszómákat összetartó ragasztófehérjék lebontását, valamint lebontja a CDK ciklin alegységét. Így a replikációs komplexek újra össze tudnak állni és várnak a DNS szintézist indító foszforilezésre. A sejtciklust alapvetõen két részre lehet osztani: - G1 fázisban a kromoszómák nem-replikált állapotban vannak, az APC aktivitás nagy, a CDK aktivitás pedig kicsi. Finis Nem replikált DNS Nem felállt kromoszómák - Ezzel szemben az S/M fázisban a kromoszóma replikáció folyamatban van, illetve befejezõdött, az APC aktivitás kicsi, ezért a CDK aktivitás viszont nagy. - Nem szükséges, hogy felismerhetõ G2 fázis legyen egy egyszerû eukarióta sejtben, mivel a mitózis egyes eseményei (profázis és metafázis) elkezdõdhetnek a Start -ot követõen, és a DNS szintézissel párhuzamosan lejátszódhatnak egészen a metafázisig bezárólag, akárcsak a mai sarjadzó élesztõben. A DNS replikáció (S fázis) és a mitózis kezdeti eseményeinek átlapolására azért van lehetõség, mert a kis genom 17

19 méret nem igényel intenzív kromoszóma kondenzációt az M fázis alatt. Ezzel szemben a sejtciklus Finis eseményére akkor és csak akkor kerülhet sor, amikor a DNS replikáció már teljesen befejezõdött és minden egyes kromoszóma a mitózisos orsóhoz tapadt. Kim Nasmyth (1995; 1996) szerint ez a legprimitívebb eukarióta sejtciklus szabályozási rendszer a Start -nál billen a G1-bõl az S/M állapotba 7 és a Finis során pedig onnan vissza a G1-be. A két állapot periodikus váltakozása révén a Start és a Finis felváltva következnek be, ami biztosítja a kromoszóma replikáció és a leánykromatidák elválasztásának alternálását. Ez a primitív sejtciklus szabályozás nem feltétlenül az evolúciósan elõször kialakult rendszer, de a mai eukarióták sejtciklus irányításának az alapja. Az a minimális rendszer, ami már a sejtosztódás és sejtnövekedés összehangolását megvalósította. Nasmyth (1995) felismervén a primitív eukarióta sejtciklus ezen két állapotát, arra a következtetésre jutott, hogy ezt a két állapotot az APC és a CDK antagonisztikus versengése hozza létre. Az APC lebontja a CDK ciklin alegységét és ezáltal negatív hatást gyakorol a CDK-ra. Az antagonizmus feltételezésébõl kiindulva, Nasmyth prognosztizálta, hogy a CDK is negatív hatást fejt ki az APC-re, amit a késõbbi kísérletek igazoltak is: a CDK foszforilezéssel inaktiválja az APC ciklin felismerõ Hct1 alegységét (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999). A CDK és az APC antagonisztikus versengése lehet az eukarióta sejtciklus szíve (8. ábra), mivel ez a mechanizmus biztosítja a kromoszóma replikáció és szegregáció periodikus bekövetkezését. Ezt a feltételezését, hogy a sejtciklust a legkorábbi eukariótákban az APC és a CDK antagonisztikus viselkedése szabályozta, öntöttük matematikai formába (Novák et al., 1998b, ld. 1. melléklet), amit az alábbiakban röviden ismertetek. 7 A szabályozó rendszer állapotai megfeleltethetõek a sejtciklus egyes fázisainak. Ennek megfelelõen az elkövetkezõkben a G1 és S/M állapotok a szabályozó rendszer állapotára utalnak, míg a G1 és S/M fázisok a sejtciklus szakaszait jelölik. 18

