Sejtszaporodás és reakciókinetika

Átírás

1 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 1 Sejtszaporodás és reakciókinetika Novák Béla Summary rogress of a cell through its reproductive cycle is governed by a complex network of biochemical reactions, the central components of which are a family of cyclin-dependent protein kinases (Cdk's) whose activity and specificity depends on binding to members of the cyclin family of proteins. This biochemical machinery is very complex, and as new information is accumulating at a fast pace, it becomes impossible to comprehend how all the pieces interrelate by casual verbal argument. Standard chemical kinetic theory provides a disciplined method for expressing the molecular biologist's diagrams and intuition in precise mathematical form, so that quantitative and qualitative implications of working models can be derived and compared with experiments. This synthetic approach provides a vital link between the reductionism of modern molecular biology and the integrated physiology of a living cell. A sejtciklus A szaporodó sejtek osztódásukat megelőzően egy bonyolult fejlődési folyamaton mennek keresztül, amit sejtciklusnak nevezünk (1. ábra). A sejtciklus két legfontosabb eseménye: 1. DNS-replikáció: a genetikai anyag (dezoxiribonukleinsav = DNS) lemásolása, valamint 2. mitózis (magosztódás): a kromoszómák térbeli szétválasztása. A sejtszaporodás alapfolyamatában, a sejtciklusban működő szabályozó mechanizmusok megismerése nemcsak a nem-kontrollált sejtszaporodás (rák) megfékezése, hanem a nyugvó állapotba került sejtek szaporodásra késztetése szempontjából is alapvető jelentőségű. Ennek megfelelően a sejtciklus szabályozásának vizsgálata a sejtbiológiai kutatásoknak mindig mitózis sejtosztódás DNS replikáció 1. ábra: Az eukarióta sejtciklus fõbb eseményei

2 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 2 fontos kérdése volt. A sejtszaporodást azonban sokáig csak a sejtfiziológia eszközeivel lehetett vizsgálni, aminek lényege, hogy a sejtciklus szabályozó rendszert egy fekete doboznak tekintették. A sejtek szaporodásának különböző megzavarásokat követő pontos mérésével pedig megpróbálták kitalálni, hogy milyen szabályozó szerkezet rejtőzik a fekete dobozban. Ezek a klasszikus fiziológiai kísérletek megállapították a sejtciklus szabályozásában érvényes legfontosabb szabályokat, és feltárták az egyes sejttípusok sejtciklus szabályozásában fennálló legfontosabb különbségeket is. A sejtciklust szabályozó molekuláris hálózat Az elmúlt években a molekuláris biológiai módszerek alkalmazásának eredményeként új szakasz kezdődött a sejtciklus kutatásban. A sejtciklust szabályozó fekete dobozt a laboratóriumi asztalon részeire szedték, és megkezdődött a molekuláris alkatrészek jellemzése. Természetesen ez a molekuláris szakasz még ma is tart, és ennek eredményeképpen egyre gyorsabban gazdagodik tudásunk a sejtszaporodás szabályozásáról. A molekuláris vizsgálódás eredményeként megtudtuk, hogy a sejtszaporodást egy komplikált biokémiai reakciórendszer (gépezet) irányítja, amelynek legfontosabb elemei más fehérjéket foszforilező ún. protein kinázok. Ezek olyan enzimek, melyek AT (adenozin-trifoszfát) segítségével más fehérjéket foszforileznek és ezáltal azok tulajdonságait (pl. aktivitás) megváltoztatják. A protein kinázok által foszforilezett fehérjékről pedig protein foszfatázok távolítják el a foszforsavat. A proteinek foszforilezése és defoszforilezése egy széleskörűen alkalmazott szabályozási módszer az élővilágban (a baktériumok úszásától a vércukor szint szabályozásán keresztül a sejtszaporodásig). aminosavak szintézis degradáció A sejtciklus Cdk inaktív Cdk kináz foszfatáz CKI Cdk AD AT AT Cdk szabályozásában résztvevő protein kinázok azonban csak akkor aktiválódnak, ha egy nek nevezett regulációs alegységhez kapcsolódnak (2. ábra). Éppen ezért ezeket a CKI Cdk inaktív 2. ábra: A Cdk-k aktivitásának szabályozása protein kinázokat összefoglalóan függő protein kinázoknak (Cyclin

