Acetil-kolin észteráz

Átírás

1 Acetil-kolin észteráz Két izoenzim, különböző enzim aktivitással: vörösvértestben és trombocitákban valódi acetil-kolin észteráz; nagy sebességgel hidrolizálja az acetil-kolint, bizonyos acetil-kolin koncentráció felett szubsztrát gátlás lép fel plazmában pszeudo-kolin észteráz az acetil-kolint li t kisebb aktivitással itá hidrolizálja, az acetil-kolin szubsztrát gátlást nem okoz α 2 β 2 Átviteli szám: /sec Acetil-kolin szerepe az idegingerület átvitelben Nyugalmi állapot visszaállítását acetil kolin észteráz végzi Aktív centrumban reaktív szerin oldallánc donepezil hidroklorid (Aricept )reverzibilis Inhibitor Alzheimer's kór használt

2 Valódi egy szubsztrátos enzimek az izomerázok: A B liázok A B + C Hidrolázok : A B+ H2O A-OH + BH Multiszubsztrátos enzimek: Oxidoreduktáz: d Ox 1 + Red 1 Ox 2 +R Red 2 (Kofaktort igénylők: NAD(H), FAD(H), fémion) Transzferáz: A + BX A X + B (pl. glikozil transzferáz, kináz) Ligáz X + Y + ATP XY +ADP + P i

3 Termék gátlás előfordulhat Bi Bi mechanizmus A P B Q E EA E E P E E B EQ Példa: flavoenzimek működése 1. Reduktív félreakció: FMN+ NADH H + FMNH 2 + NAD + 2. Oxidatív félreakció: FMNH 2 +S ox FMN + P red NADH NAD+ Sox Pred

4 A kötődik először, elreagálva mint termék távozik, majd a B szubsztrát kötődik és Q Q termékként távozik, visszaalakítja az enzimet a kiindulási aktív állapotba

5 Szekvenciális: A és B szubsztrát mindkettő bekötődik, mielőtt a P és Q termék eltávozik Random szekvenciális: véletlenszerű a reaktánsok bekötődése és a termékek távozása Meghatározott sorrendű szekvenciális: reaktáns kötődés és termék távozás sorrendje meghatározott

6 Többszubsztrátos reakció : szekvenciális mechanizmus meghatározott sorrend

7 RANDOM SORREND

8 Irreverzibilis Inaktiváció + E + S ES E + P + I Enzyme inaktivátor EI E----I (Inaktív kovalensen módosított enzim) Csoport specifikus reagensek Affinjelölők Mechanizmus csapdák

9 1.Csoport specifikus reagensek Ciszteil oldallánc jódacetamid Inaktivált enzim

10 2. Affinjelölők szubsztrát analógok, amelyek kovalensen módosítják a katalitikusan aktív oldalláncokat specifikusak az enzim aktív helyén levő oldalláncokra Kimotripszin természetes szubsztrátuma Specificitást meghatározó csoport aktív zsebbe történő kötődést meghatározó csoport Tosil-L-fenilalanin klórmetilketon (TPCK) reaktív szubstrát analóg Reaktív csoport Az aktív helyhez kötődik és reagál az ott lévő hisztidinnel

11 Acetilkolin észteráz Szeril oldallánc Diizopropil-foszfofluoridát DIPF (ideggáz) Szerin proteázok (pl. kimotripszin, acetilkolin észteráz) gátlószere kovalens módosítás aktív szeril oldalláncon keresztül

12 Mechanizmus csapda- suicide inhibition a legspecifikusabb irreverzibilis inhibítorok, kovalens módosítók, amelyeket az enzim olyan intermedierré alakít amely kovalensen kötődik a reaktív csoporthoz és inaktiválja az enzimet Példák: 1.Monoaminoxidáz (MAO)dezaminálja a neurotranszmittereket az agyban pl. dopamint, szerotonint Az N,N-Dimetilpropargilamin a monoaminoxidáz FAD kofaktorát kovalensen módosítja az első oxidációs lépés után 2. A reaktív ß-laktám gyűrűt tartalmazó penicillin kovalens kötést képez a bakteriális glikopeptid transzpeptidáz katalitikusan aktív szeril oldalláncával Pentaglicin lánc N-term. +D-ala-D-ala C-term Kereszt kötés + D-ala

13 Mechanizmus-csapda 1. Monoaminoxidáz

14 Penicillin szerkezete Tiazolidin gyűrű Reaktív peptid kötés a β-laktám gyűrűn Bakteriális glikopeptid transzpeptidáz inhibítor, penicillin gátolja az utolsó lépést a sejtfal szintézisben a keresztkötések kialakítását a peptodiglikán szálak között