20 A primitív APC-CDK szabályozó A primitív eukarióta sejtciklus szabályozás leírására alkalmazott mechanizmus (9.ábra) az APC és a CDK antagonisztikus viselkedésén alapszik: a CDK inaktiválja az APC-t, ezzel szemben az APC aktív formája megindítja a Cdk/ciklin dimerek ciklin alegységének degradációját. Tegyük fel, hogy a CDK katalitikus alegysége (Cdk) stabilis és állandó koncentrációban van jelen a sejtben, valamint a Cdk és a ciklin kapcsolódása gyors folyamat. Ebben az esetben a CDK és az APC közötti antagonisztikus kölcsönhatás leírható az alábbi két kinetikai egyenlettel: ' ( k ( 1 [APC]) k [APC] ) [CDK] d[cdk] = k mass " 2 2 dt d[apc] dt = 1 ( k' k" [ACT] ) ( 1 [APC] ) 3 3 J 3 1 [APC] k 4 [CDK]*[APC] J [APC] 4 (1a) (1b) ahol [CDK] = [Cdk/ciklin dimerek a sejtmagban] és [APC] = az APC aktív hányada. Ezekben az egyenletekben k 1, k 2, stb. sebességi állandók, és a mass a citoplazma tömegének egy önkényes egységben vett mérõszáma. k as nem felállt kromoszómák nem replikált DNS apoact k ai k aa ACT k ad lebomlott aktivátor Sejtmag inaktív APC k 3 k 4 Cdk ciklin APC k 2 aktív Cdk lebomlott ciklin Cdk ciklin asszociáció (gyors) Aminosavak 9. ábra: A primitív APC-CDK szabályzó. A ciklin alegység (ovális) szintézisét (1. lépés) követõen, gyorsan és irreverzibilisen köt a Cdk alegységhez (téglalap), ezután az aktív dimer azonnal a sejtmagba jut. A ciklin alegység az APC (Pac-Man ikon) által lebomlik (2. lépés). Az APC-t a Cdk/ciklin dimer kikapcsolja (4. lépés), míg az aktivátor (ACT) bekapcsolja (3. lépés). Az aktivátor (zöld csillag) állandó sebességgel képzõdik egy inaktív (apo) formában (as. lépés), és az APC bontja le (ad. lépés). Az újonnan képzõdött aktivátornak az aktív formába kell jutnia (aa. lépés), amit a nem replikált DNS-rõl és a mitózisos orsókhoz még nem tapadt kromoszómákról érkezõ jelek gátolnak (ai. lépés). Cdk Ciklin k 1 19

21 A ciklin a citoplazmában a citoplazma méretével arányos mértékben (k 1 mass) szintetizálódik, gyorsan hozzáköt a feleslegben jelenlévõ szabad kináz (Cdk) alegységekhez és a kész dimer (CDK) a sejtmagba kerül és ott felhalmozódik. A CDK aktivitás a ciklin lebomlás hatására tûnik el. A lebomlás sebességét az határozza meg, hogy az APC milyen arányban oszlik meg a két formája közt: k 2 és k 2 azok a sebességi állandók, amelyek a kevésbé aktív és az aktívabb formát jellemzik (Feltételezzük, hogy az enzimes folyamatban az enzim (APC) nincs telítve a szubsztrátjával (CDK).) Az APC aktiválás és inaktiválás leírására Michaelis-Menten kinetikát használunk: a (k 3 k 3 [ACT]) és k 4 [CDK] az aktiválás és inaktiválás V max -ai (ACT és CDK a folyamatokat katalizáló enzimek). Egységnyinek vettük az összes APC koncentrációt és a Michaelis konstansokat (J 3 és J 4 ) pedig az összes APC szinthez képest alacsonynak vettük, így az APC aktivitás egy nagyon érzékeny kapcsolóként viselkedik (Goldbeter & Koshland, 1981). A rendszer vizsgálatához egyelõre vegyük az APC-t inaktíváló enzim (ACT) aktivitását egy paraméternek Fázissík diagram Egy pár nemlineáris közönséges differenciálegyenlet (ODE) tanulmányozására a fázissík technika az egyik legalkalmasabb módszer (Edelstein-Keshet, 1987). A fázissík jelen esetben egy olyan derékszögû koordináta rendszer, ahol a [CDK] az [APC] függvényében van ábrázolva. Minden egyes biokémiailag reális [CDK], [APC] koncentráció, aktivitás pár meghatározza a szabályozó rendszer egy állapotát és megfelel a fázissík egy pontjának. Az ODE-k határozzák meg minden egyes pontban, hogy milyen gyorsan változik a CDK