Több szubsztrátos enzim-reakciókról beszélve két teljesen különbözõ rekció típust kell megismernünk.

HTML
DOWNLOAD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Több szubsztrátos enzim-reakciókról beszélve két teljesen különbözõ rekció típust kell megismernünk."

Attila Pásztor
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 .5.Több szubsztrátos reakciók Több szubsztrátos enzim-reakciókról beszélve két teljesen különbözõ rekció típust kell megismernünk. A.) Egy enzim, ahhoz, hogy terméket képezzen, egyszerre több különbözõ szubsztrátot kell, hogy megkössön. Példa erre az egyik legismertebb kétszubsztrátos reakció, a glükóz + (Mg)ATP fi Glükóz-6-foszfát + (Mg)ADP foszforilezéses átalakulás, amelyet a hexokináz enzim katalizál. Itt a rekció végbemeneteléhez az enzimnek mind a glükózt mind pedig az ATPt meg kell kötnie ahhoz, hogy termék (a legtöbb ilyen esetben két termék) képzõdjék. ) A másik esetben a reakció keverékben egy enzim és több különbözõ, lényegében alternatív szubsztrát van jelen. Erre példát szolgáltat a legtöbb biopolimer hidrolizáló enzim, mint például az α-amiláz és az amiloglikozidázok, cellulázok és a proteinázok. Függetlenül attól, hogy ezekben az esetekben exo- vagy endo-enzimekrõl van e szó, a reakció keverékben egyidejûleg több, különbözõ polimerizációs fokú szubsztrát van jelen. Az A) esetben a két szubsztrátos rekciók tipikus esetét vizsgáljuk meg részletesebben. ét szubsztrát és egy enzim reakciójakor a közöttük létrejövõ kapcsolódás történéseit tekintve többféle mechanizmus képzelhetõ el: a)random bi-bi reakciók (véletlenszerü, mind szubsztrát mind termék oldalról bimolekulás reakciók): A két szubsztrát, A és véletlenszerûen kapcsolódnak az enzimhez, hasonlóan a nemkompetitív inhibíció S és I molekuláinak kapcsolódásához, és a két termék is véletlenszerûen válik le az enzimrõl az alábbi séma szerint. A sémából következik, hogy e mechanizmus és a nemkompetitív vagy a lineáris kevert típusú inhibíció között csupán az a különbség, hogy itt a ternér EA komplex katalitikusan aktív, azaz belõle termékek képzõdnek, míg az ESI komplex - mint láttuk - inaktív. 8

2 A E + A EA EP P + E P Q Q α β Q Q α A k P β P E + A EA EPQ P + EQ k -P A sebesség meghatározó lépés a lassú EA EPQ átalakulás és ekkor a P+Q irányában levezethetõ egy sebességi egyenlet: max A αa A A α A A (33) b)határozott sorrendû bi-bi reakciók Lehetséges, hogy csak akkor tud az enzimhez kapcsolódni, ha az A már kapcsolódott és e komplex képzõdés következtében az enzim olyan konformáció változáson ment keresztül, amely lehetõvé teszi a kapcsolását is. Az egyszerûsített séma ekkor a következõ: k E + A EA EQ Q + E k 5 k k -5 P k k - k 4 k -4 EA k 3 k -3 EPQ 83

3 Ha a k3 a legkisebb, azaz az EA EPQ átalakulás a sebesség meghatározó (vagyis E, A, EA és EA egyensúlyi koncentrációk, tehát a rapid ekvilibrium feltételezés igaz), akkor a sebességi egyenlet a következõ lesz: max A A A A + + A A (34) c) Ping-pong mechanizmus A harmadik lehetséges mechanizmus szerint eloször az E foszforilezodik (a hexokináz reakció példájánál maradva) azaz reagál AMgATP-vel, majd a PMgADP leválásával létrejön a foszforilált enzim (F). Ezután történik meg a szubsztráttal (itt:glükóz) való komplex képzés (F, FQ) végül a foszforilált szubsztrát ( itt: glükóz-6-foszfát) és az eredeti enzim molekula szétválnak. A mechanizmus neve onnan ered, hogy az enzim itt két stabil módosulat között oszcillál, pattog ide-oda mint a ping-pong labda. Mg(ADP) P glükóz EP F FOSZFORILÁLT HEXOINÁZ F EA HEXOINÁZ E EQ Mg(ADP) A Q glükóz-6p 84

4 A steady-state feltételezésen alapuló kinetikai egyenlet ebben az esetben A A + + A max m ma (35) issé átalakítva, a következõ egyenlet azt mutatja, hogy rögzített koncentráció mellett hogyan változik a reakciósebesség az A koncentrációjának változásával: A (36) max m ma + A + A ping-pong mechanizmusnak megfelelõ dupla reciprok Lineweaver-urk ábrázolás a 39. ábrán látható.(együk észre, hogy az egyenlet szimmetrikus, azaz A és felcserélhetõk). max app + max m / ma / max maapp + ma /max m /A 39.ábra Ping-pong mechanizmus L- ábrázolása A valóságban a hexokináz esetében nem kapunk a 39. ábrán látható párhuzamos reciprok görbéket, tehát biztosan nem a ping-pong mechanizmust 85