3 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 3 dependent protein kinase, röviden Cdk) nevezzük. Az így kialakult aktív Cdk/ komplex képes a sejtciklus egy bizonyos eseményének elindítására. Mivel a kapcsolódása elengedhetetlenül szükséges a Cdk aktiválódásához, ezért a sejtek a mennyiségének (koncentrációjának) szabályozásával tudják a Cdk aktivitást befolyásolni. A fehérje koncentrációja pedig mind képződésének (szintézis) mind lebomlásának (degradáció) sebességével szabályozható (2. ábra). A Cdk aktivitása azonban nemcsak a ek koncentrációján keresztül szabályozódik. A Cdk-k aktív centruma foszforilezhető treonin és tirozin oldalláncokat tartalmaz, melyek foszforilezése más protein kinázok hatására gátolja a Cdk-t szubsztrátjainak (foszforilezendő fehérje és AT) megkötésében. A aktív centrum foszforilezett aminosavainak defoszforilezése protein foszfatáz hatására pedig aktiválja a Cdk-t. Azonban a RB Cdk/ komplex aktivitása nemcsak kovalens módosítással (foszforilezés) szabályozódhat. Az utóbbi években felfedezett ún. dependens kináz inhibitorok (CKI) a Cdk/ komplexhez történő kapcsolódásukkal gátolják annak kináz aktivitását. Mivel a sejtciklus különböző eseményeit általában különböző Cdk-k különböző ekkel alkotott komplexei indítják el, ezért könnyű elképzelni, hogy egy igen komplex biokémiai reakciórendszerről van szó. A 3. ábra az emlős sejtek sejtciklusát szabályozó biokémiai gépezet egy egyszerűsített vázlatát mutatja. A sejtciklust irányító biokémiai gépezet, tehát nem más mint Cdk-k, ek, CKI-k, valamint egyéb protein kinázok és foszfatázok szövevényes hálózata. Ez a biokémiai gépezet nagyon hasonló a különböző fejlettségű eukarióta (valódi sejtmagvas) sejtekben, ami különös fontosságot ad megismerésének. Igaz, hogy a magasabbrendű sejtek RB RB E2F p27 E2F p16 Cdk2 E AC - - Wee1 Cdk4 D p27 Cdk2 E B B p27 Cdc25 Cdk4 D AC p27 Cdk2 Cdk4 E mitózis Cdk2 DNS replikáció 3. ábra: A Cdk-k egyszerûsített hálózata emlõs sejtekben.

4 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 4 szabályozó rendszere több komponenst használ az összetettebb feladatok megoldása érdekében, de a mechanizmus lényegében nagyon hasonló az egyszerűbb eukarióta sejtekéhez (pl. élesztők). A sejtciklust szabályozó molekuláris hálózat bonyolultsága felveti a rész és egész problémájának kérdését. Nevezetesen egy ilyen komplikált reakciórendszer esetén miként lehet a részekből (molekulák) megjósolni az egész rendszer (a sejt) fiziológiai viselkedését. Ezen kérdés megválaszolásának pedig különös jelentősége van, amikor ellenőrizni szeretnénk, hogy molekuláris ismereteink összhangban állnak-e az egész sejtet leíró fiziológiai kísérletek eredményeivel. A reakciókinetika alkalmazhatósága A kémikusoknak az ilyen és ehhez hasonló nehézségek feloldására jól bevált módszerük van: a kémiai reakció kinetika módszere. Ennek lényege és alkalmazásának főbb lépései a következők: 1. a feltételezett reakciómechanizmust sebességi egyenletekbe fordítjuk, vagyis minden egyes kémiai komponens koncentrációjának időbeli változási sebességére egy differenciálegyenletet írunk, 2. az egyenletek megoldásával kiszámoljuk a feltételezett mechanizmus várható viselkedését, 3. amit összevetve a kérdéses reakció kísérletes megfigyelésével, 4. addig módosítjuk a mechanizmust, amíg megfelelő egyezést nem kapunk a kísérletek és az elmélet között. Miért ne lehetne ezt a módszert a sejtciklus szabályozó reakcióhálózat mechanizmusának felderítésében is alkalmazni? 1991-ben John Tyson professzorral (Virginia Tech, Biológia Tanszék) közös munkába kezdtünk, amelynek célja az eukarióta sejtciklus matematikai modellezése a molekuláris biológiai ismeretek alapján a kémiai reakció kinetika módszerével. A biológusok nagy többsége azonban nem fogadja ezt a megközelítést olyan lelkesen. Talán senki sem tagadja a sejtciklus modellezésének szükségességét, de a legtöbben azt túl korainak tartják, mondván még rengeteg molekuláris részletet nem ismerünk. Szerintünk a helyzet éppen fordított: a sejtciklus szabályozási rendszerről összegyűjtött ismereteink már most túllépték azt a mértéket, hogy a róluk történő gondolkodásunkat egyszerűen intuícióink irányítsák. A probléma ugyanis igen hasonló egy olyan kirakós játékhoz ( puzzle ), amelynek a fedőképét nem ismerjük, biztosak lehetünk abban is, hogy bizonyos darabok hiányoznak a dobozból, és az egyes elemek összeillesztésére nem áll rendelkezésünkre egy sima felület. A reakciókinetika módszere

