ENZIMKINETIKA. v reakciósebesség. 1 / v. 1. ábra. Michaelis-Menten ábrázolás 2. ábra. Lineweaver-Burk ábrázolás. Michaelis-Menten ábrázolás

Átírás

1 ENZKNETKA Az enzimek biokatalizátorok, melyek az aktiációs energia csökkentése réén képesek a kémiai reakciók sebességét specifikusan gyorsítani. Az enzimek a termodinamikai egyensúlyt nem áltoztatják meg, miel a reerzibilis reakciók sebességét mindkét irányban, azonos mértékben nöelik meg. Az enzimreakciók sebességét számos tényező befolyásolja: hőmérséklet, ph, ionerősség, szubsztrátkoncentráció, aktiátorok, inhibitorok, stb. a./ Hőmérsékletnöekedés hatására, mint a kémiai reakciók esetében általában, a reakciósebesség nő, amíg a imális sebességet eléri (hőmérsékleti imum). A hőmérséklet toábbi nöelése fokozza a polipeptidlánc mozgékonyságát, így a molekula szerkezete részben agy teljesen felbomolhat (hődenaturálás). b./ A reakciók ph-függése szintén imumgörbét köet. Az optimális ph-tól aló eltérés befolyásolja az oldalláncok disszociációs állapotát, hatással an az enzim funkcióképes konformációjának fenntartására. A ph befolyásolja a szubsztrátok és koenzimek disszociábilis csoportjait is. A különböző enzimek hőmérséklet és ph optimuma igen tág határok között áltozik. c./ A reakciósebesség szubsztrátkoncentrációtól aló függése derékszögű hiperbolát ír le (1. ábra). ichaelis-enten ábrázolás Lineweaer-Burk ábrázolás 2.12 reakciósebesség szubsztrátkoncentráció 1. ábra. ichaelis-enten ábrázolás 2. ábra. Lineweaer-Burk ábrázolás Alacsony szubsztrátkoncentrációk esetén a mért enzimaktiitás lineárisan függ a szubsztrátkoncentrációjától (első rendű reakció). Ezen a szakaszon a V / K hányados a reakció sebességi állandója. A hányados a hiperbola érintője nulla szubsztrátkoncentrációnál. Bizonyos szubsztrátkoncentrációk felett az enzimmolekulák telítődnek a szubsztráttal, az enzimreakció (nullarendűé álik) sebessége nem nöelhető toább (V ). Biológiai minták enzimaktiitásának meghatározása esetén mindig szubsztrátfelesleget alkalmazunk, hogy az összes enzimmolekula működését biztosítsuk. Az enzimek nagy részének működése a klasszikus ichaelis-enten elmélettel írható le. Ezt steady-state kinetikának is neezik. Alapfeltételek. A reakció során az [ES] komplex koncentrációja ne áltozzon. Az [ES] komplex képződése egyensúlyra ezető reakció legyen és az egyensúly gyorsan álljon be. A teljes enzimreakció sebességmeghatározó reakciója az ES E P átalakulás legyen. A reakció ne legyen megfordítható. Gyakorlatban, kompromisszummal, elfogadható az erős egyensúlyeltolódás E P irányába. Csak egy szubsztrát egyen részt a reakcióban. Többszubsztrátos reakcióknál csak egy szubsztrát koncentrációja szabja meg a reakciósebességet, a többi szubsztrát koncentrációjának a reakciósebességre kifejtett hatása elhanyagolhatóan kicsi legyen. Valódi kezdősebességeket mérjünk. Az enzim koncentrációja minden mérésnél azonos legyen és a reakció során ne áltozzon. Az összes, az enzimreakciókat befolyásoló 1