15 Staphylococcus baktérium sejtfal összetevőjének (peptidoglikán) szerkezete: glikán D-Ala-peptidlánc Bakteriális sejtfal Különlegessége, hogy D-ala aminosavakat tartalmaz Penicillin a D-ala-D-ala Egységek szerkezeti analógja pentaglicin

16 Glikopeptid transzpeptidáz katalizálta reakció mechanizmusa 1. Transzpeptidáz kovalens acil-enzim Köztiterméket t képez a terminális D- ala-d-ala peptidde 2. Acil-enzim köztitermék Az acil-enzim reagál a terminális glicin amino (Nu - )csoportjával

17 Penicillin utánozva a D-ala-D-ala szerkezetet a transzpeptidáz aktív centrumába kötődik A penicillin négy tagú feszített β-laktám gyűrűje nagyon reaktív, az enzim katalitikusan aktív szeril oldalláncával kovalens kötést képez, penicilloil-enzim komplex alakul ki, amely tovább nem reagál az enzim inaktiválódik

18 Az enzimaktivitások mérése A klinikai kémia talán leggyakoribb módszerei közé az enzimaktivitások itá k mérése é tartozik. t Ezt az indokolja, hogy a metabolikus folyamatok enzimei normál körülmények között is megtalálhatók a biológiai folyadékokban (vér, vizelet, nyál, bélcsatorna nedvek, tej). A kóros, általában a sejtek sérülésével járó folyamatokban a kiszabadult enzimek mennyisége megnő, ő az aktivitásuk itá k fokozódik

19 Enzimaktivitás mértékegységei: Nemzetközi Biokémiai Szövetség: unit 1U = 1μmol átalakult szubsztrát 1 min SI mértékegységrendszer : katal 25 ºC on standard körülmények között katal= 1 mol átalakult szubsztrát 1nanokatal = 10-9 katal 1 1U = nanokatal 1sec egységnyi térfogatra vonatkozó enzimaktivitás - volumenaktivitás: Specifikus aktivitás: Minta tisztasági fokának jellemzése U / l; mu/ml; nanokatal/ml U Spec.akt. = mg protein = μmol átalakult szubsztrát min mg protein

20 Farmakológia gyakorlatban az I 50 mérése Azt a gátlóanyag koncentrációt jelöli, amely a maximális gátlás 50%-t okozza Tisztán nem-kompetitív gátlás esetén K I = I 50 I 50 és K I közötti összefüggés reverzibilis gátlások esetén Gátlás típus I 50 kompetitív Nem-kompetitív unkompetitív vegyes (K M +[S])K I / K M K I (K M +[S])K I / [S] (K M +[S])K I K I /(K M K I +K I [S])

21 A belső minőség-ellenőrzés leggyakoribb paraméterei Reprodukálhatóság (precizitás, pontosság), azonos minta nagyszámú ismételt lemérése alapján kiszámíthatjuk az átlagot vagy az ahhoz tartozó szórást A specifitás azt fejezi ki, hogy az adott módszerrel valóban csak az és csakis az a paramétert határozható meg. Az érzékenységet az adott mérendő paraméter azon legkisebb mennyi- sége jellemzi, amely a mérés során reprodukálhatóan megmérhető. (A megbízhatóság (torzítás), az összehasonlító mérésekre alkalmas kontroll anyag általunk mintaként történő többszöri lemérését összevethetjük annak a kinyilvánított (deklarált) értékével. Ilyenkor a mért és deklarált különbsége adja a torzítás tényleges (abszolút) értékét (pl.: U/L-ben).)

22 Az enzim katalitikus aktivitásának mérése Az enzim reakciók követése: 1. Folyamatos enzim kinetikai i vizsgálat Azon fizikai paraméter időbeli változásának folyamatos követése, amely arányos a szubsztrát vagy termék koncentrációval Pl. NADH függő (enzim)rendszerek esetén a NADH csökkenést vagy növekedést detektálhatjuk spektrofotometriásan : 340nm en a NADH elnyelési maximumán követhetjük Ha proton szabadul fel az enzim reakció során, akkor követhetjük a ph változást Oxigén fogyás esetén oxigén-elektróddal mérhetjük a változást

23 Lambert-Beer törvény: 15 1,5 A = ε c l 1 A =: log Io/I (Io: a bejövő fény intenzitása; 0,5 I:átmenő fény intenzitása) 0 ε= molaris extinkciós koefficiens; (M -1 cm -1 ) l = a fény út hossza cm A 2 NAD + NADH + H hullámhossz (nm)