és az APC aktivitása. Geometriailag az ODE-k egy kis nyilat rendelnek minden ponthoz és ezt a nyílhalmazt hívjuk vektorsíknak. Ahol a ciklin szintézis és degradáció tökéletes egyensúlyban van, ott dcdk/dt=0, tehát a vektorsík vertikális. A fázissík ezen pontjainak halmazát CDK egyensúlyi görbének nevezzük, ami a következõ egyenlettel adható meg: [CDK] k1 mass = ' k " 2 ( 1 [APC]) k [APC] 2 (2a) 8 Amelyik egyenletben ACT-t használok, ott paraméternek, ahol pedig [ACT]-t, ott változónak tekintem az aktivátort. 20

22 Hasonlóan, ahol az APC aktiválás sebessége megegyezik az inaktiválás sebességével, ott horizontális a vektorsík, és ezt az ún. APC egyensúlyi görbét az alábbi egyenlet adja meg: (k [CDK] = ' 3 k " 3 ACT) (1 [APC]) J 4 [APC] " k [APC] J 1 [APC] 4 3 (2b) A matematikai zsargon ezeket az egyensúlyi görbéket nullklínáknak nevezi. Ezt a két egyensúlyi görbét (nullklínát) ábrázoltuk a 10. ábrán. Ahol az egyensúlyi görbék metszik egymást, ott a szabályozó rendszer állandósult állapotban van. A állandósult állapot stabilis, ha bármilyen kis CDK ill. APC változtatásra a rendszer visszatér az eredeti állapotába, egyébként pedig instabilis. A 10A. ábrán a paraméterek úgy vannak megválasztva, hogy az egyensúlyi görbék három ponton is metszik egymást: az egyik stabilis állandósult állapotban az APC aktív és ezért kicsi a CDK aktivitás; míg a másik stabilis állandósult állapotban éppen fordítva, az APC inaktív és így nagy a CDK aktivitása. Az instabilis állandósult állapot köztes APC és CDK koncentrációkkal jellemezhetõ. A matematikusok ezeket a stabilis állandósult állapotokat csomópontoknak, az instabilis állandósult állapotot pedig nyeregpontnak hívják. A két csomópont megfelel a korábban említett G1 illetve S/M állapotoknak. APC G1 mass = 1 ACT tot = 0.05 kai = 0.5 A APC mass = 1.6 ACT tot = 0.05 kai = 0.5 B S/M CDK 0.2 S/M CDK APC G1 mass = 2 ACT tot = 1.5 kai = 0.5 D APC G1 mass = 1.75 ACT tot = 1 kai = 7 C CDK ábra: Az APC-CDK szabályozó fázissík görbéi a sejtciklus során. Mind a négy mezõben a Cdk egyensúlyi görbét (kék) és az APC egyensúlyi görbét (piros) ábrázoltuk. A metszéspontokban stabilis csomópontok ( ) és instabilis nyeregpontok (ο) jönnek létre. Az ábrán jelöltem, hogy az adott metszéspontok mely paraméter értékeknél adódnak. 0.2 S/M CDK 21

23 A szabályozó rendszer attól függõen, hogy a 10A. ábrán milyen kezdeti értékektõl indul, el fogja érni vagy az egyik vagy a másik stabilis állandósult állapotot és ott marad mindaddig, amíg valami nagy változás nem történik. Ez lehet egy kellõen nagy fluktuáció az egyik változóban, vagy egy nagy változás az egyik paraméterben. Tételezzük fel, hogy a szabályozási rendszer a G1 állapotban tartózkodik. Forgatókönyvünk szerint a Start" az a kritikus esemény, ami a sejtnövekedés hatására a sejtet G1-bõl S/M-be löki. Amint a sejttömeg (mass) növekszik, a CDK egyensúlyi görbe jobbra felfelé mozdul, és ezáltal a G1 csomópont és az instabil nyeregpont összeütközik, majd eltûnik (10B. ábra). A matematikusok ezt nyeregcsomó bifurkációnak (Noszticzius & Wittmann, 1992) hívják. Esetünkben a sejttömeg (mass) nevezhetõ ún. bifurkációs paraméternek. A Start"-hoz szükséges kritikus sejttömeget a mass értéke adja meg a bifurkációpontban és bármely ennél nagyobb mass érték esetén csak egy stabilis állandósult (S/M) állapot létezik, ahova a rendszernek tartania kell. A Start" átmenet során az APC inaktiválódik, a CDK pedig aktiválódik, mert a G1 állapot eltûnik és csak az S/M stabilis állandósult állapot marad a rendszer számára. A Finis" az az esemény, amely visszalöki a sejtet S/M-bõl G1-be. Feltételeztük, hogy ez egy aktivátor" (ACT a 9. ábrán) hatására történik meg, ami ellensúlyozza a CDK gátló hatását az APC-n. Modellünkben ez az aktivátor folyamatosan szintetizálódik és az APC hatására lebomlik. Az újonnan szintetizált aktivátor" egy hatástalan apo formában képzõdik, amit poszt-transzlációsan módosítani kell, hogy aktív legyen. Ezt a két ellentétes irányú reakciót aa -val ill. ai -vel jelöltem a 9. ábrán. A Start-ot követõen az ACT akkumulálódik, mert bomlása APC függõ és a Start-nál az APC inaktiválódik. Az ACT molekulák többsége azonban hatástalan ( apo formában) marad mindaddig, amíg a DNS replikáció folyik vagy míg a kromoszómák össze nem kapcsolódtak a magorsó fonalakkal, mert ezen idõ alatt az ai lépés sebessége nagyobb mint az aa lépésé (ld. 10C. ábra). Amikor mindezen folyamatok lejátszódtak, akkor az ACT molekulák inaktiválódási sebessége ( ai lépés) lecsökken az eredeti értékre, ezért az apoact átalakul ACT-vé és aktiválja az APC-t. A fázissíkon (10D. ábra) ez megfelel az APC egyensúlyi görbe jobbra tolódásának, ami az S/M állapot nyereg-csomó bifurkáció általi eltûnését okozza, ezért a szabályozó rendszer visszatér a G1 állapotba. Amint a sejt elosztódik (mass mass/2) és az ACT- 22

24 t lebontja az APC, akkor mind a CDK mind az APC egyensúlyi görbe visszatér a 10a. ábrán látható eredeti pozícióba és a ciklus kezdõdik elölrõl A modell numerikus szimulációja A 9. ábrán látható mechanizmus teljes leírásához az 1a-1b. egyenleteket ki kell egészíteni az alábbi differenciálegyenletekkel: dmass = ì mass dt d[act dt T ] = k as ( k' ( 1 [APC]) k" [APC] ) [ACT ] ad ad T (1c) (1d) d[act] dt = k aa ([ACT ] [ACT]) k [ACT] ( k' ( 1 [APC] ) k" [APC] ) [ACT] T ai ad ad (1e) ahol [ACT](t)=[ACT] és [ACT T ](t)=[act][apoact]. A k ai egy függvény, ami a nem replikált DNS és a nem felállt kromoszómák hatását írja le a modellben, aminek értékét jellegzetesen változtatjuk a sejtciklus alatt (1. melléklet 3. ábra). Az 1. melléklet 4. ábrája az 1a-e egyenletek egy tipikus oszcillációs megoldását mutatja. Különbözõ növekedési sebességeknél (µ) végzett szimulációk azt mutatják, hogy a két egymást követõ sejtosztódás között eltelt ciklusidõ mindig egyenlõ a tömeg duplázódási idõvel, (ln2)/µ, aminek kiegyensúlyozott növekedésnél mindig igaznak kell lennie. Ez a növekedési sebesség megegyezik a sejtpopulációra vonatkozó fajlagos növekedési sebességgel, így adott körülmények között állandónak tekinthetjük. A modell azért rendelkezik a kiegyensúlyozott növekedés tulajdonságával, mert a Start" átmenetet a sejtméret szabályozza. Mivel az anyasejt tökéletesen félbe osztódik, a két egymást követõ Start" közötti idõ pontosan megegyezik a tömeg duplázódási idõvel. 23

