A krónikus myeloid leukémia molekuláris genetikai követésére szolgáló, BCR-ABL mennyiségi PCR magyarországi standardizációja Andrikovics Hajnalka 1, Bors András 1, Meggyesi Nóra 1, Bödör Csaba 2, Rajnai Hajnalka 2, Alpár Donát 3, Kajtár Béla 3, László Zsuzsa 4, Antal-Szalmás Péter 5, Matolcsy András 2 és Tordai Attila 1 1 OVSZ, Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium 2 SE I. Pathológiai Intézet 3 PTE, Patológiai Intézet 4 SZTE, Genetikai Intézet 5 DEOEC, KBMPI
Krónikus myeloid leukémia (CML) Definíció: a vérképző rendszer rosszindulatú megbetegedése, amely érettebb fehérvérsejtek kóros felszaporodásával jár. Genetikai háttér: t(9;22)(q34;q11)
CML patogenezise és új terápiás megközelítése Célzott BCR-ABL tirozin kináz inhibitorok Szabályozatlan és kóros jelátviteli folyamatok elindítása Sejtproliferáció
CML követésében alkalmazott genetikai módszerek Karyotipizálás 0,0001 FISH BCR-ABL (%) 100 10 1 0,1 0,01 Philadelphia-pozitivitás, Citogenetikai módszerekm vizsgálati tartománya Molekuláris módszerekm vizsgálati tartománya Major molekuláris válasz (MMR) = BCR-ABL IS =0,1% 10 12 10 11 10 10 10 9 10 8 A leukémiás sejtek száma 0,001 10 7 Minőségi BCR-ABL PCR Teljes molekuláris válasz 10 6 Mennyiségi BCR-ABL PCR
IRIS vizsgálat (2000) (International Randomized Study of Interferon and STI571) EFS: 18-Month Landmark Analysis % Without Event 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 BCR-ABL % (IS) 0.1% <=0.01% (n = 164) >0.1-1% (n = 47) - <0% Ph pozitivitás >1-10% (n = 25) 0-35% Ph pozitivitás >10% (n = 13) - >35% Ph pozitivitás 95% 86% 62% 58% 0 12 24 36 48 60 72 84 Months Since Start of Treatment P =.01
BCR-ABL mennyiségi PCR (RQ-PCR) standardizáció Számos eltérő metodika Nehezen standardizálható módszer A módszer m CV% magas Kimutathatósági alsó határ r laboronként nt változó Különböző laborok eredményei nem hasonlíthatóak ak össze. Kezelőorvosok és s betegek könnyen k összezavarhatóak ak ( PCR-itis ). Szuboptimális kezelés Ezt kiküszöbölendő: BCR-ABL molekuláris monitorozás s standardizáció
BCR-ABL RQ-PCR egyszerűsített folyamata FOLYAMAT VARIÁCIÓK Mintavétel 1. Minta típusa: perifériás vér, csontvelő 2. Alvadásgátlás (EDTA, citrát) 3. Szállítási idő (<6h), ±RNS stabilizáló oldat Fehérvérsejt szeparálás 1. Vvs lízis 2. Ficoll- nem ajánlott RNS izolálás 1. Trizol (RNáz védelem GTvel, fenol-kloroform extrakció) 2. Qiagen oszlopos extrakció 3. MagnaPure Reverz transzkripció 1. Reverz transzkriptáz (MMLV, Supercript, AMV.) 2. Primer (random hexa/oligodt/szekvencia spec.) Real-time kvantitatív PCR (RQ-PCR) 1. RT-platform: LC, AB, RG 2. Kontroll gén: ABL, BCR, GUSB, B2M, G6PD 3. Standard görbe: nincs-dct, plazmid, RNS, cdns
BCR-ABL RQ-PCR standardizáció hogyan? A) Minden preanalitikai és analitikai lépés egységes protokoll szerinti megvalósítása (RNS izolálás, reverz transzkripció, PCR protokoll, kontroll gén, egységes plazmid kontroll, kiértékelés) A korábban beállított módszerek cseréjét teszi szükségessé. B) Nagy mennyiségben előállítható nemzetközi referencia anyagok előállításával munkaigényes mintacserék nélkül is megállapítható lesz a laborokra jellemző CF. C) A kapott eredmények nemzetközi skála ( International Scale, IS) szerinti megadása. A laboratóriumi BCR-ABL eredmények átszámítása BCR-ABL IS-re egy konverziós faktor (CF) segítségével. A CF egy standardizált laboratóriummal történő mintacsere során meghatározható, így a laboratóriumokban a korábban beállított BCR-ABL RQ-PCR módszerek használhatóak.