24 NH 2 O Flavin mononukleotid (FMN) Flavin adenin dinukleotid (FAD) H 2 C O O P HO O O N N OH N N O P O 5' O O CH 2 4' R = Phosphate Foszfát O O P O R Izoalloxazin gyűrű 5' O 5' CH 2 4' R = Adenine - dinukleotid Me Me 8 H O H O H O CH 2 4' 3' 2' 1' CH 2 N 10 H H H α 5 7 4α 6 N 4 N O Riboflavin 3 2 O NH

25 Flavin mononukleotid redukciója 460 nm-en követhető 460nm Absorban nce Wavelength [nm] NADH + FMN 600

26 2. Nem folyamatos (szakaszos) enzim kinetikai vizsgálat Különböző időpontokban megállított enzimreakcióban határozzuk meg a szubsztrát koncentráció fogyását vagy a termék keletkezését Ha nincsen jól detektálható elnyelése egyik ágensnek sem a reakció során, akkor a reakció leállítása után valamilyen szubsztrátra ill termékre nézve specifikus színreakcióval állapítjuk meg a kérdéses koncentrációt Szakaszos

27 3. Csatolt enzim rendszerek kinetikai vizsgálat A kérdéses enzim reakcióhoz csatolunk egy jól követhető második enzim reakciót Pl glükóz + ATP hexokináz glükóz-6-foszfát+ ADP glükóz-6-foszfát dehidrogenáz glükóz-6-foszfát + NADox 6-foszfoglükonát + NADH NAD + redukciója jól követhető 340 nm-en

28 Gyorsreakciók követése stopped-flow spektrofotometriával A reakciómechanizmus elemi lépéseinek a felderítése Stacionárius szakasz, sebesség meghatározó lépés, é hagyományosan követhető tő szakasz Előegyensúly, gyors, stacionárius szakasz Kétfázisú reakció

29 Kimotripszin katalizálta hidrolízise két fázisú O -C N- H Peptid kötés kinetikát követ O Nitrofenol acetát CH 3 C O NO 2 + H 2 O Kimotripszin O -C O- Acetát O HO NO 2 CH 3 C OH Nitrofenol Észter kötés ea c ó o a á sába acetát e A reakció korai fázisában acetát nem szabadul fel, ellentétben a korai nitrofenol termeléstől

30 A Kimotripszin két lépésben katalizálja a fenil acetát hidrolízisét Acilezés O Nitrofenol acetát O CH 3 C O NO 2 CH 3 C O O - CH 2 CH 3 COOH O-H CH 2 O CH 2 HO NO 2 Dezacilezés (lassú lépés) é + H 2 O trofenol Ni Reakció kinetikája Kétfázisú reakció Idő (sec)

31 K2: Gyors, tranziens szakasz- (stopped-flow fotométerrel követhető) K 3 : Sebesség meghatározó folyamat Leglassúbb stacionárius szakasz (hagyományos módon követhető)

32 Enzimaktivitást befolyásoló tényezők 1. Szubsztrát koncentráció, enzim koncentráció 2. ph 3. Hőmérséklet 4. Ionerősség 5. Kofaktorok (pl. NADH; fémionok), védőanyagok (merkaptoetanol SHenzimeknél, specifikus ionok jelenléte (glikozidázok esetén Ca 2+ stabilizálja az aktív enzimkonformációt) 6. gátlószerek, aktivátorok jelenléte

33 Aminosavak protonálódása ph = log (1/[H ]) = - log 10 [H ] Savi disszociációs állandó HA <-----> H + + A - ] K = + [ H ][ A [ HA] ] pk = - lg K = lg (1/K)

34 Hisztidin ionizációs állapotai

35 A fehérje protonáltsági fokát az oldalláncok minősége határozza meg

36

37 Fehérjében kötött aminosavak protonálódási állandói különbözhetnek a szabad aminosav protonálódási állandóival meghatározó fehérje környezet

38 Pozitívan töltött Negatívan töltött

39 [H + ] [OH - ] pi= 5,2

40

41 K d k cat E + S ES E + P Ka Egyértékű savi disszociációs állandó: Ka EH + K d EH + S Nem-kompetitív gátlás mechanizmus analógiája alapján: v k cat [S] = [E] 0 (K M + [S]) (1+[I]/ K I ) Behelyesttesítve: [H] + -t [I] helyébe K a t K I helyébe v k = cat [S] [E] 0 (K M + [S]) (1+[H + ]/ K a ) [E] 0 K M [H + ] = (1+ t ) 1 v k cat K a [S] meredekség reciprok + (1+ [H+ ] ) 1 K a k cat tengely.- metszet