5 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 5 asztallapként használható fel a sejtciklus puzzle kirakásában, mely azzal a további előnnyel is jár, hogy a szabályozási rendszer dinamikai aspektusai is megjeleníthetők. Ezt a megközelítési módszert most a sejtciklus szabályozó hálózat egy kisebb szeletén, a mitózis (magosztódás) szabályozásán keresztül próbálom meg illusztrálni. A eukarióta sejtek mitózis kontrollja A mitózis bekövetkezését minden eukarióta sejtben egy Cdk/ komplex indítja el, amit mitózis serkentő faktornak (Mitosis romoting Factor = MF) nevezünk. Az MF az elsőnek felfedezett Cdk () és egy mitózisos (B-típusú) komplexe (4. ábra). Az MF-et a aktív centrumában foszforilező és inaktiváló tirozin kináz enzimet Wee1-nek nevezzük. Ha ugyanis az enzimet kódoló gént hasadó élesztőben mutációval inaktíváljuk akkor a sejtek kisebb méretnél (wee = törpe) osztódnak. A Wee1 tirozin kináz által létrehozott inaktív MF-et (premf) a Cdc25 tirozin foszfatáz aktiválja, amit ugyancsak a hasadó élesztőben fedeztek fel először. Ennek mutációja sejtciklus (mitózis) gátlást eredményez, mivel Cdc25 hiányában az MF nem aktiválódhat. Az MF aktiválódását és inaktiválódását enzimes szabályozási mechanizmusok teszik teljessé és irreverzibilissé. Mind a Wee1 mind a Cdc25 foszforilezéssel szabályozott enzimek és az MF mindkét enzim foszforilezésére képes. Amíg azonban a Wee1 MF általi foszforilezése gátolja annak aktivitását, addig a Cdc25 foszforilezése aktívája azt. A két enzim MF általi szabályozása pozitív visszacsatolási mechanizmust eredményez a mitózis kontrollban. k 4 k 2 B Wee1 k k w wr Wee1 Cdc25 k 25r k 25 Cdc25 k 2 B MF AC k apr AC k ap k 3 B k 2 k 1 aminosavak 4. ábra: Az eukarióta sejtek mitózis kontrolljának egyszerûsített sémája.

6 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 6 Az MF azonban nemcsak a tirozin módosító enzimeket (Wee1 és Cdc25), hanem a mitózisos ek lebontásáért felelős gépezetet is szabályozza. A B-típusú ek a mitózis végén kerülnek gyors lebontásra, ami az MF aktivitásának megszűntetéséhez szükséges. A mitózisos ek lebontására ubiqitinnel történt megjelölésüket követően kerül sor. A folyamat sebességmeghatározó lépése az ubiquitin molekulák hez való kapcsolása, amit a cikloszómának nevezett enzimkomplex katalizál. Ezt a komplexet, amit gyakran anafázis serkentő faktornak (AC) is hívnak, az MF aktiválja. Mivel a lebontása megszünteti az MF aktivitását, ezért az MF-nek az AC-re gyakorolt pozitív hatása negatív visszacsatolást eredményez a mechanizmusban. 1. d dt [!] = k 1 - k 3 ["] [!] - k 2 [!] 2. d dt "! = k 3 [!] ["] k cdc25 -"! 3. d dt -"! 4. d dt [ -" ] = k wee 5. d dt [Cdc25] = k25 6. d dt [Wee] = kwr [Wee-] 7. d dt [AC* ] = "! - k cdc25 - k wee -" - k! 2 "! - k 2 "! -"! = k 2 -" - k! 4 [ -" ] "! [Cdc25] k25r [Cdc25-] - J25 [Cdc25] J25r [Cdc25-] kw " Jwr [Wee-] -! [Wee] Jw [Wee] k ap "! [AC] J apc [AC] - Reakciósebességi függvények: 8. k2 = V2 ' [AC] V2 [AC * ] k apr [AC * ] J apr [AC * ] 9. kcdc25 = V25 [Cdc25] V25 [Cdc25-] 10. kwee = Vwee [Wee-] Vwee [Wee] Megmaradási egyenletek: 11. ["] total = "! -" [ -" ] [ " ]! 12. [Cdc25] total = [Cdc25] [Cdc25-] 13. [Wee] total = [Wee-] [Wee] 5. ábra: A mitózis kontroll egy matematikai modellje.