BCR-ABL RQ-PCR standardizáció International Scale meghatározás mintacserével T. Hughes S. Branford Adelaide, Australia Ausztrál referencia laboratórium IRIS vizsgálat Európai referencia laboratórium A. Hochhaus M. Müller Mannheim, Németország Ausztrália, Új Zéland, É/D-Amerika, D-Afrika Országszintű referencia laboratóriumok 26 európai országszintű referencia labor Magyar referencia Laboratórium OVSZ Sejtkeverék lizátum küldése CML beteg perifériás vér lizátum küldése SE PTE SZTE DEOEC Kalibrálandó hazai laboratóriumok Branford, Blood 2008; 112: 3330 Müller, Leukemia, 2009: 23: 1957
Hazai laborok (2009) BCR-ABL teszt/ zt/év Referencia OVSZ SE PTE SZTE DEOEC 1200 1200 600 500 350 Europe Against Cancer standardised protocol (Gabert J et al: Leukemia. 2003;17:2318-57. Készülék LC480 AB7300 MJ Res. CHROMO4, PTC 200 BioRad i- cycler LC - t(9;22) Quant.Kit LC1.0 Kontroll géng ABL1 ABL1 ABL1 ABL1 G6PDH Standard görbe Kontrol Reverz transzk zkripció Plasmid (inhouse) patient cdna (low/high) MMLV RT (Promega) random hexamer ΔΔCt K562/patie nt cdna AB High Capacity RT Kit Plazmid (IPSOGENE) Omniscript+Sensiscr ipt QUANTITECT RT KIT (Qiagen) K562 hígítás BioRad c- DNS synthesis kit LC - t(9;22) Quant. Kit LC - t(9;22) Quant. Kit LC - t(9;22) Quant. Kit RNS S izolálás Trizol Trizol Trizol Trizol Qiagen
A `Nemzetközi Skálá -n történő BCR-ABL meghatározás menete mintacserével Résztvevő laboratóriumok: 1) Referencia laboratórium: standardizált, meghatározott CF 2) Kalibrálandó laboratórium(ok) Mintacsere: 1) A referencia laboratórium BCR-ABL-pozitív és negatív fehérvérsejt keverékek (hígítási sorát) lizátumait küldi a kalibrálandó laboratóriumoknak eredmények összevetése előzetes konverziós faktor meghatározása 2) A kalibrálandó laboratóriumok CML-ben szenvedő betegek mintáit (25-30 db) küldik a referencia laboratóriumba, amelyekből korábban már elvégezték BCR-ABLmeghatározást. eredmények összevetése végleges konverziós faktor meghatározása
Előzetes konverziós faktor meghatározása 1) Fehérvérsejt keverék lizátumok előállítása: egészséges donorok buffy coat fehérvérsejtjeiből (~5-10*10 9 WBC) + egy CML-beteg diagnózis megállapításkor levett perifériás vérminta (b3a2 poz.) keveréke 2) 12 minta laboronként, 4 hígítás (10%, 1%, 0.1%, 0.01%) 3) 10 millió WBC mintánként, 1ml Trizolban Azonos (harmonizált) munkafolyamat: RNS izolálás Trizollal Nem feltétlenül azonos munkafolyamatok: cdns szintézis, RQ- PCR, plazmid, kiértékelési mód.