42 Vegyes gátlásként értelmezve: K E a K d k cat E + S ES E + P K ES a EH + K d EH + S v k = cat [S] [E] 0 [S]) (1+[H + ]/ K ES a )+K M (1+[H + ]/ K ae ) A ph függés kifejezhető: K M a pp + = K ES MK a +[H ]K M K ES a /K E a K ES a +[H + ] k cat app = k cat K a ES K a ES + [H + ] ES komplex Ionizációs állandójától függ k cat app K M app = (k cat/k M )K E a K ae + [H + ] Enzim ionizációs állandójától függ

43 Acetilkolin észteráz ph optimuma 9 felett: aktív centrumban : szerin

44 Kétértékű sav ionizációja H 2 E H 2 ES K 1 K 1 S + HE - HES - HE - + P E 2- K 2 K 2 ES 2- Ks= [EH] [S] [EHS] k cat app = k cat K 1 [H + ] k + = cat K 1+[H + +K/ + 1 K 2 +K 1 [H ]+ [H+] 2 ]/K 1 2 [H ] Mikor optimális a ph azaz maximális a k cat ha a nevező a legkisebb: 1 +[H+]/K1+ K2/ [H+] =min [H + ]opt= K 1 K 2

45 Papain aktivitásának ph függése His159 Reakció sebess ség Cys25

46 Papain katalitikusan aktív oldalláncainak ionizációja Aktív Inaktív -H + Aktív -H + Inaktív Inaktív + H + +H + pka=8.1 pk a =3.4 tiolát-imidazólium ion pár. Cisztein proton leadás

47 A Kimotripszin proteolízissel aktiválódik Kimotripszinogen (inaktív) 245 p-kimotripszin (aktív) R15-I16 tripszin S14-R15 L13 I16 a-kimotripszin (aktív) p-kimotripszin t i i T147-N148 Y146 A149 Diszulfid kötések Campbell (1 1999) Bioche emistry (3d) p.179

48 O C O - H C H N N H O CH 2 Ser 195 = Biology of th e Cell (4e) p..158 Asp 102 O C O H C C H CH 2 His 57 H C N N H aktív Ser - O CH2 Ser 195 = Alberts et al (2002) Molecular Asp 102 C C H CH 2 His 57 Töltés relé az aktív centrumban

49 ph hatása a Kimotripszin Aktivitására Relatív Aktivitás ph Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.162

50 Juang RH ( 2004) BCbasics ph Isoelektomos pont, pi A fehérje eredő töltése ph hatása a fehérje eredő töltésére

51 Katalitikus triád: Imidazol gyűrű protonáltsági állapota a ph függvényében ph 6 H H ph 7 H N O C O - = Asp 102 C C C H N + N H C CH 2 H H C + N H C-H H + Inaktív H O CH 2 H N Ser 195 C C C N H Ad dapted from Dressler & Po otter (2000) Discovering Enzymes, p His 57 Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158

52 Kimotripszin proteolitikus hasítás hatására elnyeri natív szerkezetét Asp194 és a protonált Ile16 közötti sóhíd Kialakul a Katalitikus triád

53 Proteolitikus hasítás hatására a Kimotripszin β- láncában az Ile16 N-Terminálissá válik Relat N-term tív aktivitás L13 I16 Y146 ph NH 2 Ile 16 Asp194 és a protonált Ile16 között sóhíd alakul ki pka ph 9 ph 10 CH - 2 COO + NH 3 Ile16 Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.165

54 Az N-terminális Ile16 N és az Asp194 közötti ionos kölcsönhatás stabilizálja az aktív enzim 3D szerkezetét: kialakul a katalitikus triád His 57 Ser 195 Gly 193 Asp 102 Asp 194 Katalitikus Triád + NH 3 Ile 16 Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p

55 Hőmérséklet hatása

56 Arrhenius összefüggés: A Reakciósebesség - hőmérséklet aktiválási energia kapcsolata : k = A e-ea /RT k: Sebességi állandó (arányos a reakció sebességgel) ln k/a = -E a / RT ln nk 1/T

57 Hőmérséklet hatása enzim reakció sebességére Arrhenius hőmérsékleti függés tartománya k = A e-ea/rt denaturáció ln(v) versus 1/T tgα =-Ea /R

58 Denaturáció sebessége jóval nagyobb mint az aktiváció sebessége E a = 4-20 kcal/mol d[ E] dt E d = kcal/mol = kd[ E] A hőmérséklet növelése 30 to 40 C-ra, az enzim aktivitást 1.8-szorosára növeli, addig az enzim denaturáció sebességét 41- szeresére növeli

59 Enzim molekulák térszerkezete hőhatására megbomlik (rendezetlen gombolyag) - denaturálódik

60