25 Hiszterézis A primitív eukarióta ciklust jól meg lehet feleltetni egy hiszterézis hurok (Farkas et al., 1992) körüli forgásnak. Hiszterézis olyan rendszerekben fordul elõ, amelyeknek több állandósult állapotuk van, és arra a tényre utal, hogy a rendszer megfigyelt állapota nemcsak a paramétereinek az értékén alapszik, hanem a történetétõl is függ (a rendszer elõzõ állapotától). A hiszterézis hurok illusztrálásához visszatérek a két komponensû rendszerhez (1a,b egyenletek). Az APC állandósult állapotának értékeit a mass/(k 3 k 3 ACT) függvényében ábrázolva, miközben az összes többi paraméter értéke állandó, egy bifurkációs diagram kapható. Azért választottuk a mass/(k 3 k 3 ACT)-t bifurkációs paraméternek, mert így a számlálóban a Start, a nevezõben a Finis átmenetért felelõs paraméterek szerepelnek. A (2a,b) egyenletekbõl esetén mass/(k 3 k 3 ACT) kifejezhetõ, mint az APC állandósult állapotának függvénye: ' k mass = " k ACT ' " ( k ( ) ) ( ) ( ) 2 1 [APC] k 2 [APC] 1 [APC] J 4 [APC] " k k [APC] ( J 1 [APC]) amit a 11. ábrán ábrázoltunk. A bifurkációs paraméter bizonyos értékeinél az APCnek három alternatív állandósult állapota van: két csomópont, amit egy nyeregpont választ el. A kisméretû, újszülött, G1 fázisú sejtek az A pontban tartózkodnak, mert az APC aktív (11. ábra). Amint a sejttömeg (mass) növekszik, a szabályozó rendszer a felsõ szaggatott vonallal jelzett pályán mozog, miközben a sejt G1 fázisban marad (aktív APC), mindaddig amíg a sejt el nem ér egy kritikus sejttömeget. Kritikus sejttömeg elérésekor a G1 állapot egy nyereg-csomó bifurkációval eltûnik (B pont) és a szabályozó rendszer a C pontba kerül: APC inaktiválódik és ennek következtében a CDK aktiválódik. Ez a sejtciklus Start" átmenete. A Start"-ot követõen, miután a DNS replikáció befejezõdött és a kromoszómák felálltak a metafázisos síkra, az ACT értéke hirtelen megnövekszik, ezért a bifurkációs paraméter lecsökken. Az S/M állapot eltûnik egy nyereg-csomó bifurkációval a D pontban és az APC aktiválódik, ami a szabályozó rendszert visszabillenti G1 állapotba ( Finis" átmenet). 24

26 A sejtciklus átmenetek ebben a forgatókönyvben az instabilis állandósult állapothoz (nyeregponthoz) kapcsolódnak, ami egy integráns része a hiszterézis huroknak. Ahogy a mass/(k 3 k 3 ACT) értéke a sejtnövekedés és a kromoszómás ciklus hatására változik, a nyeregpont elõre-hátra ingázik, elpusztítva elõbb a G1 állapotot, majd az S/M állapotot. A hiszterézis hurok nyereg-csomó bifurkációi az ACT és a sejttömeg (mass) lassú, lépésszerû változásait gyors átmenetekké ( Start" és a Finis") alakítják át. Tehát a mass/(k 3 k 3 ACT) arány periódikus változásai lökdösik körbe a sejtet a sejtciklus hiszterézis hurkán. Ez az arány szoros kapcsolatot mutat a ún. nukleo-citoplazmás aránnyal, ami bizonyítottan (Novák & Tyson, 1993) a növekedõ sejtek ciklusait szabályozza. Csupán nem növekedõ, embrionális sejtek (sejt)ciklusánál tapasztalhatunk spontán oszcillációt, növekedõ sejtek ezt a hiszterézis hurkot járják körbe sejtciklusuk folyamán. Hiszterézis hurok 1 A növekedés 0.8 APC csomó B 0.6 APC 0.4 Finis nyereg Start D csomó APC DNS repl. & kromoszóma felállás C mass / (k 3 k 3 *ACT) 11. ábra: Az APC-Cdk szabályozó bifurkációs diagramja. Az abszcisszán a bifurkációs paraméter: mass/(k 3 k 3 ACT) szerepel, az ordinátán pedig az APC állandósult állapota látható. A bifurkációs paraméter értékek egy tartományában (1.8 < mass/(k 3 k 3 ACT) < 6.9) az APC-nek (és ebbõl kifolyólag a Cdk-nak is) három lehetséges állandósult állapota létezhet. B és D pontoknál az APCaktív és APC-inaktív állapotok egy-egy nyeregcsomó bifurkációval alakulnak egymásba. Az ábrán a hiszterézis hurok számolt, a trajektória pedig sematikus. 25