Fehérvérsejt keverék lizátumok: Linearitás és szenzitivitás vizsgálata Lineáris eredmény R 2 >98% Nem lineáris eredmény R 2 <98% Formula: Log y = (meredekség (log MMR IS )) + ordináta tengely metszet CF = MMR IS / antilog y Müller, Leukemia, 2009: 23: 1957
Előzetes konverziós faktor meghatározása Sejtkeverék lizátum meghatározás eredményei (konverzió előtt) Hígítás OVSZ DEOEC PTE SE SZTE 0,01% 0,0355 0,0138 0,0105 0,0317-0,1% 0,1634 0,1078 0,0748 0,2283 0,3467 1% 1,2016 1,2033 0,7985 2,410 4,0667 10% 9,8330 13,242 7,7675 25,40 50,50 Sejtkeverék lizátum meghatározás eredményei (konverzió után) (CF) OVSZ (0,540) DEOEC (0,879) PTE (1,249) SE (0,409) SZTE (0,245) 0,01% 0,0192 0,0121 0,0131 0,0130-0,1% 0,0883 0,0948 0,0934 0,0935 0,0849 1% 0,6493 1,0575 0,9970 0,9875 0,9960 10% 5,3138 11,638 9,6980 10,410 12,3678 CV%: 55% 58% 68% 82% CV%: 23% 5% 17% 30% 100 100 Mért BCR-ABL/ABL (%) 10 DEOEC 1 PTE SE 0,1 OVSZ SZTE Mért BCR-ABL/ABL IS (%) (%) 10 1 0,1 OVSZ DEOEC PTE SE SZTE 0,01 0,01 0,01 0,10 1,00 10,00 0,01 0,10 Elméleti 1,00 hígítás 10,00 (%) Elméleti hígítás (%) Elméleti hígítás (%)
Előzetes konverziós faktor validálása 25-30 b3a2 /b2a2 pozitív minta küldése a referencia laboratóriumba (WBC Trizolban) a BCR-ABL expresszió széles tartományt öleljen fel (0.01%- 10% BCR-ABL IS, legmagasabb BCR-ABL értéket mutató beteg is legalább major citogenetikai választ mutasson). Eredmények összevetése (referencia és kalibrálandó laboratórium): i) CF felhasználása a sejtkeverék lizátumokból ii) új CF megállapítása a betegmintákból (Bland-Altman difference plots)
Konverziós faktor meghatározása Bland Altman korrelációval OVSZ- SE I Pathológia Elfogadható az egyezés a két laboratóriumi módszer között, ha 2 a 3 kritériumból teljesül: 2x (0,5-2x) eltérésen belül van a minták 50%-a OVSZ-SE I. Path 56% 3x (0,33-3x) eltérésen belül van a minták 75%-a OVSZ-SE I. Path 83% CF=0,5046 5x (0,2-5x) eltérésen belül van a minták 90%-a OVSZ-SE I. Path 94%
Európai standardizáció eredményei 57 laboratórium indított standardizációt 51/57 lineáris sejtkeverék lizátum eredmény 48/51 küldött 30 betegmintát 43/48 minta-cserénél egyeztek megfelelő mértékben az eredmények. OVSZ 2008 BCR-ABL/ABL: 2x: 78% 3x: 96% 5x: 100% Konverziós faktorok jellemzői: Branford, 2008 CF (n=36) 0,18-13,5 EAC (n=14): 0,23-1,4 (1,4x alacsonyabb -4,3x magasabb) BCR-ABL/BCR (n=11) CF: 0,42-5,27 (5,3 x alacsonyabb- 2,4x magasabb) Müller, 2009 CF (n=51) 0,103-104,7 A teljes analitikai rendszer felelős a variabilitásért. Branford: ismételt mintacsere, 16/20 labor 1,2x eltérésen belül maradt, ahol eltérések voltak:1) Random primer koncentrációt optimalizáltak EAC szerint, 2) RT-t csere 3) PCR-készülék csere: Taqman rendszerek 1,7x magasabbak LC rendszereknél. 4) referencia gén csere.
Összefoglalás A sejtkeverék lizátum hígításainak vizsgálata a körkontroll keretében a BCR-ABL RQ-PCR linearitás és szenzitivitás vizsgálatára alkalmas. A laboratórium-specifikus konverziós faktor meghatározása lehetővé teszi, hogy az adott laboratórium BCR-ABL eredményét a nemzetközi skála (International Scale, IS) alapján fejezze ki: BCR-ABL local * CF local = BCR-ABL IS A betegminta cserék alapján meghatározott konverziós faktor alkalmazása nagyobb konkordanciával járt a referencia és a kalibrálandó labor eredményei között.
4 fő projekt * CML adatbázis * Molekuláris monitorozás * Farmakológiai monitorozás * Ismeretek/tudás terjesztése.
Köszönetnyilvánítás OVSZ, Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium Bors András Csehné Bánhidi Klára Horváth Csongorné Meggyesi Nóra Pfundt Antalné Tordai Attila SE I. Pathológiai Intézet Bödör Csaba Rajnai Hajnalka Csernus Balázs Matolcsy András PTE KK Patológiai Intézet Alpár Donát Kajtár Béla Pajor László DEOEC KBMPI Antal-Szalmás Péter Kappelmayer János SZTE, Genetikai Intézet László Zsuzsanna