7 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 7 A mitózis kontroll matematikai leírása A mitózis szabályozás eukarióta sejtekben működő mechanizmusa leírható az 5. ábrán látható egyenletekkel. Ez a nemlineáris differenciálegyenlet-rendszer a paraméterek (sebességi állandók (k), Michaelis konstansok (J) és az enzimek összkoncentrációi (ld. megmaradási egyenletek)), specifikálását követően számítógéppel numerikusan megoldható. Sokkal szemléletesebb képet kapunk azonban a mitózis kontroll dinamizmusáról egy egyszerű grafikus módszer alkalmazásával az aktív MF ( " ) - ( [!] -" "!!! ) síkon. Az MF - síkon egyensúlyi görbének nevezzük mindazon pontok összességét, melyek mentén bizonyos ellentétes irányú folyamatok éppen kiegyensúlyozzák egymást, azaz eredőjük nulla. A mitózis kontroll dinamizmusa szempontjából két egyensúlyi görbének van különös jelentősége: 1. dimer egyensúlyi görbe (DEG) mentén a / dimerek tirozin foszforilezési és defoszforilezési sebessége azonosan egyenlő, vagyis az MF koncentráció állandó. 2. egyensúlyi görbe (CEG) mentén pedig a szintézis sebessége azonos a degradációval, vagyis a koncentrációja nem változik. A 6. ábrán láthatóan a DEG N-alakú görbe, ami a mitózis kontroll pozitív visszacsatolásos mechanizmusainak következménye. A görbe felett az MF aktivitás növekszik (defoszforilezés gyorsabb a foszforilezésnél), míg alatta csökken (foszforilezés gyorsabb a defoszforilezésnél) és ennek következtében a DEG középső ága instabil. Ezzel szemben DEG bal és jobboldali ága stabil állapotokat jelentenek és a sejtciklus két fontos fázisát reprezentálják: 1. baloldali ág: kis MF aktivitású interfázis, MF MF 6. ábra: A dimer (A) és a (B) egyensúlyi görbe. A B