27 Ez az egy egyszerû modell, amit eddig tárgyaltunk rendelkezik egy eukarióta sejtciklus minden lényeges tulajdonságával: pre-replikatív és poszt-replikatív állapotokkal, a Start"-nál ható méretkontrollal és egy ellenõrzõ mechanizmussal, ami összekapcsolja a kromoszómás ciklust a Finis átmenettel. Az elõzõekben bemutatott primitív modellt kiegészítettük egy ciklin dependens kináz inhibitorral (CKI), valamint a CDK foszforilezéses inaktiválásával (Novák et al., 1998b). Késõbb ezekbõl az egyszerû modellekbõl kiindulva elkészítettük mind a hasadó mind a sarjadzó élesztõ sejtciklusának részletes matematikai modelljeit (Chen et al., 2000; Novák et al., 1998a; Novák et al., 1999; Sveiczer et al., 2000). A hasadó élesztõ sejtciklusának mindhárom szabályozópontját tartalmazó modell (Novák et al., 1998a) megalkotása után az abban feltételezett mechanizmusunkat igazolták is (Martin-Castellanos et al., 2000). A modellt továbbfejlesztettük, és ezzel az új modellel (Sveiczer et al., 2000) már a hasadó élesztõ egy rendkívül érdekes mutánsának viselkedését is le tudtuk írni (Sveiczer et al., 1996). Értekezésem további részében a hasadó élesztõ modellekre nem térek ki részletesen, csak a sarjadzó élesztõre vonatkozó modelljeinket mutatom be. 26

28 3.2. A sarjadzó élesztõ sejtciklusának modellje A primitív eukarióta sejtciklus elõzõekben ismertetett modelljét kiegészítettük egy CDK inhibitorral (CKI). Ehhez a modellhez a sarjadzó élesztõ különbözõ ciklinjeit, transzkripciós faktorait, APC szabályozóit hozzáadva megalkottuk a sarjadzó élesztõ sejtciklusának egy olyan modelljét, amellyel igen részletesen leírható nemcsak a vad típusú sejt fiziológiai viselkedése, hanem számos mutáns sejté is. A matematikai modell alapját képezõ szabályozási hálózat egyszerûsített vázlata a 12. ábrán 9 látható és a 2. melléklet bevezetõjében ( oldal) olvasható indoklás a részleteket illetõen. Röviden összefoglalva, a sarjadzó élesztõ kilenc ciklinje közül négyet különböztettünk meg, ami jól megfelel a korábban már ismertetett redundanciának. Két Cln-t veszünk figyelembe (Cln3 és Cln2), mert a Cln1 szerepe azonos a Cln2- ével. A Clb5-6 és a Clb1-2 párokból csak a Clb5-öt és Clb2-öt szerepeltetjük a modellben, mivel a Clb3 és Clb4 hiányában a sejtciklus teljesen normálisan fut, így ezeket egyszerûen elhagyjuk. A primitív eukarióta sejtciklus modell jellegzetes antagonizmusa a sarjadzó élesztõben a Cdk1/Clb2 és az APC/Hct1 (más néven APC/Cdh1) versengésében érvényesül. Érdemes megfigyelni azonban, hogy ehhez az antagonizmushoz (pozitív visszacsatolás) a sarjadzó élesztõ sejtciklus szabályozásában egy újabb antagonizmus társul: a sarjadzó élesztõ CKI-je (Sic1) sztöchiometrikusan gátolja a Cdk1/Clb2,5 komplexeket, amelyek viszont foszforilezéssel serkentik a Sic1 lebontását. Az elõzõekben bemutatott módszerrel a 12. ábrán látható komponensek mindegyikére egy egyenletet felírva, a szabályozó hálózatot egy nemlineáris közönséges differenciálegyenlet rendszerré alakítottuk (2. melléklet 1. táblázat). Az egyenleteket most is a komponensek (fehérjemolekulák) koncentrációira írtuk fel, úgy ahogy azt a 2.3. pontban tárgyaltuk, összevonva a transzkripció (génátírás) és transzláció (fehérjeszintézis) folyamatát. 9 Az elõzõekben APC-vel jelölt ciklin lebontó komplexet innentõl a ciklin lebontásért felelõs szabályozójával, a Hct1-gyel (más ismert neve: Cdh1) jelölöm. Míg az eddigiekben ACT-vel jelölt aktivátort Cdc20-szal, mivel ismert, hogy a S. cerevisiae-ban az APC/Cdc20 az az aktivátor, ami az APC/Hct1-et aktiválja. 27