2 tényező, mint puffer összetétele, ph, ionerősség, hőmérséklet a méréssorozaton belül állandó legyen. érés során az koncentrációja 4-6 százaléknál nagyobb mértékben ne csökkenjen. Az elmélet lényegét a köetkező egyenlet írja le (1): (1) 2 Ebből leezethető a köetkező (2) összefüggés (lásd bőebben a Sillabuszt): V ( 2) K S S ( 3) 1 K 1 1 V S V A (2) egyenlet egy hiperbola x (független áltozó) és y (függő áltozó) összefüggését írja le (x =, és y = ). Enzimkinetikai izsgálatoknál cél az egyenlet két állandójának, V -nak és K -nek meghatározása. Háromnál több, különböző szubsztrátkoncentrációt alkalmaza, mérjük a reakciósebességet. Célszerűen akkor járunk el, ha a mérőpontok a hiperbola középső szakaszára esnek. Ezt előkísérletekkel lehet megállapítani. Kis szubsztrátkoncentrációknál, miel a reakcióban a szubsztrátnak csak kis részét használhatjuk el, és mérési módszerünk érzékenységétől függően, a hiperbola elején nincsenek mérőpontok. A szubsztráttelítés tartományában szintén hiányoznak a mérőpontok, mert az alkalmazható szubsztrátkoncentrációnak határt szab annak oldhatósága, a szubsztrátgátlás, stb. A K és V értékét tehát a hiperbola középső, csonka szakaszából kell meghatároznunk. A ichaelis-enten egyenlet felállításának idejében (1913) a hiperbola állandóinak közetlen meghatározása nem olt lehetséges. A probléma megoldására a hiperbola egyenletének transzformálását alkalmazták. Ezzel az összefüggés lineáris lett, melyből a két konstans grafikusan agy egyszerű számítással megállapítható. lyen transzformálások pl.: az Eadie-Hofstee, Hanes-Woolf, Scatchard megoldások. Legismertebb transzformált forma a Lineweaer-Burk kettős reciprok egyenlet (3), illete ábrázolás (2. ábra). Ebben a szubsztrátkoncentráció reciprokának függényében (1/ az x-tengelyen) a reakciósebesség reciprokát (1/ az y-tengelyen) ábrázoljuk. A mérőpontok közé egyenest illeszte és az y-tengely felé meghosszabbíta (grafikus extrapolálás) az metszi az y-tengelyt majd az x-tengelyt. Az y-tengely metszete 1 / V értékét adja, az x-tengely metszete pedig -1/K értékét. A (3) egyenlet egy y = ax b egyenes egyenlete, melyben: y = 1/, a = K / V, x = és b = 1/V. a már, a mérési adatokból V és K számítását, a számítógépek birtokában, alkalmas algoritmusok (Leenberg és arquardt, simplex-módszer) felhasználásáal, iterációs programmal égezzük. Ezzel a mérési hibák megfelelő statisztikai kezelésének is eleget teszünk. Számítási példához szolgáljanak a köetkező adatok: mmol / mol//min 1/(mmol/) 1/(mmol//min) A 2. ábra szerint agy számítógéppel megolda a feladatot V értékéne mol / / min-ot, K - nek 7. mmol / -t kapunk. A paraméterek a mérésnél használt egységeket eszik fel. Az egyenletekben szereplő K és V a köetkezőképpen definiálható: A K a imális reakciósebesség feléhez tartozó szubsztrátkoncentráció; jellemzi az enzim szubsztrát iránti affinitását. ásként fogalmaza, bizonyos megkötésekkel: az a szubsztrátkoncentráció melynél az enzim kötőhelyeinek fele szubsztráttal an telíte. Kis K érték nagy enzim szubsztrát affinitást jelent. K értéke független az enzim koncentrációjától. Egysége: mol -1. K k k k 2 3 A sebességi állandó másodrendű reakció sebességi állandója, egysége: mol -1 min -1. A sebességi állandó egy elsőrendű reakció sebességi állandója, egysége: min -1. A sebességi állandó a fent 1

3 ázolt feltételek (egyensúlyeltolódás E P irányába) esetében pszeudo-elsőrendű reakció sebességi állandója, egysége: min -1. A V az adott enzimkoncentráció mellett, az enzim telítése esetén, elérhető imális reakciósebesség. V értékét a hiperbola aszimptotikusan közelíti meg. K -mel azonos szubsztrátkoncentrációnál az enzimreakció sebessége V -nak %-a, 2K koncentrációnál 66.6 %, 3K -nél 7 %, K -nél 9.91 %, K -nél 99.9 %. A telítés annyit jelent, hogy az enzim teljes mennyisége ES komplex-szé alakult. Tehát a imális sebesség csak a jelenleő enzim mennyiségétől függ. A reakciósebesség egysége lehet bármely érték időegységnyi áltozása agy általában: mol -1 min -1. Az enzimműködés fontos jellemzője toábbá a kcat, mely a legtöbb enzimreakcióban megegyezik a -mal. Ez a szubsztráttelítés esetén tapasztalható imális sebességi állandó, más néen átiteli szám. ENZGÁTLÁSOK 1. rreerzibilis gátlás Az enzim egy agy több funkciós csoportjának koalens módosítása. Az inhibitor dialízissel agy szubsztrát adásáal nem táolítható el. (pl. SH- csoport jód-acetáttal történő karboximetilálása, szeril oldallánc OH-csoportjának reakciója diizopropil-fluoro-foszfáttal). 2. Reerzibilis gátlás Az inhibitor reerzibilisen kötődik az enzimhez agy a működéséhez szükséges kofaktorhoz (pl. a fehérjéhez kötött fémionhoz). Az enzim és inhibitor között kialakuló kapcsolat nem koalens. Típusai: kompetití, nem kompetití, un-kompetití, keert típusú gátlás. K i K S K i K S E ES E ES KOPETTV UN-KOPETTV NE-KOPETTV - Az enzim - szubsztrát, illete enzim - inhibitor komplexek kialakulásának lehetőségei kompetití, nem kompetití és a gyakorlatokon nem tárgyalt un-kompetití enzimgátlások esetében. Kompetití gátlásnál a gátlószer csak az enzimmel kapcsolódik reerzibilisen (a szubsztráthoz hasonlóan). Unkompetití gátlásnál a gátlószer reerzibilis kapcsolódása az enzim-szubsztrát komplex-szel jön létre. Nem kompetití gátlásnál a gátlószer az enzimhez és az ES-komplexhez is kapcsolódhat, eltérő affinitással. A nem kompetití gátlástípus tárgyalásánál, a számítások egyszerűsítése céljából, a két affinitást azonosnak esszük (K = K S). a./ Kompetití gátlás Az inhibitor rendszerint a szubsztráthoz hasonló szerkezetű, erseng azzal az enzim aktí centrumához aló kötődésben. egfelelően magas szubsztrátkoncentráció alkalmazásáal az inhibitor teljesen leszorítható az enzimről, így a imális reakciósebesség elérhető; K nő, V áltozatlan (3. és 4. ábra). 3