5 követik e foszforiláció történései. A valódi görbesereg a 40. ábrán láthatóhoz hasonlít, azaz egy pontban metszik a különbözõ -k mellett kapott egyenesek egymást. Ennek alapján azonban még nem tudhatjuk, hogy vajon a két lehetséges másik mechanizmus közül melyik írja le a valóságot, mivel mind az a) mind a b) modell ugyanolyan L- görbesereget produkál. A hexokináz reakció valódi mechanizmusának kiderítéséhez egy sor egyéb kinetikai vizsgálatot is el kell végezni. / ma / max /max -/ A 40. ábra Random bi-bi és határozott sorrendû bi-bi reakciók L- diagramja /A A ) többszubsztrátos esetet vizsgálva meg kell állapítanunk, hogy sok enzim képes egynél többféle szubsztrátnak az átalakítására is. Ilyen esetekben a különféle alternatív szubsztrátok versengenek egymással az enzim aktív helyéért, helyeiért. A legkézenfekvõbb példát erre a hidrolitikus depolimeráz enzimek szolgáltatják, amelyek sok azonos kötésre hatnak, sokszor attól függetlenül, hogy milyen hosszú a polimer szegmens, ugyanakkor a kinetikai paraméterek dimer, trimer, oligomerek esetén sokszor mások mint nagy polimer fokszám esetében. Példaként említjük a lizozim enzimet, amely a tojás fehérjében, nyálban és könnyben elõforduló hidroláz és amely olyan komplex muko-poliszaharidokat bont mint például a sejtfal mureinje (s ilymódon a Gram+ baktériumokat elpusztítja). Az ilyen polimerek esetében valamennyi, a monomereket összekapcsoló kondenzációs kötés úgy viselkedik, mint egy-egy különálló szubsztrát. Az ilyen 86

6 polimerek abban az értelemben sem tekinthetõek közönséges egyszerû szubsztrátoknak, hogy általában már eleve különbözõ lánchosszúságú polimerek keverékei. A hidrolitikus enzimek némelyike szelektivitást mutat aszerint, hogy a polimer mely részét bontja: exo-hidrolázok - láncvégi vagy közel láncvégi kötéseket bontanak, endo-hidrolázok - láncon belüli kötéseket statisztikusan bontanak. Jó és komplex példa az ilyen enzimek kinetikai viselkedésére a celluláz komplex ( amellyel más stúdium keretében ismerkedhetünk meg). E helyütt egy igen egyszerû kétszubsztrátos rendszer kinetikai leírását adjuk meg, amely a következõ sémán alapszik: k E + S ES E + P E + S ES E + P Mindkét szubsztrát a jelenlévõ enzimnek csak egy adott hányadával tud reagálni, mint a kompetitív inhibíció esetén, a különbség abban áll, hogy itt mindkét enzim-szubsztrát komplexbõl termék jön létre. A kinetikai egyenletek az egyes részreakciók sebességeit külön-külön leírva a következõk: k ke0s S S + + ke0s S S + + (37) 87

7 Az egyenletekbõl láthatóan mindkét reakció sebessége kisebb mintha csak az egyik vagy csak a másik szubsztrát lenne jelen egyedül. Ezt a tényt ki lehet használni arra, hogy eldöntsük, vajon egy ismeretlen mintában egy adott enzim két szubsztrátra hat-e, avagy mindkét szubsztrátra más-más enzim hat. Ilyen típusú reakciók esetében gondot okozhat, ha mindkét szubsztrátból ugyanaz a termék képzõdik (például amilázos keményítõ bontásnál: maltóz), ekkor csak az eredõ reakció sebességet tudjuk megmérni a két elõzõ egyenlet összegeként: + T E k S k S + S S (38) S-nek és S-nek a relatív mennyiségét változtatva az eredõ reakciósebesség is megváltozik. Ha az összes szubsztrát ST0S, vagyis nincs jelen a másik szubsztrát, vagy ha a fordított esetet tételezzük fel, a következõ két szélsõ helyzetet kapjuk: E k S + S 0 T0 T S S,S 0 T S 0,S S T0 T0 T0 E k S + S 0 T0 T0 ilágos, hogy így az eredõ reakcióra a kisérletileg meghatározott max és m nemcsak a teljes szubsztrát koncentrációtól, hanem az egyes szubsztrátok S/S arányától is függ. 88

Hasonló dokumentumok

[S] v' [I] [1] Kompetitív gátlás

[S] v' [I] [1] Kompetitív gátlás 8. Szeminárium Enzimkinetika II. Jelen szeminárium során az enzimaktivitás szabályozásával foglalkozunk. Mivel a klinikai gyakorlatban használt gyógyszerhatóanyagok jelentős része enzimgátló hatással bír