29 A kísérleti eredményekkel összhangban feltételeztük, hogy a Cdk1 alegység feleslegben (nem limitáló koncentrációban) van jelen, ezért az egyes Cdk1/ciklin komplexek koncentrációja megegyezik az adott ciklin koncentrációjával. Ennek megfelelõen a késõbbi tárgyalásban az adott ciklin nevével a Cdk1/ciklin komplexre is utalunk. apocdc20 replikálatlan DNS és magorsóhoz nem tapadt kromoszómák lebomlott Cdc20 inaktív Hct1 Cdk1 Cln2 MCM1 Cdc20 Cdk1 Clb2 Hct1 aktív Cdk1 lebomlott Clb2 Sic1 Cdk1 Clb2 Sic1 mitózis Sic1 P SCF gyors lebomlott Sic1 Sic1 Cdk1 Cln3 Cdk1 Clb5 MBF - SBF Cdk1 Clb5 Cdk1 Cln2 lebomlott Cln2 12. ábra: A sarjadzó élesztõ sejtciklus szabályozóinak kölcsönhatásai. A sejtnövekedés hatására a Cdk1/Cln3 szintje a sejtmagban elér egy kritikus értéket és bekapcsolja az SBF és MBF transzkripciós faktorokat. Az SBF elindítja a Cln2 szintézisét, ami a sarjadzás elindításához szükséges. Az MBF felelõs a Clb5 képzõdéséért, és a Cdk1/Clb5 aktivitás a DNS szintézis elkezdéséhez vezet. A Cdk1/Clb5 aktivitás elõször azonban még gátlódik a Sic1 (CKI) révén. Azonban, ahogy a Cln2 szintje tovább nõ, elkezdi a Sic1 foszforilezését, ami az SCF által gyorsan lebomlik, így felszabadul a Clb5. A Cdk1/Cln2 másik szerepe, hogy kikapcsolja a Clb2 (a mitózis indításáért felelõs ciklin) lebontásáért felelõs Hct1 nevû, APC szabályzó fehérjét. Ezzel lehetõvé teszi, hogy a Cdk1/Clb2 pozitív visszacsatolással aktiválja saját szintézisét az MCM1 nevû transzkripciós faktoron keresztül. A Cdk1/Clb2 azontúl, hogy elindítja a mitózist, kikapcsolja a Cln2 szintézisét is, és elindítja a Cdc20 (az APC másik szabályzója) szintézisét. A Cdc20 azonban csak akkor aktiválódik, amikor a kromoszómák felálltak a metafázisos síkra. A Cdc20 ekkor elindítja a kromoszómák szegregálását (ábrán nincs feltüntetve) és aktiválja a Hct1-et, és ezzel elindítja a Clb2 lebontását. Cdk1 sarjadzás lebomlott Clb5 DNS replikáció 28

30 A modell numerikus szimulációja A differenciálegyenlet-rendszert numerikus szimuláció módszerével vizsgáltuk számítógépen. A számítógépes szimulációhoz azonban ismernünk kell a modellben szereplõ reakciósebességi állandók és egyéb paraméterek értékeit. Szerencsére a modell felállításához felhasznált irodalmi adatokból meg lehetett határozni a paraméterek egy részének értékét (ld. 2. melléklet old.). Az irodalmi adatokból nem meghatározható paramétereket pedig úgy próbáltuk beállítani, hogy a szimulációk során kapott idõgörbék minél tökéletesebb hasonlóságot mutassanak az egyes komponensek irodalomból megismert változásával. A szimulációkhoz használt paraméter értékekrõl a 2. melléklet 2. táblázata ad áttekintést. A 13. ábra egy ilyen számítógépes szimuláció alapján mutatja három különbözõ ciklin (Cln2, Clb2 és Clb5) koncentráció változását egy sarjadzó élesztõ leánysejtjének sejtciklusa alatt. Természetesen a program számolja a 12. ábrán mutatott összes komponens idõbeli változását, de itt az egyszerûség kedvéért csak erre a háromra, illetve a sejt méretére szeretnék koncentrálni. A 2. melléklet 3. ábráján több komponens változása is nyomon követhetõ a sejtciklus alatt. 