4 /V ábra. Kompetití gátlás 4. ábra. Kompetití gátlás ichaelis-enten ábrázolása Lineweaer-Burk ábrázolása A ábráig a görbék paraméterei: K = 7. mmol /, V = 2 mol / / min, [] = mmol / és K i = 2. mmol /. b./ Nem kompetití gátlás /V ábra. Nem kompetití gátlás 6. ábra. Nem kompetití gátlás ichaelis-enten ábrázolása Lineweaer-Burk ábrázolása A nem kompetití inhibitorok feltehetően nem az aktí centrumhoz kötődnek, így a szubsztrát kapcsolódását nem közetlenül akadályozzák, az enzim szubsztráthoz aló affinitása nem áltozik meg; K áltozatlan. Az enzim katalitikus működése azonban más mechanizmusok szerint gátlódik; V csökken (. és 6. ábra) [pl. az enzim működéséhez szükséges fémionok (pl. Zn 2, g 2, Ca 2 ) megkötése komplex-képzőkkel (EDTA, EGTA, NaF)]. c./ Un-kompetití gátlás A nem kompetití gátláshoz hasonlóan az un-kompetití gátlás is ritka az egyszubsztrátos enzimreakciók között, de többszubsztrátos reakcióknál gyakran észlelhető. Un-kompetití gátlásnál a K nő, a V értéke csökken (7. és 8. ábra). A gátlást leíró modell feltételezi, hogy a gátlószer csak az ES komplex-szel lép kapcsolatba és átmenetileg az ES hármas komplex keletkezik. Un-kompetití gátlásra iskolapélda az arilszulfatáz agy néhány dehidrogenáz gátlása cianiddal agy hidrazinnal. Közös jellemzői ezeknek a gátlószereknek, hogy jó nukleofil jellegű molekulák. A nukleofil reaktáns 4

5 elektronokban gazdag atomcsoport és elektronpár leadására hajlamos: a reakciókban Brnsted bázisként iselkedik /V ábra. Un-kompetití gátlás 8. ábra. Un-kompetití gátlás ichaelis-enten ábrázolása Lineweaer-Burk ábrázolása Az enzim és inhibitor kapcsolódásakor kialakuló E komplex stabilitását, az inhibitor hatékonyságát a K i inhibitor állandóal jellemezhetjük. Ennek meghatározása történhet grafikus úton, pl. Dixon szerint, ahol a reakció sebességének reciprokát ábrázoljuk az inhibitor koncentráció függényében, különböző szubsztrátkoncentrációk mellett. A gyakorlatokon általában nincs lehetőség a grafikon megrajzolásához szükséges számos mérési pont felételére, ezért egyetlen mérési pont alapján a megfelelő egyenlet segítségéel számítjuk az inhibíciós állandót: Kompetití gátlás: Nem kompetití gátlás: [ ] K Ki ( )( K [ S]) K K S [ ] ( ) A gátlószer jelenlétében mért reakciósebesség mindig kisebb a gátlószer nélkül mért reakció sebességénél. A Lineweaer-Burk ábrázolásnál ez a szerkesztett egyeneseknek az alapegyenestől aló eltérésében jelenik meg. Az eltérés jellegét a gátlás típusa határozza meg (lásd 4., 6. és 8. ábra). értékét az inhibitorkoncentráció ([]) és az inhibitorállandó (K i) a köetkező egyenlet szerint áltoztatja: 1 Ezzel a kifejezéssel a Lineweaer-Burk egyenlet különböző tagjai kiegészülnek. Kompetití gátlásnál az iránytangens áltozik, 1 / V értéke áltozatlan (4. ábra). A Lineweaer-Burk egyenletben a K / V tagot kell 1 [] / K i értékéel megszorozni: K i 1 K V K S V A nem kompetití gátlásnál, ahol a gátolt reakció egyenesének meredeksége és 1 / V nő, K áltozatlan (6. ábra), a Lineweaer-Burk egyenlet mindkét tagja bőül: i 1 K V K S V K i i

6 Un-kompetití gátlásnál az egyenes meredeksége áltozatlan, 1 / V és -1 / K értéke nő (8. ábra). A Lineweaer-Burk egyenletben az 1 / V tagot kell szorozni 1 [] / K i értékéel. 1 K V S V K i 6