8 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 8 2. jobboldali ág: nagy MF aktivitású mitózis. Az N-alakú DEG következtében az interfázisból mitózisba való átmenetet jelentő MF aktiválódás csak akkor következhet be, ha a szintje meghaladja a DEG lokális maximumát (MF aktiválódás küszöbe). A mitózisból interfázisba való átmenet pedig megköveteli, hogy a szintje a DEG lokális minimuma alá csökkenjen (MF inaktiválódás küszöbe). Mivel a két küszöb a DEG N-alakja következtében nem egyforma, ezért a mitózis kontroll hiszterézis tulajdonsággal rendelkezik: kisebb koncentráció is elegendő az MF aktívan tartásához, mint aktiválásához. A MF aktiválódás küszöbét kísérletesen már régen igazolták, a hiszterézis jelenségét a mitózis kontrollban viszont még nem. Jonathan Moore (Duke University) azonban az általunk javasolt kísérleti protokollt követve hiszterézisre utaló adatokat kapott. A mitózis kontroll hiszterézisének kísérletes igazolása az interfázis - mitózis közti irreverzibilis átmenetek megértéséhez nagyon fontos. A 6. ábrán ugyancsak látható CEG szigmoid alakú, aminek az a magyarázata, hogy az MF serkenti a ek lebomlását. A görbe felett a koncentráció csökken, alatta pedig növekszik. A két egyensúlyi görbe MF - síkon történő együttes ábrázolásával egyszerűen megjósolható a mitózis szabályozási rendszer dinamikája. A két egyensúlyi görbe metszéspontja olyan steady state-et reprezentál, ahol mind a tirozin foszforilezés/defoszforilezés mind a szintézis/degradáció egyensúlyba jutnak. A mitózis kontroll fiziológiája Annak ellenére, hogy a mitózis bekövetkezése ugyanazon molekuláris mechanizmusnak engedelmeskedik a Földön található minden eukarióta sejtben, a mitózis szabályozásának fiziológiai szempontból két jellegzetesen különböző típusát lehet megkülönböztetni. Ezen különbségek bemutatására két olyan közkedvelt sejttípust használok, melyek sejtciklusában a mitózis kontroll a sebességmeghatározó (7. ábra): 1. Az afrikai karmos béka (Xenopus laevis) gyors (30 perces ) embrionális ciklusai alatt nincs sejtnövekedés, és a valamint az MF citoplazmás koncentrációnak autonóm oszcillációi a sejtmag hiányában is megfigyelhetők. 2. A hasadó élesztő sejtciklusa a sejtnövekedés által kontrollált, vagyis a sejtek két osztódása közt eltelt ciklusidő a sejttömeg megduplázódásának idejével azonos. A Cdk/ komplexek a

9 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 9 sejtmagban akkumulálódnak és az MF aktiválódása csak egy kritikus sejtméret felett következik be. Béka embrió Hasadó élesztõ - sejtmag citoplazma Wee1 Cdc25 Wee1 Cdc25 aminosavak aminosavak MF MF 7. ábra: A béka embrió és a hasadó élesztő sejtciklusának összehasonlítása. Az eltérő viselkedés magyarázata a két egyensúlyi görbe metszéspontjában található steady state stabilitásában keresendő. Az embrionális ciklus modelljében a két egyensúlyi görbe a DEG középső, instabil ágán metszik egymást. Ez ennek megfelelően egy instabil steady state-t jelent, amit egy határciklus vesz körül, amelynek eredményeként a és az MF autonóm

10 Novák Béla: Sejtszaporodás és reakciókinetika 10 oszcillációt mutatnak.a hasadó élesztő modelljében viszont a steady state stabilitása változik a sejtmérettel. Ennek eredményeként a ciklus elején, a kritikus méretnél kisebb sejtek esetén a két egyensúlyi görbe a DEG bal szárán metszi egymást, ami kis MF aktivitású steady state-et jelent. A sejtek növekedésével párhuzamosan azonban a CEG felfelé mozdul, mert a / dimerek a sejtmagban akkumulálnak. Amikor a sejtek mérete eléri illetve meghaladja a kritikus értéket, akkor a steady state elveszti stabilitását és az MF hirtelen aktiválódik és a sejtek mitózisba lépnek. Kitekintés A reakciókinetika módszere összekötőkapocs lehet a molekuláris részletek és az intakt sejt fiziológiája között. A fentiekben kizárólag a mitózis kontroll matematikai leírásával foglalkoztunk, ami csupán része a sejtciklust szabályozó hálózatnak (ld. 3. ábra), de természetesen az itt bemutatott reakciókinetikai módszerek ugyanúgy alkalmasak a szabályozási hálózat más szeleteinek, mint pl. a DNS replikáció szabályozásának leírására is. Az így kidolgozott részmodellek pedig egyszerűen összekapcsolhatók a sejtciklus egészét leíró egységes modellé. Szelektált irodalom Novák B. & Tyson, J.J. Modeling the cell division cycle: M-phase trigger, oscillations and size control. Journal of Theoretical Biology 165 (1993) p. Novák B. & Tyson, J.J. Numerical analysis of a comprehensive model of M-phase control in Xenopus oocyte extracts and intact embryos. Journal of Cell Science 106 (1993) p. Tyson, J.J., Novák B., Odell, G.M., Chen, K. & Thron, C.D. Chemical kinetic theory as a tool for understanding the regulation of M-phase promoting factor in the cell cycle. Trends in Biochemical Sciences 21 (1996) p. Novák B. & John J. Tyson: Modeling the control of DNA replication in fission yeast. roceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94 (1997) p.