2 Sejttömeg anyasejt 1 Cln2 Clb2 leánysejt Clb Idõ ( perc ) 13. ábra: A sarjadzó élesztõ sejtciklusának szimulációja. A 12. ábrán látható rendszert leíró egyenleteket a vad típusú sejtnek megfelelõ paraméterekkel megoldva (2. melléklet 1-2. táblázat) kaptuk ezt az eredményt. A kis leánysejtben egy kritikus méretnél megjelenik a Cln2 és a Clb5 aktivitás, ami elindítja a sarjadzást és a DNS szintézist, majd a Clb2 iniciálja a mitózist. Osztódás után az anyasejt nagyobbnak születik, így elõbb eléri a kritikus méretet, így ciklusideje rövidebb lesz. A leánysejt ciklusa az elõzõével megegyezõ lesz. 29

31 A kisméretû, újszülött leánysejt G1 fázisban van, és ilyenkor egyik ciklin sem mutatható ki (ld. Futcher, 1996). Amikor azonban a sejt elér egy kritikus méretet, akkor a Cln3 sejtmagbeli szintje is elér egy olyan szintet, hogy aktiválni tudja a Cln2 és a Clb5 transzkripcióját. Mivel a Cln2 indítja el a sarjadzást, ezért ilyenkor megjelenik a sarjképzõdmény a sejten. A Cln2-nek azonban más esszenciális hatásai is vannak. Foszforilezéssel eltünteti a Clb2 és a Clb5 inhibitorát (Sic1) és kikapcsolja a Clb2 lebontását. Ennek következtében mindkét B-típusú ciklinnek (Clb2 és Clb5) megnõ a koncentrációja. A Clb5 koncentrációja azonban sokkal elõbb növekszik, mint a Clb2-é, mert a Clb5 transzkripciós faktorát (MBF) is a Cln3 aktiválja, míg a Clb2-nek saját magának kell aktiválnia a transzkripciós faktorát (MCM1) és ez a pozitív visszacsatolás a mechanizmusban lassú. A két B-típusú ciklin megjelenésében tapasztalható különbség jó összhangban van azzal a ténnyel, hogy Clb5 a DNS replikáció, míg a Clb2 a késõbb lejátszódó mitózis elindításában játszik szerepet (ld. Nasmyth, 1996). A Clb2 azonban nemcsak aktiválja a saját szintézisét, hanem serkenti a saját lebontását is (negatív visszacsatolás). A negatív visszacsatolás azonban a primitív eukarióta sejt modelljéhez képest eltérõen valósul meg. A 9. ábrán látható modellben az APC lebontja az õt aktiváló ACT molekulákat, ami egy negatív visszacsatolást jelent. Láthatóan ez a hatás a 12. ábráról hiányzik, mert a sarjadzó élesztõ Cdc20 nevû fehérjéjét (ami az ACT-nak felel meg) az APC/Hct1 nem bontja. Ezzel szemben a Cdk1/Clb2 serkenti a Cdc20 szintézisét, ami ugyanazt a negatív visszacsatolást eredményezi, hiszen a Cdc20 aktiválja az APC/Hct1-t, ami lebontja a Clb2-t. Ennek a változtatásnak az a magyarázata, hogy a negatív visszacsatolást a primitív eukarióta sejtciklus modell felállításánál konkrét kísérleti adatok hiányában csak prognosztizálni tudtuk, de konkrét megvalósulási formáját nem ismerhettük. Az idõközben megismert irodalmi adatok a Cdc20 szintjének szabályozásáról, sokkal inkább a szintézis, mint a lebomlás szabályozására utalnak (Hwang et al., 1998). Az APC/Cdc20 aktiválása csak akkor következhet be, ha már felálltak a kromoszómák a metafázisos síkra (Hwang et al., 1998). Ekkor a Cdc20 aktiválódik és elindítja az anafázist, valamint a Hct1 aktiválódását, ami a Clb-ek lebomlásához vezet. A Clb2 szintjének csökkenése váltja ki a sejtosztódást, ami két különbözõ méretû sejtet eredményez: egy kis leánysejtet és egy nagyobb anyasejtet (Hartwell & 30